Nghiên cứu phương pháp tạo hạt nano chitosan định hướng ứng dụng bảo quản thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

NGUYỄN THỊ KIM THOA

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TẠO HẠT NANO CHITOSAN
ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
Mã số: 60 54 01 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 06 năm 2016


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: TS.Trần Bích Lam

Cán bộ chấm nhận xét 1:TS. Hoàng Kim Anh

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Phan Ngọc Hòa

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 11 tháng 07 năm 2016.

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn

2. TS. Hồng Kim Anh
3. TS. Phan Ngọc Hịa
4. TS. Lê Trung Thiên
5. TS. Tôn Nữ Minh Nguyệt
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA

GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn

GS.TS. Phan Thanh Sơn Nam


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

------------------------

-----------------------------------

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Thị Kim Thoa

MSHV: 13111030

Ngày sinh: 18/09/1985

Nơi sinh: Đồng Nai

Chuyên ngành: CN Thực Phẩm

Mã số: 60 54 01 01

I. Tên đề tài
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP TẠO HẠT NANO CHITOSAN ĐỊNH
HƢỚNG ỨNG DỤNG BẢO QUẢN THỤC PHẨM

II. Nhiệm vụ và nội dung
Nhiệm vụ
 Khảo sát phƣơng pháp tạo hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ion với
STPP, dƣới sự hỗ trợ của sóng siêu âm kết hợp với đồng hóa
Nội dung
 Khảo sát các điều kiện tạo hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel với STPP
dƣới sự hỗ trợ của sóng siêu âm, sóng siêu âm kết hợp đồng hóa.
 Xác định điều kiện tạo hạt nano chitosan thích hợp nhằm thu đƣợc kích thƣớc hạt
nhỏ nhất theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm.
 Đánh giá ảnh hƣởng của nguyên liệu đến khả năng tạo hạt nano chitosan
 Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của dung dịch nano chitosan ở điều kiện in
vitro


III. Ngày giao nhiệm vụ

11/01/2016

IV. Ngày hoàn thành nhiệm vụ
17/06/2016

V. Cán bộ hƣớng dẫn
TS. Trần Bích Lam
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 06 năm 2016
Cán bộ hƣớng dẫn

TS. Trần Bích Lam

Chủ nhiệm bộ mơn

GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn

Trƣởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học

GS.TS. Phan Thanh Sơn Nam


LỜI CẢM ƠN
Ngày đƣợc tin mình đậu cao học BK là một ngày vui, nó mở đầu cho chặng đƣờng
mới với nhiều hy vọng về một tƣơng lai tốt đẹp hơn, nhƣng để có thể đến đƣợc hội
trƣờng A5, đó thật sự là một con đƣờng chơng gai. Đã có lúc tôi mệt mỏi cực độ với
các báo cáo, các kỳ thi, đã có lúc tơi muốn bỏ cuộc khi các thí nghiệm cứ làm hồi mà
kết quả mong muốn vẫn chƣa thấy đâu. Những lúc nhƣ vậy, gia đình, bạn bè, thầy cô
và đặc biệt là Cô hƣớng dẫn của tơi TS. Trần Bích Lam vẫn bên tơi động viên, khuyến
khích tơi tìm giải pháp để vƣợt qua khó khăn, và truyền cho tôi đam mê nghiên cứu.
Và tôi đã có những ngƣời bạn rất tốt, cảm nhận đƣợc tấm lịng của Thầy Cơ giành cho

học trị mình, điều đó thật đáng trân trọng và quý giá biết bao. Qua lời cảm ơn này, tôi
xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cơ TS.Trần Bích Lam, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn
tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể quý Thầy, Cô thuộc bộ môn công nghệ thực phẩm,
Đại học Bách Khoa Tp.HCM, những ngƣời đã nhiệt tình hỗ trợ để tơi có thể tiến hành
tốt các nhiệm vụ nghiên cứu trong luận văn.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn các anh, chị và các bạn học ở phịng thí nghiệm cơng nghệ
thực phẩm, những ngƣời bạn đồng hành cùng tôi trong thời gian thực hiện luận văn
cao học tại trƣờng Đại học Bách Khoa Tp.HCM.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 11 tháng 07 năm 2016
Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ KIM THOA

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

iii

ABSTRACT
In this thesis, the research work mainly forcused on the preparation of nano-scale
chitosan, and its application in food preservation.
Chitosan is a natural polysaccharide prepared by the N-deacetylation of chitin. It
has been widely used in food and bioengineering industries, including the
encapsulation of active food ingredients, in enzyme immobilization, and as a carrier
for controlled drug delivery, due to its significant biological and chemical properties
such as biodegradability, biocompatibility, bioactivity, and polycationicity

The method to prepare nano chitosan by ionic gelation using sodium
tripolyphotphate as cross-linking agent with assistance of ultrasound and high
pressure with Mw: 57.7kDa and DDA: 94.3%. Studied the influence of a number of
factors such as: pH, ratios of components, sonication power and time, molecular
weight and degree acetylation of material to optimum nanosacle. According to the
results of experimental planning with pH:4, CS/STPP; 4:1, sonication time: 288s,
power: 5.85W/g, will have nanosize optimum is 165.5nm. Another material with
Mw: 48kDa, DDA: 54.6%, in optimize condition the nanozise is 228.4nm. In the in
vitro experiment, nanoparticles chitosan 165.5nm showed the best inhibitory effect
growth of C. acutatum fungus.

