Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------o0o---------------

NGUYỄN LƯU VĨNH KHANG

TRÍCH LY FLAVONOID TỪ LÁ CÂY HOÀN NGỌC TRẮNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SIÊU ÂM VÀ THỬ NGHIỆM
HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO TRÍCH
(Extraction of flavonoids from Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk. leaves
by ultrasonic-assisted extraction method and investigation of antibacterial activity)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC
Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2019


Cơng trình được hồn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Minh Nam……………………………….
TS. Nguyễn Hữu Hiếu……………………………...
Cán bộ chấm nhận xét 1: .……………………………..……
Cán bộ chấm nhận xét 2: …………………………………..
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM
Tp. HCM, ngày tháng năm 2019
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. ……………………………………………. – Chủ tịch
2. ……………………………………………. – Ủy viên phản biện 1
3. ……………………………………………. – Ủy viên phản biện 2

4. ……………………………………………. – Ủy viên
5. ……………………………………………. – Thư kí
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

………………………………….

……………………………………

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN LƯU VĨNH KHANG
Ngày, tháng, năm sinh: 16/08/1993

MSHV: 1770139

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh

Mã số: 60520301

I. TÊN ĐỀ TÀI:
Tên tiếng Việt: “Trích ly flavonoid từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ trợ
siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích”
Tên tiếng Anh: “Extraction of flavonoids from Pseuderanthemum palatiferum
(Nees) Radlk. leaves by ultrasonic-assisted extraction method and investigation of
antibacterial activity”
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
2.1. Tổng quan: cây hoàn ngọc trắng, flavonoid, hoạt tính của lá hồn ngọc trắng,
phương pháp trích ly hỗ trợ siêu âm, phương pháp định lượng flavonoid, phương pháp thử
nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích, quy hoạch thực nghiệm.
2.2. Thực nghiệm
 Trích ly flavonoid (quercetin và kaempferol) từ lá hoàn ngọc trắng bằng phương
pháp hỗ trợ siêu âm.
 Khảo sát ảnh hưởng của từng điều kiện đến hàm lượng quercetin và kaempferol bao
gồm: nồng độ etanol, thời gian siêu âm, nhiệt độ trích ly và công suất siêu âm.
 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời ba điều kiện nồng độ etanol, thời gian siêu âm và
nhiệt độ trích ly đến hàm lượng quercetin và kaempferol bằng quy hoạch thực nghiệm theo
phương pháp tâm xoay bậc hai với mơ hình Box-Wilson.
 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 07/2018
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 07/2019
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.HOÀNG MINH NAM, TS. NGUYỄN HỮU HIẾU
Tp. HCM, ngày … tháng… năm 2019
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PTN TĐ ĐHQG-HCM
CNHH & DK

TS. HOÀNG MINH NAM

TS. NGUYỄN HỮU HIẾU

TS. NGUYỄN HỮU HIẾU

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS. TS PHAN THANH SƠN NAM
ii


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi để tác giả
thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô trong khoa Kỹ thuật Hóa học,
Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tác giả và tạo điều kiện
thuận lợi cho tác giả trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến hai thầy TS. Hoàng Minh Nam và TS. Nguyễn Hữu
Hiếu đã tận tình hướng dẫn tác giả hồn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến tập thể nghiên cứu viên ở Phịng thí nghiệm Trọng
điểm ĐHQG-HCM Cơng nghệ hóa học và Dầu khí (CEPP) đã tạo điều kiện thuận lợi để
tác giả hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và quý anh chị Trung tâm
Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 (QUATEST 3) đã tạo điều kiện thuận lợi
và hỗ trợ tác giả trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Tháng 07 năm 2019
Tác giả
Nguyễn Lưu Vĩnh Khang

iii


TÓM TẮT
Trong luận văn này, hoạt chất flavonoid (quercetin và kaempferol) được trích ly từ lá
hồn ngọc trắng bằng phương pháp sử dụng dung mơi etanol có hỗ trợ siêu âm. Hàm
lượng quercetin và kaempferol trong cao trích được xác định bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography - HPLC).
Ảnh hưởng của từng điều kiện trích ly như nồng độ etanol (%), thời gian siêu âm
(phút), nhiệt độ trích ly (oC) và cơng suất siêu âm (W) đến hàm lượng quercetin và
kaempferol được khảo sát bằng phương pháp luân phiên từng biến để chọn ra ba điều
kiện ảnh hưởng nhất. Sau đó, tiến hành khảo sát đồng thời ba điều kiện này như nồng
độ etanol, thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly bằng phương pháp tâm xoay bậc hai với
mơ hình Box – Wilson. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Design Expert 11.0 để tìm
điều kiện trích ly cho hàm lượng quercetin và kaempferol cao nhất. Đồng thời phương
pháp trích ly khơng có sự hỗ trợ của sóng siêu âm cũng được thực hiện để đối chứng.
Cao trích có hàm lượng quercetin và kaempferol cao nhất được thử hoạt tính kháng
khuẩn để xác định nồng độ ức chế tối thiểu trên hai vi khuẩn: Streptococcus agalactiae
và Edwardsiella ictaluri.

