phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá cỏ mực (eclipta alba h.)

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN












LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC


PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ RUỘT TÔM SÚ
VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
CỦA CAO CHIẾT LÁ CỎ MỰC (ECLIPTA
ALBA H.)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS ĐÁI THỊ XUÂN TRANG
KHOA: KHOA HỌC TỰ NHIÊN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
TRƯƠNG PHAM THẢO QUỲNH
MSSV: 3102677
LỚP: CỬ NHÂN SINH HỌC – K36

2


LỜI CAM ĐOAN





Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cán bộ hướng dẫn và tôi. Các
kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai nghiên cứu
trong bất kì công trình nghiên cứu của luận văn nào.

Cán bộ hướng dẫn Tác giả






Ts Đái Thị Xuân Trang Trương Phạm Thảo Quỳnh

3


PHẦN KÝ DUYỆT





Đề tài: “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn của cao cây cỏ mực (Eclipta alba H.)” do sinh viên Trương Phạm
Thảo Quỳnh thực hiện đã được duyệt thông qua hội đồng phản biện luận văn tốt
nghiệp đại học.

Cần Th
ơ, ngày….tháng….năm 2013
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG



TS: Đái Thị Xuân Trang





4


LỜI CẢM TẠ

Để đề tài luận văn này được hoàn thành thuận lợi, bên cạnh sự cố gắng của
chính bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ từ thầy, cô, gia
đình, bạn bè và các anh, chị khóa trên. Tôi chân thành gửi lời tri ân đến:
Cô Đái thị Xuân Trang và cô Võ Thị Tú Anh đã tận tâm hướng dẫn, truyền đạt
những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập cũng như trong tiến trình
làm luận văn tốt nghiệp.
Thầy Quách Quang Huy và Phạm Kháng Nguyên Huân đã luôn đồng hành và
giúp đỡ tận tình trong suốt 4 năm học qua.
Toàn thể Cán bộ của bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên đã truyền đạt
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và luôn quan tâm, giúp đỡ tạo mọi điều kiện
thuận lợi nhất cho chúng em học tập - nghiên cứu.
Gia đình thân yêu luôn ở bên chăm sóc, cổ vũ và động viên.
Tập thể lớp Sinh học K36, các anh, chị khóa trên và các em khóa dưới đã giúp

đỡ, chia sẽ nhiều kinh nghiệm trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn
này.
Những người bạn thân thiết đã gắn bó, chia sẽ mọi niềm vui nổi buồn trong
suốt thời gian qua.


Trương Phạm Thảo Quỳnh
Xin chân thành cảm ơn !!!



5
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH SÁCH BẢNG ii
DANH SÁCH HÌNH iii
DANH MỤC VIẾT TẮT iv
TÓM LƯỢC v
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Sơ lược về tôm sú 3
2.2. Sơ lược về hệ vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm 4
2.3. Cỏ mực 5
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 8
3.1. Phương tiện nghiên cứu 8
3.2. Phương pháp nghiên cứu 9
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12
4.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú 12
4.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao lá cây cỏ mực 16

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 20
5.1. Kết luận 20
5.2. Đề nghị 20
5.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO 21
PHỤ LỤC









6


DANH SÁCH BẢNG
Trang

Bảng 1. Đặc điểm cơ bản các dòng vi khuẩn 14
Bảng 2. Khả năng kháng vi khuẩn đường ruột tôm của cao lá cây cỏ mực 16

7
DANH SÁCH HÌNH
Trang

Hình 1. Cây cỏ mực (Eclipta alba) 6
Hình 2. Vi khuẩn đường ruột tôm trên môi trường TCBS 12
Hình 3. Các dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 13

Hình 4. Hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học khi đã nhuộm Gram 14
Hình 5. Vòng vô khuẩn của cao lá Cỏ Mực lên một số dòng vi khuẩn 15
Hình 6. Biểu đồ thể hiện đường kính vòng vô khuẩn ở các nồng độ cao chiết khác
nhau ở các dòng vi khuẩn khác nhau 17

8
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TCBS Thiosulphate citrate bile-salts sucrose
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
NA nutrition agar