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

iv

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Chitosan là nguyên liệu phổ biến trong tự nhiên, nano chitosan với kích thƣớc nano,
có những ƣu điểm vƣợt trội và đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong lĩnh vực
bảo quản thực phẩm, nhờ tính an tồn với ngƣời sử dụng và thân thiện với môi
trƣờng, nano chitosan đƣợc quan tâm. Nghiên cứu này đề cập tới quá trình tạo hạt
nano chitosan bằng phƣơng pháp gel ion với natri tripolyphotphat (STPP) dƣới sự
hỗ trợ của sóng siêu âm và đồng hóa. Các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ pH, tỷ lệ
chitosan/STPP, thời gian và công suất siêu âm, cũng nhƣ khối lƣợng phân tử và độ
deacetyl hóa của chitosan đƣợc khảo sát nhằm tạo ra hạt nano chitosan có kích
thƣớc nhỏ nhất. Theo kết quả quy hoạch thực nghiệm, với pH:4, tỷ lệ
chitosan/STPP: 4:1, thời gian siêu âm: 288s, công suất siêu âm: 5.85W/g, kích
thƣớc trung bình hạt nano chitosan tạo ra: 165.5nm, với độ bền theo thời gian:

3ngày. Khối lƣợng phân tử và độ deacetyl hóa có ảnh hƣởng tới kích thƣớc hạt nano
chitosan, nguyên liệu khối lƣợng phân tử 48kDa, độ deacetyl hóa 54.6% tạo ra kích
thƣớc hạt nano chitosan 228.4nm, trong khi nguyên liệu khối lƣợng phân tử
57,7kDa độ deacetyl hóa 94.3% tạo ra kích thƣớc hạt nano chitosan 165.5nm. Nano
chitosan165.5nm có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm mốc C.
Acutatum trong điều kiện in vitro.

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

v

LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các
kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao
chép từ bất kỳ một nguồn nào và dƣới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các
nguồn tài liệu đã đƣợc thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng
theo yêu cầu.

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Kim Thoa

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
ABSTRACT .............................................................................................................. iii
TÓM TẮT LUẬN VĂN ............................................................................................ iv
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... v
Chƣơng 1. GIỚI THIỆU.............................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
2. Mục tiêu đề tài ......................................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 3
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................... 4
2.1.Ứng dụng của nano chitosan ............................................................................. 4
2.2.Tổng quan về chitosan ...................................................................................... 6
2.2.1. Cấu trúc của chitosan ................................................................................ 6
2.2.2. Tính chất chitosan .................................................................................... 8
2.3. Tổng quan về nanochitosan .............................................................................. 9
2.3.1. Lịch sử phát triển ................................................................................... 10
2.3.2. Nguyên lý chung chế tạo nano ................................................................ 11
2.3.3. Các phƣơng pháp tạo nanochitosan ........................................................ 12
2.4.Tác dụng cắt mạch chitosan của sóng siêu âm................................................ 19
Chƣơng 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 21
3.1.

Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ tiến hành .............................................. 21

3.1.1.

Nguyên liệu chitosan ......................................................................... 21

3.1.2.

Chủng nấm Colletotrichum acutatum gây bệnh thán thƣ trên cà chua .
........................................................................................................... 21

3.1.3.

Hóa chất ............................................................................................. 21

3.1.4.

Thiết bị tạo hạt nano chitosan............................................................ 22

3.2.

Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 22

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

vii

3.2.1.

Khảo sát nguyên liệu chitosan ........................................................... 23

3.2.2.

Các phƣơng pháp tạo hạt nano chitosan ............................................ 23

3.2.3.

Khảo sát ảnh hƣởng của nguyên liệu chitosan ................................. 29

3.3.

Các phƣơng pháp xác định kích thƣớc hạt ................................................. 30

3.3.1.

Phƣơng pháp đo tán xạ ánh sáng động học DLS (Dynamic Light

Scattering) ......................................................................................................... 30
3.3.2.

Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron

microscopy) ....................................................................................................... 32
3.3.3.

Phƣơng pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron

microscopy) ....................................................................................................... 32
3.3.4.

Các chỉ tiêu theo dõi .......................................................................... 32

3.3.5.

Thử nghiệm tính kháng nấm của nano chitosan trong điều kiện in

vitro

........................................................................................................... 32

3.4.

Phƣơng pháp xử lý số liệu .......................................................................... 34

Chƣơng 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 35
4.1.

Khảo sát tính chất của nguyên liệu chitosan .............................................. 35

4.1.1.

