Nghiên cứu thu nhận và đánh giá tính chất của collagen từ vảy cá chẽm bằng phương pháp hóa sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

PHAN THỊ PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT
CỦA COLLAGEN TỪ VẢY CÁ CHẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HÓA SINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

PHAN THỊ PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT
CỦA COLLAGEN TỪ VẢY CÁ CHẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
HÓA SINH
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành:
Mã ngành:
Mã học viên:
Quyết định giao đề tài:
Quyết định thành lập hội đồng:
Ngày bảo vệ:
Người hướng dẫn khoa học:

Công nghệ sinh học
8420201
58CH301
745/QĐ-ĐHNT ngày 28/12/2017
1140/QĐ-ĐHNT ngày 10/09/2019
28/9/2019

TS. Nguyễn Văn Hòa
PGS.TS. Trang Sĩ Trung
Chủ tịch Hội Đồng:
TS. Khổng Trung Thắng
Phòng Đào tạo Sau Đại học:
KHÁNH HÒA - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu thu nhận và đánh giá
tính chất collagen từ vảy cá chẽm bằng phương pháp hóa sinh” là cơng trình
nghiên cứu của cá nhân tơi và chưa từng được cơng bố trong bất cứ cơng trình khoa
học nào khác cho tới thời điểm này.
Khánh Hòa, tháng 7 năm 2019
Tác giả

Phan Thị Phượng

iii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài “Nghiên cứu thu nhận và đánh giá tính chất collagen từ

vảy cá chẽm bằng phương pháp hóa sinh”. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với quý thầy
cô giáo Viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Trường - Trường Đại học Nha Trang đã truyền
đạt cho tơi những kiến thức bổ ích trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Hịa và PGS.TS. Trang Sĩ Trung
đã tận tình chỉ dẫn, định hướng, truyền thụ kiến thức trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Qua đây tơi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với các đồng nghiệp đã cùng sát
cánh, chia sẻ và động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài này.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân giúp đỡ, khích lệ tơi trong
suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Khánh Hòa, tháng 7 năm 2019
Tác giả

Phan Thị Phượng

iv


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.......................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................iv
MỤC LỤC .......................................................................................................................v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................ix
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ............................................................................................xi
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về collagen....................................................................................3
1.1.1. Thành phần cấu tạo, cấu trúc collagen ..................................................................4

1.1.2. Cấu trúc phân tử của collagen ...............................................................................6
1.1.3. Cấu trúc sợi của collagen.......................................................................................7
1.1.4. Phân loại collagen..................................................................................................8
1.1.5. Nguồn gốc thu nhận collagen ..............................................................................10
1.1.6. Phương pháp thu nhận .........................................................................................11
1.1.7. Tính chất của collagen.........................................................................................13
1.1.8. Ứng dụng của collagen ........................................................................................16
1.2. Collagen chiết xuất từ cá ........................................................................................19
1.3. Collagen thủy phân và Enzyme Pepsin ..................................................................21
1.3.1. Collagen thủy phân..............................................................................................21
1.3.2. Enyme Pepsin ......................................................................................................22
1.4. Cá và colagen chiết xuất từ cá chẽm ......................................................................23
1.4.1. Đặc điểm sinh học ...............................................................................................23
1.4.2. Đặc điểm phân bố ................................................................................................24
1.4.3. Cấu tạo vảy cá .....................................................................................................24
1.5. Một số nghiên cứu tách chiết collagen từ cá ..........................................................26
1.5.1. Nghiên cứu ngoài nước .......................................................................................26
1.5.2. Nghiên cứu trong nước ........................................................................................27
v


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................29
2.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................29
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ..................................................................................29
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................30
2.3.1. Quy trình chiết collagen từ vảy cá chẽm .............................................................30
2.3.2. Đánh giá tính chất sản phẩm và xử lý số liệu.....................................................33
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................40
3.1. Tính chất của nguyên liệu vảy cá ban đầu..............................................................40
3.2. Tiền xử lý nguyên liệu............................................................................................40

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình loại khống ...................................................42
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch EDTA..........................................................42
3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết collagen ...............................................45
3.5. Tính chất đặc trưng collagen thu được từ vảy cá ...................................................47
3.5.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................................47
3.5.2. Nhiệt độ biến tính của collagen ...........................................................................48
3.5.3. Tinh sạch sản phẩm LMWC................................................................................49
3.5.4. Khối lượng phân tử của collagen.........................................................................50
3.5.5. Thành phần axit amin có trong LMWC ..............................................................51
3.6. Quy trình đề xuất thu nhận collagen thủy phân......................................................52
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................54
4.1. Kết luận...................................................................................................................54
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................55
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ASC

Axit soluble collagen

Collagen hòa tan trong dung
dịch axit

BSE

Bovine Spongiform Encephalopathy

Bệnh bò điên

EDTA

Ethylen Diamin Tetra axetic Axit

Axit ethylendiamin tetra
axetic

FTIR

Fourrier Transformation Infrared

Phổ hồng ngoại chuyển đổi

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
LMWC

Low molecular weight collagen

Collagen phân tử lượng thấp

PSC

Pepsin soluble collagen

Collagen hòa tan trong dung
dịch pepsin

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Điện di gel polyacrylamide
Gel Electrophoresis

