Nghiên cứu tình trạng methyl hóa một số chỉ thị phân tử ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN PHI CƯỜNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HỐ MỘT SỐ CHỈ THỊ
PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Ngành/chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Khoa:

CNSH-CNTP

Khóa học:

2016-2020

Thái Ngun – năm 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN PHI CƯỜNG
Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HỐ MỘT SỐ CHỈ THỊ
PHÂN TỬ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Ngành/chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Lớp:

48-CNSH

Khoa:

CNSH-CNTP

Khóa học:

2016-2020

Người hướng dẫn:

1. PGS.TS. Dương Văn Cường
2. ThS. Vũ Hoài Nam

Thái Nguyên – năm 2020

i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực tập và nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt
nghiệp ngồi sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo,
hướng dẫn và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hồn thành
luận văn:
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS.Dương Văn
Cường người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực
hiện đề tài cũng như trong q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công
Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Vũ Hoài Nam cùng các cán bộ, các anh
chị làm việc tại Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ,
tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và
bạn bè đã ln động viên, chia sẻ và giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn trong q
trình học tập, nghiên cứu và hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Xin trân trọng cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 06 năm 2020
Sinh Viên

Nguyễn Phi Cường


ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài .................................. 15

Bảng 3.2: Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài........................... 16
Bảng 4.1: Kết quả nồng độ DNA sau khi đo quang phổ ................................ 28


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính
năm 2018 ........................................................................................................... 5
Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính
năm 2018 ........................................................................................................... 6
Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính
năm 2018 ........................................................................................................... 7
Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo
độ tuổi ................................................................................................................ 9
Hình 2.5: Q trình methyl hóa DNA ............................................................. 10
Hình 3.2.2.1: Kết quả tách DNA bằng phương pháp của Campos và
cộng sự ............................................................................................................ 23
Hình 3.2.2.2: Kết quả tách DNA bằng phương pháp sử dụng bộ KIT ........... 23
Hình 3.2.2.3: Kết quả tách DNA bằng phương pháp NAOH 2N ................... 24
Hình 3.2.2.4: Kết quả tách DNA bằng phương pháp lysis buffer .................. 25
Hình 4.5 : Vị trí kích thước gene FLI 1 .......................................................... 31
Hình 4.6. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene FLI 1......................... 32
Hình 4.7. Vị trí kích thước gene AGRN ......................................................... 32
Hình 4.8. Thiết kế mồi khuếch đại cho promoter gene AGRN ...................... 33


iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DNA

: Deoxirybonucleic Acid

PCR

: Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction

RNA

: Ribonucleic Axit

CRC

: Colorectal Cancer (Ung thư đại trực tràng)

SNP

: Sequence Number PDU

Kb

: Kilo base – Kilo bazo nito

Ng

: Nanogam

v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ ii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................... iv
MỤC LỤC ........................................................................................................ v
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát .................................................................................. 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ........................................................................................ 3
1.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
2.1.Ung thư đại trực tràng ................................................................................. 4
2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng ............................................................ 4
2.1.2.Cơ chế gây ung thư .................................................................................. 4
2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới.......................................... 5
2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam ........................................ 8
2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng ......................................................... 9
2.2.1. Methyl hóa DNA là gì ............................................................................. 9
2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng ................... 11
2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi
bisulfite............................................................................................................ 11
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina
Infinium 450K ................................................................................................. 12
2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế ........................................................... 13
2.5.1 Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN
......................................................................................................................... 13

vi

2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1 ......................... 13
2.5.4 Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN....................................................... 14
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................... 15
3.1.Vật liệu ...................................................................................................... 15
3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm......................................................................... 15
3.1.2.Mẫu bệnh phẩm ...................................................................................... 16
3.1.3.Trang thiết bị .......................................................................................... 16
3.2.Phương pháp.............................................................................................. 16
3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde .................. 17
3.2.2.Đánh giá chất lượng DNA tách chiết ..................................................... 23
3.2.3.Giới thiệu về phương pháp biến đổi bisulfite conversion ...................... 25
3.2.4.Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa ................................................. 26
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28
4. Kết quả ........................................................................................................ 28
4.1.Kết quả đo hàm lượng DNA ..................................................................... 28
4.1.1.Phương pháp của campos và cộng sự .................................................... 28
4.1.2.Sử dụng bộ KIT ...................................................................................... 28
4.1.3.Phương pháp NaOH 2N ......................................................................... 29
4.1.4.Phương pháp Lysis buffer ...................................................................... 29
4.2 Phân tích in silico và thiết kế mồi ............................................................. 31
4.4.1 Gene FLI 1 ............................................................................................. 31
4.4.2. Gene AGRN .......................................................................................... 32
4.4.3. Kết quả thiết kế mồi .............................................................................. 33
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 35
1. Kết luận ....................................................................................................... 35
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 36