9
TÓM LƯỢC
Mười hai dòng vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú của huyện Trần Văn
Thời, tỉnh Cà Mau trên môi trường thạch TCBS. Các dòng vi khuẩn có dạng tròn
hoặc không đều, bìa nguyên hoặc răng cưa, một số dòng vi khuẩn tạo bao nhày
xung quanh khuẩn lạc, đường kính khuẩn lạc biến thiên từ 0,5 – 4 mm. Tất cả 12
dòng vi khuẩn đều là vi khuẩn Gram âm và có khả năng di động trên môi trường
TCBS bán lỏng. Trong 12 dòng vi khuẩn phân lập được có 10 dòng vi khuẩn bị ức
chế bởi cao chiết lá cây cỏ mực. trong đó, dòng vi khuẩn G2, G3, G4, G7, Y8, và
Y9 bị ức chế bởi cao lá cây cỏ mực ở nồng độ 6 µg/mL, dòng vi khuẩn Y4 bị ức chế
bởi cao từ nồng độ 8 µg/mL, dòng vi khuẩn Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 16
µg/mL, dòng vi khuẩn G1 và Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 32 µg/mL. Hai dòng
vi khuẩn Y2 và Y5 không bị ức chế bởi cao chiết cây cỏ mực ở tất cả các nồng độ
khảo sát. Trong đó, các dòng bị ức chế mạnh nhất bởi cao chiết lá cây cỏ mực
đáng kể đến là dòng vi khuẩn G7 (đường kính vòng vô khuẩn 30,3 mm ở nồng
độ 8 µg/mL), G3 (đường kính vòng vô khuẩn 59,6 mm ở nồng độ 128 µg/mL) và
G4 (đường kính vòng vô khuẩn 57,3 mm ở nồng độ 128 µg/mL).
Từ khóa: Tính kháng khuẩn, vi khuẩn đường ruột tôm, bệnh tôm sú, cây
cỏ mực, Eclipta alba H.

10
Chương 1: GIỚI THIỆU

Đồng bằng sông Cửu Long được biết đến là vùng cung cấp thuỷ sản lớn nhất
nước, đa dạng về hình thức nuôi và có hơn 1.200.000 ha nuôi thuỷ sản chiếm
khoảng 60% tổng diện tích nuôi cả nước [1]. Trong đó, tôm sú (Penaeus monodon)
là đối tượng nuôi truyền thống và có giá trị kinh tế cao. Trước đây, tôm sú (Penaeus
monodon) chỉ được nuôi ở vùng nước lợ, mặn nhưng hiện nay tôm sú cũng được
nuôi kết hợp với trồng lúa, nghề nuôi tôm không những phát triển kinh tế mà còn
góp phần cải thiện đời sống người dân.
Tuy nhiên, việc quản lý môi trường nuôi thủy sản chưa thật sự chặc chẽ và
hợp lý. Nhiều vùng nuôi tôm thâm canh hoá với mật độ cao, không theo qui hoạch,
sự gia tăng diện tích nuôi, đa dạng hóa đối tượng nuôi, sử dụng giống sinh sản nhân
tạo ở mật độ cao, thức ăn công nghiệp, sự di nhập tôm giống và tôm bố mẹ,…các
nguyên nhân trên dẫn đến tình trạng dịch bệnh bùng phát và thường xuyên xảy ra
trong nhiều khu vực nuôi, sự xuất hiện và lây lan của nhiều bệnh nguy hiểm, đặc
biệt là bệnh do virus và vi khuẩn gây ra. Nhiều nhóm vi khuẩn gây dịch bệnh trên
tôm như Leucothrix spp., Vibrio spp., Photobacterium, Aeromonas và Propionige-
nium (phylum Fusobacteria) [2] đang trở thành mối lo ngại của người dân. Vibrio
spp. gây bệnh dịch tả ở người, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng và mất
nước, có khả năng bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi
rất rộng.
Người dân thường sử dụng một số loài thảo dược như cỏ mực, sài đất, hoàng
kỳ, tỏi, xuyên tâm liên, xoan, thầu dầu tía để trị bệnh trên tôm cá. Tuy nhiên, việc
sử dụng chỉ dừng lại ở mức kinh nghiệm và thường chưa có cơ sở khoa học và liều
lượng cụ thể. Trong những năm gần đây, hoạt tính kháng khuẩn của các loài thảo
dược đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng như cây tràm, húng chanh, sống đời,
diệp hạ châu Trong tương lai, việc sử dụng thảo dược để điều trị bệnh động vật

thủy sản được xem là tối ưu do có tính an toàn cho con người, môi trường và không
để lại tồn dư, phù hợp với các quy định về an toàn thực phẩm.

