ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP LC MSMS ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN m1 TRONG sữa THÔ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ THU

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS ĐỊNH
LƢỢNG AFLATOXIN M1 TRONG SỮA THƠ
Chun ngành: Kỹ Thuật Hóa Học
Mã số chun ngành: 60.52.75

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH – 08 / 2016


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học : TS. Trần Thị Kiều Anh
Chữ ký :
Cán bộ chấm nhận xét 1 :........................................................................
Chữ ký :
Cán bộ chấm nhận xét 2 :........................................................................
Chữ ký :
Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM ngày . . . . .
tháng . . . . năm . . . . .
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. ............................................................
2. ............................................................
3. ............................................................

4. ............................................................
5. ............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi
luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).


MỤC LỤC
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................ 9
1.1.

Sơ lƣợc về Aflatoxin:.............................................................................................. 9

1.1.1.

Giới thiệu về Aflatoxin .................................................................................... 9

1.1.2.

Tính chất vật lý .............................................................................................. 10

1.1.3.

Nguồn gốc phát sinh ..................................................................................... 11

1.1.4.

Giới hạn tối đa cho phép của Aflatoxin trong sữa ......................................... 12

1.1.5.

Hiện trạng nhiễm Aflatoxin trong sản phẩm cho ngƣời và động vật ............ 13

1.1.5.1.

Ngoài nƣớc .............................................................................................. 13

1.1.5.2.

Trong nƣớc .............................................................................................. 15

1.1.6.

Phƣơng pháp xác định Aflatoxin ................................................................... 16

1.1.6.1.

Phƣơng pháp xử lý mẫu .......................................................................... 16

1.1.6.2.

Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng .................................................. 20

1.1.7.

Giới thiệu chung về phƣơng pháp sắc ký ...................................................... 23

1.1.7.1.

Định nghĩa ............................................................................................... 23

1.1.7.2.

Phân loại .................................................................................................. 23

1.1.7.3.

Nguyên lý hoạt động của cột sắc ký ....................................................... 24

1.1.7.4.

Giới thiệu chung về sắc ký lỏng .............................................................. 28

1.1.7.5.

Các bộ phận cơ bản của hệ thống HPLC ................................................ 28

1.1.8

Sắc ký lỏng đầu dò khối phổ .......................................................................... 32

1.1.8.1.

Cấu tạo chung của hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ ......................... 32

1.1.8.2.

Các hệ thống tách khối ............................................................................ 35

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 39
2.1.

ĐỐI TƢỢNG – MỤC TIÊU – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: .............................. 39


2.1.1.

Đối tƣợng........................................................................................................... 39

2.1.2.

Mục đích ............................................................................................................ 39

2.1.3.

Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................... 39
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 39

2.2.

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ......................................................................................... 40
3.1.

KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ LC-MS/MS ........................................................ 41

3.1.1.

Khảo sát các thơng số của đầu dị ..................................................................... 41

3.1.2.

Khảo sát các thơng số LC .................................................................................. 42

3.2.

3.1.2.1.

Khảo sát thành phần pha động ................................................................ 42

3.1.2.2.

Khảo sát nồng độ acid acetic thêm vào ................................................... 42

3.1.2.3.

Khảo sát độ lặp lại của thời gian lƣu và diện tích ................................... 42

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT THU HỒI CỦA

PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................................ 43
3.2.1.

Khảo sát lƣợng muối ...................................................................................... 43

3.2.2.

Khảo sát thể tích dung mơi chiết ................................................................... 43

3.2.3.

Khảo sát thời gian lắc..................................................................................... 43

3.3.

ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP ............................................................................. 43

3.3.1.

Khảo sát khoảng tuyến tính của phƣơng pháp ............................................... 43

3.3.2.

Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng

pháp

44

3.3.3.

Xác định độ chính xác của phƣơng pháp ....................................................... 44

3.4.

3.3.3.1.

Độ chụm (precision) ............................................................................... 45

3.3.3.2.

Độ đúng ................................................................................................... 48

ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP ĐÃ ĐÁNH GIÁ ĐỂ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN M1

TRÊN MẪU SỮA THỰC .............................................................................................. 50


CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................ 50
4.1.

KHẢO SÁT CÁC THƠNG SỐ LC-MS/MS ........................................................ 50

4.1.1.

Khảo sát các thơng số LC-MS/MS ................................................................ 50

4.1.2.