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ung thư đại trực tràng là một trong những dạng ung thư hàng đầu trên thế
giới cũng như tại Việt Nam. Trong các cơ chế phân tử liên quan đến ung thư
đại trực tràng, sự methyl hóa DNA là một trong những cơ chế có ảnh hưởng
lớn. Các nghiên cứu về methyl hóa ở DNA đa phần được thực hiện trên quần
thể người Châu Âu và người Châu Mỹ, hay nói cách khác là người da trắng là
chính và một phần là người da đen. Các nghiên cứu trên quần thể người da vàng
còn hạn chế về mặt số lượng.
DNA methylation là một cơ chế epigenetics và cơ chế này không giống
như cơ chế di truyền, cơ chế epigenetics có sự khác biệt bởi yếu tố môi trường.
Yếu tố môi trường ở đây rất rộng, nó bao gồm các yếu tố như chủng tộc, chế
độ ăn uống, chế độ sinh hoạt,…
Trong những năm đầu của cuộc cách mạng sinh học phân tử, nghiên cứu
ung thư chủ yếu tập trung vào thay đổi di truyền, bao gồm cả ung thư đại trực
tràng. Cơ chế epigenetics là cơ chế rất cần thiết cho sự phát triển bình thường
và duy trì các mẫu biểu hiện gen đặc hiệu của mơ ở động vật có vú. Sự gián
đoạn của q trình biểu sinh có thể dẫn đến thay đổi chức năng gen và biến đổi
tế bào ác tính.[1]
Ở người, methyl hóa DNA là một trong những vấn đề được quan tâm
và nghiên cứu chuyên sâu. Trong các tế bào bình thường, nó đảm bảo sự điều
hịa biểu hiện gen và làm gen ổn định. Q trình methyl hóa DNA có liên quan
đến thay đổi histone và sự tương tác của các thay đổi biểu sinh, các thay đổi
này rất quan trọng để điều chỉnh hoạt động của bộ gen bằng cách thay đổi cấu

trúc chromatin. Q trình methyl hóa bị hạn chế ở dư lượng cytosine và
chủ yếu gặp trong dinucleotide cytosine-guanine (CG) (thường được viết
tắt là CpGine). Dinucleotide này khơng được thể hiện trong tồn bộ bộ


2

gen, nhưng nó xuất hiện với độ dài tăng dần trong khoảng 0,3 kb và khoảng
40% gen người có chứa một đảo CpG trong vùng promoter. Việc bổ sung
cộng hóa trị của một nhóm methyl thường xảy ra ở cytosine trong các
dinucleotide CpG và tập trung thành các cụm lớn gọi là đảo CpG [2].
Việc phát hiện ra ung thư đại trực tràng hiện nay được xem là điều cần
thiết, nhưng để phát hiện sớm không hề dễ dàng. Đặc điểm của khối u khi mới
phát sinh là kích thước cịn rất nhỏ, sau đó khối u tăng kích thước và bám vào
thành ruột nhưng chưa đâm thủng thành ruột. Khi ở dai đoạn này, tỷ lệ sống sót
của người mắc bệnh là 90%. Khối u sẽ tiếp tục tăng kích thước, đâm thủng
thành ruột nhưng chưa di căn, tỷ lệ sống sót của người mắc bệnh lúc này giảm
đi còn 70%. Bản thân những người mắc ung thư đại trực tràng họ thường không
thể biết được những triệu chứng ban đầu của bệnh, tỷ lệ phát hiện bệnh là 39%.
Khi tế bào ung thư đã di căn đến các vùng khác của cơ thể thì tỷ lệ phát hiện
bệnh là 61%, lúc này tỉ lệ sống sót của người bênh chỉ cịn 12% vì phát hiện
q muộn.
Vì vậy, việc phát hiện sớm bệnh và tầm quan trọng của sự thay đổi methyl
hóa DNA trong khối u có một ý nghĩa rất lớn đối với con người, trong tương
lai methyl hóa có thể được phát triển thành một chỉ số theo dõi phác đồ điều trị
ung thư.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng em tiến hành đề tài: “NGHIÊN CỨU
TÌNH TRẠNG METHYL HỐ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ Ở BỆNH
NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Tìm ra những chỉ thị phân tử có mức độ methyl hóa DNA đủ lớn với
tần số xuất hiện cao và đặc thù trong quần thể bệnh nhân ung thư đại trực
tràng Việt Nam.