Xác định khối lƣợng phân tử và độ deacetyl hóa của nguyên liệu

chitosan ........................................................................................................... 35
4.1.2.
4.2.

Xác định cấu trúc của nguyên liệu chitosan ...................................... 36

Khảo sát phƣơng pháp tạo nano chitosan ................................................... 36

4.2.1.

Phƣơng pháp gel ion có hỗ trợ sóng siêu âm .................................... 36

4.2.2.

Khảo sát khả năng tạo hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp gel ion

có hỗ trợ đồng hóa và sóng siêu âm .................................................................. 39
4.2.3.

Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ chitosan/ tripolyphotphate ................. 45

4.2.4.

Khảo sát ảnh hƣởng của pH dung dịch chitosan ............................... 47

4.3.

Tối ƣu hóa quy hoạch thực nghiệm xác định thông số phù hợp ................ 50

4.4.

Xác định độ bền của dung dịch nano chitosan ........................................... 58

4.5.

Đánh giá sự hình thành nano chitosan qua phổ hồng ngoại ....................... 60

4.6.

Khảo sát ảnh hƣởng của nguyên liệu chitosan đến khả năng tạo hạt nano

chitosan.................................................................................................................. 63
HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ
4.7.

viii

Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật .......................................................... 64

4.7.1.

Kết quả xác định thời gian nảy mầm của bào tử nấm Colletotrichum

acutatum ........................................................................................................... 64
4.7.2.

Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của nano chitosan đến đƣờng kính tản

nấm C. acutatum gây bệnh thán thƣ trên cà chua sau thu hoạch ...................... 66
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 70
5.1.

Kết luận ...................................................................................................... 70

5.2.

Kiến nghị .................................................................................................... 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 72
PHỤ LỤC .................................................................................................................. 81

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1: Bố trí quy hoạch thực nghiệm .................................................................27
Bảng 3. 2:Bố trí thí nghiệm xác định khả năng kháng nấm C. acutatum của nano
chitosan trong điều kiện in vitro................................................................................33
Bảng 4. 1: Tính chất cơ bản của nguyên liệu chitosan Cần Thơ và Nha Trang ......35
Bảng 4. 2: Ảnh hƣởng của công suất siêu âm tới kích thƣớc trung bình hạt chitosan
...................................................................................................................................37
Bảng 4. 3: Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................38
Bảng 4. 4: Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................39
Bảng 4. 5: Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................40
Bảng 4. 6: Ảnh hƣởng của cơng suất siêu âm đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................43
Bảng 4. 7: Ảnh hƣởng của tỷ lệ chitosan/STPP đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................45
Bảng 4. 8:Ảnh hƣởng của pH đến kích thƣớc trung bình hạt nano chitosan ............48

Bảng 4. 9: Bảng ma trận và kết quả thực nghiệm .....................................................50
Bảng 4. 10: Bảng ƣớc lƣợng các tham số (Parameter Estimates).............................54
Bảng 4. 11: Tác động của các yếu tố khảo sát lên kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................54
Bảng 4. 12: So sánh phổ hồng ngoại của chitosan và nano chitosan ........................60
Bảng 4. 13: Ảnh hƣởng của các nồng độ nano chitosan đến đƣờng kính tản nấm C.
acutatum ....................................................................................................................68
HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

x

DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1: Cơng thức cấu tạo của Chitin và chitosan ..................................................7
Hình2. 2: Cơng thức cấu tạo của chitin, chitosan, cellulose .......................................7
Hình2. 3:Phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng (Ana, 2012) ......................................13
Hình2. 4: Sơ đồ tạo giọt bằng phƣơng pháp tạo giọt/kết tủa ....................................13
Hình2. 5: . Sơ đồ phƣơng pháp hợp nhất giọt nhũ tƣơng .........................................14
Hình2. 6: . Sơ đồ tạo nanochitosan bằng phƣơng pháp khuếch tán dung mơi nhũ
tƣơng .........................................................................................................................15
Hình2. 7: Sơ đồ tạo nanochitosan bằng phƣơng pháp sấy phun ...............................15
Hình2. 8: Sơ đồ tạo mixen đảo .................................................................................16
Hình2. 9: Sơ đồ tạo nanochitosan bằng phƣơng pháp mixen đảo.............................17
Hình2. 10: Sơ đồ tạo hạt nanochitosan bằng phƣơng pháp thay đổi đặc tính tạo gel
ionic với các chất polymer hóa .................................................................................18
Hình2. 11:Sơ đồ tạo hạt nanochitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ionic...................19
Hình2. 12: Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl cắt mạch chitosan ........20
Hình 3. 1: Nguyên liệu chitosan ................................................................................21

Hình 3. 2: Sơ đồ nội dung nghiên cứu ......................................................................23
Hình 3. 3: Tƣơng tác của ánh sáng lên bề mặt hạt ....................................................31
Hình 4. 1:Ảnh SEM của mẫu bột chitosan nguyên liệu ............................................36
Hình 4. 2: Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................40
Hình 4. 3: Phân bố kích thƣớc hạt nano chitosan theo thời gian ..............................42
Hình 4. 4: Ảnh hƣởng của cơng suất siêu âm đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................44
Hình 4. 5: Phân bố kích thƣớc hạt nano chitosan theo công suất .............................44