Khảo sát các thông số LC .............................................................................. 54

4.1.2.1.

Khảo sát thành phần pha động.................................................................... 54

4.1.2.2.

Khảo sát nồng độ acid acetic thêm vào ...................................................... 55

4.1.2.3.

Khảo sát độ lặp lại của thời gian lƣu và diện tích ...................................... 56

4.2.

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT THU HỒI CỦA

PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................................ 57
4.2.1.

Khảo sát lƣợng muối ...................................................................................... 57

4.2.2.

Khảo sát thể tích dung môi chiết ................................................................... 58

4.2.3.

Khảo sát thời gian lắc..................................................................................... 59

4.3.

ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP ............................................................................. 60

4.3.1.

Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp và ảnh hƣởng của nền mẫu ................. 60

4.3.2.

Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng

pháp:

61

4.3.3.

Xác định độ chính xác của phƣơng pháp ....................................................... 63

4.4.

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU THỰC ................................................................ 66

CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 68
5.1.

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 68

5.2.

ĐỀ NGHỊ .............................................................................................................. 69


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AFM1 (Aflatoxin M1)

Độc tố Aflatoxin M1

AOAC (Association of Official

Hiệp hội các nhà hóa phân tích

Analytical Chemists)

chính thức

CV (Coefficient of variation)

Hệ số biến thiên

ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Thử nghiệm miễn dịch gắn men
FAO (Food and Agriculture Organization

Tổ chức Lƣơng thực và Nông

Of the United Nations)

nghiệp Liên Hiệp Quốc

HPLC (High pressure liquid chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IAC (Immunoaffinity column)

Cột miễn dịch

ISO (International Organization for

Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế

Standardization)
IUPAC (International Union of Pure and

Liên minh Quốc tế về Hóa học

Applied Chemistry Nomenclature)

thuần túy và Hóa học ứng dụng

LC-MS/MS (Liquid chromatography–

Sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ

mass spectrometry)
LLE (Liquid liquid extraction)

Chiết lỏng – lỏng

LOD (Limit of detection)

Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of quantitation)

Giới hạn định lƣợng

MRL (Maximum residue limit)

Giới hạn tồn dƣ tối đa cho phép

P-HPLC (Reversed phase high pressure Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
liquid chromatography)
RSD (Relative standard deviation)

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD (Standard deviation)

Độ lệch chuẩn

SIM (Selected-Ion Monitoring)

Chế độ quét chọn lọc ion

SPE (Solid phase extraction)

Chiết pha rắn

TLC (Thin layer chromatography)

Sắc ký lớp mỏng

UHPLC-MS/MS (Ultra high pressure liquid

Sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ

chromatography mass spectrometry)


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Giới hạn cho phép Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm từ sữa
ở một số quốc gia……………………………………………………………trang 10
Bảng 1.2 Các nghiên cứu về sự hiện diện của Aflatoxin M1 trong sữa thô

ở một số nƣớc…………………………………………………………………..…11
Bảng 1.3 Dữ liệu về các nghiên cứu sự hiện diện của Aflatoxin trong sữa ở các
nƣớc Đông Á………………………………………………………………..…..…12
Bảng 1.4 Dữ liệu về các nghiên cứu sự hiện diện của Aflatoxin trong sữa ở các
nƣớc Trung Đông, Châu Phi và Mỹ Latin…………………………………….….13
Bảng 1.5 Phân loại các phƣơng pháp sắc ký cột…………………………………..22
Bảng 3.1: Chƣơng trình gradient nồng độ……………………………………….. 40
Bảng 3.2 : Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)…48
Bảng 3.3 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC 2002)........48
Bảng 3.4: Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu………………………….48
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát các chƣơng trình dung môi khác nhau……...…………54
Bảng 4.2 Kết quả nồng độ acid thêm vào………………………………….………55
Bảng 4.3 Độ lặp lại của diện tích peak, thời gian lƣu và tỉ lệ 2 ion………..………55
Bảng 4.4 Khoảng tỉ lệ ion cho phép để định danh mẫu dƣơng tính ………………56
Bảng 4.5 Kết quả khảo sát lƣợng muối thêm vào………………………….………57
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát thể tích dung mơi chiết…………………………..…….58
Bảng 4.7 Kết quả khảo sát thời gian lắc 5 phút, 10 phút, 15 phút và 20 phút.…….59
Bảng 4.8 Độ thu hồi của Aflatoxin M1 trong sữa thô tại nồng độ 0,025 µg/L.……..62
Bảng 4.9 Kết quả lặp lại 7 lần ở nồng độ 0,05 ppb…………………………...……63
Bảng 4.10 Kết quả phân tích 7 lần lặp lại ở nồng độ 0,25 ppb…………………….63
Bảng 4.11 Kết quả lặp lại 7 lần ở nồng độ 0,5 ppb………………………...………63
Bảng 4.12 Kết quả lặp lại 7 lần ở nồng độ 2 ppb……………………………….….64
Bảng 4.13 Kết quả phân tích Aflatoxin trong mẫu thực…………………………....66