3

1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Tách chiết được DNA đạt được tiêu chuẩn từ mẫu mô bệnh nhân ung thư
đại trực tràng từ mẫu cố định formaldehyde để vụ cho các nội dung thí nghiệm
của đề tài.
- Thiết kế được một số cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.
1.3. Nội dung nghiên cứu
- Tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của bệnh nhân ung
thư đại trực tràng.
- Phần tích được các đặc điểm, cấu trúc của gene trên máy tính.
- Thiết kế được cặp mồi PCR đặc hiệu methyl hóa.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Ung thư đại trực tràng
2.1.1. Khái niệm ung thư đại trực tràng
Vài thập kỷ trước, do điều kiện khoa học và cơ sở vật chất trang thiết bị
chưa phát triển, bệnh ung thư đại trực tràng được chẩn là một bệnh rất
mới. Ngày nay, ung thư đại trực tràng được xem là căn bệnh nguy hiểm đứng
thứ tư trên thế giới với gần 900 000 ca tử vong hàng năm [3].

Ung thư ruột hay ung thư đại trực tràng là tên gọi chung của ung thư đại
tràng và và ung thư trực tràng, tức là ung thư phát triển từ đại tràng hay trực
tràng (là những phần của ruột già), nó được tạo nên bởi sự phát triển bất thường
của các tế bào và có khả năng lan rộng ra các bộ phận khác của cơ thể. Dấu hiệu
và triệu chứng bao gồm xuất hiện máu trong phân, tụt cân, đau bụng giữ dội, có sự
thay đổi trong nhu động ruột và cơ thể luôn luôn cảm thấy mệt mỏi.
Hầu hết các nguyên nhân gây bệnh ung thư đại trực tràng là do các yếu tố
về lối sống không lành mạnh và độ tuổi, với chỉ một số ít trường hợp là do rối
loạn gen di truyền. Bên cạnh vấn đề về tỷ lệ dân số già và thói quen ăn uống
của các nước có thu nhập bình quân đầu người cao thì các yếu tố nguy cơ gây
nên bệnh có thể kể đến ở đây bao gồm chế độ ăn khơng tốt, bệnh béo phì, hút
nhiều thuốc lá, và ít hoạt động thể chất, lười tập thể dục. Những yếu tố về chế
độ ăn làm tăng nguy cơ hình thành bệnh là nhiều người ăn thịt đỏ, thịt sống, sử
dụng những sản phẩm thịt để lâu q hạn, khơng đảm bảo về ăn chín uống sôi.
Không chỉ thế mà vấn đề về sử dụng rượu cũng rất đáng nói, vì uống rượu nhiều
cũng là yếu tố nguy cơ gây nên các bệnh về đường ruột như viêm đường ruột,
trong đó bao gồm bệnh Crohn và viêm loét đại tràng [4].
2.1.2.Cơ chế gây ung thư
Sự hình thành ung thư đại trực tràng bắt đầu với sự biến đổi của niêm
mạc biểu mơ bình thường thành biểu mô tăng sinh. Những tế bào biểu mô ruột


5

tăng sinh mất tổ chức và cấu trúc của chúng và có khả năng hình thành
adenomas. Adenomas sau đó có thể phát triển và xâm lấn vào vùng dưới niêm
mạc và trở thành ung thư với khả năng phổ biến vào đại tràng. Chuỗi hoạt động
này được gọi là chuỗi adenoma-carcinoma, từ đó có thể dẫn đến CRC. Ba cơ
chế chính của sự mất ổn định di truyền: mất ổn định nhiễm sắc thể, mất ổn định
kính hiển vi và kiểu hình methylator đảo CpG. Các cơ chế này có tác động đến

các đường dẫn tín hiệu chính và dẫn đến mất kiểm soát sự tăng sinh tế bào, tăng
trưởng tế bào không giới hạn và phát triển khối u [5].
2.1.2.Tình hình ung thư đại trực tràng trên thế giới
Theo dữ liệu của GLOBOCAN 2018, ung thư đại trực tràng (CRC) là bệnh
ung thư đứng thứ tư trên thế giới và là dạng ung thư được chẩn đoán phổ biến
thứ ba trên toàn cầu, bao gồm 11% trong số tất cả các chẩn đốn ung thư khác
nhau.