iv


ABSTRACT
In this assay, flavonoid (quercetin and kaempferol) is extracted from the
Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk. (P. palatiferum) leaves by using ethanol
solvent and ultrasound-assisted method. The contents of quercetin and kaempferol were
determined by high-performance liquid chromatography method.
Effects of extraction conditions as ethanol concentration (%), ultrasonic time (min),
extraction temperature (oC) and the ultrasonic power (W) on quercetin and kaempferol

contents in the extract, which were investigated by alternate each variable method to
choose the three most influential factor. Then, carry out a survey of the simultaneous
effects of three factors such as ethanol concentration (%), ultrasonic time (min),
extraction temperature (oC) by a quadratic rotation method with the Box - Wilson model.
Data are processed with Design Expert 11.0 software to find extraction conditions for
the highest quercetin and kaempferol content. At the same time, the check sample
extracted with the above conditions but without ultrasonic support was also tested to
compare with the extraction sample in suitable conditions.
Extract with the highest concentration of quercetin and kaempferol tested for
antibacterial activity to determine the minimum inhibitory concentration for
Streptococcus agalactiae and Edwardsiella ictaluri.

v


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan luận văn này là cơng trình nghiên cứu của cá nhân tác giả và
được thực hiện dưới sự hướng dẫn của hai thầy TS. Hồng Minh Nam và TS. Nguyễn
Hữu Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Cơng nghệ Hóa học và Dầu
khí (CEPP), Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM.
Số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hồn tồn trung thực.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2019
Tác giả
Nguyễn Lưu Vĩnh Khang

vi


MỤC LỤC
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ .............................................................................ii

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. iii
TÓM TẮT ..................................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................................... v
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... vi
MỤC LỤC ....................................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... xi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................xii
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Cây hoàn ngọc trắng .............................................................................................. 2
1.1.1. Phân loại khoa học và khu vực phân bố ....................................................... 2
1.1.2. Mô tả thực vật ............................................................................................... 2
1.1.3. Thành phần hố học của lá cây HNT ........................................................... 3
1.1.4. Cơng dụng ..................................................................................................... 5
1.1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước .................................................. 6
1.2. Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản .................................................................................. 7
1.2.1. Tình hình chung ............................................................................................ 7
1.2.2. Vi khuẩn Streptococcus agalactiae ............................................................... 8
1.2.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ..................................................................... 9
1.2.4. Kháng khuẩn ............................................................................................... 11
1.3. Các phương pháp trích ly .................................................................................... 11
1.3.1. Phương pháp trích ly truyền thống ............................................................. 11
1.3.2. Phương pháp trích ly hiện đại .................................................................... 12
1.4. Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu và tính mới của
luận văn ............................................................................................................................... 17
1.4.1. Tính cấp thiết .............................................................................................. 17
1.4.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 18
1.4.3. Nội dung ...................................................................................................... 18
vii

1.4.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 18
1.4.5. Tính mới của luận văn ................................................................................ 24
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM.................................................................................. 25
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị - dụng cụ và địa điểm thực hiện ...................... 25
2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................................. 25
2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................... 25
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ ......................................................................................... 26
2.1.4. Địa điểm thực hiện ...................................................................................... 27
2.2. Thí nghiệm............................................................................................................. 27
2.2.1. Khảo sát quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT ................. 27
2.2.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao trích ........................................... 33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................................. 36
3.1. Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng quercetin và kaempferol .. 36
3.1.1. Ảnh hưởng của từng điều kiện .................................................................... 36
3.1.2. Ảnh hưởng đồng thời các điều kiện ............................................................ 40
3.1.3. Kiểm chứng mơ hình ................................................................................... 54
3.2. Hoạt tính kháng khuẩn của cao trích ................................................................. 56
3.2.1. Đối với S. agalactiae .................................................................................. 56
3.2.2. Đối với E. ictaluri ....................................................................................... 58
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ........................................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ

viii


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Lá và rễ cây hồn ngọc trắng........................................................................... 3
Hình 1.2: Cơng thức hóa học của (a) flavone, (b) isoflavonoid và (c) neoflavonoid ..... 4
Hình 1.3: Cơng thức hóa học của quercetin .................................................................... 4
Hình 1.4: Cơng thức hóa học của kaempferol ................................................................. 5
Hình 1.5: Vi khuẩn S. agalactiae .................................................................................... 8
Hình 1.6: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn S. Agalactiae gây bệnh trên cá diêu hồng .......... 9
Hình 1.7: Vi khuẩn E. ictaluri ......................................................................................... 9
Hình 1.8: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá da trơn .................. 10
Hình 1.9: Nhóm OH kháng khuẩn của hoạt chất quercetin và kaempferol .................. 11
Hình 1.10: Phổ điện từ ................................................................................................... 12
Hình 1.11: Một số loại enzyme thơng dụng ................................................................. 13
Hình 1.12: Giản đồ áp suất – nhiệt độ của CO2............................................................. 14
Hình 1.13: Tần số của âm thanh .................................................................................... 15
Hình 1.14: Mơ hình tâm xoay bậc hai ........................................................................... 19
Hình 1.15: Sơ đồ nguyên lý máy HPLC ........................................................................ 21
Hình 1.16: Cách đo đường kính vịng kháng khuẩn ...................................................... 23
Hình 2.1: Lá HNT đã sấy khơ và xay nhuyễn ............................................................... 25
Hình 2.2: (a) Bể siêu âm, (b) Máy HPLC-30 Nexera.................................................... 26
Hình 2.3: Quy trình trích ly quercetin và kaempferol từ lá HNT .................................. 27
Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH ...................................................................... 36
Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm .................................................................. 37
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly .................................................................... 38
Hình 3.4: Ảnh hưởng của cơng suất siêu âm ................................................................. 39
Hình 3.5: Hàm lượng quercetin từ số liệu thực nghiệm và dự đốn ............................. 43
Hình 3.6: Sự ảnh hưởng đồng thời của ba điều kiện khảo sát ....................................... 44
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH và thời gian siêu âm đến .............................. 45
hàm lượng quercetin ...................................................................................................... 45
Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly đến............................ 46
hàm lượng quercetin ...................................................................................................... 46
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và nồng độ EtOH đến ................................ 47

ix


hàm lượng quercetin ...................................................................................................... 47
Hình 3.10: Hàm lượng kaempferol từ số liệu thực nghiệm và dự đốn ........................ 50
Hình 3.11: Sự tác động của ba điều kiện khảo sát......................................................... 51
Hình 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ EtOH và thời gian siêu âm đến ............................ 52
hàm lượng kaempferol ................................................................................................... 52
Hình 3.13: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm và nhiệt độ trích ly đến.......................... 53
hàm lượng kaempferol ................................................................................................... 53
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly và nồng độ EtOH đến .............................. 54
hàm lượng kaempferol ................................................................................................... 54
Hình 3.15: Hoạt tính kháng khuẩn S. agalactiae của cao trích HNT ............................ 56
Hình 3.16: Kết quả kháng khuẩn S. agalactiae bằng kỹ thuật pha lỗng tới hạn của cao
trích HNT ....................................................................................................................... 57
Hình 3.17: Hoạt tính kháng khuẩn E. ictaluri của cao trích HNT ................................ 58
Hình 3.18: Kết quả kháng khuẩn E. ictaluri bằng kỹ thuật pha lỗng tới hạn của cao
trích HNT ....................................................................................................................... 59

x


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Chuẩn và hoá chất sử dụng ...........................................................................25
Bảng 2.2: Thiết bị, dụng cụ sử dụng .............................................................................26
Bảng 2.3: Thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH .............................................................28
Bảng 2.4: Thí nghiệm khảo sát thời gian siêu âm .........................................................29
Bảng 2.5: Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ trích ly ...........................................................30
Bảng 2.6: Thí nghiệm khảo sát công suất siêu âm ........................................................30
Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình Box-Wilson ............................................31

Bảng 2.8: Chuẩn bị chất chuẩn làm việc .......................................................................33
Bảng 2.9: Nồng độ dịch trích pha lỗng ........................................................................35
Bảng 3.1: Khoảng biến thiên .........................................................................................40
Bảng 3.2: Mức thí nghiệm .............................................................................................40
Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mơ hình Box-Wilson đối với quercetin ....41
Bảng 3.4: Kết quả phân tích ANOVA đối với quercetin ..............................................42
Bảng 3.5: Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm .......................43
Bảng 3.6: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mơ hình Box-Wilson đối với kaempferol 48
Bảng 3.7: Kết quả phân tích ANOVA đối với kaempferol ...........................................49
Bảng 3.8: Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm .......................50
Bảng 3.9: Điều kiện hiệu chỉnh từ mơ hình...................................................................55
Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng mơ hình ......................................................................55

xi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ANOVA

Analysis of variation

Phân tích phương sai

DAD

Diode-Array Detector

Đầu dị dãy diode

DMSO

Dimethylsulfoxide

Dimetyl sulfoxit

HPLC

FAO
MIC

High-performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Food and Agriculture Organization of

