Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP 9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------

Nguyễn Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN
MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------

Nguyễn Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN
MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Trịnh Hồng Thái
TS. Đỗ Minh Hà

Hà Nội – Năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trịnh Hồng Thái,
người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình,
những ý kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS. Đỗ Minh Hà
trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được
sự giúp đỡ của ThS. Phạm Thị Bích, ThS. Nguyễn Thị Tú Linh, ThS. Lê Lan
Phương và các bạn sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan
tâm, giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh,
bệnh viện K, Hà Nội; khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội; khoa
sàng lọc máu của Viện Huyết học và truyền máu Trung ương.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm công
nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và
luôn bên tôi trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, tháng 3 năm 2015
Học Viên

Nguyễn Thị Như Quỳnh

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................... 3
1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng..................................................................... 3
1.1.1. Ung thư đại trực tràng.......................................................................................... 3
1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng......................................................... 4
1.1.3. Chẩn đoán và điều trị bệnh................................................................................. 5
1.1.4. Các giai đoạn của UTĐTT................................................................................. 7
1.2. Matrix Metalloproteases (MMP)........................................................................ 10
1.2.1. Khái quát chung về họ Matrix Metalloprotease (MMPs).........................10
1.2.2. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase...................................................... 12
1.2.3. Một số nghiên cứu về họ MMP ở ung thư đại trực tràng.......................... 16
1.2.4. Một số nghiên cứu về đa hình đơn nucleotide trên các gen MMP..........17
1.2.5. Một số nghiên cứu về đa hình vùng promoter gen MMP-9...................... 19
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................. 21
2.1 Nguyên liệu.............................................................................................................. 21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................ 21
2.1.2. Hóa chất................................................................................................................ 21
2.1.3. Thiết bị.................................................................................................................. 22
2.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu................................................................... 22
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô........................................................................ 23
2.2.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu............................................................ 24
2.2.3. Khuếch đại đoạn gen trên vùng promoter của gen MMP-9 bằng
phương pháp PCR.......................................................................................................... 24
2.2.4. Phương pháp RFLP............................................................................................ 26
2.2.5. Điện di................................................................................................................... 26
2.2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR.................................................................................. 27
2.2.7. Giải trình tự trực tiếp......................................................................................... 28
2.2.8. Nhân dòng phân tử............................................................................................. 28

2.2.9. Xử lý số liệu và tính toán thống kê................................................................ 32
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 33


3.1. Kết quả phân tích biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô của bệnh
nhân UTĐTT...................................................................................................................... 33
3.1.1. Kết quả phân tích biến đổi của gen MMP-9 bằng kỹ thuật PCR-RFLP
33
3.1.2. Kết quả giải trình tự trực tiếp và nhân dòng................................................ 35
3.2. Kết quả phân tích biến đổi ADN của gen MMP-9 từ mẫu máu..................42
3.2.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen có chứa vị trí biến đổi của promoter gen
MMP-9.............................................................................................................................. 42
3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa biến đổi trong vùng promoter
gen MMP-9...................................................................................................................... 43
3.3. Phân tích mối liên hệ giữa biến đổi C-1562T với một số đặc điểm bệnh
học của bệnh nhân UTĐTT............................................................................................. 44
3.4. Phân tích biến đổi C-1562T ở bệnh nhân UTĐTT và người bình thường
50
KẾT LUẬN............................................................................................................................. 53
KIẾN NGHỊ............................................................................................................................ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................... 54


DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng ...........................................................................
Hình 2: Các giai đoạn bệnh UTĐTT ....................................................................
Hình 3: Cấu trúc các vùng của MMP .................................................................
Hình 4: Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR ...............................................
Hình 5: Vector plasmid pJET1.2 ........................................................................
Hình 6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR promoter gen MMP-9 từ ADN tổng số

tách từ mô .......................................................................................................
Hình 7: Hình ảnh điện di kết quả cắt enzyme sản phẩm PCR từ ADN tổng số của
mô ..................................................................................................................
Hình 8: Hình ảnh kết quả giải trình tự trực tiếp ..................................................
Hình 9: Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào E. Coli DH5α . 37
Hình 10: Hình ảnh điện di ADN plasmid được tách từ E.Coli DH5α .................
Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ plasmid và sản phẩm cắt bằng
enzyme giới hạn ..............................................................................................
Hình 12: Kết quả phân tích trình tự plasmid ......................................................
Hình 13: Kết quả so sánh trình tự mẫu không mang biến đổi với trình tự tham
khảo sử dụng chương trình BLAST ................................................................
Hình 14: Kết quả so sánh trình tự mẫu mang biến đổi với trình tự tham khảo sử
dụng chương trình BLAST .............................................................................
Hình 15: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ mẫu máu thường và bệnh .............
Hình 16: Hình ảnh cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR từ mẫu máu người bình
thường cho máu và mẫu máu bệnh nhân UTĐTT ............................................
Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RE mẫu mô u-mô lân cận u và mẫu
máu của cùng một bệnh nhân ..........................................................................
Hình 18: Biểu đồ phân bố biển đổi C-1562T theo vị trí mô ...............................
Hình 19: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo vị trí ung thư .........................
1