Hình 2.1: Bản đồ tỷ lệ mắc bệnh ung thư trên thế giới ước tính
năm 2018 />Khoảng 1.096.000 trường hợp ung thư ruột kết mới ước tính sẽ được chẩn
đốn vào năm 2018, trong khi khoảng 704.000 trường hợp ung thư trực tràng
mới được phát hiện. CRC là bệnh ung thư được chẩn đoán có tỷ lệ mắc nhiều


6

nhất ở nam giới với 10 trong số 191 quốc gia trên tồn thế giới. Cịn chẩn đốn
trên phụ nữ thì khơng có quốc gia nào có tỉ lệ cao cả [6].
Tỷ lệ mắc bệnh CRC không chỉ xảy ra nhiều ở nam giới hơn là nữ giới mà
tỷ lệ đó cịn gấp 3 đến 4 lần đối với các quốc gia đang phát triển. Tỷ lệ mắc
bệnh chuẩn theo tuổi trên thế giới là 100.000 ca, ở cả hai giới là 19,7%, ở nam
là 23,6% và ở nữ là 16,3%. Mặc dù tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi ở nam giới là
30,1%/100.000 ở các quốc gia có chỉ số HDI (chỉ số phát triển con người) cao,
nhưng ở các quốc gia có HDI thấp thì tỷ lệ này giảm xuống (thống kê tương tự
ở nữ là 20,9% và 5,9%). Năm 2018, khoảng 576.000 đàn ông và 521.000 phụ
nữ được chẩn đốn mắc bệnh ung thư đại trực tràng [6].

Hình 2.2: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo tuổi ước tính năm 2018
/>Các nước phát triển là các nước có nguy cơ mắc ung thư đại tràng và trực
tràng cao nhất. Đối với ung thư ruột kết, Nam Âu, Úc / New Zealand và Bắc

7

Âu là những khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất. Đối với ung thư trực tràng,
các khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là Đơng Âu, Úc / New Zealand và Đông
Á. Bắc Mỹ cũng là một trong những nơi có tỷ lệ mắc cao nhất đối với cả hai
bệnh ung thư. Quốc gia có tỷ lệ mắc CRC cao nhất trên 100,000 dân là Hungary
(70,6%) ở nam và Na Uy (29,3%) ở nữ. Tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Ả Rập Saudi,
Ô-man, Yemen, Bahrain, Qatar, Kuwait và Slovakia CRC cũng là bệnh ung thư
được chẩn đoán nhiều nhất ở nam giới. Trong khi đó, tất cả các khu vực của
Châu Phi, cũng như Nam Á thì CRC có tỷ lệ mắc thấp nhất đối với cả hai giới
[6]

.

Hình 2.3: Biểu đồ tỷ lệ mắc ung thư chuẩn theo giới tính ước tính năm
2018 />Ung thư trực tràng là một trong những bệnh gây tử vong nhiều nhất, với
310.000 ca tử vong, chiếm 3,2% tổng số ca tử vong do ung thư, ở độ tuổi từ 0
đến 74 tuổi, tử vong do ung thư đại tràng là 0,66% ở nam giới và 0,44% ở phụ


8

nữ. Nguy cơ tương tự ung thư trực tràng là 0,46% ở nam và 0,26% ở nữ. Tỷ lệ
tử vong chuẩn hóa theo độ tuổi (thế giới) ở cả hai giới là 8.9% trên 100.000 ca
CRC. Dự kiến đến năm 2030 gánh nặng toàn cầu về ung thư đại trực tràng
sẽ tăng lên 60%, thêm hơn 2,2 triệu trường hợp mới và 1,1 triệu ca tử vong
hàng năm [7].
2.1.3.Tình hình ung thư đại trực tràng tại Việt Nam