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

xi

Hình 4. 6: Ảnh hƣởng của tỷ lệ chitosan/STPP đến kích thƣớc trung bình hạt nano
chitosan......................................................................................................................46
Hình 4. 7: Phân bố kích thƣớc hạt nano chitosan theo tỷ lệ CS/STPP .....................47
Hình 4. 8: Phân bố kích thƣớc nano chitosan theo pH .............................................49
Hình 4. 9: Ảnh hƣởng của pH đến kích thƣớc trung bình hạt nano chitosan ...........50
Hình 4. 10: Mơ hình biểu thị tính tƣơng quan giữa kích thƣớc thực tế và kích thƣớc
dự đốn của hạt nano chitosan ..................................................................................53
Hình 4. 11: Mơ hình bề mặt đáp ứng của thời gian và cơng suất siêu âm lên kích
thƣớc hạt ....................................................................................................................55
Hình 4. 12: Dự đốn thơng số tối ƣu .......................................................................55
Hình 4. 13: Sơ đồ đƣờng đồng mức (Contour profile) .............................................56
Hình 4. 14: Dự đốn thơng số tối ƣu ........................................................................57
Hình 4. 15: Sơ đồ đƣờng đồng mức tối ƣu ..............................................................57

Hình 4. 16: DLS mẫu chitosan sau 3 ngày bảo quản ...............................................59
Hình 4. 17: DLS mẫu chitosan sau 6 ngày bảo quản ...............................................59
Hình 4. 18: Phổ FTIR của chitosan và Chitosan-STPP ............................................60
Hình 4. 19: Kết quả chụp FE-SEM của nano chitosan .............................................61
Hình 4. 20: Kết quả chụp TEM của mẫu nano chitosan ...........................................62
Hình 4. 21: Ảnh chụp trên kính hiển vi điển tử FE – SEM của nguyên liệu chitosan
và nano chitosan ........................................................................................................63
Hình 4. 22: Phân bố kích thƣớc hạt nano chitosan của mẫu nguyên liệu Nha Trang
...................................................................................................................................63
Hình 4. 23: Bào tử nấm nảy mầm sau 7 giờ..............................................................65
Hình 4. 24: Hình ảnh đƣờng kính tản nấm C. acutatum sau 240 giờ nuôi cấy khi bổ
sung nano chitosan ....................................................................................................67

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

xii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
C. acutatum:

Colletotrichum acutatum

CS:

Chitosan

STPP:

Sodium tripolyphosphate

S. aureus:

Staphylococcus aureus

E. coli:

Escherichia coli

HMW:

Trọng lƣợng phân tử cao

LMW:

Trọng lƣợng phân tử cao

CS/STPP:

Tỷ lệ chitosan/tripolyphosphat

DI:

Chỉ số đa phân tán (polydispersity index)

DD:

Độ deacetyl hóa chitosan

DA:

Độ acetyl chitosan

GPC:

Sắc ký thẩm thấu gel

FE-SEM:

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope)

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua

FT-IR:

Phổ hồng ngoại

TEM:

Kính hiển vi điện tử truyền qua

DLS:

Máy tán xạ ánh sáng động học, (Dynamic Light Scattering)

MIC:

Nồng độ ức chế tối thiểu 90% sự phát triển sợi nấm
(The minimum concentration showing over 90% inhibition
of mycelial growth)

EC50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển
(The concentration inhibiting growth by 50%)

CT:

Công thức

PDA:

Potato Dextrose Agar

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

1

Chƣơng 1. GIỚI THIỆU

1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, sản lƣợng rau quả nƣớc ta tăng nhanh về số
lƣợng, tuy nhiên vẫn chƣa đáp ứng đƣợc với nhu cầu của ngƣời tiêu dùng và xuất