11
Do đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và Khảo sát hoạt tính
kháng khuẩn của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba H.)” là cần thiết. Đề tài đóng
góp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng thảo dược trong điều trị bệnh trên thủy sản.
Mục tiêu của đề tài là đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn được phân lập từ
ruột tôm sú (Penaeus monodon) bệnh của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba).

12
Chương 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về tôm sú
Khoá phân loại tôm sú:
Ngành Arthoopoda
Lớp Malacostraca
Bộ Decapoda
Họ Penaeidae
Chi Penaeus
Loài Penaeus monodon
Tôm sú có tên tiếng anh phổ biến black tiger shrimp. Tôm sú (Penaeus
monodon) có khả năng sinh trưởng nhanh. Tôm sẽ đạt mức trưởng thành sau
khoảng 4-5 tháng nuôi trồng. Tôm trưởng thành có chiều dài đến 27 cm và trọng
lượng khoảng 250 g/con, đây là trọng lượng lý tưởng cho tôm thương phẩm tiêu thụ
quốc tế [3].
Trong tự nhiên, tôm nước mặn sinh trưởng ở xa bờ. Đến mùa sinh sản, tôm
trưởng thành tiến vào gần bờ để đẻ trứng. Trứng nở ra ấu trùng trải qua 3 thời kì
biến thái Naupilus, Zoea, Mysis. Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các cửa
sông, nơi nước biển và nước sông pha với nhau tạo nên vùng nước lợ có độ mặn

thấp hơn ngoài biển, thích hợp cho ấu trùng phát triển. Trong môi trường này, ấu
trùng tiến sang thời kì hậu ấu trùng. Sau đó, hậu ấu trùng chuyển sang thời kì ấu
niên đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng thành tôm sú hoàn chỉnh và sinh sản.
Tôm sú có thể chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn, độ mặn tối ưu là 15-25‰.
Tôm sú thuộc loài hoạt động về đêm và hay ăn thịt lẫn nhau. Lúc còn nhỏ, ấu trùng
tôm sú có khuynh hướng sống bám vào thành ao hồ, các góc hồ hoặc chui sâu dưới
lớp cát, đáy ao hồ về ban ngày, đến đêm nổi lên hoạt động, kiếm tìm thức ăn [3].
Tôm sú thuộc loài động vật máu lạnh, thân nhiệt thay đổi theo nhiệt độ môi
trường bên ngoài. Nhiệt độ ảnh hưởng đến nhiều phương diện trong đời sống của
tôm như hô hấp, tiêu hoá, miễn nhiễm, sự tăng trưởng,… Ở nhiệt độ 28
°
C, tôm sú

13
lớn tương đố chậm, ở 30
°
C, tôm lớn nhanh hơn nhưng rất dễ mắc các dịch bệnh như
bệnh MBV (Monodon Baculovirus)…
2.2. Sơ lược về hệ vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên tôm
Ở Việt Nam, những dạng nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản
xuất hoặc ương tôm giống. Khi vi khuẩn phát sáng hiện trong cơ thể tôm với số
lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh phát sáng, có thể quan sát được trong bóng
tối. Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm
giống và kể cả tôm trưởng thành [4]. Chính vì vậy mà bệnh phát sáng ở tôm được
liệt kê vào danh sách các chỉ tiêu kiểm dịch tôm giống. Ở các trại sản xuất tôm
giống, thuốc kháng sinh hiện vẫn là cách phổ biển được sử dụng để phòng trị bệnh
phát sáng. Trong một nghiên cứu về vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng
sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus
monodon) ở ĐBSCL cho thấy vị trí phân loại của 27 chủng vi khuẩn phát sáng phân
lập từ tôm sú giống và nước tại trại ương được xác định bằng phương pháp phân