Tổng tỷ lệ mắc ung thư của tất cả các bệnh ung thư là trên 100.000 người,
được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IACR) đưa ra vào năm 2012, trong
đó có 173 trường hợp đối với nam và 114,3 trường hợp đối với nữ. Những số
liệu thống kê mới cho thấy tỷ lệ mắc ung thư cả hai giới ở các quốc gia là
125.000 trường hợp mới mỗi năm. Ước tính của IARC cho thấy tỷ lệ tử vong
do ung thư là 148 trên 100.000 trường hợp đối với nam giới, 76.3 trên 100.000
trường hợp đối với nữ và 94.700 người chết vì ung thư mỗi năm. Năm bệnh
ung thư thường gặp nhất tại Việt Nam ở cả nam và nữ là ung thư gan (17,6%
trường hợp mới), ung thư phổi (17,5% trường hợp mới), ung thư dạ dày (11,4%
trường hợp mới), ung thư vú (8,9% trường hợp mới) và đại trực tràng (7% tất
cả các trường hợp mới).
Từ những số liệu thống kê trên, sự thay đổi về tỷ lệ mắc các bệnh ung thư
tại Việt Nam như sau. Chúng ta có tỷ lệ tương đối cao đối với ung thư gan và
ung thư phổi, xếp sau đó là ung thư dạ dày, cuối cùng là ung thư vú và ung thư
đại trực tràng. Tỷ lệ mắc bênh ung thư đại trực tràng tại Việt Nam là thấp nhất
đối với các loại ung thư khác. Nguyên nhân ở đây là vì người dân Việt Nam
đặc biệt là nam giới sử dụng rất nhiều thuốc lá gây ảnh hưởng rất lớn đến phổi,
khơng những thế nhiều người dân điển hình như công nhân tiếp xúc rất nhiều
với chất gây ung thư từ cơng việc, nghề nghiệp. Sự lão hóa của người cao tuổi,
rượu bia và béo phì do lối sống khơng lành mạnh [8].


9

Hình 2.4: Biểu đồ ước tính tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa theo độ
tuổi (Thế giới) năm 2018, Việt Nam, cả hai giới, độ tuổi 0-74
/>2.2. Methyl hóa và ung thư đại trực tràng
2.2.1. Methyl hóa DNA là gì
Di truyền học là một lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất
hiện trong hoạt các động hoặc chức năng của gen do sự thay đổi trực tiếp của

chuỗi DNA. Những thay đổi này gồm đột biến, xóa, chèn và dịch. Ngược lại,
biểu sinh học là lĩnh vực nghiên cứu về những thay đổi có thể xuất hiện trong
hoạt động hoặc có trong chức năng gen mà không liên quan đến bất kỳ thay đổi
nào của trình tự DNA. Mặc dù hầu hết tất cả các tế bào trong một sinh vật sống
đều chứa cùng một thông tin di truyền, nhưng không phải tất cả các gen đều
được biểu hiện đồng thời bởi tất cả các loại tế bào. Xét về ý nghĩa rông hơn, thì
các cơ chế biểu sinh là cầu trung gian cho các sự biểu hiện gen đa dạng trong
nhiều loại tế bào và mô của các sinh vật đa bào. Trong bộ gen của động vật có
vú, q trình methyl hóa DNA là một cơ chế biểu sinh liên quan đến việc


10

chuyển một nhóm methyl vào vị trí C5 của cytosine để tạo thành 5methylcytosine. Q trình methyl hóa DNA này có vai trị điều chỉnh biểu hiện
gen bằng cách thu thập các protein liên quan đến ức chế gen hoặc ức chế sự
gắn kết của các yếu tố phiên mã với DNA.
Trong lịch sử, q trình methyl hóa DNA được phát hiện ở động vật có
vú ngay khi DNA được xác định là vật liệu di truyền ( Avery et al ,
1944 ; McCarty và Avery, 1946 ). Năm 1948, Rollin Hotchkiss lần đầu tiên
phát hiện ra cytosine đã biến đổi trong một chế phẩm của tuyến ức ở loài bò,
mà cụ thể là con bê non bằng phương pháp sắc ký giấy. Q trình methyl hóa
DNA được xúc tác bởi một họ methyltransferase DNA (Dnmts) chuyển một
nhóm methyl từ S - adenyl methionine (SAM) sang carbon thứ năm của
cytosine để tạo thành 5mC. Dnmt3a và Dnmt3b có thể xây dựng lên một bản
sao methyl hóa mới để DNA chưa được sửa đổi thực hiện sửa đổi, do đó nó
được gọi là de novo Dnmt (Hình a). Mặt khác, Dnmt1 hoạt động trong q trình
sao chép DNA, mục đích là sao chép mẫu methyl hóa DNA từ chuỗi DNA mẹ
lên chuỗi DNA con mới được tổng hợp.