khẩu nguyên nhân là do vấn đề an toàn thực phẩm. Theo Cục An toàn thực phẩm
(Bộ Y tế, 12/ 2015), trung bình mỗi năm có khoảng 170 vụ ngộ độc thực phẩm với
gần 7 nghìn ngƣời trúng độc và 37 ngƣời chết.
Gần đây, ở trong nƣớc đã có những nghiên cứu ứng dụng chuyên sâu về vấn
đề bảo quản trái cây ứng dụng công nghệ màng nano chitosan, một hƣớng của cơng
nghệ hóa học xanh: thân thiện với mơi trƣờng, an tồn với con ngƣời, chi phí bảo
quản thấp. Nghiên cứu đã đạt đƣợc những kết quả khả quan khi ứng dụng trong bảo
quản ớt, thanh long, chống các loài nấm mốc khác nhau.
Chitosan đƣợc cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamin liên kết với nhau bởi liên
kết α-(1,4)-glycoside. Là vật liệu phổ biến trong tự nhiên, có nhiều trong vỏ các lồi
giáp xác, cơn trùng và một số loại nấm và là phụ phẩm của ngành chế biến thủy sản.
Nanochitosan khơng những mang đầy đủ các tính chất của chitosan thơng
thƣờng nhƣ khơng độc, có khả năng thích ứng sinh học cao, khả năng tự phân hủy,
khả năng tạo màng…mà ở kích thƣớc nanomet từ 20 – 100nm, có diện tích bề mặt
lớn với điện tích dƣơng lớn hơn, do đó hoạt tính sinh học cao hơn so với chitosan và
oligochitosan. Chính đặc điểm khác biệt này đã tạo ra các ứng dụng chitosan ở kích
thƣớc nanomet trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp (kháng
khuẩn, kháng nấm, kích thích sinh trƣởng, bảo vệ cây trồng).
Từ những yêu cầu thực tế trên, với mong muốn đƣợc đƣa nano chitosan vào
ứng dụng rộng rãi hơn trong bảo quản nơng sản thực phẩm nói chung và rau quả nói
riêng, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phƣơng pháp tạo hạt
nano chitosan định hƣớng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm”
HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

2

2. Mục tiêu đề tài

Đề xuất quy trình tạo hạt nano chitosan bằng sóng siêu âm, sóng siêu âm kết
hợp đồng hóa áp lực cao
Khảo sát điều kiện siêu âm tối ƣu, nhằm tạo hạt có kích thƣớc nhỏ nhất
Khảo sát ở điều kiện tối ƣu với nguyên liệu chitosan khác
Khảo sát tính kháng nấm của nano chitosan trong điều kiện in vitro
3. Nội dung nghiên cứu
a) Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tạo hạt nano bằng phƣơng pháp
tạo gel ion với sodium tripolyphosphate có hỗ trợ của sóng siêu âm, sóng siêu âm
kết hợp đồng hóa áp lực cao.
b) Khảo sát 4 yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình tạo hạt
 pH dung dịch chitosan
 Tỷ lệ chitosan/STPP
 Thời gian siêu âm
 Cơng suất siêu âm
Xác định điều kiện thích hợp để tạo hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp thực
nghiệm
c) Ứng dụng thông số tối ƣu từ kết quả nghiên cứu của chitosan Hùng Tiến, Cần
Thơ vào nguyên liệu chitosan trƣờng Đại học Thủy sản Nha Trang
d) Khảo sát khả năng kháng nấm Colletotrichum acutatum của chế phẩm nano
chitosan trong điều kiện in vitro
Quá trình khảo sát đƣợc đánh giá dựa trên ba đáp ứng: kích thƣớc trung bình hạt,
độ đồng đều của hạt và thời gian bền của mẫu nano chitosan

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

3

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của luận văn sẽ là cở sở khoa học cho việc áp dụng
phƣơng pháp tạo gel ion với sodium tripolyphosphate có hỗ trợ của sóng siêu âm
kết hợp đồng hóa áp lực cao để tạo hạt nano chitosan.
Từ kết quả của luận văn cho phép xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất nano
chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ion với sodium tripolyphosphate có hỗ trợ của
sóng siêu âm kết hợp đồng hóa áp lực

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

4

Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Ứng dụng của nano chitosan
Công nghệ nano phát triển mạnh mẽ và thu hút nhiều nhà nghiên cứu vì những
ứng dụng tuyệt vời trong các lĩnh vực: sinh học, hóa học, y học… tạo ra các vật liệu
ứng dụng khác nhau, trong đó nano chitosan.
Sự phát triển mạnh mẽ của cơng nghệ nano đã mang lại nhiều ứng dụng thực
tiễn trong cuộc sống và mở ra nhiều nghiên cứu khác.Nano chitosan đang đƣợc
quan tâm và nghiên cứu tập trung vào các lĩnh vực: dùng làm chất kháng khuẩn[1],
[2], [3], [4],[5],[6], chất chống oxi hóa [7], [8], [9],[10], chất kháng khối u [11], chất
gây hiệu ứng tăng cƣờng miễn dịch[12], [13], chất kích kháng bệnh và thúc đẩy
tăng trƣởng cho cây trồng [14],[15], chất mang dƣợc phẩm [16], [17]… Ðặc biệt
oligochitosan có độ polyme hóa từ 7 – 10 có hiệu ứng chống xâm nhiễm của nhiều
loại nấm gây bệnh thực vật thông qua cơ chế tự tạo kháng sinh (phytoalexin) [18]
Đáng chú ý, việc ứng dụng nanochitosan để kháng khuẩn, kháng nấm gây hại