Hình 20:Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo độ tuổi............................................ 47
Hình 21: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo giai đoạn TNM............................ 48
Hình 22: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T ở bệnh nhân UTĐTT và người bình
thường................................................................................................................................... 50

2

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh
khác nhau................................................................................................................................ 9
Bảng 2: Bảng phân loại các nhóm trong họ MMP (ở người)...................................... 11
Bảng 3: Hoạt động và ảnh hưởng của họ MMP trong sự tiến triển của các giai
đoạn ung thư........................................................................................................................ 14
Bảng 4 : Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu................................................ 21
Bảng 5: Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.................................................... 22
Bảng 6: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR.................................... 25
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR.................................................................................. 25
Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI............................ 26
Bảng 9: Thành phần phản ứng tạo đầu bằng................................................................... 29
Bảng 10: Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector............................... 29
Bảng 11: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi MP9
31
Bảng 12: Thành phần mỗi phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi
pJet1.2................................................................................................................................... 31
Bảng 13: Phân bố biến đổi C-1562T của promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung
thư đại trực tràng theo một số đặc điểm bệnh học của bệnh.................................. 455
Bảng 14: Tần suất xuất hiện alen C và T trên đoạn ADN có chứa biến đổi của
promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo một số đặc điểm
bệnh học của bệnh.............................................................................................................. 49
Bảng 15: Tần suất xuất hiện các alen C và T trên đoạn ADN promoter của gen
MMP-9 ở mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT và mẫu máu của người bình thường
50
Bảng 16: Tần suất xuất hiện các alen C và T trên đoạn ADN promoter của gen
MMP-9 ở mẫu máu bệnh nhân UTĐTT và mẫu máu người bình thường.............51

3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

AFAP

Actin Filament Associated Protein

AJCC

Ủy ban ung thư Mỹ - American Joint Committee on Cancer

COPD

Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính - Chronic Obstructive Pulmonary
Disease

cs

Cộng sự

ECM

Chất nền ngoại bào - Extralcellular Matrix

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtBr

Ethidium Bromide

FAP

Đa polyp tuyến gia đình - Familial adenomatous polyposis

FOBT

Kiểm tra máu ẩn trong phân - Fecal occult blood test

FISH

Lai huỳnh quang tại chỗ - Fluorescence in situ hybridization

HNPCC

Ung thư đại trực tràng di truyền không đa polyp - Hereditary
Non-Polyposis Colorectal Cancer

MMP

Matrix Metalloproteinase

NK

Giết tự nhiên – Nature killer

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp - Polymerase Chain Reaction

RFLP

Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn - Restriction
Fragment Length Polymorphism

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TBE

Tris-Borate-EDTA

TGF

Yếu tố sinh trưởng kích thích chuyển dạng – Transforming
growth factor

TIMP

Tissue Inhibitor of Metalloproteinase

UTĐTT

Ung thư đại trực tràng

VEGF

Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu – Vascular Endothelial Growth Factor

4


MỞ ĐẦU
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là loại ung thư phổ biến đứng đầu trong
các loại ung thư đường tiêu hóa tại các nước trên thế giới. Tại Việt Nam và các
nước châu Á, UTĐTT xếp thứ tư ở nam giới (sau ung thư gan, phổi và dạ dày) và
thứ ba ở nữ giới (sau ung thư cổ tử cung và ung thư vú). Từ năm 2007 đến 2011,
ở Việt Nam, chỉ tính riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, đã ghi nhận 3557 ca mắc