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần axit amin trong collagen và các loại protein khác .................. 4
Bảng 1.2: Sự phân bố các amino axit trong chuỗi polypeptide .................................. 5
Bảng 1.3: Phân loại và vị trí phân bố các loại collagen trong cơ thể người ............... 9
Bảng 1.4: Nguồn chiết collagen từ biển và một số loài tiềm năng ........................... 10
Bảng 1.5: Collagen hydrolysate trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo .................... 17
Bảng 1.6: Collagen hydrolysate sử dụng trong chế biến sữa .................................... 18
Bảng 1.7: Collagen hydrolysate trong quá trình lọc các sản phẩm đồ uống............. 18
Bảng 1.8: Ứng dụng của collagen hydrolysate trong công nghệ chế biến thịt ......... 18
Bảng 1.9: Thành phần hóa học cơ bản của vảy cá chẽm Châu Âu và vảy cá hồng đỏ ...... 25

Bảng 1.10: Thành phần khối lượng của một số loài cá có giá trị kinh tế.................. 25
Bảng 3.1: Thành phần hóa học cơ bản của vảy cá chẽm và vảy của một số loài cá khác.......40
Bảng 3.2: Kết quả cảm quan khảo sát nồng độ xử lý protein phi collagen............... 41
Bảng 3.3: Kết quả đánh giá cảm quan khảo sát nồng độ khử khoáng ...................... 41
Bảng 3.4: Kết quả đo độ nhớt của collagen .............................................................. 48
Bảng 3.5: Thành phần axit amin trong LMWC ........................................................ 51

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của hydroxyproline ...................................................... 5
Hình 1.2: Trình tự sắp xếp các amino axit trong phân tử Collagen ............................ 6
Hình 1.3: Cấu trúc của Tropocollagen (triple helix) ................................................... 6
Hình 1.4: Liên kết ngang giữa các phân tử Tropocollagen ......................................... 7
Hình 1.5: Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen ........ 7
Hình 1.6: Cấu trúc sợi của collagen ............................................................................ 7
Hình 1.7: Một vài dạng sinh học của collagen............................................................ 8
Hình 1.8: Viên bao nang cứng................................................................................... 16
Hình 1.9: Viên bao nang mềm .................................................................................. 16
Hình 1.10: Các bọt collagen có tác dụng cầm máu................................................... 17
Hình 1.11: Collagen dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ ............................................... 17
Hình 1.12: Collagen đối với da ................................................................................. 17
Hình 1.13: Mặt nạ collagen thủy phân ...................................................................... 17
Hình 1.14: Biểu đồ so sánh sự hấp thu collagen chiết xuất từ lợn và chiết xuất từ cá ...... 19
Hình 1.15: Chiết collagen từ da cá trống đen............................................................ 21
Hình 1.16: Những lợi ích khác mà collagen thủy phân mang lại cho cơ thể con người .. 21
Hình 1.17: Quá trình phân hủy collagen thành collagen thủy phân.......................... 22
Hình 1.18: Cấu trúc của Enyme pepsin..................................................................... 22
Hình 1.19: Chức năng của Pepsin và ứng dụng ........................................................ 22

Hình 1.20: Cá chẽm................................................................................................... 23
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng qt....................................................................... 30
Hình 2.2: Máy phân tích FTIR .................................................................................. 38
Hình 3.1: Ảnh chụp vảy cá trước (bên trái) và sau (bên phải) quá trình tiền xử lý .... 42
Hình 3.2: Ảnh chụp vảy cá trước (bên trái) và sau (bên phải) q trình loại khống........42
Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ EDTA đến hiệu suất loại khống trong vảy cá.. 43
Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất loại khống trong vảy cá ............ 44
Hình 3.5: Dịch chiết collagen sau khi thủy phân ...................................................... 45
ix


Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ axit axetic đến hiệu suất thủy phân LMWC...... 46
Hình 3.7: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/vảy cá đến hiệu suất thu hồi LMWC ......... 46
Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất thu hồi LMWC .................. 47
Hình 3.9: Phổ FTIR của (a) vảy cá, (b) vảy cá sau khử protein phi collagen, (c)
LMWC....................................................................................................................... 47
Hình 3.10: Đồ thị độ nhớt của collagen .................................................................... 48
Hình 3.11: Kết quả điện di SDS-PAGE của các mẫu LMWC thu được sau 12 giờ, 18
giờ và 24 giờ thẩm tích.............................................................................................. 49
Hình 3.12: Kết quả điện di SDS-PAGE của các mẫu LMWC thu được sau (a) 36 giờ,
(b) 24 giờ, (c) 12 giờ thủy phân ................................................................................ 50
Hình 3.13: Phổ sắc ký mẫu LMWC từ vảy cá chẽm................................................. 51

x


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Năm 2018, sản lượng thủy sản đạt con số cao nhất từ trước đến nay, với 7.74
triệu tấn, tăng 7,2% so với năm trước, lập mốc 9 tỷ USD (tongcucthuysan.gov.vn).
Theo Viện nghiên cứu hải sản (Viện NCHS), hiện nay cả nước ta có 1.015 cơ sở chế