trên các đối tƣợng rau quả sau thu hoạch đang thu hút nhiều nhà khoa học trên thế
giới quan tâm.
Năm 2009 Ying Ma và cộng sự tiến hành nghiên cứu khả năng kháng
Escherichia coli và Staphylococcus aureus với nanochitosan (thu đƣợc từ việc cắt
mạch chitosan bằng H2O2, kích thƣớc 36nm). Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với
E. coli tại nồng độ 5mg/mL tỷ lệ kháng khuẩn xấp xỉ đạt 95%, với S. aureus tỷ lệ
này chỉ đạt 81% [19]
Một nghiên cứu khác của Ling Yien Ing và cộng sự (2012) cho thấy hiệu quả
sử dụng nanochitosan theo phƣơng pháp tạo gel ionic đƣợc chuẩn bị từ chitosan có
trọng lƣợng phân tử thấp (LMW), và chitosan có trọng lƣợng phân tử cao (HMW)
trong ứng dụng kháng Candida albicans, Fusarium solanivàAspergillus niger. Kết
quả cho thấy, nồng độ ức chế tối thiểu 50% (MIC) của các loại nanochitosan đều
thấp hơn rất nhiều so với chitosan thơng thƣờng, ngồi ra tác giả còn nhận thấy sự
tác động lên cấu trúc của nanochitosan LMW và HMW với Aspergillus niger[20].
HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

5

Cũng trong năm 2012, N. Zahid, A. Ali và cộng sự nghiên cứu tác dụng của
nanochitosan ở kích thƣớc 200nm, 600nm và 1000nm đối với Colletotrichum
gloeosporioides gây bệnh thán thƣ trên quả thanh long. Kết quả cho thấy với kích
thƣớc 600nm đạt hiệu quả kháng nấm tốt nhất trong điều kiện in vitro, thể hiện ở
việc ức chế sự thình thành bào tử, nảy mầm của bào tử và sinh khối [21].
Một nghiên cứu khác của A. Ali và cộng sự khi sử dụng nanochitosan có kích
thƣớc (nm): 200, 400, 600, 800 và 1000 ở các nồng độ khác nhau trong điều kiện
invitro với các chủng thán thƣ phân lập từ chuối, đu đủ và thanh long. Kết quả cho
thấy ở kích thƣớc hạt 200nm đối với chuối, 600nm đối với thanh long và đu đủ ở

cùng nồng độ 1% là tốt nhất trong việc ức chế sự hình thành bệnh và duy trì chất
lƣợng ở tất cả trái cây sau 28 ngày bảo quản lạnh [22].
Năm 2013 N. Chookhongkha và cộng sự đã nghiên cứu tác động của màng
bao chitosan và nanochitosan (tạo gel ionic) đến sự tăng trƣởng của 4 chủng nấm và
chất lƣợng của hạt ớt giống sau bảo quản. Bốn đối tƣợng nấm đƣợc nghiên cứu ở
đây bao gồm Rhizopus sp, Colletotrichum capsici, C. gloeosporioides, và
Aspergillus niger. Kết quả ở điều kiện in vitro cho thấy nanochitosan ở nồng độ
0,6% có tác dụng ức chế mạnh mẽ hơn đối với sự sinh trƣởng của các chủng nấm so
với chitosan thông thƣờng [23]
Theo nghiên cứu của M.A. Mustafa và cộng sự cho thấy sau 20 ngày bảo quản
cà chua ở nhiệt độ 15°C, độ ẩm 70-80%; nanochitosan (400, 600, 800nm) có tác
dụng hạn chế các biến đổi về khối lƣợng, màu sắc, độ cứng và hàm lƣợng
chlorophyll hơn so với công thức đối chứng là mẫu xử lý bằng nƣớc cất và mẫu xử
lý bằng 5% (v/v) chất nhũ hóa. Tuy kết quả khơng chỉ ra đƣợc kích thƣớc hạt nhƣ
thế nào là đạt hiệu quả bảo quản tối ƣu, nhƣng nghiên cứu đã cho thấy các cơng
thức xử lý bởi nanochitosan có thể làm chậm q trình chín tới 5 ngày[24].
Ở trong nƣớc những năm gần đây cũng đã có những nghiên cứu chuyên sâu
vào ứng dụng của nano chitosan:
Năm 2011, Dƣơng Thị Ánh Tuyết và cộng sự [25]đã nghiên cứu chế tạo nano
chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ion làm chất hấp phụ protein ứng dụng trong
dẫn truyền thuốc. Kết quả cho thấy với tỷ lệ chitosan/STPP là 6:1 tại pH 4 cho chế
HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