tích cụm so sánh với 26 chủng vi khuẩn chuẩn và chủng tham khảo dựa vào khoảng
cách Euclid-UPGMA. Kết quả so sánh qua 41 chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh
hóa cho thấy các chủng vi khuẩn phát sáng được phân thành ba nhóm chủ yếu cùng
với vi khuẩn chuẩn và vi khuẩn tham khảo. Tuy nhiên chúng chỉ thuộc vào hai loài
vi khuẩn là V. harveyi và V. carchariae. Kết quả kháng sinh đồ 26 trong số 27
chủng nói trên với 6 loại thuốc kháng sinh thông dụng trong nuôi thủy sản cho thấy
100% chủng thử nghiệm kháng với ampicilin, và có khoảng từ (hoặc ít hơn) 15%
kháng với trimethoprim/sulfamethoxazole, tetracillin, chloramphenicol,
nitrofurantoin và norfloxacin. Phần lớn (77%) các chủng chỉ kháng với một loại
kháng sinh. Số chủng kháng với 2 loại kháng sinh là 15%. Có một chủng kháng 4
loại và một chủng kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm [4].
Nhóm vi khuẩn γ-Proteobacteria là nhóm vi khuẩn thường gặp trong ruột tôm
sú ở các trại nuôi. Hệ vi khuẩn đường ruột tôm sú phong phú và đa dạng ở các trại
nuôi tôm khác nhau. Các nhóm vi khuẩn này bao gồm Vibrio, Photobacterium,
Aeromonas và Propionige-nium (ngành Fusobacteria). Một số nhóm vi khuẩn
thường gặp khác, bao gồm Actinomyces, Anaerobaculum, Halospiru-lina,
Pseudomonas, Mycoplasma và Shewanella [2]. Hai nhóm vi khuẩn là nguyên nhân

14
gây ra nhiều bệnh khác nhau ở tôm bao gồm Leucothrix spp. và một vài loài Vibrio.
Hiện nay có khoảng 28 loài thuộc Vibrio spp. Trong đó, có 4 loài thuộc tác nhân
gây bệnh cho con người gồm V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V.
alginolyticu [5].
Vibrio spp. Được tìm thấy phổ biến ở trong nước biển và ven bờ, trong nước
bể ương tảo, bể ương Artemia, trong bể ươm ấu trùng. Trong bể ương lượng ấu
trùng Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng mặt. Đối với cá, Vibrio
spp. gây bệnh nhiễm khuẩn máu là chủ yếu. Đối với tôm, Vibrio spp. gây bệnh phát
sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin, gây bệnh máu vón cục ở cua, bệnh ấu trùng
nhuyễn thể. Những loài gây bệnh cho động vật thuỷ sản là V. alginolyticus, V.
anguillarum, V. ordalii, V. salmonicida, V. parahaemolyticus, V. harvey, V. vulnificus… V.

anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá chình. V. anguillarum
được Hofer mô tả lần đầu năm 1904. V. salmonicida gây bệnh ở vùng nước lạnh. V.
parahaemolyticus gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú. V. alginolyticus gây bệnh
đỏ dọc thân ấu trùng tôm sú [5]. Phân lập ở trong mắt tôm sắp chết có các loài vi
khuẩn V. harveyi chiếm 29,6% và các loài khác V. vulnificus 21,6%, V.
alginolyticus 10,2%, V. anguillarum 10,2%, V. parahaemolyticus 4,2% [5]. Trước
đây Vibrio được xem là nhóm vi khuẩn cơ hội, tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch
xảy ra trên tôm sú nuôi đều do vi khuẩn Vibrio gây ra. Do đó, loài này được xem là
tác nhân chính chứ không phải là tác nhân cơ hội. Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm
giống kể cả tôm trưởng thành. Khi dịch bệnh xuất hiện trên họ tôm biển có thể gây
chết 100% [6].
2.3. Cây Cỏ Mực
Trong dân gian từ rất lâu cây thảo dược đã được sử dụng để trị nhiều bệnh
phổ biến đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn, các loại cao chiết từ thảo dược cũng
được sử dụng để trị bệnh nhưng chỉ dừng lại ở kinh nghiệm dân gian, chưa có
phương pháp khoa học cụ thể. Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu về
tính kháng khuẩn của một số cây thảo dược như cây tràm (Melaleuca leucadendra)
[7], cây sống đời (Kalanchoe pinnata) [8], cây húng chanh (Plectranthus
amboinicus)[9], cây diệp hạ châu thân xanh (Phyllanthus amarus) [10],…