biến (CSCB) thủy sản quy mô lớn nhỏ khác nhau, sản xuất sản phẩm XK và tiêu
dùng nội địa. Sự phát triển nhanh chóng của ngành chế biến cũng kéo theo những
bất cập trong các lĩnh vực phụ trợ khác, trong đó có quản lý và xử lý chất thải sau
chế biến, bởi các chất thải này có khả năng làm xuống cấp nghiêm trọng chất lượng
môi trường sống xung quanh. Hiện thực, mục tiêu có tính cấp thiết đặt ra cho ngành
chế biến là chế biến sâu và “chế biến hết” trong tái cơ cấu sản xuất, đẩy mạnh ứng
dụng công nghệ chế biến các phụ phẩm.
Trong những năm qua, nghề nuôi biển ở nước ta liên tục phát triển. Các lồi cá
ni phổ biến nhất là cá song (chiếm xấp xỉ 50%), cá giò (30%) và chẽm (7 - 8%).
Nuôi cá chẽm được phân bố dọc theo bờ biển các tỉnh như Quảng Ninh, Hải Phòng,
Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hịa, Bình Thuận, Bà
Rịa - Vũng Tàu, Nam bộ và quần đảo Trường Sa với 2 lồi chính là cá chẽm (Lates
calcarifer) và cá chẽm mõm nhọn (Psammoperca waigiensis). Cá chẽm sau thu
hoạch chủ yếu được chế biến và xuất khẩu. Trong quá trình chế biến cá phi lê chỉ có
khoảng 30% - 40% là thịt cá, còn lại một lượng lớn là phế liệu chiếm khoảng 60 70% bao gồm vây, vảy, đầu, nội tạng, gan, xương,... Hầu hết các phế liệu này chưa
được sử dụng một cách hiệu quả để thu nhận các sản phẩm có giá trị gia tăng.
Collagen là một loại protein chiếm tới 25-35% tổng lượng protein trong cơ
thể người. Collagen có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau.
Trong thực tế, collagen sử dụng cho người được tìm thấy trong các sản phẩm thực
phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Cho đến nay, nguồn nguyên liệu chủ yếu chiết tách
collagen trên thế giới có nguồn gốc từ da lợn, cao nhất khoảng 46%, tiếp theo là da
bò (29,4%), xương (23,1%) và các nguồn khác (1,5%). Tuy nhiên, bệnh lở mồm
long móng ở lợn và bệnh bò điên đã gây ra những lo ngại về sự an toàn của collagen
chiết xuất từ lợn và bị. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã và đang tìm nguồn chiết
collagen thay thế, trong đó có nguồn nguyên liệu từ biển như sứa, bạch tuộc, sao
biển, cua, da cá và vảy cá. Hơn nữa, việc sử dụng vảy cá để thu nhận collagen không
chỉ làm giảm ô nhiễm mà cịn có thể thu hồi được sản phẩm có giá trị gia tăng cao.
xi

Do đó, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu thu nhận collagen từ vảy cá. Tuy nhiên,
các nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết thu nhận collagen. Trong khi,
collagen có khối lượng phân tử thấp mới được cơ thể và da người hấp thu dễ dàng.
“Nghiên cứu thu nhận và đánh giá tính chất collagen từ vảy cá chẽm bằng
phương pháp hóa sinh”, Collagen có độ tinh khiết cao được tách chiết từ vảy cá
chẽm và thủy phân sử dụng pepsin nhằm hướng đến sử dụng trong thực phẩm, mỹ
phẩm và y dược.
Phương pháp tách chiết: Phương pháp hóa sinh, sử dụng tác nhân thân
thiện với môi trường. Sử dụng EDTA- axit hữu cơ trong quá trình khử khống, thủy
phân thu hồi collagen sử dụng enzyme pepsin.
Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình thu nhận và đánh giá tính chất collagen
có khối lượng phân tử thấp (< 50kDa) từ vảy cá chẽm.
Kết quả thu được: LMWC có thể được thu nhận từ vảy cá chẽm (Lates
calcarifer) với điều kiện xử lý thích hợp nhất là khử protein phi collagen với NaOH
0,2M (tỷ lệ vảy cá/dung dịch NaOH 1/20) trong 24 giờ; khử khoáng bằng EDTA
0,5M (tỷ lệ vảy cá/dung dịch EDTA 1/10) trong 24 giờ; sau đó thủy phân với thời
enzyme pepsin, thời gian 36 giờ, tỷ lệ enzym/vảy cá (0,100 wt.%). Sản phẩm thu
được có khối lượng phân tử thấp (khoảng 10 kDa) và độ tinh khiết cao.
Từ khóa: Vảy cá chẽm; collagen; phế liệu thủy sản; sản phẩm giá trị gia tăng