Tổ chức Lương thực và

The United Nations

Nông nghiệp Liên Hợp Quốc

Minimal Inhibitory Concentration

xii

Nồng độ ức chế tối thiểu


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trên thị trường thủy sản hiện nay sản phẩm cá diêu hồng và da trơn xuất khẩu của
Việt Nam đã được xuất sang nhiều quốc gia trên thế giới. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất
khẩu Thủy sản Việt Nam, các sản phẩm cá xuất khẩu của Việt Nam đang chiếm lĩnh gần
như toàn bộ thị phần thế giới, kim ngạch xuất khẩu cá đạt hơn 500 triệu đơ la và dự kiến
trong 2018 sẽ có 600 ngàn tấn cá xuất khẩu, thu về gần 2 tỷ đô la Mỹ. Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn Việt Nam còn đưa ra dự kiến trong vòng 10 năm tới diện tích ni cá
sẽ tăng gấp đơi so với hiện nay, đẩy mạnh đầu tư hai khu vực sông Tiền và sông Hậu.
Tuy nhiên, bệnh nhiễm khuẩn trên cá đang phát triển phức tạp, ảnh hưởng lớn đến chất
lượng thịt cá và người nuôi cá. Phương pháp chữa trị chủ yếu là điều trị bằng thuốc kháng
sinh, song có thể dẫn đến rủi ro do hiện tượng kháng thuốc. Với thực trạng đó, ngày nay,
các nhà khoa học đang hướng đến các loại kháng sinh có nguồn gốc thực vật, nhằm hạn
chế tình trạng kháng kháng sinh ở thủy sản. Các loại hoạt chất có khả năng kháng khuẩn
đang nhận được nhiều sự quan tâm như carotenoid, flavonoid, alkaloid, terpenoid, trong
đó, flavonoid được nghiên cứu là có hoạt tính kháng khuẩn cao và được tìm thấy nhiều
trong các bộ phận của cây hoàn ngọc trắng, đặc biệt chứa nhiều trong lá cây.
Dược liệu có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương
pháp ngâm trích truyền thống dễ thực hiện, đơn giản nhưng tốn nhiều thời gian và hàm
lượng flavonoid thấp, các phương pháp trích ly hiện đại như sử dụng hỗ trợ vi sóng,
enzyme, lưu chất siêu tới hạn và hỗ trợ siêu âm có ưu điểm thời gian trích ly nhanh, hàm
lượng flavonoid cao nhưng thiết bị lại đắt tiền. Phương pháp trích ly sử dụng dung mơi có
hỗ trợ siêu âm với giá thành hóa chất và thiết bị tương đối thấp nhưng cho thời gian trích
ly ngắn, hàm lượng trích ly cao, sản phẩm sau khi trích ly có chất lượng tốt và thiết bị dễ
sử dụng là những ưu điểm nổi trội phương pháp này.

Vì vậy, đề tài “Trích ly flavonoid từ lá cây hoàn ngọc trắng bằng phương pháp hỗ
trợ siêu âm và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của cao trích” được chọn để nghiên
cứu.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Cây hoàn ngọc trắng
1.1.1. Phân loại khoa học và khu vực phân bố
Cây hoàn ngọc trắng (HNT) cịn có tên gọi khác là Xn Hoa, Tu Lình,
Nhật Nguyệt. Cây được tìm thấy lần đầu tiên ở Miền Bắc Việt Nam, thường mọc hoang ở
các vùng núi Cao Lạng và hiện nay được trồng với quy mô lớn tại Tây Ninh [1, 2]. Hồn
ngọc trắng có phân loại khoa học như sau:
 Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.
 Ngành: thực vật có hoa (Angiospermae)
 Lớp: hai lá mầm (Eudicots)
 Bộ: Hoa Mơi (Lamiales)
 Họ: Ơ Rơ (Acanthaceae)
 Chi: Xn hoa (Pseuderanthemum)
 Lồi: Pseuderanthemum palatiferum
1.1.2. Mơ tả thực vật
Cây mọc thành bụi, cao 0,6-1,5 m, là cây lâu năm. Khi cây còn non, thân trơn nhẵn, các
đốt có màu hơi vàng, lá mọc đối xứng và có cuống dài, có hình mũi giác; khi già chuyển
thành màu nâu, phân ra thành nhiều nhánh. Lá mọc đối, phiến lá bầu dục dài; mép lá nguyên
hoặc lượn sóng, có khía; cuống lá dài 1,5-2,5 cm. Mặt trên hầu như nhẵn với rất ít lơng che
chở đa bào ngắn hoặc lơng tiết có chân đơn bào, dọc gân chính nhiều lông; mặt dưới nhẵn;
gân phụ 5-6 cặp như được thể hiện ở hình 1.1. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, cụm hoa
dài 10-16 cm. Hoa lưỡng tính, khơng đều, màu trắng. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm
lịch [1].