Hình 2.5: Quá trình methyl hóa DNA

11

Tất cả ba Dnmts đều tham gia sâu rộng vào sự phát triển của phôi. Khi
đạt thời điểm ngừng, các tế bào biểu hiện Dnmt sẽ giảm đi nhiều. Điều này cho
thấy rằng mơ hình methyl hóa DNA trong các tế bào postmitotic là ổn định. Tuy
nhiên, các tế bào thần kinh postmitotic trong não động vật có vú trưởng thành
vẫn có sự xuất hiện đáng kể của tế bào biểu hiện Dnmts, điều này làm tăng khả
năng methyl hóa Dnmts và DNA có thể nó đóng một vai trị mới trong não
( Goto et al , 1994 ; Feng et al , 2005 ) [1].
2.2.3. Bất thường methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng
Methyl hóa DNA là một trong những biểu sinh học có thể điều chỉnh biểu
hiện của gen. Ở người, q trình methyl hóa DNA xảy ra ở cytosine, nó được
gọi là dinucleotide CpG (liên kết C-phosphodiester-G). Phần lớn các
dinucleotide CpG trong bộ gen của con người đều bị methyl hóa, tuy nhiên ở
trên gen có các khu vực tập chung nhiều CpG, những khu vực đó được gọi là
đảo CpG và thường khơng được methyl hóa trong các tế bào khỏe mạnh bình
thường. Các đảo CpG được tìm thấy ở các vùng promoter của ~ 40 406060%
gen ức chế khối u. Chúng thường dài khoảng 200 B20002000 bps, có hàm
lượng CG>50% và tham gia vào q trình điều hịa biểu hiện gen. Dinucleotide
methyl hóa CpG thường được tìm thấy trong gen, trong centromeres, trong các
yếu tố retrotransCPon và trong các trình tự LINE-1, SINE / Alu, v.v. Theo một
nghĩa nào đó, q trình methyl hóa bình thường này về cơ bản được đảo ngược
như quá trình của các tế bào ung thư [9].
2.3. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến
đổi bisulfite
Trong những năm qua, biến đổi bisulfite đã trở thành phương pháp được
sử dụng rộng rãi nhất để phân tích methyl hóa DNA. Đó là cách thuận tiện và
hiệu quả nhất để xây dựng lên một tấm bản đồ methyl hóa DNA cho từng cá

nhân người bệnh. Là bước đầu tiên trong kỹ thuật phân tích của nhiều lĩnh vực
nghiên cứu khác, điều cực kỳ quan trọng là quá trình biến đổi bisulfite được


12

hiểu và áp dụng rất tốt trong thực tế. Chuyển đổi bisulfite là một q trình tương
đối khắc nghiệt, nó sẽ thay đổi đáng kể tính chất hóa học và tính chất vật lý của
mẫu DNA. Trong q trình biến đổi, DNA của chúng ta sẽ chuyển từ các phân
tử sợi kép lớn và ổn định sang một loạt các phân tử sợi đơn bị phân mảnh ngẫu
nhiên. Ngoài ra, hầu hết các cytosine đã được chuyển đổi thành uracil. Về cơ
bản, sau khi trải qua sự biến đổi lớn như vậy thì DNA của chúng ta khơng cịn
giống DNA gốc nữa, nên ta sẽ phải lưu ý thực hiện một số điều chỉnh sao cho
phù hợp với mục đích tiếp theo [10].
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao
Illumina Infinium 450K
Có hơn 28 triệu vị trí CpG (cịn gọi là các điểm dinucleotide CpG) trong
bộ gen của con người. Do sự ảnh hưởng ngày càng tăng trong nghiên cứu biểu
sinh, quá trình methyl hóa DNA nói riêng, các nhà nghiên cứu khoa học họ cần
một cơ sở dữ liệu tham khảo nơi có thể tìm thấy thơng tin về các vị trí CpG.
Thay vì sử dụng các cơ sở dữ liệu cơng cộng đang phát triển để cung cấp
chính xác. Illumina đã phát triển một phương pháp nhất quán chỉ định vị trí
CpG dựa trên thực tế hoặc trình tự tóm lược của từng vị trí CpG riêng lẻ.
Phương pháp Illumina tận dụng các chuỗi bên cạnh một vị trí CpG để tạo ra
một cụm vị trí CpG đặc biệt. Các số liệu này dựa trên những thơng tin trình tự
duy nhất và không bị ảnh hưởng bởi các phiên bản bộ gen khác. Illumina được
chuẩn hóa thành thuật ngữ cũng tương đương với thuật ngữ chuỗi TOP / BOT
thường được sử dụng để chỉ định chuỗi SNP.
Ưu điểm của phương pháp này là nó sẽ ln chỉ biểu thị định danh và định
hướng cùng một số vị trí CpG giống nhau ngay cả khi cơ sở dữ liệu công cộng

và bộ genome thay đổi. Điều này sẽ cho phép tất cả các nhà nghiên cứu khoa
học dễ dàng nghiên cứu các điều tương quan đến vị trí CpG được xác định với
nghiên cứu [10].