bệnh mới UTĐTT (chiếm 10,74% tổng số ca mắc bệnh ung thư) [52].
UTĐTT là một trong những loại ung thư có độ ác tính rất cao đồng nghĩa
với tỷ lệ tử vong cao. Tại Mỹ, năm 2013 ghi nhận tới 142820 ca UTĐTT mới được
chẩn đoán, trong đó có 50830 ca có khả năng dẫn đến tử vong sớm (chiếm 35,59%
trường hợp mắc UTĐTT), năm 2014 thống kê có 136830 người mắc UTĐTT mới
và 50310 trường hợp tử vong (chiếm 36,77% trường hợp mắc UTĐTT) [53].
UTĐTT là kết quả của nhiều quá trình với những giai đoạn phức tạp biến
đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư liên quan tới các gen gây ung thư, các
gen ức chế khối u và vi môi trường khối u. Tương tác giữa mô đệm và biểu mô
đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của ung thư. Liên kết giữa các tế bào
ung thư ác tính với mô đệm xung quanh (nguyên bào sợi, tế bào nội mô và các tế
bào viêm) cũng là nền tảng cho sự phát triển và di căn ung thư. Ngoài các tế bào
mô đệm bên trong khối u, ECM (extracellular matrix – chất nền ngoại bào) cũng
có những tác động quan trọng đối với sự tiến triển ung thư. ECM được cấu tạo chủ
yếu bằng các sợi protein liên kết các cacbohydrat kết hợp cùng với một số chất vô

cơ và hữu cơ khác nhau. ECM thực hiện một loạt chức năng trong việc giúp các tế
bào liên kết với nhau tạo nên các mô nhất định và thu nhận thông tin. Tế bào ung
thư sẽ tác động vào ECM làm thay đổi cấu trúc của ECM, từ đó các tế bào ung thư
có thể dễ dàng di chuyển từ u nguyên phát sang các vị trí khác. Các protein của
ECM đóng vai trò quan trọng trong sự tăng sinh và di căn của tế bào ung thư, các
protease khác nhau điều khiển sự tu sửa cũng như phân giải ECM. Một nhóm cụ
thể của các protease là matrix metalloproteinase (MMP)
– enzyme phân giải protein có chứa kim loại đang ngày càng được nghiên cứu
rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam [18].
1


MMP-9 (92kDa collagenase loại IV, gelatinase B) là một thành viên họ
MMP, là protease liên quan chính đến sự suy thoái của ECM. Mức độ biểu hiện
của MMP-9 ở một loạt bệnh ung thư của người cao hơn so với những người khỏe
mạnh. Trong các tế bào u ác tính di căn, mức độ biểu hiện của MMP-9 cũng cao
hơn so với những dòng tế bào u ác tính chưa di căn. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng,
những biểu hiện quá mức của MMP-9 có đóng góp nhất định vào sự phát triển
cũng như tiến triển của ung thư đại trực tràng. Những biến đổi vùng promoter gen
MMP-9 mã hóa cho protein MMP-9 có thể làm thay đổi cấu trúc và chức năng
protein, do đó có thể tác động tới sự phát triển và di căn của tế bào ung thư [18].
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về những biến đổi vùng promoter gen MMP9 ở nhiều bệnh khác nhau trong đó có ung thư. Tuy nhiên ở Việt Nam đến nay
chưa có nghiên cứu nào về biến đổi vùng promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân
UTĐTT. Chính vì những lý do như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư
đại trực tràng”. Với mục đích:
- Xác định được biến đổi ADN trong vùng promoter thuộc gen MMP-9 ở

một nhóm bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.
- Đánh giá mối liên quan của những biến đổi ADN vùng promoter gen

MMP-9 với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt
Nam.
Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc
thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng
Ung thư là một loại bệnh liên quan tới sự tăng sinh về mặt số lượng một
cách nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể. Các
tế bào bất thường này có thể xâm nhập vào các mô lân cận hoặc di chuyển đến các
mô ở vị trí xa bằng cách xâm nhập vào mạch máu hoặc hệ bạch huyết. Chúng sẽ
tập trung lại và tiêu diệt các tế bào bình thường dẫn đến suy thoái chức năng của
các bộ phận mà chúng tiến đến [55].
1.1.1. Ung thư đại trực tràng
Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) thường xảy ra tại các mô đại tràng (phần
dài nhất của ruột già) hoặc trực tràng (vài inch cuối cùng của ruột già trước hậu
môn). Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao gồm đại tràng lên (ascending
colon), đại tràng ngang (transverse colon) và đại tràng xuống (descending colon).
Trực tràng (rectum) là phần ruột thẳng để chứa phân, nối giữa đại tràng và hậu
môn (Hình 1). Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng,
thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thư nào
xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thường được gọi chung là ung thư đại
trực tràng [53].

Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng [56]

3


1.1.2. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến UTĐTT liên quan đến sự biến đổi bệnh
học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống kê các tài liệu
tổng quan cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này là:
1.1.2.1. Yếu tố di truyền
- Sai hỏng trong gen: Các tế bào có thể tăng sinh không kiểm soát nếu có

sai hỏng ADN. Đặc biệt nếu sự sai hỏng này làm tổn thương tới các gen liên quan
đến quá trình phân chia tế bào. Như bốn nhóm gen chính chịu trách nhiệm cho quá
trình phân chia tế bào: Các gen gây ung thý oncogenes; các gen ức chế khối u nhý
p21, p53; các gen kiểm soát quá trình apoptosis và nhóm các gen sửa chữa ADN.
Ung thý xảy ra khi tế bào có ðột biến gen làm cho tế bào không thể tự sửa chữa
ADN bị tổn thýõng vì vậy không thể ði vào quá trình chết theo chu trình. Bên cạnh
các ðột biến ở gen phân chia tế bào, ung thý còn là kết quả của các ðột biến gen
gây ung thý và quá trình ức chế gen ức chế khối u, dẫn ðến sự tãng sinh tế bào
không ðýợc kiểm soát [54].
- Di truyền theo gia ðình: Khoảng 20% UTÐTT ðýợc cho là gây ra bởi ðột

biến gen di truyền. Hội chứng di truyền có liên quan ðến UTÐTT bao gồm: FAP
(đa polyp tuyến gia đình), AFAP là một kiểu nhẹ hơn FAP và HNPCC (UTĐTT di
truyền không do polyp). Những biến đổi này đa phần dẫn đến ung thư ở độ tuổi
còn rất trẻ [53].
- Ngoài ra còn có yếu tố dân tộc: Người Do Thái, người Mỹ gốc Phi có

nguy cơ mắc bệnh UTĐTT cao hơn các dân tộc khác [3].
1.1.2.2. Yếu tố không di truyền

- Chế độ dinh dưỡng: Các loại thịt đỏ (thịt bò, thịt cừu) và các loại thịt chế

biến (xúc xích, thịt hun khói, đồ hộp) có thể làm tăng nguy cơ ung thư đại trực
tràng. Nấu thịt ở nhiệt độ rất cao (chiên, nướng) có thể tạo ra các hóa chất độc hại
làm tăng nguy cơ ung thư. Còn chế độ ăn rau, trái cây và ngũ cốc nguyên hạt có
thể làm giảm nguy cơ ung thư đại trực tràng [32].
- Vận động: Thói quen lười vận động có thể làm tăng nguy cơ ung thư [15,

26, 36].

4


- Thừa cân: Tình trạng rất thừa cân, béo phì làm tăng nguy cơ của việc mắc

và tử vong vì ung thư đại trực tràng [15].
- Hút thuốc: Những người hút thuốc trong thời gian dài cũng có nguy cơ bị

ung thư đại trực tràng cao hơn những người không hút thuốc. Hút thuốc cũng làm
tăng nguy cơ của nhiều loại ung thư khác [33].
- Sử dụng rượu: Người sử dụng nhiều rượu có khả năng mắc UTĐTT cao

hơn những người không hoặc rất ít khi sử dụng rượu. Khoảng 15% các trường hợp
mắc UTĐTT là do sử dụng quá nhiều rượu [29].
- Bệnh tật: Những người có tiền sử mắc các bệnh đường ruột như viêm

ruột, viêm loét đại tràng; bệnh Crohn và đái tháo đường loại 2 cũng có nguy cơ
mắc bệnh UTĐTT cao hơn người bình thường. Trong các bệnh này, đại tràng
thường bị viêm trong một thời gian dài [11, 50].
1.1.3. Chẩn đoán và điều trị bệnh

Xét nghiệm sàng lọc hay chẩn đoán có thể tìm thấy các polyp hoặc ung thư
trước khi chúng phát triển. Phát hiện sớm rất có ý nghĩa bởi các bác sỹ sẽ lựa chọn
được những phương pháp phù hợp cho từng bệnh nhân, từng giai đoạn bệnh, giúp
quá trình điều trị bệnh hiệu quả hơn [52].
Chẩn đoán
Thăm khám trực tràng: Phương pháp này chỉ phát hiện được không quá
10% trường hợp UTĐTT.
Chụp hình đại tràng với chất cản quang: Phương pháp này dùng thuốc xổ
cùng với dung dịch có tính cản quang (barium) sẽ được tiêm vào trong ruột già
thông qua đường hậu môn khi đó hình ảnh của ruột già được hiển thị trên phim khi
chụp X-quang.
Xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân (FOBT): Sử dụng xét nghiệm này để
xem máu có ẩn trong phân không vì mắt thường không nhìn thấy được.
Xét nghiệm ADN phân: Để tìm kiếm các tế bào UTĐTT hoặc polyp tiền ung
thư.
Nội soi đại trực tràng: Sử dụng ống mỏng, dễ uốn nắn có kết nối với video
camera được đưa vào hậu môn, qua trực tràng và cho phép bác sỹ quan sát