15
Cây Cỏ mực (Eclipta alba) còn gọi là cây Nhọ nồi. Cỏ mực thuộc loại cây
thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có khi gần như thẳng đứng, có
lông trắng, cứng, thưa. Thân màu lục hay màu nâu nhạt hay hơi đỏ tía. Lá mọc đối,
phiến lá dài và hẹp khoảng 2,5 х 1,2 cm. Mép lá nguyên hay có răng cưa cạn, hai
mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay đầu cành, các hoa cái
hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa… Quả bế dẹt có 3 cạnh, có
cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá rộng vì nó là loài
cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát [11].
Khóa phân loại cây cỏ mực:

Ngành Anthophyta
Lớp Asteridae
Bộ Asterales
Họ Asteraceae
Chi Eclipta
Loài Eclipta alba [11]

Cỏ mực (Eclipta alba) được dùng để điều trị các bệnh như nôn ra máu từ dạ
dày, chảy máu cam, tiểu ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột,
lỵ, trẻ em suy dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da,
ezecma, vết loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra, Cỏ mực còn được dùng
làm thuốc sát trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt,
sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc [11].
Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc
tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt từ cây cỏ mực (Eclipta alba), mỗi ngày 1-3 ống (2 ml).
Có nơi đã sản xuất thành công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu [11]. Đã có
nghiên cứu cho thấy cỏ mực được dùng để điều trị cho bệnh nhân bị viêm âm đạo
do tạp khuẩn, do nấm và do Trichomonas, và được cho có độc tính rất thấp, giới hạn
an toàn rộng, cầm máu tốt, trong vài trường hợp cá biệt, tác dụng này của cỏ mực
thể hiện rõ rệt hơn cả tác dụng của vitamin K (rõ rệt trong các trường hợp suy gan)
Hình 1: Cây cỏ mực (Eclipta alba)
Nguồn: />content/uploads/2012/10/co
-
nho
-
noi.jpg


16

[10]. Cỏ mực được nghiên cứu là có khả năng kháng một số loài vi khuẩn như
Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Staphylococcus aureus và Aeromonas
hydrophila [10].

17
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Phương tiện
● Phương tiện
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh
học, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
● Dụng cụ
Bình tam giác, bình định mức, đĩa petri đường kính 30 mm, ống nghiệm.
Micropipet, kim cấy, lamel, lam, kẹp, đèn cồn, đũa thủy tinh, chai trữ vi
khuẩn (3 – 5 mL), ống đong (10 mL, 100 mL) cốc thủy tinh (10 mL, 40 mL, 200
mL), giấy lọc Whatman.
● Thiết bị
Tủ cấy vô trùng (Laminar low, Việt Nam)
Nồi khử trùng nhiệt ướt (t = 121°C, P = 1 bar. Hirayama)
Tủ sấy (Memmer, Đức)
Tủ ủ ( t = 32°C. Memmer, Đức)
Cân phân tích (Mettle Toler, Switzerland)
Kính hiển Vi (CH20BIMF200, Olympus, Japan; Nikon Eclipse E200)
Tủ lạnh (Sanyo)
Máy ly tâm (Centrifuge 5417R)
Máy ảnh
Máy cô quay đứng EYELA N10, Japan
● Vật liệu thí nghiệm
Mẫu tôm sú (Penaeus monodon) lớn có dấu hiệu nhiễm bệnh đường ruột
được thu thập từ các trại giống và các ao nuôi tôm tại ấp Tân Thành, xã Lợi An,
huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau.

Cây cỏ mực (Eclipta alba) được thu lá tại xã Thới Hưng, huyện Cờ Đỏ,
thành phố Cần Thơ.