13

2.5. Nghiên cứu trong nước và quốc tế
2.5.1 Một số nghiên cứu trong nước liên quan về gene FLI 1 và gene AGRN
- Tuy nhiên chưa có nghiên cứu cụ thể nào xác định tính trạng methyl hóa
về gene FLI 1 và gene AGRN, dưới đây là một số nghiên cứu trong nước có
liên quan đến methyl hóa DNA tại Việt Nam.
- Tháng 7 năm 2018, các nhà nghiên cứu Tràng Lan Vũ, Nguyễn Thu
Trang, Văn Thị Hồng Đoàn và Lan Thị Thượng Võ đã nghiên cứu về methyl
hóa BRCA1, RASSF1A và GSTP1 ở phụ nữ Việt Nam bị ung thư vú 11
- Tháng 3 năm 2018, các nhà nghiên cứu Phương Kim Trường, Thuận Đức
Lão, Thủy Ái Huyền đã nghiên cứu Hypermethylation của Biomarker dựa trên
gen DcR1 trong sàng lọc ung thư không xâm lấn của bệnh nhân ung thư cổ tử
cung Việt Nam [12].
- Tháng 1 năm 2016, Thị Thượng Lan Võ, Bích Thuận Ta, Văn To
Ta, Diệu Linh Vương, Quỳnh Uyên Nguyễn đã nghiên cứu về methyl hóa
Promoter của GSTP1 và RASSF1A trong ung thư tuyến tiền liệt và tăng sản
lành tính ở nam giới Việt Nam [13].
2.5.2 Một số nghiên cứu quốc tế có liên quan về gene FLI 1
- Tháng 11 năm 2015, David J. Elzi, Meihua Song, Peter J. Houghton,
Yidong Chen và Yuzuru Shiio đã nghiên cứu vai trò của gene FLI 1 đối với
bênh ung thư xương và mô mềm ở trẻ em [14].
- Ngày 26 tháng 5 năm 2014, Nicolò Riggi, Birgit Knoechel, Shawn M.
Gillespie và những người cộng sự đã nghiên cứu EWS-FLI1 sử dụng các cơ
chế tái cấu trúc chromatin khác nhau để trực tiếp kích hoạt hoặc kìm nén các

yếu tố tăng cường trong Ewing sarcoma [15].
- Tháng 2 năm 2015, Mara L. Lennard Richard , Danielle Brandon ,
Tamara K. Nowling , Dennis K. Watson , và Xian K. Zhang đã cho ra bài báo
nghiên cứu Fli-1 kiểm soát phiên mã từ chất kích thích gen MCP-1, có thể cung
cấp một cơ chế mới để kích hoạt chemokine và cytokine [16].


14

2.5.4 Nghiên cứu quốc tế về gene AGRN
- Tháng 12 năm 2016, Celine Lefebvre, Thomas Bachelot, Thomas
Filleron, Marion Pedrero, Mario Campone, Jean-Charles Soria đã nghiên cứu
về đột biến của ung thư vú di căn, và gene AGRN là một gen có liên quan đến
căn bệnh này [17].
- Tháng 8 năm 2018, Xin Li, Xianteng Wang, Wanlu Song, Hui
Xu, Rongyao Huang, Yuting Wang, Wenwei Zhao, Zhengtao Xiao, Xuerui
Yang đã nghiên cứu đặc tính gây ung thư của NEAT1 trong các tế bào ung thư
tuyến tiền liệt phụ thuộc vào mạch điều hòa phiên mã CDC5L-AGRN 18.
- Tháng 12 năm 2019, Lei Zhang, Zhe Zhang, Zhenglun Yu đã nghiên cứu
Xác định một dấu hiệu gen liên quan đến glycolysis mới để dự đốn di căn và
sống sót ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi [19].


15

PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1.Vật liệu
3.1.1.Các hóa chất, sinh phẩm
Bảng 3.1: Danh mục các hóa chất sử dụng trong đề tài

Tên hóa chất
Agarose
NaOH
NaCl
EDTA
Ethanol
Tris – HCL
Tris Base, for Molecular Biology
PCR Mastermix
Loading dye
Kit tách DNA
Nước cất, nước khử ion
Proteinase K
Rnase
Ethidium Bronide
PBS