5


toàn bộ đại tràng. Ngoài ra, ống soi này còn có tác dụng để cắt bỏ các khối polyp
và ung thư trong khi làm xét nghiệm.
Chụp cắt lớp ruột già: Sử dụng kỹ thuật cắt lớp điện toán để chụp ảnh của
ruột già. Các hình ảnh sẽ được kết hợp trên máy tính để giúp bác sỹ tìm kiếm
polyp hoặc ung thư.
Soi đại tràng Sigma: Cho phép nhìn thấy những khối u khi chúng còn rất
nhỏ, trước cả khi chúng bị phát hiện bằng xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân. Tuy
nhiên, soi đại tràng Sigma có thể bỏ sót các khối u ở phần trên của ruột già.
Chẩn đoán bằng mô học và tế bào học: Phương pháp này cho phép phân

biệt giữa các tế bào bình thường, loạn sản và ung thư biểu mô tại chỗ. Phương
pháp này được coi là chuẩn vàng trong việc xác định UTĐTT, có ý nghĩa rất lớn
trong tiên lượng và điều trị bệnh.
Chẩn đoán phân tử: Đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm và
giúp các bác sỹ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp. Hiện nay, chẩn đoán phân tử
thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến: PCR, Realtime PCR, FISH… có
thể phát hiện những bất thường ở các gen một cách chính xác.
Điều trị
Phẫu thuật UTĐTT: Phẫu thuật cắt đại tràng là phương pháp duy nhất điều
trị ung thư đại tràng ở giai đoạn sớm. Phương pháp phẫu thuật đại tràng qua nội soi
cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân một thời gian ngắn sau mổ (ít đau)
nhưng kết quả lâu dài của cắt đại tràng qua nội soi so với mổ mở thì vẫn trong giai
đoạn nghiên cứu. Trong hầu hết các trường hợp, bác sỹ sẽ phải nối lại những phần
còn lành của đại tràng. Khi không thể nối lại những phần còn lành, cần phải thực
hiện phẫu thuật mở thông đại tràng tạm thời hoặc vĩnh viễn. Khoảng 15% bệnh
nhân ung thư đại tràng cần phải mở thông đại tràng vĩnh viễn.
Hóa trị UTĐTT: Hóa trị liệu là phương pháp sử dụng thuốc chống ung thư
để tiêu diệt tế bào ung thư. Hóa trị liệu có thể được sử dụng để tiêu diệt tất cả
những tế bào ung thư còn sót lại trong cơ thể sau phẫu thuật, để kiểm soát sự phát
triển của khối u hoặc để giảm bớt triệu chứng của bệnh. Nhược điểm của phương
pháp này là không chỉ nhằm vào các tế bào bệnh mà còn làm tổn thương đến mô,
tế bào lành như tế bào tủy xương.
6


Xạ trị UTĐTT: Xạ trị còn được gọi là phương pháp phóng xạ, sử dụng tia X
có năng lượng cao để tiêu diệt tế bào ung thư. Hạn chế của phương pháp này là
không áp dụng được khi ung thư đã lan ra toàn cơ thể. Biến chứng của phương
pháp này nhiều khi khá trầm trọng ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh,
gây tổn thương các mô lành, làm cho mô bị chai cứng.

1.1.4. Các giai đoạn của UTĐTT
Hiện nay có hai hệ thống phân chia giai đoạn ung thư [53]:
Hệ thống phân loại Dukes: Được bác sĩ Dukes người Anh đưa ra vào năm
1932 và chỉ dành riêng cho UTĐTT.
-

Dukes A: Ung thư chỉ ở lớp trong cùng của đại tràng hoặc trực tràng. Tỷ
lệ điều trị khỏi là khoảng 90%.

-

Dukes B: Ung thư đã phát triển thông qua lớp cơ của đại tràng hoặc trực
tràng. Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 70%.

-

Dukes C: Ung thư đã lan rộng đến ít nhất một hạch bạch huyết ở khu
vực gần đường ruột. Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 30%.

-

Dukes D: Ung thư đã lan đến một nơi khác trong cơ thể như gan, phổi.
Hiệu quả điều trị không cao, ở giai đoạn này ít được can thiệp phẫu
thuật mà đa số sử dụng các biện pháp mang tính tác động toàn thân
như hóa trị, sử dụng tế bào miễn dịch.