6

phẩm nano chitosan có kích thƣớc nhỏ nhất 48,70 nm. Sử dụng chế phẩm này làm
chất hấp phụ protein cho thấy khả năng hấp phụ cao 96,41 % (1,93 mg/mg) tại 0,5

mg hạt nano chitosan.
Năm 2011 Nguyễn Anh Dũng và cộng sự đã thực hiện thành công ở quy mơ
phịng thí nghiệm quy trình tạo hạt nano chitosan, sản phẩm hạt nano chitosan có
kích thƣớc trung bình từ 80 – 106 nm. Hạt nano chitosan này đƣợc sử dụng làm tá
dƣợc hấp phụ chất kích thích miễn dịch cho vaccin cúm A/H1N1. Theo Nguyễn
Anh Dũng nghiên cứu cho thấy, hạt nano chitosan giúp gia tăng khả năng đáp ứng
miễn dịch, khả năng hình thành kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cúm A/H1N1
khi đƣợc thí nghiệm trên chuột. [26]
Trong lĩnh vực kháng khuẩn, La Thị Kim Ngân và cộng sự đã công bố kết quả
sử dụng nano chitosan tạo ra bằng phƣơng pháp sấy phun với kích thƣớc hạt 95,5 –
395 nm và điện thế zeta là 39,3 - 45,7 mV ứng dụng kháng Staphylococcus aureus.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy nano chitosan ức chế mạnh mẽ sự phát triển của
S.aureus, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ở mức 20µg/mL thấp hơn rất nhiều so với
chitosan thông thƣờng hoặc thuốc kháng sinh amoxicillin.[27]
Các khảo sát này bƣớc đầu cho thấy những kết quả khả quan trong việc ứng
dụng chitosan. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chƣa đi sâu vào khảo sát thực
nghiệm và đánh giá kết quả tạo hạt nano chitosan, chƣa đáp ứng đuợc hết những
tiềm năng to lớn mà công nghệ tạo hạt nano chitosan hứa hẹn sẽ mang đến cho con
nguời.
2.2. Tổng quan về chitosan
2.2.1.

Cấu trúc của chitosan
Chitosan là một polymer carbohydrate tự nhiên có thể tạo ra bằng cách

deacetyl hóa chitin. Chitosan có thể tìm thấy trong tự nhiên từ động vật giáp xác
nhƣ tơm, cua. Chitosan cịn có thể tìm thấy từ những vi sinh vật nhƣ nấm, men.

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa

Luận văn thạc sĩ

7

Hình2. 1: Cơng thức cấu tạo của Chitin và chitosan
Chitin là polymer sinh học có nhiều trong thiên nhiên chỉ đứng sau xenluloza.
Cấu trúc hóa học của Chitin gần giống với xenluloza.[30]
Chitosan là một dạng Chitin đã bị khử axetyl, nhƣng khơng giống Chitin, nó
lại tan đƣợc trong dung dịch axit.
Chitosan đƣợc cấu tạo từ các mắt xích D-glucosamin liên kết với nhau bởi
liên kết -(1,4)-glycoside

Hình2. 2: Công thức cấu tạo của chitin, chitosan, cellulose

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ
2.2.2.

8

Tính chất chitosan [31]

2.2.2.1. Tính chất vật lý
Màu trắng ngà hoặc vàng nhạt, không mùi, không vị, dạng bột hoặc dạng vảy
2.2.2.2. Tính chất hóa học
Tính tan: Chitosan khơng hồ tan trong nƣớc và kiềm. Tan trong dung dịch
axít lỗng tạo nhành một dung dịch keo có độ nhớt cao.

Chitosan là một polymer mang điện tích dƣơng nên đƣợc xem là một
polycationic (pH<6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm nhƣ
protein, aminopolysaccharide (alginate), axít béo và phospholipid nhờ sự có
mặt của nhóm amin (NH2) [32]. Chính tính chất này giúp cho chitosan thể
hiện đƣợc khả năng kháng nấm, kháng khuẩn cao của mình khi liên kết với
phần mang điện tích âm trên thành thế bào vi sinh vật.
Chitosan có hai nhóm chức hoạt động là –OH và –NH2 nên dễ phản ứng hóa
học hơn chitin (chỉ có 1 nhóm –OH)
Có khả năng hấp phụ cao đối với các kim loại nặng.
2.2.2.3. Tính chất sinh học
Chitosan có tính chất cơ học tốt, khơng độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ
sinh học, nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại
đến môi trƣờng.
Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer đƣợc nối với nhau bởi
các liên kết β-(1-4)-glycoside; các liên kết này bị cắt đứt bởi các chất nhƣ:
acid, bazơ, tác nhân oxy hoá và các enzyme thuỷ phân[33][34]
Có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn và kích thích sự phát triển tăng sinh của
tế bào. Là hợp chất cao phân tử nên bị giảm khối lƣợng theo thời gian do sự tự
cắt mạch, nhƣng hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm khơng giảm.