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Aflatoxin M1 ……………………….……..…....trang 7
Hình 1.2 Các loại Aflatoxin phổ biến………………………………...……...……..8
Hình 1.3 So sánh hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích bằng chiết lỏng – lỏng
và dùng IAC …………………………………………………………………..…16

Hình 1.4 Sơ đồ các thành phần chính của một hệ thống HPLC ….........................19
Hình 1.5 Quá trình tách sắc ký trên cột của hai chất A và B…………...…………23
Hình 1.6 Trình bày sơ đồ một hệ thống sắc ký lỏng................................................27
Hình 1.7 Nguồn ion hóa ESI………………………………………………..……..31
Hình 1.8 Nguồn ion hóa hóa học ở áp suất thƣờng………………………………..32
Hình 1.9 Nguồn ion hóa quang học tại áp suất khí quyển……………………..…..33
Hình 1.10 Trình bày ứng dụng của 3 nguồn ion hóa cho các hợp chất có độ phân cực
khác nhau………………………………………………………………………..…33
Hình 1.11 Thiết bị phân tích tứ cực…………………………………………...…...34
Hình 1.12 Thiết bị 3 tứ cực……………………………………………………...…34
Hình 1.13 Mơ hình đầu dị TOF……………………………………………………35
Hình 1.14 Mơ hình bẫy ion……………………………………………….………..36
Hình 3.1 Qui trình phân tích mẫu dự kiến………………………………….…….. 39
Hình 3.2 Biểu diễn mối liên hệ độ chính xác theo độ đúng và độ chụm…………..43
Hình 4.1 Kết quả phổ quét fullscan..........................................................................50
Hình 4.2 Kết quả khảo sát giá trị fragmentor thay đổi từ 60 – 110 V......................50
Hình 4.3 Kết quả khảo sát các giá trị fragmentor thay đổi 100, 105, 110,
115, 120 V................................................................................................................51
Hình 4.4 Kết quả khảo sát giá trị CE thay đổi từ 5- 30 eV……………….……….52
Hình 4.5 Kết quả khảo sát giá trị CE thay đổi từ 15 – 25 eV…………………..…52
Hình 4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của nền mẫu lên đƣờng chuẩn……………………..60
Hình 4.7 Sắc ký đồ mẫu spike 0,02 ppb……………………………………………61
Hình 4.8 Sắc ký đồ mẫu spike 0,05 ppb………………………………………...….61
Hình 4.9 Sơ đồ qui trình xử lý mẫu…………………………………………...……65


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc về Aflatoxin:
1.1.1. Giới thiệu về Aflatoxin: [1]
-

Aflatoxin

M1

2,3,6a,9a-Tetrahydo-9a-hydroxy-

methoxycyclopenta[c]furo[3’

,2’

:4,5]furo[2,3-h][1]benzopyran-1,11-dion

hay 4-

hydroxyAflatoxin B1.
-

17H12O7

-

Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo Aflatoxin M1
-

Aflatoxin là một trong những mycotoxin thƣờng gặp nhất, đƣợc sinh ra chủ yếu bởi hai
loại mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.

-

Có 6 loại Aflatoxin phổ biến nhất:


Hình 1.2 Các loại Aflatoxin phổ biến
1.1.2. Tính chất vật lý:
o

-

C

-

Điểm sôi: 644 oC

-

Áp suất hơi: 1.8x10-17 mmHg (25o C)

-

pKa: 10.82

-

Tính ổn định: ổn định ở nhiệt độ và áp suất bình thƣờng.

-

Độ hịa tan: rất ít tan trong nƣớc (10-30 mg/ml); không tan trong các dung môi không

phân cực; dễ tan trong các dung môi hữu cơ phân cực vừa (ví dụ nhƣ chloroform và
methanol) và đặc biệt là trong dimethyl sulfoxide .