18
● Hóa chất
Ethanol 96°, methanol (Merck), dimethyl sulfoxide (Merck), natri clorua
(China), yeast extract (Himeda, India), chloroform (Merck), peptone (China),
dipotassium phosphate (China), agar (Việt Nam).
Môi trường phân lập vi khuẩn: Thiosulphate citrate bile-salts sucrose (TCBS) [12].
Môi trường dinh dưỡng NA [12].
3.2. Phương pháp
● Thí nghiệm 1: Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn
Phương pháp thu mẫu
Tôm sú (Penaeus monodon) được thu từ các ao nuôi tại ấp Tân Thành, xã
Lợi An, Huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau.
Mẫu tôm được thu nguyên con, còn sống để phân lập vi khuẩn. Tôm được
xác định là bệnh khi có dấu hiệu sau tôm bơi lờ đờ, cập mé, bỏ ăn, thức ăn trong
ruột bị đứt khúc, không liền mạch. Mẫu tôm sau khi được vớt khỏi mặt nước thì tiến
hành giải phẫu lấy bệnh phẩm ngay và chỉ những mẫu bệnh phẩm còn sống mới
được sử dụng để phân lập vi khuẩn.
Phương pháp phân lập vi khuẩn
Tôm bệnh được giải phẫu để lấy phần ruột. Ruột tôm được nghiền trong ống
nghiệm chứa 2 mL dung dịch nước muối 0,9%, sau đó dịch nghiền được trải đều lên
đĩa thạch môi trường TCBS, mẫu được ủ ở nhiệt độ 32°C. Sau 24 giờ, quan sát đặc
điểm khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc tiêu biểu và cấy chuyển sang môi trường
chọn lọc TCBS. Vi khuẩn được phân lập trên môi trường TCBS cho đến khi quan
sát được các khuẩn lạc đồng nhất về hình thái (màu sắc, độ nổi, bìa, kích thước,
hình dạng).
Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương
pháp nhuộm Gram [13].

● Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính của cao chiết cây cỏ mực
Cỏ mực sau khi thu hái được loại bỏ phần sâu bệnh, rửa sạch, phơi khô ngoài
nắng tự nhiên rồi nghiền thành bột. Bột được chiết bằng phương pháp ngâm dầm

19
với methanol trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết methanol được cô quay để
loại bỏ dung môi dưới áp suất thấp thu được cao tổng. Cao tổng sau thu được trữ ở
4
°
C [14].
Nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết đối với vi khuẩn được xác định bằng
phương pháp khuếch tán trên thạch [17]. Dịch vi khuẩn với mật số 10
6
vi khuẩn/mL
được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cây cỏ mực. Độ đục
của dịch vi khuẩn được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy
trắng có kẻ các vạch đen. Nếu dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục
chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm dung dịch NaCl
0,9% hoặc cho thêm dịch vi khuẩn. Dịch vi khuẩn có độ đục tương đương độ đục
McFaland được pha loãng 100 lần để được dịch vi khuẩn có nồng độ 10
6
vi
khuẩn/mL [15]. Đường kính vòng vô trùng được đo bằng mm. Nồng độ ức chế tối
thiểu được xác định tại nồng độ cao chiết thấp nhất có thể tạo vòng vô khuẩn [15].
Phương pháp khuếch tán trên thạch
● Chuẩn bị cao chiết
Cao chiết được pha với dung môi methanol để được các nồng độ 128, 64,
32,16 và 8 µg/mL
● Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
100 µL dịch nuôi vi khuẩn với mật số 10

6
vi khuẩn/mL được trãi đều trên
mặt thạch môi trường TCBS. Đĩa thạch được để khô 15 phút trước khi đặt khoanh
giấy tẩm cao chiết.
Khoanh giấy (đường kính 6 mm) được cho ngấm cao chiết cây cỏ mực ở các
nồng độ 128, 64, 32,16, 8 µg/mL và mẫu được chuẩn bị tương tự nhưng thay cao
chiết bằng dung môi đã sử dụng rồi để khô sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã trải
vi khuẩn. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần. Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong
30 phút cho cao chiết từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
Mẫu vi khuẩn được ủ ở 32°C trong 24 giờ. Quan sát và ghi nhận đường kính
vùng ức chế (đo bằng thước đo đơn vị mm). Đường kính vùng ức chế bao gồm
đường kính khoanh giấy. Ranh giới vùng ức chế xác định bằng một vùng không có

20
bất kỳ khuẩn lạc nào có thể phát hiện bằng mắt thường, bỏ qua các khuẩn lạc li ti ở
mép mà chỉ có thể phát hiện dưới kính hiển vi.