xii


LỜI MỞ ĐẦU
Đường bờ biển Việt Nam kéo dài 3260 km, hệ thống sơng dày đặc và khí hậu
thuận lợi đã biến thuỷ sản trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của nước
ta. Cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng và xuất khẩu các mặt hàng thủy sản,
một lượng lớn các phế liệu bị thải ra như nội tạng, đầu, da, xương, vảy…lượng phế
liệu này nếu khơng được xử lý thích hợp sẽ dẫn đến ô nhiễm môi trường và đặc biệt
lãng phí. Trong khi, các phế liệu này chứa nhiều hợp chất có giá trị cao như collagen,

astaxanthin, lipid,….là nguyên liệu cho nhiều ngành sản xuất khác như: phân bón, chế
biến thức ăn gia súc, làm bao bì sinh học, cơng nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm,…
Collagen là protein được sử dụng nhiều trong ngành sản xuất thực phẩm, dược
phẩm và mỹ phẩm....Hiện nay, collagen thương mại chủ yếu được tách chiết từ da và
xương của trâu, bò, lợn. Tuy nhiên, do sự bùng phát của bệnh lở mồm long móng do
đó từ năm 1990 bắt đầu một hướng chuyển biến mới: bắt đầu “tách chiết collagen từ
da cá”. Phát minh này của các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học Gdansk (Ba Lan) đã
gây tiếng vang mạnh mẽ trên toàn cầu. Trong những năm gần đây nhiều quốc gia như:
Mỹ, Pháp, Đức, Ba Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc đã đầu tư hàng triệu đôla vào nghiên
cứu thu nhận collagen để làm nguyên liệu sản xuất da nhân tạo, chỉ tự tiêu, thuốc mỡ
điều trị bỏng và các sản phẩm làm đẹp như mặt nạ, kem dưỡng da, dầu dưỡng tóc, …
Đặc biệt, collagen có phân tử lượng thấp dễ dàng hấp thu hơn nhiều so với collagen
thơng thường.
Với mong muốn góp phần nâng cao giá trị kinh tế của cá chẽm; đồng thời cũng
góp phần vào việc giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thu
nhận và đánh giá tính chất collagen từ vảy cá chẽm bằng phương pháp hóa sinh”.
Mục tiêu là bước đầu xây dựng một quy trình thu nhận collagen có phân tử lượng thấp,
độ tinh khiết cao sử dụng tác nhân phản ứng thân thiện với môi trường, hướng đến ứng
dụng trong sản xuất ở quy mơ lớn.
Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng quy trình thu nhận và đánh giá tính chất collagen thủy phân từ vảy cá chẽm.
Nội dung nghiên cứu
-

Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu.

-

Khảo sát điều kiện khử khoáng: nồng độ, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ…

-

Khảo sát điều kiện thủy phân: nồng độ, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ,…

-

Đánh giá tính chất, cấu trúc của sản phẩm thu được.
1


Ý nghĩa khoa học của đề tài
Xây dựng quy trình thu nhận collagen thủy phân từ vảy cá chẽm sử dụng tác
nhân thân thiện môi trường.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Nâng cao giá trị kinh tế cho nguồn phế liệu vảy cá chẽm.
Đối tượng nghiên cứu
-

Vảy cá chẽm.

-

Collagen phân tử lượng thấp.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về collagen
Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen

cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc.
Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 25% - 35% tổng
lượng protein trong cơ thể ở các động vật có xương sống. Collagen được phân bố
trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, răng, hệ thống mạch máu của động vật và có
mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ và là thành phần chính của dây
chằng và gân,.. [6].
Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân
bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học
của da như : sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm,...Nó đóng vai trị kết nối tế bào, kích
thích q trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da. Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện
sống và tác động của mơi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, khi đó sợi
collagen sẽ mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá hủy. Chính vì
vậy mà collagen đóng vai trị là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành
thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng...
Collagen cũng được phân bố ở giác mạc, và tồn tại dưới dạng tinh thể. Trong
mô cơ, collagen chiếm khoảng từ 1% đến 2%.
Collagen là thành phần chính của mơ liên kết, có chức năng tạo độ vững chắc
và đàn hồi. Collagen có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại với
nhau để hình thành các mơ và cơ quan nền tảng trong cơ thể. Collagen cung cấp cho
các mơ liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp
mang tính cấu trúc của nó. Trong gân và dây chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ
cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn hồi. Collagen cịn là chất nền hữu cơ có
trong xương và men răng giúp chúng chống lại sự rạn nứt. Nó là thành phần chính
trong da, mạch máu, các cơ. Bên cạnh các chức năng cơ học, ở giác mạc, thủy tinh thể,
trật tự cấu trúc của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt duy trì thị lực.
Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng. Sự linh hoạt của nó là
nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, nhiều tính chất khác nhau nên có nhiều chức năng
khác nhau [7].
3

1.1.1. Thành phần cấu tạo, cấu trúc collagen
Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại amino axit. Thành
phần amino axit có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc của collagen, nhưng vẫn tồn tại
một vài tính chất chung và duy nhất cho tất cả collagen.
Bảng 1.1: Thành phần axit amin trong collagen và các loại protein khác [6]
Thành phần (số gốc/1000gốc)