-

Aflatoxin không bị phân hủy trong quá trình xử lý (thanh trùng, đun nấu) và bảo quản
sữa hay các quá trình chế biến các sản phẩm từ sữa [2, 3, 4].

-

Các Aflatoxin phát huỳnh quang mạnh trong ánh sáng tia cực tím (khoảng 365 nm); B1
và B2 phát huỳnh quang màu xanh, G1 và G2 phát huỳnh quang màu xanh lá cây.


Độc tính của Aflatoxin:[5-9]
Các Aflatoxin đƣợc phân lập đầu tiên và đƣợc nhận diện nhƣ là tác nhân gây bệnh hoại tử gan
năm 1960, hơn 100.000 con gà tây chết ở Anh và Mỹ đƣợc cho ăn đậu phộng nhiễm mốc.
Đối với động vật: tác hại của Aflatoxin là gây giảm tăng trọng, chán ăn, sa trực tràng, phù nề
bụng, giảm khả năng sinh sản, sẩy thai và giảm khối lƣợng sơ sinh. Một số bằng chứng cũng
cho thấy Aflatoxin ảnh hƣởng đến vi dạ cỏ, dẫn đến giảm sự phân giải chất xơ, sản xuất acid
béo bay hơi và hình thành amoni. Aflatoxin gây ra các tình trạng bệnh móng, khớp trên bị sữa,
lơng thơ, xanh xao, gan nhiễm mỡ, tiêu chảy, ức chế miễn dịch,... Trong trƣờng hợp nhiễm cấp
tính cịn có các triệu chứng thần kinh nhƣ đi lòng vòng, tai co giật, nghiến răng, chảy bọt ở
miệng, hơn mê và mất điều hịa.
Đối với con ngƣời: bệnh do nhiễm Aflatoxin cấp tính đã đƣợc thơng báo ở các nƣớc, với các
biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Một loạt các nghiên
cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thƣ gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với
Aflatoxin, nhƣng cơ chế tác động của Aflatoxin gây ung thƣ gan ở ngƣời nhƣ thế nào vẫn còn
nhiều tranh cãi. Tuy nhiên, đã tìm thấy sự gắn kết của Aflatoxin với ADN của tế bào gan ở
những bệnh nhân bị ung thƣ gan ngun phát, phức hợp này cịn đƣợc tìm thấy trong máu

ngoại vi, trong máu nhau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với Aflatoxin.
Bên cạnh đó cịn có sự liên quan giữa phơi nhiễm Aflatoxin với sự đột biến gen ở các bệnh
nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm sốt sự chết tế bào theo chƣơng
trình. Khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển
thành ác tính. Ngồi ra, Aflatoxin cịn đƣợc chứng minh là có ảnh hƣởng tới sự cịi cộc, kém
phát triển ở thai nhi và trẻ em.
1.1.3. Nguồn gốc phát sinh :[5-7, 10-12]
Các sản phẩm thực phẩm dễ bị nhiễm độc tố Aflatoxin bao gồm ngũ cốc (ngơ, lúa, kê, gạo, lúa
mì), hạt có dầu (lạc, đậu tƣơng, dầu hƣớng dƣơng, bơng), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, bột
nghệ, gừng), hạt cây (hạnh nhân, hồ trăn, óc chó, dừa) và sữa. Aflatoxin là độc tố tự nhiên chủ
yếu đƣợc sản xuất bởi hai loại nấm mốc: Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Trong
đó, Aspergillus flavus là phổ biến rộng rãi trong tự nhiên và thƣờng đƣợc tìm thấy khi các loại
ngũ cốc đƣợc phát triển trong điều kiện nóng ẩm. Loại nấm này có trong đất, thực vật phân
hủy, cỏ khơ, hạt trải qua sự suy giảm vi sinh và xâm nhập tất cả các loại chất nền hữu cơ bất cứ


khi nào và bất cứ nơi nào các điều kiện thuận lợi cho sự tăng trƣởng của nó. Điều kiện thuận lợi
bao gồm độ ẩm cao và nhiệt độ cao. Có ít nhất 13 loại Aflatoxin khác nhau đƣợc hình thành
trong tự nhiên với Aflatoxin B1 đƣợc coi là độc nhất.
Aflatoxin B1 sau khi bị ăn vào thì khoả

–

ạng

Aflatoxin M1. Aflatoxin M1

1

ức ăn nhiễm Aflatoxin.