2


Hình 1.1: Lá và rễ cây hồn ngọc trắng
Các bộ phận của HNT đều được dân gian sử dụng để chữa bệnh. Đặc biệt là lá vì trong
đó có chứa nhiều thành phần hóa học có hoạt tính sinh học [3].
1.1.3. Thành phần hoá học của lá cây HNT
Bằng các phương pháp phân lập, định danh và định lượng bởi các thiết bị hiện đại như
sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography – HPLC), sắc kí khí
(Gas Chromatography – GC), phổ hồng ngoại chuyển hóa Fourier (Fourier Transform
InfraRed – FT-IR), khối phổ (Mass Spectrometry – MS), quang phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy – NMR) cho thấy lá HNT chứa nhiều
hoạt chất như flavonoid, apigenin, triterpenoids, saponin, -sitosterol, stigmasterol, axit
salicylic, phenolic và axit ascobic [4, 5].
1.1.3.1. Flavonoid
Flavonoid bắt nguồn từ Latin, flavus nghĩa là màu vàng, màu của flavonoid trong tự
nhiên, là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật. Tuy nhiên, một số flavonoid có
màu xanh, tím đỏ và cũng có một số khác lại khơng có màu [6].
Theo

danh

pháp IUPAC,

nhóm

flavonoid

có

thể

được

chia

thành:

flavone (2-phenylchromen-4-one), isoflavonoid (3-phenylchromen-4-one (3-phenyl1,4benzopyrone)) và neoflavonoid (4-phenylcoumarine (4-phenyl-1,2-benzopyrone)). Các
cơng thức hóa học được thể hiện ở hình 1.2 [7].

3


(a)

(b)

(c)

Hình 1.2: Cơng thức hóa học của (a) flavone, (b) isoflavonoid và (c) neoflavonoid
Flavonoid phổ biến ở nhiều loài thực vật và có nhiều chức năng. Flavonoid là một sắc
tố sinh học, sắc tố thực vật quan trọng tạo ra màu sắc của hoa, cụ thể giúp sản xuất sắc tố
vàng, đỏ, xanh cho cánh hoa để thu hút nhiều động vật đến thụ phấn. Trong thực vật bậc
cao, flavonoid tham gia vào lọc tia cực tím, cộng sinh cố định đạm và sắc tố hoa. Flavonoid
có thể hoạt động như một chất chuyển giao hóa học hoặc điều chỉnh sinh lý, có thể hoạt
động như các chất ức chế chu kỳ tế bào [8].
Trong flavonoid, nổi bật có hai hoạt chất có hoạt tính sinh học là quercetin và
kaempferol.

1.1.3.2. Quercetin
Quercetin có danh pháp IUPAC là 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-Hchromen-4-one, là một flavone phân bố rộng rãi trong thực vật, có cơng thức hóa học như
thể hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3: Cơng thức hóa học của quercetin
Quercetin thường có mặt dưới dạng glycosit và được chuyển đổi thành liên hợp
glucuronit/sunphat trong quá trình hấp thu ở ruột và do đó chỉ có các chất chuyển hóa liên
hợp được tìm thấy trong máu lưu thông. Quercetin đã được chứng minh là tương tác với
một số thụ thể, đặc biệt là thụ thể hydrocacbon aryl, có liên quan đến sự phát triển của bệnh
ung thư do một số hóa chất gây ra. Quercetin cũng đã được chứng minh là điều chỉnh một
4


số đường dẫn truyền tín hiệu liên quan đến quá trình viêm và gây ung thư. Các nghiên cứu
động vật gặm nhấm đã chứng minh rằng việc sử dụng quercetin trong chế độ ăn kiêng ngăn
ngừa ung thư đại tràng và các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng quercetin có thể liên
quan đến việc ngăn ngừa ung thư phổi. Do đó, quercetin trong chế độ ăn uống là một tác
nhân đầy hứa hẹn để ngăn ngừa ung thư và nghiên cứu sâu rộng hơn [9].
1.1.3.3. Kaempferol
Kaempferol (3,4,5,7-tetrahydroxyflavone) là một flavone được tìm thấy trong nhiều loại
thực vật và thực phẩm có nguồn gốc thực vật, có cơng thức hóa học như thể hiện ở hình
1.4.

Hình 1.4: Cơng thức hóa học của kaempferol
Kaempferol là một chất rắn kết tinh màu vàng với điểm nóng chảy là 276 oC, ít tan trong
nước, tan nhiều trong EtOH nóng, ete và dimethyl sulfoxide (DMSO). Kaempferol có hoạt
tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa cao, có thể làm giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư khác
nhau.
1.1.4. Công dụng
Theo các bài thuốc dân gian, HNT có khả năng chữa nhiều loại bệnh:

 Phịng và hỗ trợ điều trị bệnh u bướu.
 Chữa rối loạn tiêu hóa, kích thích tiêu hóa, tốt cho bệnh nhân bị dạ dày, đại tràng,
đường ruột. Với người bệnh đau bụng đi ngoài, chỉ cần nhai sống 3 lá HNT trong 3 lần là
khỏi.
 Loét hành tá tràng, chảy máu đường ruột.
 Khôi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, chữa suy nhược thần kinh.
 Tác dụng cầm máu cực kỳ hiệu quả, bạn chỉ cần nhai lá HNT đắp vào vùng bị sưng
đau, chảy máu, vết thương sẽ được cầm máu ngay.
5


 Hỗ trợ điều trị bệnh huyết áp, tim mạch.
 Tác dụng bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, tiểu ra máu, tiểu buốt,
tiểu gắt [10, 11].
Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã nổi lên phong trào trồng cây HNT để chữa những
bệnh thuộc đường tiêu hoá hoặc tiểu đường và hầu hết các cơng dụng đó đều đã và đang
được khoa học chứng minh bằng các cơng trình nghiên cứu trong và ngồi nước.
1.1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước
1.1.5.1. Ngồi nước
Năm 2013, khả năng kháng viêm của cao trích lá HNT được đánh giá bằng xét nghiệm
phù tai do ethyl phenylpropiolate gây ra trên chuột nhắt trắng. Cao trích cho thấy khả năng
kháng viêm cấp tính và mãn tính đáng kể. Cao trích ở hàm lượng thấp được sử dụng trong
xét nghiệm viêm cấp tính (1 mg/tai chuột) có tác dụng kháng viêm cấp tính tương đương
với hoạt chất kháng viêm chuẩn – phenylbutazone. Tác dụng kháng viêm mãn tính phụ
thuộc vào hàm lượng cao trích và có tác dụng tốt hơn so với chất đối chứng diclofenate
[12].
Năm 2015, hai hợp chất stigmasterol và sitosterol-3-O-D-glucopyranoside đã được phân
lập từ lá HNT được nghiên cứu điều trị bệnh tiểu đường. Với liều 0,25 và 0,50 mg/kg cao
trích được cho chuột bị tiểu đường điều trị trong 21 ngày. So sánh lượng đường huyết lúc
đói (Fasting blood glucose – FBG) vào các ngày 0, 4, 7, 10, 14, 17 và 21 với một thuốc

chống tiểu đường – glibenclamine cho thấy lượng đường trong máu ở tất cả các liều điều
trị đã giảm đáng kể, cùng với sự gia tăng đồng thời của insulin. Stigmasterol 0,5 mg/kg có
hiệu quả hạ đường huyết tốt nhất. Ngoài ra, hai hoạt chất này cũng làm tăng lượng
cholesterol tốt (High-Density Lipoprotein – HDL), làm giảm lượng cholesterol xấu (LowDensity Lipoprotein – LDL), hàm lượng urê trong máu, creatinine, v.v. [13].
Năm 2016, cao trích EtOH của lá HNT được thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường
bằng khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase in vitro. Kết quả cho thấy cao
trích có khả năng ức chế cả α-amylase và α-glucosidase với các giá trị ức chế 50% (the half
maximal inhibitory concentration – IC50) tương ứng là (11,79 ± 8,10) mg/mL và (1,00 ±
0,11) mg/mL [5].

6


1.1.5.2. Trong nước
Năm 2004, các hợp chất 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit panmitic và axit
salicylic được phân lập từ cây HNT [14].
Năm 2005, nghiên cứu về thử độc tính và tác dụng ức chế q trình peroxit hố lipid
màng tế bào, thử nghiệm chữa bệnh dịch tả đối với heo chưa cai sữa, phân lập triterpenoid
và steroid từ lá HNT bằng phương pháp NMR lần lượt được thực hiện [15, 16].
Năm 2006, tám hợp chất: dotriacontan, phytol, squalen, 24-metylencycloaratanol,
lolionlide, β-sitosterol, β-sitoterol 3-β-O-D-glucopyranoside và stigmasterol 3-β-O-Dglucopyranoside lần đầu tiên được phân lập trong lá HNT, đồng thời khảo sát khả năng
kháng khuẩn đường ruột của cao trích [17].
Tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của cao trích lá HNT trồng tại Việt
Nam vẫn chưa được tìm hiểu về chiều sâu. Bên cạnh đó, tình hình kháng thuốc kháng sinh
của các loại vi khuẩn đang diễn ra phổ biến trên người và kể cả động vật, nhất là đối với
thủy sản.
1.2. Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản
1.2.1. Tình hình chung
Theo một thông báo đặc biệt được hệ thống thông tin và cảnh báo sớm của Tổ chức
Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the