Collagen

Casein

Albumin

Glycine

363

30

19

Alanin

107

43

35

Valine

29

54

28

Leucine

28

60

32

Isoleucine

15

49

25

Serin

32

60

36

Threonine

19

41

16

Cystein

-

2

1

Methionine

5

17

16

Aspatic axit

47

63

32

Glutamic axit

77

153

52

Lycine

31

61

20

Hydroxylycine

7

-

-

Arginine

49

25

15

Histidine

5

19

7

Phennylalanine

15

28

21

Tyrosine

5

45

9

Trytophan

-

8

3

Proline

131

65

14

Hydroxyproline

107

-

-

Trong thành phần collagen chứa một lượng lớn glycine (Gly), chiếm khoảng
33% và proline (Pro), chiếm tỉ lệ 12% và hydroxyproline (Hyp), chiếm tỉ lệ 22% [6].
Collagen là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngồi ra trong
thành phần Collagen cịn chứa khoáng, chiếm tỉ lệ 1%.
Hydroxyproline là một axit amin đặc trưng của collagen mà các loại protein
khác khơng có. Hydroxyproline được hình thành sau quá trình điều chỉnh proline khi

được kết hợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y. Hydroxyproline có cơng thức phân tử
4


là C5H9NO3, khác với proline, trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn nhóm OH nằm
ở vị trí cacbon gamma, axit amin này có vai trị quan trọng trong sự ổn định cấu trúc
của collagen, là dẫn xuất của proline trong q trình hình thành chuỗi collagen có sự
xúc tác của enzyme hydroxylase proline và sự có mặt của Vitamin C để giúp bổ sung
thêm oxy, thiếu vitamin C sẽ làm chậm quá trình tổng hợp hydroxyproline, ảnh hưởng
đến quá trình xây dựng cấu trúc protein gây ra những rối loạn trong cơ thể.

Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo của hydroxyproline [24]
Phân tử collagen bao gồm 3 chuỗi xoắn lại với nhau tạo thành collagen triplehelix tạo thành cấu trúc 3D- một mơ hình lý tưởng cho các liên kết hydro giữa các
chuỗi. Mỗi chuỗi trong triple-helix quay theo chiều kim đồng hồ. Triple-helix dài xấp
xỉ 300nm và mỗi chuỗi có khối lượng phân tử khoảng 105 kDa. Triple-helix được ổn
định bởi liên kết hydro giữa các chuỗi. Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương tác
giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực
mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen. Sự biến tính
collagen làm cho các cầu nối bị tách một phần hoặc hoàn toàn gây nên sự tách rời các
chuỗi do phá hủy các liên kết hydro, chính điều này làm mất đi cấu trúc triple-helix.
Mơ hình “ triple-helix” của collagen dựa trên những nghiên cứu về hiện tượng nhiễu
xạ sợi. Chuỗi nhiễu xạ sợi thể hiện trên mức trung bình của tồn bộ phân tử collagen ,
và mơ hình đặc trưng thể hiện đó là sự sắp xếp lặp đi lặp lại của các chuỗi polypeptid,
thông thường là Gly-Pro-Hyp.
Bảng 1.2: Sự phân bố các amino axit trong chuỗi polypeptide [24]
Triple helix

Tỉ lệ so với tổng bộ ba(%)

Gly – X – X

44

Gly – X – Y

20

Gly – Y – X

27

Gly – Y – Y

9

Collagen cũng chứa các đơn vị carbonhydrate, cả monosaccharide galactose
hoặc disaccharide glucosylgalactose, liên kết với hydroxylysine thơng qua nhóm
hydroxyl chức năng của amino axit. Tỷ lệ của mono/disaccharide phụ thuộc vào loại
5


collagen và tình trạng sinh học. Chức năng của các đơn vị carbohydrate vẫn chưa được
hiểu biết đầy đủ, nhưng ảnh hưởng của chúng trong việc gắn kết phần bên phân tử
collagen hình thành nên sợi và bán kính của sợi đang được nghiên cứu.
Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùng gồm khoảng 9  26 amino axit
tại các điểm đầu mút amino hay carboxyl của chuỗi. Các vùng này không tham gia với
cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide
1.1.2. Cấu trúc phân tử của collagen

Hình 1.2: Trình tự sắp xếp các amino axit trong phân tử Collagen [6]

Phân tử collagen là một protein hình trụ, có cấu trúc bậc 4, do các đơn vị
tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có
nhiều mức cấu trúc. Đơn vị cơ bản của collagen là “Tropocollagen”, liên kết với nhau
tạo thành những sợi nhỏ. Tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài
khoảng 300nm, đường kính 1.5nm, gồm ba sợi polypeptide (còn gọi là 3 chuỗi ) cuộn
lại với nhau, mỗi chuỗi  cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3
gốc trên một vòng xoắn, hay cịn gọi là chuỗi xoắn 3.

Hình 1.3: Cấu trúc của Tropocollagen (triple helix) [11]
Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng các
liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau
một khoảng 67nm và có 1 khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ
vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi
collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng. Vì
thế collagen rất chắc, dai và bền.
6


Hình 1.4: Liên kết ngang giữa các phân tử Tropocollagen [11]
Các tropocollagen sẽ liên kết ngang với nhau theo kiểu cộng hóa trị và chính
nhờ vào liên kết này mà các phân tử tropocollagen hình thành nên sợi collagen. Các
sợi collagen rất dài và mảnh, chúng sắp xếp tạo thành mạng collagen [10,11].