Hệ thống phân chia TNM: Được Ủy ban ung thư Hoa Kỳ (AJCC) và Hiệp
hội chống ung thư quốc tế (UICC) thông qua năm 1974. Sử dụng chung cho nhiều
loại ung thư dựa vào 3 tiêu chí chính: Kích thước khối u, hạch lympho và sự di căn
của khối u (bảng 1). Áp dụng cụ thể cho UTĐTT như sau:

T (Tumor): Cho biết kích cỡ mức độ lan sâu vào thành ruột
-

Tx: Không có mô tả do không đầy đủ thông tin.

-

Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ, khối u chỉ ảnh hưởng đến lớp niêm mạc.

-

T1: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp niêm mạc – cơ và xâm lấn đến
lớp dưới niêm mạc.

-

T2: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp dưới niêm mạc, xâm lấn đến
lớp cơ.

7


-

T3: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp cơ và xâm lấn đến các lớp
ngoài cùng của đại tràng nhưng chưa xuyên thủng qua thanh mạc, khối
u chưa ăn lan đến các cơ quan và mô lân cận.

-

T4a: Ung thư đã phát triển xuyên qua thanh mạc.

-

T4b: Ung thư đã phát triển xuyên qua thành ðại tràng, dính chặt hoặc
xâm lấn các mô và cõ quan kề cận.

N (Lympho node): Cho biết khối u đã lan đến các hạch bạch huyết và số
lượng hạch.
-

Nx: Không có mô tả về liên quan đến hạch bạch huyết do thông tin
không đầy đủ.

-

N0: Không có ung thư ở các hạch bạch huyết kề cận.

-

N1a: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 1 hạch bạch huyết kề cận.

-

N1b: Tế bào ung thư được tìm thấy trong 2 – 3 hạch bạch huyết kề cận.

-

N1c: Tìm thấy các tập hợp tế bào ung thư nhỏ ở vùng mỡ gần các hạch
bạch huyết, nhưng chưa có ở các hạch bạch huyết.

N2a: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 4 – 6 hạch bạch huyết kề cận.

-

N2b: Tìm thấy tế bào ung thư trong từ 7 hạch bạch huyết kề cận trở
lên.

- M0: Không có di căn xa.
- M1a: Ung thư đã lan đến cơ quan ở xa hoặc một nhóm hạch bạch huyết ở

xa.
- M1b: Ung thư đã lan rộng đến từ 1 cơ quan xa trở lên hoặc một nhóm các

hạch bạch huyết ở xa, hoặc đã lan tràn đến các phần phúc mạc ở xa.
-

Giai ðoạn 0: Ung thý chỉ ðýợc tìm thấy ở lớp niêm mạc trong cùng của
ðại tràng hoặc trực tràng. Ung thý biểu mô tại chỗ là một tên khác cho
UTÐTT giai ðoạn này.

-

Giai ðoạn I: Khối u ðã phát triển vào thành trong của ðại tràng hoặc trực
tràng. Khối u chýa phát triển výợt qua thành.
8


-

Giai ðoạn II: Khối u phát triển sâu hõn vào trong hoặc xuyên qua thành

ðại tràng hoặc trực tràng. Nó có thể ðã xâm lấn các mô lân cận nhýng
các tế bào ung thý chýa lây lan ðến các hạch bạch huyết.

-

Giai ðoạn III: Ung thý ðã lan ðến các hạch bạch huyết gần ðó nhýng
chýa ðến các bộ phận khác của cõ thể.

-

Giai ðoạn IV: Ung thý ðã lan ra các bộ phận khác của cõ thể, chẳng hạn
nhý gan hoặc phổi (hình 2).

Hình 2: Các giai đoạn bệnh UTĐTT [52]
Bảng 1: Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau

Giai đoạn
Giai đoạn 0
Giai đoạn I
Giai đoạn II A
Giai đoạn II B
Giai đoạn III A
Giai đoạn III B
Giai đoạn III C
Giai đoạn IV