21
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú
Mười hai dòng vi khuẩn phân lập được từ 30 mẫu ruột tôm sú bệnh trên môi
trường TCBS đều có tế bào dạng hình que (dài hoặc ngắn), di động. Các dòng vi
khuẩn này được kí hiệu như sau: kí hiệu đầu là Y (yellow) hoặc G (green) thể hiện
màu sắc khuẩn lạc trên môi trường TCBS. Chữ số cuối là kí hiệu cho số dòng vi
khuẩn phân lập được.
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn
Trên môi trường TCBS, khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn có màu vàng hoặc
màu xanh lá (đậm hoặc nhạt). Màu sắc của khuẩn lạc quyết định màu của môi
trường nuôi cấy. Đối với khuẩn lạc có màu vàng, môi trường trong đĩa nuôi cấy
chuyển từ xanh sang vàng. Đối với khuẩn lạc xanh, màu sắc môi trường thay đổi

không đáng kể, màu xanh có thể nhạt đi hoặc không. Kết quả sự chuyển màu này là
do trong quá trình phát triển của vi khuẩn, các vi khuẩn có khả năng sử dụng đường
sucrose thì có khuẩn lạc màu vàng còn vi khuẩn không có khả năng sử dụng đường
sucrose thì khuẩn lạc sẽ có màu xanh [16].









Hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng hình tròn
hoặc tròn không đều, bìa nguyên hoặc gợn sóng, có tâm hoặc không có tâm ở giữa
khuẩn lạc, độ nổi từ lài đến mô. Kết quả này so với nghiên cứu về các dòng vi
Hình 2: Vi khuẩn đường ruột tôm trên môi trường TCBS
A: Khuẩn lạc vàng; B: Khuẩn lạc xanh

A B

22
khuẩn gây bệnh trên tôm sú của Bùi Quang Tề [5] và Đặng Thị Hoàng Oanh [4] là
phù hợp.

Y2
G2
Y5
G5 G4
G1
Hình 3: Các dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập
Y2: khuẩn lạc vàng, tròn không đều, không bóng
G1: khuẩn lạc xanh, tròn, bóng
G2: khuẩn lạc xanh, tròn, không bóng, có bao
Y5: khu
ẩn lạc v
àng, tròn, bóng


23
Trong 12 dòng vi khuẩn đã phân lập được, có 4 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc
màu vàng, 7 dòng màu xanh và 1 dòng màu xanh nhạt. Một số dòng vi khuẩn tạo

bao nhày xung quanh khuẩn lạc như G2, G4, G1, Y7. Sự hình thành bao nhày
(biofilm) của các dòng vi khuẩn giúp chúng hấp thu chất dinh dưỡng, kháng thuốc
kháng sinh và liên kết được với các tế bào khác hoặc với vật chủ [13]. Đường kính
khuẩn lạc biến thiên từ 0,5-4 mm. (Bảng 1)
Hình dạng tế bào vi khuẩn của 12 dòng vi khuẩn phân lập được đều có hình
que và hơi cong, và bắt màu hồng của sarafine khi nhuộm Gram chứng tỏ các dòng
vi khuẩn đều Gram âm. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Bùi Quang
Tể [5] và Đặng Thị Hoàng Oanh [4]. (Hình 4)
Bảng 1: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn
STT

Dòng
vi
khuẩn
Màu sắc Hình dạng Tâm

Dạng bìa
Độ
nổi
Kích
thước
(mm)
1 G1 Xanh Tròn + Nguyên Nổi 2-2,2
2 G2 Xanh Tròn - Nguyên Lài 1-1,5
3 G3 Xanh Tròn - Nguyên Nổi 1,2-1,7
4 G4 Xanh nhạt Tròn + Nguyên Lài 3-3,5
5 G5 Xanh Tròn + Nguyên Nổi 3,5-4
6 Y1 Vàng Tròn - Nguyên Nổi 0,5-1
7 Y2 Vàng Tròn - Răng cưa Lài 2,2-3
8 Y3 Vàng Tròn + Nguyên Nổi 2,2-3

9 Y4 Vàng Tròn + Răng cưa Lài 1,2-1,7
10 Y5 Vàng Không đều + Nguyên Nổi 2-2,5
11 Y6 Vàng Không đều - Răng cưa Lài 3,5-4
12 Y7 Vàng Tròn + Nguyên Nổi 2-2,5
Chú thích: “+“ có tâm, “-” không có tâm.