Hình 1.5: Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen [11]
1.1.3. Cấu trúc sợi của collagen
Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao
gồm những sợi mảnh, nhỏ. Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp
với nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm từ 4  8 phân tử collagen
hoặc với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril). Những sợi này có đường kính
từ 10  500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển. Các sợi collagen sẽ thiết

lập nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi (fiber bundle).

Hình 1.6: Cấu trúc sợi của collagen [12]
7


Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen. Các
vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn. Các sợi lớn hơn sẽ kết hợp với nhau tạo thành
những bó sợi collagen. Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thức kết hợp và
mức độ tập trung khác nhau trong các mơ khác nhau để cung cấp các đặc tính khác
nhau của mô. Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi
với tính chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có
một khoảng trống khoảng 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau. Nhờ vào cấu trúc có
thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, tạo
cho các mô có được độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng biệt [6, 12].
1.1.4. Phân loại collagen
Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng.

Hình 1.7. Một vài dạng sinh học của collagen [13]
Chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 28 loại collagen. Họ
collagen được phân loại thành những phân họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các
siêu phân tử. Sự phân bố trong các mơ của những loại protein khác nhau thể hiện tính
đa dạng và phạm vi đáng chú ý, từ những loại collagen riêng biệt như collagen II, X có
trong sụn đến những loại collagen dạng sợi phân bố rộng khắp như collagen I và V.
Những loại collagen khác nhau thực hiện những chức năng chun dụng trong
các mơ và có phương thức sắp xếp riêng biệt của các siêu phân tử. Dựa theo cấu trúc
và cách tổ chức sắp xếp các phân tử trong chuỗi, collagen được phân chia thành 7
nhóm chính: collagen dạng hình sợi, FACIT collagen, collagen dạng mạng, collagen
dạng giữ chặt, collagen chuyển màng, collagen màng nền và các loại collagen có chức
năng duy nhất khác. Những loại collagen này khác nhau về chiều dài của chuỗi xoắn

ốc cũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắn ốc.
8


Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da,
xương, gân. Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn. Collagen loại III lại phụ
thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật.
Bảng 1.3: Phân loại và vị trí phân bố các loại collagen trong cơ thể người [13]
Dạng collagen
Loại
Cấu tạo phân tử
Phân bố
I
[1(I)]2 2(I)] Xương, gân, dây chằng, giác mạc,..

Collagen dạng sợi

II

[1(II)]3]

Sụn, thủy tinh thể, ...

III

[1(III)]3]

Da,thành mạch máu, lưới sọi của cá
mô( phổi, gan, lách,...

V

1(V), 2(V),3(V)

Phổi, giác mạc, xương,...

XI

1(XI)2(XI)3(XI)

Sụn, thủy tinh thể,...

IV

[1(IV)]2 2(IV)]1 - 2

Collagen vi sợi

VI

1(VI), 2(VI),3(VI)

Sợi neo collagen

VII

Màng nền

Màng nền

collagen

[1(VII)]3

Sụn, phổi, thành mạch máu,
Da, vùng chuyển tiếp biểu bì - da,
niêm mạc miệng,...

Dạng mạng lưới

VIII
X

lục giác collagen
XI

FACIT collagen

[1(VIII)]2 2(VIII)]
[3(X)]3
1(IX)2(IX)3(IX)

Màng tế bào,...
Sụn,...
Sụn, dịch thủy tinh, giác mạc,...

XII

[1(XII)]3

Màng sụn, dây chằng, gan,...

XIV

[1(XIV)]3

Gan, thành mạch máu, phổi, cơ vân,...

XIX

[1(XIX)]3

Sarcoma cơ vân của con người

XX

[1(XX)]3

Biểu mô giác mạc, phôi da, xương ức
sụn, gân,...

XXI

[1(XXI)]3

Thành mạch máu,...

XIII

[1(XIII)]3

Biểu bì, nang tóc, ruột, sụn bào, phổi,
gan,...

Collagen chuyển

XVII

[1(XVII)]3

màng

XV

[1(XV)]3

Vùng chuyển tiếp biểu bì – da,...
Nguyên bào sợi, các té bào cơ trơn,
thận, tụy,..

XVI

[1(XVI)]3

Nguyên bào sợi, phiến keratin,...

XVII

[1(XVII)]3

Phổi, gan,...