9

1.2. Matrix Metalloproteases (MMP)
1.2.1. Khái quát chung về họ Matrix Metalloprotease (MMPs)
Họ MMP là một họ enzyme có nhiều chức năng trong cơ thể sống, có khả
năng phân giải các protein của chất nền ngoại bào như collagen màng nền hay lớp
gian bào, proteoglycan, fibronectin, laminin, do đó chúng liên quan đến quy trình
tái tạo mô, quá trình phát triển phôi, mang thai, tăng trưởng và quá trình hồi phục,
chữa lành vết thương [40, 5]. Hoạt động của các MMP được kiểm soát bởi các chất
ức chế mô đặc hiệu TIMP (Tissue Inhibitors of Mettaloproteinase) hoặc các chất
ức chế mô không đặc hiệu cụ thể α2-macroglobulin. Sự phá vỡ cân bằng MMPTIMP có thể dẫn tới trạng thái bệnh lý như dạng thấp khớp, viêm xương khớp, xơ
vữa động mạch, tăng sinh khối u, di căn và chứng xơ hóa [5, 44].
Các MMP có thể được tự tổng hợp như một nội tiết tố hoặc được chuyển
đến từ ngoài màng dưới dạng proenzyme và quá trình hoạt động của chúng sẽ
được kích hoạt khi loại bỏ đầu N của một propeptide. Để giữ cho các enzyme này
ở dạng nghỉ, các phân tử Zn

2+

phải liên kết với một gốc cysteine tại trung tâm hoạt

động của enzyme. Liên kết này bị ảnh hưởng bởi một số tác nhân như tác nhân
chaotropic, sự phân cắt của các propeptide của các thành viên trong họ MMP hoặc
bởi các protease khác. Khi liên kết này bị phá vỡ, các MMP sẽ được hoạt hóa và
thực hiện một số chức năng của chúng trong cơ thể sống [45]. Họ MMP bắt đầu
đươc biết đến từ nghiên cứu của Gross và Lapière vào năm 1962, khi họ nghiên
cứu về những mảnh đuôi nòng nọc cấy trên môi trường gel có bổ sung collagen,
nhận thấy một loại enzyme đã phân giải collagen trong môi trường nuôi cấy. Điều
đó cho thấy trong thời gian biến thái, ở đuôi nòng nọc xuất hiện một loại protease
có khả năng phân giải collagen [46].
Hiện nay có tất cả 26 enzyme thuộc họ MMP (bảng 2) đã được tìm thấy và
chia thành 6 nhóm dựa vào cơ chất mà nó có thể phân giải, với vùng peptide có

chức năng và trình tự tương đồng [39]. Tuy nhiên không phải MMP nào cũng được
phát hiện ở người, ví dụ như MMP-18 chỉ được phát hiện ở loài Xenopus.

10


Bảng 2: Bảng phân loại các nhóm trong họ MMP (ở người) [40]
Nhóm

Collagenases

Gelatinases

Stromelysins

Matrilysins

MT-MMP

Các loại khác


Cấu trúc chung của một MMP thường bao gồm: Một propeptit khoảng 80
axit amin, vùng chức năng xúc tác của MMP khoảng 170 axit amin, liên kết peptit
có chiều dài biến động (còn được gọi là hinge region) và một vùng chức năng
hemopexin (Hpx) khoảng 200 axit amin (hình 3).
11


Hình 3: Cấu trúc các vùng của MMP [44]

1.2.2. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase
1.2.2.1. Vai trò của họ MMP đối với các quá trình trong cơ thể sống
Họ MMP tham gia vào rất nhiều quá trình trong cơ thể, cụ thể bao gồm:
Di cư tế bào: Sự hiện diện của các chất nền ngoại bào là chướng ngại cho
quá trình di cư của tế bào. Những tế bào bám trên chất nền ngoại bào khi muốn
chuyển từ vị trí này sang vị trí khác phải thay đổi từ kiểu bám dính sang kiểu di
động. Sự thay đổi yêu cầu cần một số quá trình: Sự hoạt hóa chức năng vận động
của khung tế bào, sự phân hóa thuận nghịch tại các vị trí bám dính, các phân tử
bám dính trên bề mặt tế bào cung cấp sức kéo dãn, tháo dỡ của chất nền ngoại bào
để phá vỡ các rào cản vật lý và sự hiện diện của chất dẫn dụ hóa học sẽ định hướng
cho tế bào di cư. Họ MMP tham gia vào tất cả các giai đoạn của quá trình này.
Fisher cùng cs năm 1994, Hiraoka cùng cs năm 1998 đều đã phát hiện thấy trong
mạch, các tế bào nội mô di cư vào ECM xung quanh, còn trong môi trường nuôi
cấy, sự di cư của các tế bào nội mô xuyên qua collagen và fibrin gel bị suy
12