-

1.1.4. Giới hạn tối đa cho phép của Aflatoxin trong sữa
Vì các tác hại rất nguy hiểm mà độc tố này gây ra cho ngƣời và động vật nên giới hạn cho phép
của Aflatoxin trong thực phẩm rất thấp, đặc biệt đối với sữa là 0,5 µg/kg theo qui chuẩn quốc
gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm (QCVN 8-1:2011/BYT)
Bảng 1.1 Giới hạn cho phép Aflatoxin M1 trong sữa và các sản phẩm từ sữa ở một số quốc gia
[15].
Quốc gia
Pháp
Thổ Nhỉ Kỳ
CH Czech
Bỉ
Mỹ
Thụy Sỹ
Hà Lan
Đức
Úc

Hàm lƣợng AFM1 cho phép (µg/L)
0,05 : Sữa cho ngƣời lớn
0,03 : Sữa cho em bé
0,05: Sữa và các sản phẩm từ sữa
0,25: Phô mai
0,1: Sữa cho em bé
0,5: Sữa cho ngƣời lớn
0,05: Sữa
0,5: Sữa
0,05: Sữa và các sản phẩm từ sữa

0,25: Phô mai
0,02: Bơ
0,2: Phô mai
0,05: Sữa
0,05: Sữa


1.1.5. Hiện trạng nhiễm Aflatoxin trong sản phẩm cho ngƣời và động vật:
1.1.5.1. Ngoài nƣớc:
Năm 2007, tại Lahore, Pakistan, Khushi Muhammad và cộng sự đã phân tích 84 mẫu sữa thô,
kết quả là 81% nhiễm Aflatoxin M1 vƣợt quá giới hạn cho phép [13]. Theo Hikmet Mavuş
Buldu năm 2008 đã phân tích 90 mẫu sữa thơ tại nguồn ở Thổ Nhỉ Kỳ, cho kết quả là 100%
mẫu đều dƣơng tính với Aflatoxin M1 với nồng độ từ 5-80 ng/L [5]. Năm 2011, tại tỉnh Gilan
(phía Bắc Iran), Reza Kazemi Darsanaki và cộng sự đã phân tích 90 mẫu sữa nguyên liệu, kết
quả có 56 mẫu trong tổng số 90 mẫu nhiễm Aflatoxin M1 nồng độ từ 2,1-131 ng/L [14]. Bảng
1.2 – 1.4 trình bày một số kết quả phân tích Aflatoxin trong sữa trên thế giới.
Bảng 1.2 Các nghiên cứu về sự hiện diện của Aflatoxin M1 trong sữa thô ở một số nƣớc [6]
Số mẫu sữa phân
Quốc gia
tích
Argentina
56
Hy Lạp
166
Indonesia
342
Italia
296
UAE
59

Thái Lan
310
Iran
100

% số mẫu nhiễu Aflatoxin M1 vƣợt quá
mức 50 ng/l
0
1.8
21
1.7
56
84
78


Bảng 1.3 Dữ liệu về các nghiên cứu sự hiện diện của Aflatoxin trong sữa ở các nƣớc Đông Á
[7]
Quốc gia

Mẫu
dƣơng
tính/tổng
số mẫu

Nhiễm (µg/L)

Số mẫu
nhiễm có
hàm lƣợng

> MRL
(µg/L)

Trung Quốc 135/135

0.008

Trung Quốc 43/72

Mùa
Mùa đông
xuân(0.029),
13 > 0.05
Mùa hè(0.032),
Mùa thu(0.032),
Mùa
đông(0.124)
UHT
20%>0.05
Pasteurized
65%>0.05

Trung Quốc Sữa
109/179(
tiệt trùng
UTH
84/153, tiệt
trùng
Pasteurized
4/26)

Hàn Quốc
48/100
Indonesia
113/113

Thái Lan

150/150

Nhật

298

2 > 0.05
48 < 0.005 µg/l,
65 (0.0050.025)

Trung bình
0.085

0 > 0.025
and 0.05
Tất cả các
mẫu < 0.5
0

Hàm lƣợng
(µg/L)

Đối tƣợng

mẫu

18(13%)(0- Sữa và
0.16) 79
các sản
(0.16 to 0.5) phẩm từ
sữa
0.01 - 0.42
Sữa

UHT
54.9%(0.00
6-0.16)
Pasteurized
96.2%(0.02
3-0.154)