ĐVT
Gam
Gam
Gam
Gam
Ml
Gam
Gam
Pk
Ml
Bộ
Ml
Ml

Ml
Ml

TAE 1X

Ml

TE
CIAA

Ml
Ml

Alkali

Ml

10X DreamTaq Buffer
DreamTaq DNA Polymerase
10mM dNTP Mix

Ml
Ml
Ml

Dung dịch 25:24:1

Ml

Lysis Buffer

Ml

Bộ Tissue Genomic DNA Extraction
Mini Kit
Bộ EZ DNA Methylation - Gold

Hãng sản xuất
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Merck
Thermo scientific
Thermo scientific
Thermo scientific
Thermo scientific
Thermo scientific
Merck
(Na2HPO4.2H2O,
NaH2PO4.H2O, NaCl)
(Tris base, Acid Acetic,
EDTA)
(100nM Tris/1mM EDTA)
(chloroform, isoamylakihol)
(0,1M NaOH, SDS 1%,
pH=12)
Thermo scientific

Thermo scientific
Thermo scientific
(Phenol, Chloroform,
Isoamylakihol)
(Tris HCl 1M, EDTA 0,5M,
SDS 10%)

Bộ

FavorPrep

Bộ

Zymo Research


16

3.1.2.Mẫu bệnh phẩm
Mẫu khối u và mô lành liền kề cố định formaldehyde của bệnh nhân ung
thư đại trực tràng, được lấy ở Bệnh Viện K Trung ương Việt Nam năm 2019.
3.1.3.Trang thiết bị
Bảng 3.2: Danh mục các trang thiết bị sử dụng trong đề tài
Tên thiết bị

Nguồn gốc xuất xứ

Máy lọc nước

Pall Co – UK

Bể rửa sóng siêu âm

Jeiotech – korea

Bể ổn nhiệt

Techne - OSI

Máy li tâm

Eppendorf – CHLB Đức

Máy ảnh chụp gel

Gel Logic 1500 – Kodak – USA

Tủ lạnh -20ºC; -80ºC

Super freezer Eco130 – Ficchtti – Italy

Cân điện tử

TE 214S – Startorius Germany

Lị vi sóng

MS – 2347AR – LG VN

Nồi hấp khử trùng

HV – 110 – Hirayama – Japan

Máy vortex

Genius 3 – IKA Genmany/China

Bộ điện di

Scie – plas Ltd – UK

Máy PCR

Amplied Biosytems USA/Singapore

Máy đo quang phổ Nadrop One

Thermo scientific

3.2.Phương pháp
Với mục đích tách chiết được DNA cố định formaldehyde để phục vụ
cho các quá trình nghiên cứu về sau, và bởi vì DNA cố định formal nên DNA
trong quá trình ngâm đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, vì vậy cần phải sử dụng
các phương pháp khác nhau để thực hiện tách chiết.
 Sự ảnh hưởng của formaldehyde đến DNA
Thông thường formaldehyde được dùng để làm chất bảo quản các mẫu
sinh phẩm trong phịng thí nghiệm, nó giúp kéo dài thời gian bảo quản các mẫu


17

sinh phẩm rất tốt. Nhưng mặt khác nó lại gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng
DNA. Cụ thể, formaldehyd sẽ phản ứng với DNA và protein, các phân tử DNAprotein được liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, gây ra q trình oxy
hóa và phản ứng khử amin, làm biến tính DNA, ảnh hưởng nghiêm trọng đến
enzyme [20].
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã thực hiện tách chiết DNA cố định
formaldehyde và họ cũng chỉ tách chiết ra ở một mức độ nhất định. Vì DNA từ
các mô lưu trữ cố định không phải lúc nào cũng phù hợp để phân tích do chất
lượng khơng đủ và rất khó để tách chiết.
3.2.1.Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô cố định formaldehyde
 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại
trực tràng cố định formal bằng phương pháp của Campos và cộng sự.
Phương pháp này chúng em tham khảo từ phương pháp chiết xuất gan
bằng Phenol-chloroform của tác giả SM Hykin, Adapted from Campos and
Gilbert (2012), Kearney and Stuart (2004). Chúng em đã thay đổi một số bước
trong phương pháp để phù hợp với điều kiện làm việc của phịng thí nghiệm sinh
học phân tử Viện Khoa Học Sự Sống Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Protocol for Extraction of hDNA from Formalin-fixed Museum
Specimens: Liver Extraction by Phenol-chloroform SM Hykin, Adapted from
Campos and Gilbert (2012), Kearney and Stuart (2004)
Bước 1. Dùng dao thái nhỏ khoảng 30-40 mg mẫu cho vào ống eppendorf
1,5 ml.
Rửa mẫu: mẫu mô được rửa 4 lần trong đệm GTE (100mM glycine, 10mM
Tris – HCL pH=8, 1mM EDTA) trong 2 giờ.
+ Mẫu mô được rửa trong 1 phút với cồn 100%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 70%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 40%.
+ Mẫu mô được rửa trong 5 phút với cồn 20%.