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

9

2.2.2.4. Độc tính
Chitosan hầu nhƣ khơng độc, có thể dùng để tiêm tĩnh mạch, khơng gây tích
lũy ở gan, có khả năng phân hủy sinh học cao, dễ dàng thải qua bài tiết. Tính

chất cơ học tốt, dễ dàng tạo màng, hịa hợp sinh học cao.
Những tính chất trên của chitosan đã mở ra nhiều hƣớng ứng dụng quan trọng
của nó trong y dƣợc và các lĩnh vực khác nhau trong đời sống.
2.2.2.5. Ứng dụng của chitosan hiện nay
Trong y tế, chitosan có tác dụng làm màng chữa bỏng, tá dƣợc độn trong làm
cốm, tá dƣợc ổn định viên nén, thuốc trị viêm loét dạ dày tá tràng. Chitosancolagen hỗn hợp làm giảm cholesterol trong máu, làm giảm sự hấp thụ lipid.
Chitin đƣợc dùng làm da nhân tạo, thuốc diệt khuẩn, chỉ khâu trong phẫu
thuật.
Trong công nghiệp thực phẩm, chitosan làm phụ gia thực phẩm duy trì hƣơng
vị tự nhiên, ổn định màu, nhũ tƣơng, làm dày cấu trúc, màng bảo quản thực
phẩm, làm trong nƣớc quả ép, giữ màu sắc và hƣơng vị tự nhiên của sản phẩm.
Trong công nghiệp in, chitosan làm chất keo cảm quang, trong công nghiệp
nhuộm làm tăng độ màu vải nhuộm. Trong nông nghiệp, oligochitosan làm
thuốc tăng trƣởng thực vật và kích thích gây tạo kháng sinh thực vật, thuốc
diệt nấm bệnh cho thực vật, gia tăng hệ số nhân và sinh khối tƣơi cho cây nuôi
cấy mô.
Trong khoa học kỹ thuật, chitosan làm dung dịch tăng độ khuyếch đại của
kính hiển vi, xử lý nƣớc thải công nghiệp và sinh hoạt: thu hồi ion kim loại,
protein, phenol, thuốc trừ sâu, thuốc nhuộm….
2.3. Tổng quan về nanochitosan
Vật liệu nano là vật liệu trong đó ít nhất một chiều có kích thƣớc nanomet. Vật
liệu nano đang ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học bởi tính chất ƣu
việt của nó. Với kích thƣớc nanomet, khả năng ứng dụng của vật liệu trở nên đa
dạng, phong phú hơn, không những có thể thay thế các vật liệu ban đầu mà thậm chí
cịn có tác dụng vƣợt trội hơn.

HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa


Luận văn thạc sĩ

10

Vật liệu nano là nhóm trung gian giữa vật liệu lớn với các nguyên tử hoặc cấu
trúc phân tử. Nghiên cứu về hạt nano là một mảng khoa học rộng lớn do tiềm năng
ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực trong đời sống.
Vật liệu nano có diện tích bề mặt riêng cao, kích thƣớc nhỏ sẽ ảnh hƣởng rất
nhiều đến tính chất của chính vật liệu, cũng nhƣ hệ chứa hạt nano, đặc biệt đối với
vật liệu khơng tan trong nƣớc. Với kích thƣớc nhỏ, vật liệu nano có những tính chất
đặc trƣng nhƣ sau:
- Diện tích bề mặt tăng: diện tích bề mặt tăng, làm tăng số lƣợng các phân tử
nằm trên bề mặt hạt
- Dễ phân tán hạt trong chất lỏng hơn: vì chuyển động nhiệt của hạt sẽ lớn hơn
chuyển động dƣới tác dụng của trọng trƣờng, các hạt sẽ khó chuyển động
xuống đáy bình và khó kết tụ
- Độ tan tăng
- Dễ dàng hấp thụ qua tế bào, da và ruột
- Tính chất quang học và vật lý khác so với vật liệu kích thƣớc lớn
Hạt nano chitosan (nanochitosan) cũng khơng nằm ngồi xu thế đó. Việc sử
dụng nanochitosan vào trong các ứng dụng nhƣ y học, sinh học, đã mang lại hiệu
quả và tác dụng hơn hẳn các vật liệu chitosan thơng thƣờng và việc phát triển các
ứng dụng của nó vào trong các lĩnh vực khác nhƣ công nghệ môi trƣờng, công nghệ
thực phẩm là điều tất yếu.
2.3.1.

Lịch sử phát triển [31]

Kể từ năm 1994, Ohya và cộng sự đề xuất việc nhốt thuốc chống ung thƣ 5 Fluorouracil (5 - FU) bằng cách cho dung dịch chitosan khâu mạch cộng hóa trị với
glutaraldehyde theo phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng. Khi đó việc phân phối
thuốc chậm hơn làm tăng hiệu quả điều trị của nó. Kể từ đó, các phƣơng pháp tạo

nanochitosan đã phát triển rộng rãi cho mục đích nghiên cứu phân phối thuốc và là
nền tảng ban đầu cho các ứng dụng khác. Chẳng hạn nhƣ sự kết hợp của các hoạt
chất trong kem đánh răng, sử dụng làm chất tăng độ hấp thụ trong thuốc nhuộm,
ứng dụng trong việc kháng khuẩn, kháng nấm,…Việc thay đổi các phƣơng pháp
chế tạo hạt nanochitosan khác nhau, khối lƣợng phân tử và mức độ deacetyl hóa
của chitosan ban đầu đã tạo thành các chế phẩm nanochitosan có kích thƣớc và khả
năng ứng dụng đa dạng[35].
HVTH: Nguyễn Thị Kim Thoa