United Nations – FAO), sự bùng phát dịch bệnh trên thuỷ sản cần được quan tâm đặc biệt
nên cần áp dụng các biện pháp quản lý thích hợp như tăng cường kiểm tra chẩn đoán, thực
thi các giấy chứng nhận sức khoẻ, triển khai các biện pháp kiểm dịch và lập kế hoạch dự
phòng [18].
Tại Việt Nam, cá diêu hồng và cá da trơn là các lồi cá có sức khoẻ tốt, khả năng kháng
bệnh cao, là hai loại cá được xuất khẩu đến rất nhiều nước trên thế giới mang về lợi nhuận
rất lớn cho ngành thủy sản. Năm 2015, sản lượng cá diêu hồng và da trơn trên thế giới từ
cả nuôi trồng thủy sản và đánh bắt lên tới 6,4 triệu tấn, với giá trị ước tính là 9,8 tỷ đơ la
Mỹ, thương mại tồn cầu đạt 1,8 tỷ đơ la Mỹ. FAO cịn cho biết cá diêu hồng là đối tượng
của an ninh lương thực và dinh dưỡng toàn cầu [19].
Bệnh xuất huyết do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra trên cá diêu hồng, bệnh

đốm trắng (hay bệnh hoại tử nội tạng) ở cá da trơn do nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
có nguy cơ lan rộng, gây thiệt hại lớn về kinh tế và đời sống của người nuôi trồng thuỷ sản.
7


Người nuôi trồng thủy sản và các nhà khoa học đã ý thức được rằng bệnh do các loài
vi khuẩn khác nhau gây ra có thể trở thành mối đe dọa số một đối với ngành thủy sản.
Streptococcus agalactiae được coi là vi khuẩn gây bệnh có ảnh hưởng lớn nhất trên cá diêu
hồng, có thể gây chết cá với số lượng lớn và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người nuôi
trồng.
1.2.2. Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, phân chia
tế bào theo trục dọc thành chuỗi. Hình ảnh dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn về vi
khuẩn này được thể hiện ở hình 1.5.

Hình 1.5: Vi khuẩn S. agalactiae [20]
Biểu hiện của cá khi nhiễm phải vi khuẩn S. agalactiae như sau:


Cá bơi lờ đờ trên tầng mặt, một số cá bị bệnh nặng bơi nghiêng mình trên

mặt nước và quay trịn một vài vịng sau đó tử vong.


Mắt cá bị lồi một bên và trên mắt kéo một lớp màng màu trắng đục.



Phía trong nắp mang bị xuất huyết, có màu đỏ nhưng khơng bị thối.



Hậu mơn sưng đỏ.



Giải phẫu trong xoang bụng chứa nhiều dịch, ruột xuất huyết và chứa các

bọt khí, quan sát thấy mật sưng to [20, 21].
Các biểu hiện trên được thể hiện ở hình 1.6.

8


Hình 1.6: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn S. Agalactiae gây bệnh trên cá diêu hồng [20]
Cá bị nhiễm trùng loại vi khuẩn này dễ dẫn đến nhiễm trùng máu và các bệnh liên quan
đến hệ thần kinh của cá dẫn đến tử vong tỷ lệ từ 30 đến 50% [20].
1.2.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) là vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước 1×2-3 μm,
khơng sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện, được thể hiện ở hình 1.7.

Hình 1.7: Vi khuẩn E. ictaluri
Biểu hiện của cá khi nhiễm vi khuẩn E. ictaluri như sau:


Cá kém ăn hay bỏ ăn, gầy yếu.



Bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây

xuất huyết, mắt lồi.


Giải phẫu cơ quan nội tạng gan, lá lách, thận bị hoại tử thành những đốm

màu trắng đục đường kính 0,5-2,5 mm, cịn gọi là bệnh đốm trắng như thể hiện ở
hình 1.8.
9


Hình 1.8: Biểu hiện bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá da trơn
E. ictaluri gây bệnh trên cá da trơn với tốc độ nhiễm bệnh và bệnh phát triển rất nhanh.
Bệnh nhiễm khuẩn trên cá đang phát triển rất phức tạp và phương pháp chữa trị chủ yếu là
điều trị bằng kháng sinh tân dược. Các loại thuốc này có hoạt tính mạnh, có thể thẩm thấu
trực tiếp vào máu, mang đến hiệu quả nhanh chóng, đặc biệt là tiêu diệt các ổ nhiễm khuẩn
tồn tại trong cơ thể. Tuy nhiên, vì chất kháng sinh tổng hợp là một hoạt chất có tính kháng
khuẩn, nên khi người dùng khơng tn thủ liệu trình điều trị thì sẽ chưa tiêu diệt hoàn toàn

vi khuẩn và lúc này vi khuẩn sẽ tự thích nghi bằng cách sinh ra một cơ chế phịng vệ với
kháng sinh đó. Lâu ngày, vi khuẩn sẽ thích nghi hồn tồn với kháng sinh và dẫn tới tình
trạng kháng thuốc (tức là thuốc khơng cịn tác dụng kháng khuẩn với vi khuẩn đó nữa)
[15].
Kháng sinh thực vật là sự phối hợp nhiều loại hợp chất với tác dụng kháng khuẩn theo
nhiều cơ chế phức tạp. Khi đó, vi khuẩn khơng có khả năng nhận diện cơ chế tác động
của kháng sinh thực vật để hình thành khả năng phịng vệ và gần như khơng có khả năng
kháng thuốc. Vì vậy, ngày nay, hướng nghiên cứu về kháng sinh thực vật đang nhận được
nhiều sự quan tâm trên thế giới.