yếu bởi chất ức chế MMP [13, 17]. Năm 1998, Sato và cs cho rằng: Trong thời
gian tu sửa xương, tế bào hủy xương được phục hồi trên bề mặt xương và sự di cư
của chúng cũng có thể bị phụ thuộc vào MMP. Điều đó đã được chứng minh khi
quan sát các tế bào xương trong môi trường nuôi cấy, nhận thấy rằng các chất ức
chế MMP kìm hãm sự di cư của các tế bào hủy xương qua chất nền collagen [37].
Sự tăng sinh và chết theo chu trình của tế bào: Mặc dù những nghiên cứu về
vai trò của MMP đối với tập tính của tế bào trong nuôi cấy còn rất ít nhưng các nhà
khoa học đã nhận thấy có sự ảnh hưởng của chúng đối với sự sinh sôi và tồn tại
của tế bào. Năm 2000, Uzui và cs nhận thấy: Trong môi trường nuôi cấy, chất ức
chế của MMP hoặc chất ức chế hóa học hay một kháng thể trung hòa có thể ảnh
hưởng đến MMP-2 làm giảm đáp ứng với tín hiệu phân chia của các tế bào cơ trơn
mạch máu đến các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet Derived

Growth Factor - PDGF). Sự ảnh hưởng của các MMP có thể là tiêu cực hay tích
cực phụ thuộc vào các tín hiệu sinh tồn được tạo ra bởi các sự kiện cụ thể đi kèm.
Những sự khác biệt trong tác động của MMP được phản ánh thông qua cơ chất của
nó trong mỗi phản ứng [42].
Quá trình hình thành hình thái mô: Brown và cs năm 1997 đã ghi nhận: Khi
các tế bào mỡ được cấy trên màng đáy, chúng di chuyển và tổ chức thành các cụm
đa bào lớn. Khi di chuyển đến một diện tích nhất định, những tế bào này tiết ra
MMP-2. Hoạt động của MMP-2 ức chế sự di cư tế bào và giúp các tế bào tổ chức
thành cấu trúc ba chiều [7]. Ngoài ra, năm 1998, nghiên cứu của Fukuda và cs đã
cho thấy: Sự ức chế hoạt động của các MMP ở thận sẽ thúc đẩy sự phân nhánh,
còn ở tuyến nước bọt thì kìm hãm sự phân nhánh [14]. Như vậy, MMP đóng một
số vai trò khác nhau như: Thay đổi ECM, cho phép sự xâm lấn, lựa chọn các điểm
phân nhánh, tổ chức điều tiết ba chiều, điều tiết quá trình chuyển đổi từ biểu mô
tới trung mô.
Điều khiển các phân tử mang hoạt tính sinh học: Hoạt động của MMP có
thể dẫn đến sự hoạt hóa hay bất hoạt của các phân tử mang hoạt tính sinh học.
1.2.2.2. Vai trò của họ MMP trong sự tiến triển loại ung thư

13


Nghiên cứu ung thư cơ bản hiện nay phần lớn tập trung vào các đột biến
gen. Tuy nhiên, chất nền ngoại bào của khối u và các tế bào lân cận khối u, các tế
bào soma cũng có những ảnh hưởng nhất định trong sự tiến triển khối u. Khi đi sâu
nghiên cứu, các nhà khoa học nhận thấy rằng các MMP có thể thay đổi vi môi
trường xung quanh khối u và biểu hiện của các MMP ở các mô ung thư tăng cao
hơn so với ở mô bình thường.
Sáu dấu hiệu cơ bản trong sinh lý học tế bào làm nền tảng cho ung thư đó
là: Tự tạo ra các tín hiệu tăng trưởng, không đáp ứng các tín hiệu ức chế tăng
trưởng, thoát khỏi quá trình chết theo chương trình (apoptosis), sự nhân rộng

không giới hạn, phát triển hệ mạch máu một cách bền vững, cuối cùng là cuộc xâm
lấn mô và di căn (bảng 3). Trước đây, các nhà khoa học chỉ tìm thấy ảnh hưởng
của các MMP trong giai đoạn xâm lấn và di căn. Nhưng những nghiên cứu gần đây
thì lại cho thấy rằng MMP cũng tham gia vào một số giai đoạn của quá trình phát
triển ung thư [16].
Bảng 3: Hoạt động và ảnh hưởng của họ MMP trong sự tiến triển của các giai
đoạn ung thư [16]
MMP
Sự xâm lấn của các tế bào ung
Một số MMP như MMP-2 và
MMP-9
Sự tăng sinh của các tế bào ung thư
MMP-1, -2, -3, -7, -9, -11, -19

MMP-3, -7

MMP-9, -2, -14
MMP-7
Chết theo chương trình của tế
MMP-7
Một số MMPs