Sữa

0.002-0.08
0.006-0.015

Sữa thô
Sữa tƣơi

LOD –
0.114

Sữa tƣơi
Sữa thô

Bảng 1.4: Dữ liệu về các nghiên cứu sự hiện diện của Aflatoxin trong sữa ở các nƣớc Trung
Đông, Châu Phi và Mỹ Latin [7]
Quốc gia

Mẫu dƣơng
tính/tổng số
mẫu

Nhiễm
(µg/L)

Brazil

25/36
119/125
83

0.062
0.031

Morocco

39/44
13/48

0.0186

Kuwait

Sữa 176/321
Phơ mai 32/40

Phơ mai
0.088

Syria
Ai Cập

101/126
175

52% ≥ 0.05
25≥0.05
15≥0.05

Lebanon

100/138

Sữa 11≥0.05
Sữa chua
4≥0.05
17%≥0.025

42/44

Số mẫu
nhiễm có

hàm lƣợng >
MRL
(µg/L)
33 mẫu
(26.4%)≥0.0
5
Sữa
83%≥0.003
3(7.4%)
≥0.05
4 ≥ 0.05
Sữa tƣơi 8
>0.05
4 >0.05
Phơ mai 1 >
0.25

Hàm lƣợng
(µg/L)

Đối tƣợng
mẫu

0.011-0.161
0.01-0.2
0.008-0.437
0.02-0.76
0.001-0.117

Sữa

Sữa
Sữa

0.001 - 0.1
0.01-0.100

Sữa tiệt trùng
Sữa ngun
liệu
Sản phẩm
sữa

0.00490.0687
LOD-0.088
0.024-0.004
Phơ mai
0.024-0.452,
0.02-0.765
0.020-0.765
< 0.018 - ≥
0.25
0.0012-0.315

Sữa
Sữa

Sữa và sữa
chua

Từ các bảng số liệu trên có thể thấy đƣợc tình trạng nhiễm Aflatoxin trong sữa trở nên nghiêm

trọng hơn ở các nƣớc đang phát triển.
1.1.5.2. Trong nƣớc:
Theo điều tra của Trung tâm y tế dự phòng TP HCM thì hàm lƣợng Aflatoxin trong lạc cao gấp
263 lần ngƣỡng cho phép. Theo khảo sát của Viện NC Dầu thực vật cũng cho kết quả cứ 11
mẫu thử thì có 5 mẫu nhiễm Aflatoxin với hàm lƣợng từ 20 – 112 mg/kg (gấp từ 2 – 11 lần
ngƣỡng cho phép). Viện Vệ sinh Y tế công cộng TP HCM đã kết luận rằng gần 95% thức ăn
gia súc chứa độc tố Aflatoxin khi tiến hành kiểm nghiệm 115 mẫu thực phẩm lƣu hành trên thị


trƣờng và mẫu do cơ sở xuất mang tới đăng ký kiểm nghiệm. Việc bảo quản không tốt các loại
thực phẩm nhƣ lạc, ngơ, một số hạt có dầu, lúa mì, gạo, sắn, sữa v.v... thƣờng dẫn đến tình
trạng sinh nấm mốc. Những nấm mốc ấy tạo ra một loại độc tố vi nấm là Aflatoxin B1.
Trong thực tế chăn ni bị sữa ở khu vực Thành Phố Hồ Chí Minh, bị đƣợc ni dƣỡng từ các
nguồn phụ phế phẩm nhƣ: xác mì, hèm bia, bã đậu… mà các loại này là môi trƣờng rất thuận lợi
để nấm mốc phát triển. Nhiều nghiên cứu cho thấy bò sữa ăn phải Aflatoxin từ thức ăn thì phần
lớn Aflatoxin đƣợc bài tiết khỏi cơ thể là qua đƣờng sữa và chuyển hóa từ dạng B1 thành dạng
Aflatoxin M1 [8, 9].
Aflatoxin đang ngày càng đƣợc chú ý do các tác tác hại mà nó gây ra cho động vật và con
ngƣời. Aflatoxin khơng bị phân hủy trong quá trình xử lý (thanh trùng hay đun nấu) và bảo
quản sữa hay các quá trình chế biến các sản phẩm từ sữa [12, 15, 16]. Do đó, nếu nguồn sữa thơ
bị nhiễm độc tố thì sau đó Aflatoxin vẫn có khả năng hiện diện trong các sản phẩm từ sữa nhƣ:
bơ sữa, phô-mát, sữa chua……. Các tác động đến kinh tế của Aflatoxin trực tiếp: cây trồng bị
mất mùa, ảnh hƣởng đến vật nuôi và sức khỏe con ngƣời; gián tiếp: phải mất chi phí định kỳ
trong việc kiểm sốt chất lƣợng, nghiên cứu, đóng gói và bảo quản hàng hóa. Do đó, việc kiểm
sốt hàm lƣợng Aflatoxin trong thực phẩm và nhất là trong sữa là rất quan trọng.
Ngoài ra, giới hạn cho phép của Aflatoxin trong thực phẩm rất thấp, đặc biệt đối với sữa là 0,5
µg/L theo tiêu chuẩn Việt Nam. Do đó việc lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS để phân tích
Aflatoxin M1 trong sữa thơ là phù hợp vì các ƣu điểm của kỹ thuật này: độ chọn lọc cao, độ
nhạy cao và đặc biệt là giới hạn phát hiện thấp.
1.1.6. Phƣơng pháp xác định Aflatoxin:

1.1.6.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu:
Dùng cột SPE
Những cải tiến đáng kể trong việc làm sạch mẫu trong phân tích Aflatoxin là sử dụng cột chiết
pha rắn (SPE). Các mẫu phân tích đƣợc cho qua một cột chứa C-8 hoặc C-18, các chất phân
tích sẽ bị giữ lại trong cột. Các chất bẩn đƣợc rửa bỏ bằng nƣớc. Cuối cùng, các chất phân tích
đƣợc rửa giải bằng dung môi phân cực là methanol hay acetonitrile. Ƣu điểm của nó là tiêu thụ
ít dung mơi hơn và khả năng tự động hóa. Một thí nghiệm đã đƣợc tiến hành bởi Bijl và cộng
sự năm 1987 [17], phân tích các mẫu pho mát đƣợc chiết xuất với hỗn hợp acetone nƣớc (3 +


1).
Acetone bay hơi trong chân không và pha nƣớc đƣợc đƣa qua một cột C-18 dùng một lần. Sau
khi cột đƣợc rửa bằng hỗn hợp acetonitrile-nƣớc (1 + 9), độc tố đƣợc tách rửa bằng acetonitrile.
Cuối cùng thì việc định lƣợng đƣợc thực hiện bởi phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp hoặc
bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng pha đảo cột C18 với đầu dò huỳnh quang. Độ thu hồi đƣợc lớn
hơn 90%, hệ số biến đổi là 6%. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp khoảng 10 ng/kg. Manetta
và cộng sự đã sử dụng cột C-8 trong quá trình làm sạch, sau đó phân tích bằng phƣơng pháp
HPLC với đầu dò huỳnh quang, dùng pyridinium hydrobromide perbromide để tạo dẫn xuất sau
cột để xác định Aflatoxin trong sữa và pho mát [18]. Giới hạn phát hiện trong sữa và pho mát là
1 ng/kg và 5ng/kg. Khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn là 0,001-0,1 ng/kg. Độ thu hồi trung
bình của Aflatoxin M1 từ sữa và phô mai ở nồng độ 25-75 ng/kg và 100-300 ng/kg, tƣơng ứng,
là 90 và 76%.
Dùng cột miễn dịch (IAC-immunoaffinity column):
Cột ái lực miễn dịch đã trở nên ngày càng phổ biến cho mục đích làm sạch mẫu vì những ƣu
điểm nhƣ chọn lọc và rất dễ sử dụng. Chúng có thể đƣợc dùng để lọc các mẫu bị nhiễm các
Aflatoxin khác nhau. Các phân tử chất phân tích (Aflatoxin) liên kết chọn lọc kháng thể trong
cột. Các thành phần khác trong nền mẫu không tƣơng tác với kháng thể và có thể đƣợc rửa bỏ.
Chất phân tích có thể đƣợc tách rửa với một dung mơi gây biến tính kháng thể. Sử dụng cột ái
lực miễn dịch cho độ thu hồi cao [19, 20].
Maria Helena Iha và các đồng nghiệp đã dùng cột ái lực miễn dịch để làm sạch mẫu trong quá