9


Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV. Những bệnh
tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gene ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp,
sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách bình
thường [13,14].
1.1.5. Nguồn gốc thu nhận collagen
 Nguồn nguyên liệu tự nhiên
Hai nguồn chiết collagen chính là từ động vật và thực vật.
Nguồn động vật phổ biến là bò, gà, heo..và cá.. Collagen chiết từ nguồn này
ứng dụng nhiều trong y học, phẫu thuật cấy ghép các mơ mềm vì tính tương thích sinh
học. Nguồn động vật trên cạn bao gồm gà, đuôi kangaroo, gân đuôi chuột, chân vịt,
gân ngựa, da và xương cá sấu , chân chim, da cừu và da ếch. Loại I và II chiết từ da
ngựa, sụn và uốn. Loại I, II, III và V chiết từ cổ gà. Loại IX được tìm thấy trong phơi
gà, I và III từ da và IV từ gân gà . Các nguồn này dễ kiếm và giá rẻ, nhưng sau một
thời gian sử dụng thì gây ra một số bệnh như dị ứng, ung thư xương. Để giải quyết vấn
đề này, các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu tới nguồn chiết collagen có tính khả thi từ
biển, collagen nguồn này được cho là khơng có bệnh truyền nhiễm, ngun liệu rẻ và
tận dụng được từ các phế phẩm trong chế biến thủy sản, một số nguồn được đề cập
trong bảng dưới đây [32].
Bảng 1.4: Nguồn chiết collagen từ biển và một số loài tiềm năng
Nguồn
Cá

Bộ phận
Da, xương, vây, vảy…collagen chiếm 50-70%, ví dụ: cá tuyết, cá cháy,
cá trống đen, cá tráp có răng, cá chẽm, tách chiết collagen type I.

Bọt biển

Là nguồn nguyên liệu giàu collagen type I và IV, các lồi điển hình
Geodia cydonium, Speriditae, and Icinia fusca.

Cá Sứa

Collagen chiếm 60%, nguồn chiết collagen type IV, V và II, gồm các
loài như Rhopilema asamushi, Stomolophus meleagris, Catostylus tagi
và Rhizostoma pulmo.

 Nguồn thực vật
Collagen có nguồn gốc từ thực vật chủ yếu ở các cây họ đậu: đậu phộng, đậu
nành, đậu đen, đậu đũa… Trong đó, hàm lượng collagen trong hạt đậu nành là nhiều
nhất. Collagen thực vật chiết xuất 100% từ thực vật, có tính chất dễ tan trong nước nên
thường được bổ sung vào các sản phẩm nước uống trái cây, giúp cơ thể dễ hấp thụ và
phát huy hiệu quả đối với sức khỏe cũng như sắc đẹp của làn da [32].
10


 Nguồn nguyên liệu nhân tạo
Vật liệu sinh học có tên KOD bắt chước hoạt tính của collagen tự nhiên – một
protein trong cơ thể có chức năng kết nối các tế bào với nhau thành các mô và nội
tạng. Nó được cấu tạo từ 36 axít amin có khả năng tự ráp nối thành các cấu trúc sợi
nano và gel nước (hydrogel). Trình tự của peptide là (Pro-Lys-Gly) (Pro-Hyp-Gly)
(Asp-Hyp- Gly), và trong axit amin một chữ cái, viết tắt là (PKG) (PO- G) (DOG), đặt
tên là KOD. Các thử nghiệm trong phịng thí nghiệm cho thấy KOD giữ chặt các tế
bào hồng cầu (tế bào máu) để ngăn chảy máu. Song song đó, nó kết dính và kích hoạt
các tiểu cầu để hình thành những cục máu kích thích làm lành vết thương. Đặc biệt,

KOD không hề gây ra bất kỳ triệu chứng viêm nhiễm nào [31].
1.1.6. Phương pháp thu nhận
Collagen về cơ bản có thể thu nhận bằng hai phương pháp: Phương pháp thủy
phân hóa học và phương pháp thủy phân enzyme. Phương pháp hóa học sử dụng phổ
biến hơn trong công nghiệp nhưng chất lượng sản phẩm chiết từ phương pháp thủy
phân chất lượng hơn, dư lượng hóa chất thải ra mơi trường rất ít bởi vậy chi phí xử lý
ít hơn rất nhiều, nhưng giá thành sản phẩm cao hơn.
 Phương pháp thủy phân axit
Dung dịch chiết được hịa tan trong dung dịch muối trung tính chẳng hạn như
natri clorua (NaCl), Tris-HCl (Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride),
phốt phát hoặc citrat. Vì phần lớn các phân tử collagen được liên kết chéo, nên phải
chọn nồng độ mưới cho phù hợp, đây là một hạn chế của phương pháp này.
Thủy phân axit có thể được thực hiện bằng cách sử dụng các axit hữu cơ như
axit axetic, axit citric và axit lactic và axit vô cơ như hydrochloric axit. Tuy nhiên, axit
hữu cơ hiệu quả hơn axit vô cơ. Axit hữu cơ có khả năng hịa tan collagens khơng liên
kết và cũng phá vỡ một số của các liên kết chéo giữa các sợi trong collagen, dẫn đến
đến độ hịa tan cao hơn của collagen trong q trình chiết xuất . Do đó, các axit hữu
cơ, đặc biệt là axit axetic, thường được sử dụng để chiết xuất collagen. Để chiết xuất
collagen hòa tan trong axit, dung dịch tiền xử lý thường bổ sung axit, thường là axit
axetic 0,5 M.
Ưu nhược điểm của phương pháp này:
Nhanh, hiệu suất cao.
Có thể cịn dư lượng hóa chất, ảnh hưởng đến chất lượng collagen.
Chi phí xử lý chất thải lớn
11