24










4.2. Khảo sát hoạt tính của cao lá cỏ mực
Trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao lá cỏ mực, dung
môi methanol được dùng để pha loãng cao chiết. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của
dung môi đối với sự phát triển của vi khuẩn là không đáng kể, dung môi không tạo
được vòng vô khuẩn đối với tất cả các dòng vi khuẩn. Như vậy, việc sử dụng
methanol làm dung môi để pha loãng cao chiết là thích hợp. Ở các nồng độ cao
chiết khác nhau, ở những dòng vi khuẩn khác nhau sẽ tạo được vòng vô khuẩn với
kích thước khác nhau.
Bảng 2: Khả năng kháng vi khuẩn đường ruột tôm của cao lá cây Cỏ Mực
khảo sát ở các nồng độ
STT

Dòng

VK
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
ở các nồng độ cao chiết khác nhau
MIC
(µg/mL) 8
µg/mL
16
µg/mL
32
µg/mL

64
µg/mL

128
µg/mL
1
G1
0
c

0
f

8,3
a

14,3
e

24,6
c

32
2
G2
15
ab

28
bc

21,6
ab

36,3
cd

40,3
b

 8
3
G3
14,3
b

18,6
de

33,6
b

29
b

59,6
a

 8
4
G4
23,6
ab

25,3
a

45
bc

34,6
a

57,3
a

 8
5
G5

30,3
a

26,3
ab

37
bc

40
bc

41,3
b

 8
6 Y1
11,6
b

28
bc

32
d

36,3
bcd

40,6

b

 8
Hình 4: Hình dạng vi khuẩn dưới
kính hiển vi quang học khi đã nhuộm
Gram


25
7
Y2
0
c

0
f

0
e

0
f

0
e

-
8
Y3
0

c

11,3
e

24,3
bc

30,6
d

35
b

16
9
Y4
19
b

25,6
cd

30
bc

33
d

37,3

b


8
10
Y5
0
c

0
f

0
e

0
f

0
e

-
11
Y6
0
c

0
f

3,3
c

12,6
e

10,3
d

32
12
Y7
23,6
ab

25,3
cd

29,3
d

35,6
bcd

41,3
b

 8
Cácchữ cái theo sau các giá trị trong cùng cột giống nhau thì không khác biệt có ý
nghĩa ở P<5%.

Kết quả thí nghiệm cho thấy cao lá cây cỏ mực có khả năng ức chế sự phát
triển của các dòng vi khuẩn đã phân lập tương đối cao. Đối với các dòng vi khuẩn
G2, G3, G4, G5, Y1 và Y7, cao chiết lá cỏ mực thể hiện tính kháng ngay ở nồng độ
8 µg/mL với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 10 mm. Do đó, đối với các dòng vi
khuẩn này, cần giảm nồng độ cao chiết để tìm được nồng độ ức chế tối thiểu của
cao chiết đối với sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết
đối với các dòng G2, G3, G4, G5, Y7 và Y4 là 6 µg/mL, dòng Y9 là 8 µg/mL, dòng
Y3 là 16 µg/mL, dòng G1 và Y6 là 32 µg/mL. Cao chiết không thể hiện tính kháng
đối với dòng Y2 và Y5. Có thể hai dòng vi khuẩn này có khả năng kháng lại các
chất diệt khuẩn có trong cao chiết hoặc do nồng độ cao chiết chưa đủ cao nên không
thể hiện hoạt tính. Như vậy, có thể tăng nồng độ cao chiết lớn hơn 128 µg/mL đối
với dòng Y2 và Y5 để có thể xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết đối với
hai dòng vi khuẩn này. (Bảng 2)
Ở mỗi nồng độ cao chiết, đường kính vòng kháng khuẩn khác biệt có ý nghĩa
ở một số dòng vi khuẩn và đối với một số dòng vi khuẩn khác thì sự khác biệt này
không có ý nghĩa về mặt thống kê. Ở nồng độ 8 µg/mL, khả năng kháng khuẩn của
cao chiết đối với dòng G1 và các dòng Y4, Y1, G3, Y6, Y3, G1 khác biệt có ý
nghĩa về mặt thống kê với P < 5%, tuy nhiên giữa dòng G7 với các dòng Y7, G4,
G2 sự khác biệt không có ý nghĩa. Ở các nồng độ khác cũng có sự khác biệt về
đường kính vòng vô khuẩn theo nhóm như trên (Phụ lục).