10


Các loại kháng sinh thực vật được nghiên cứu khá nhiều và có tác dụng diệt khuẩn cao
như flavonoid, polyphenol, triterpenoid. Trong đó, flavonoid được nghiên cứu là có tác
dụng kháng khuẩn cao trên nhiều dòng vi khuẩn khác nhau và nhóm hoạt chất này có chứa
nhiều trong lá HNT. Do đó, cần nghiên cứu về các phương pháp trích ly flavonoid từ lá
HNT để thay thế kháng sinh tân dược trong việc điều trị bệnh thủy sản.
1.2.4. Kháng khuẩn
Quercetin và kaempferol là hai hoạt chất được tìm thấy trong lá HNT, với cấu tạo vịng
gắn các nhóm OH như hình 1.9, các nhóm OH này làm tăng khả năng kháng khuẩn với cơ
chế liên kết với adhesin – yếu tố độc lực của vi khuẩn làm ức chế giải phóng acetylcholine
– thành phần lớp phospholipid ở màng tế bào làm mất chức năng của vi khuẩn [22, 23].

Hình 1.9: Nhóm OH kháng khuẩn của hoạt chất quercetin và kaempferol
1.3. Các phương pháp trích ly
Hiện nay, dược liệu có thể được trích ly bằng nhiều phương pháp khác nhau, cơ bản
được chia làm hai loại là phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại.
1.3.1. Phương pháp trích ly truyền thống
Trong phương pháp truyền thống, nguyên liệu được ngâm vào trong dung mơi

thích hợp để hịa tan các hợp chất mong muốn, có sử dụng kết hợp với nhiệt độ hoặc khuấy
trộn. Sắc thuốc là một dạng trích ly truyền thống đã được con người sử dụng
từ hàng ngàn năm nay trong lịch sử y học. Nhìn chung, phương pháp trích ly truyền thống
đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên, tốn nhiều thời gian và hàm lượng flavonoid trích ly thấp.
Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, các phương pháp trích ly cổ điển này
đang dần được thay thế bởi các máy móc, trang thiết bị hiện đại hơn.
11


1.3.2. Phương pháp trích ly hiện đại
Các phương pháp hiện đại đã và đang phổ biến hiện nay như trích ly hỗ trợ vi sóng,
enzyme, lưu chất siêu tới hạn và đặc biệt là siêu âm.
1.3.2.1. Hỗ trợ vi sóng
Vi sóng là sóng cực ngắn hay sóng siêu tần. Trong phổ điện từ, vi sóng nằm trong
khoảng tần số từ 4×1010 - 3×1011 Hz như thể hiện ở hình 1.10.

Hình 1.10: Phổ điện từ
Năng lượng của vi sóng là năng lượng điện từ. Năng lượng photon của vi sóng
rất thấp, tại tần số 2450 MHz, năng lượng photon là 0,0016 eV (xấp xỉ 0,037 kcal/mol),
trong khi năng lượng của các liên kết hóa học vào khoảng 80-120 kcal/mol. Do đó,
vi sóng khơng ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử của hợp chất hữu cơ. Sự kích thích
phân tử của vi sóng đơn thuần là tác động về động học.
Khi vi sóng chạm đến vật liệu, một phần năng lượng của nó bị phản xạ trở lại,
một phần đáng kể sẽ bị hấp thu vào trong vật liệu. Năng lượng này sẽ được chuyển hóa
thành nhiệt và giảm dần khi nó truyền đi trong vật liệu.
Sự đun nóng của vi sóng là do sự quay lưỡng cực và sự dẫn truyền ion. Nhiệt được sinh
ra do sự dẫn truyền ion là kết quả của sự tăng trở kháng của môi trường chống lại sự dịch
chuyển của các ion trong điện trường. Sự quay lưỡng cực là quá trình thay đổi hướng của
một phân tử phân cực theo chiều của điện trường. Các phân tử phân cực có xu hướng sắp
xếp theo chiều điện trường. Tuy nhiên, điện trường xoay chiều có tần số cao (MHz) gây ra

sự ma sát với vận tốc xoay rất lớn giữa các phân tử, làm cho vật chất nóng lên.
Những hợp chất càng phân cực thì dưới tác động của vi sóng sẽ nóng càng nhanh. Trong
đó, nước có độ phân cực mạnh và cấu trúc bất đối xứng, do đó, nước là một chất rất dễ đun
nóng bằng vi sóng.

12