Thủy phân enzyme
Để chiết collagen bằng phương pháp này, ta sẽ chọn dung dịch tách chiết là axit
axetic 0,5M có chứa enzyme, có thể là pepsin, Alcalase® and Flavourzyme®. Hốn

hợp này khuấy liên tục trong 48 giờ ở 4oC, sau đó lọc, dịch lọc được kết tủa, ta thu
được dung dịch collagen hịa tan.
Phương pháp chiết xuất này có thể ảnh hưởng đến chiều dài của chuỗi polypeptide
và các tính chất của collagen, như độ nhớt, độ hòa tan, cũng như khả năng giữ nước và
khả năng nhũ hóa. Điều này thay đổi tùy theo các thông số xử lý (enzyme, nhiệt độ,
thời gian và pH), tiền xử lý, phương pháp bảo quản và các tính chất của ngun liệu
thơ ban đầu . Do đó, q trình thủy phân phải được kiểm soát cấu trúc của và yêu cầu
chất lượng collagen thu được, hay cho ứng dụng nhất định. Điều này, phụ thuộc việc
sử dụng các enzyme phân giải protein động vật hoặc thực vật được lựa chọn, chẳng
hạn như trypsin, chymotrypsin, pepsin, negase, alcalase, collagenase, bromelain và papain
cho phép kiểm soát mức độ phân cắt của protein.
Thủy phân enzyme có một số ưu điểm so với thủy phân hóa học, như tính đặc
hiệu, kiểm sốt mức độ thủy phân, điều kiện hoạt động vừa phải, và hàm lượng muối
thấp hơn trong dịch thủy phân cuối cùng. Hơn nữa, enzyme thường có thể được sử
dụng ở nồng độ rất thấp và không cần thiết phải loại bỏ chúng khỏi môi trường . Mặc
dù chi phí cao cho q trình thủy phân enzyme, nhưng thực tế là nó dẫn đến mức chất
thải thấp hơn, kiểm sốt tốt hơn q trình và năng suất cao hơn.
Ưu nhược điểm của phương pháp này:
Thu được collagen sạch, khơng sợ nhiễm hóa chất độc hại;
Thân thiện với môi trường.
Thời gian tách chiết dài.
Chiết collagen bằng sóng siêu âm
Siêu âm là một q trình sử dụng năng lượng của sóng âm thanh được tạo ra với
tần số cao hơn tần số nghe của con người. Siêu âm đã được sử dụng thành công trong
chiết xuất collagen, nó giảm thời gian xử lý và tăng năng suất chiết ( thời gian có thể
giảm từ 24-45 giờ và năng suất tăng hơn 4%). Ảnh hưởng của siêu âm trong các hệ
thống chất lỏng chủ yếu là do hiện tượng được gọi là xâm thực. Trong quá trình siêu âm,
bong bóng tạo bọt nhanh chóng được hình thành, sau đó nổ ra, dẫn đến nhiệt độ và áp
suất cực cao. Điều này dẫn đến nhiễu loạn và tạo ra các lỗ hổng trong vùng xâm nhập.
12

Tuy nhiên, các nghiên cứu về ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt động của enzyme
vẫn còn rất hạn chế, do hoạt động của các enzyme có thể được điều chỉnh bằng siêu
âm, chủ yếu là do những thay đổi trong cấu trúc bậc hai và bậc ba của chúng. Áp dụng
siêu âm trong một thời gian dài có thể làm tăng nhiệt độ và độ bền cắt, cũng như áp
lực cao trong mơi trường. Nó cũng có thể phá vỡ các liên kết hydro và lực van der
Waals trong chuỗi polypeptide, dẫn đến sự biến tính của enzyme [31].
1.1.7. Tính chất của collagen
Collagen là một protein cấu trúc. Chính vì vậy collagen cũng có đầy đủ các tính
chất hóa lý của một protein.
a. Tác dụng với nước
Collagen khơng hịa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, nguyên nhân là do
tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng
phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen.
Cứ 100g collagen khơ có thể hút được khoảng 200g nước. Collagen kết hợp với
nước nở ra trong nước, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lên khơng đáng
kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3 lần [12, 13].
b. Tác dụng với và kiềm
Collagen có thể tác dụng với axit và kiềm, do trên mạch của collagen có gốc
carboxyl và amin. Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó. Trong điều kiện có axit
tồn tại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bị ức chế ( hình thành
axit yếu có độ ion hóa thấp). Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+.
Trong điều kiện có nước, nước có thể tác dụng với nhóm gốc có mang điện
trong kết cấu protide và những ion Na+, Cl- hình thành tác dụng hợp nước phụ của
collagen, khiến collagen trong môi trường axit, kiềm có độ hút nước cao hơn trong
nước ngun chất. Ngồi ra axit và kiềm có thể làm cho collagen biến đổi như sau:
-

Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa –NH3+…COO-) làm đứt mạch peptide trong

mạch chính.

-

Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO…NH– của mạch xung quanh nó.

-

Làm axit amin bị phân hủy giải phóng amoniac.
Cùng với những biến đổi đó, điểm đẳng điện của collagen hạ xuống thấp, (vì

những biến đổi đó mang tính chất thủy phân làm cho các nhóm gốc có tính hoạt động
tăng lên nhiều).
13