trình phân tích Aflatoxin M1 trong các sản phẩm từ sữa. Dung dịch H2O:MeOH (55:45) đƣợc
dùng làm dịch chiết, sau đó cho dịch chiết này qua cột IAC. Các tạp chất trong cột đƣợc rửa
bằng nƣớc, sau đó Aflatoxin trong cột đƣợc rửa giải bằng MeOH và định lƣợng bằng HPLC
đầu dò huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp lần lƣợt là 3
ng/kg và 10 ng/kg, RSD < 10% [21]. Chen cùng nhóm nghiên cứu đã định lƣợng Aflatoxin
trong sữa bằng UHPLC-MS/MS với phƣơng pháp xử lý mẫu có dùng cột IAC, 50 ml sữa tách
béo đƣợc cho qua cột mà không dùng dung môi chiết. Phƣơng pháp này cho khoảng tuyến tính
rộng (r > 0.997) ở nồng độ 0.05–500 µg/l, LOD là 0,18 ng/l, RSD < 15% [20].
Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp là mất nhiều thời gian trong quá trình xử lý mẫu, cột có độ
chọn lọc cao nên khơng thể dùng kết hợp phân tích với chất khác góp phần làm chi phí cho cột


cao. Ngồi ra thì việc dùng cột miễn dịch cũng có một nhƣợc điểm nữa là đối với các nền mẫu
phức tạp thì các tạp chất trong nền mẫu sẽ cạnh tranh với chất cần phân tích để liên kết với
kháng nguyên làm ảnh hƣởng đến kết quả phân tích [21].
Chiết lỏng – lỏng (Liquid Liquid Extraction-LLE):
Việc tách lỏng-lỏng là một quá trình dựa trên các phân bố của hợp chất hữu cơ giữa pha nƣớc
và dung môi hữu cơ (có thể hịa tan hoặc khơng hịa tan với nƣớc nhƣ acetone, chloroform hay
methanol). Methanol và nƣớc đã đƣợc sử dụng để phân tích Aflatoxin trong sữa nƣớc [23].
Phƣơng pháp này đã đƣợc sửa đổi bởi McKinney (1972) và những ngƣời khác [24].
Stubblefield và Shannon (1974) chiết với acetone và nƣớc [25]. Các nghiên cứu khác đã chứng
minh phƣơng pháp và nó đã trở thành một phƣơng pháp AOAC chính thức đối với Aflatoxin
M1 [26] (AOAC là chữ viết tắt của Hiệp hội chính thức phân tích hóa học). Chiết Aflatoxin từ
sữa nƣớc bằng chloroform và sau đó đƣợc làm sạch trong một cột silicagel nhỏ, cuối cùng đƣợc
phân tách bằng kỹ thuật TLC với đầu dò huỳnh quang đƣợc thực hiện bởi Stubblefield [27].
Sau khi sửa đổi, phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng cho xác định Aflatoxin trong phơ mai,
trong đó dùng TLC hai chiều đã để cải thiện khả năng tách Aflatoxin từ nền. Một nghiên cứu
của IUPAC đã đánh giá phƣơng pháp [28] và nó đã trở thành phƣơng pháp chính thức để tách
chiết Aflatoxin M1 trong sữa và pho mát [29].
Các hỗn hợp khác: methanol - nƣớc [30] acetone - nƣớc và acetone -chloroform - nƣớc [31] đã

đƣợc sử dụng để tách các độc tố Aflatoxin.
Năm 2011, HaoWang và các đồng nghiệp đã dùng acetonitrile để chiết Aflatoxin M1 từ sữa.
Phƣơng pháp có LOD là 0,005 µg/kg, LOQ là 0,02 µg/kg với hiệu suất thu hồi trung bình 88,8
-100,6 % và %RSD < 15% [32].
Năm 2013, Luca Campone và các đồng nghiệp đã dùng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng với thể
tích nhỏ để chiết Aflatoxin M1 từ sữa với acetonitrile làm dịch chiết, kết qủa cho ra một phƣơng
pháp chiết đơn giản chi phí thấp, dễ vận hành và tiện lợi về mặt thời gian [33].
Cũng trong năm 2013 tại Parma, Italy, Biancardi và cộng sự đã dùng ethyl acetate để chiết
Aflatoxin M1 từ sữa với độ thu hồi trung bình là 95%, khoảng tin cậy là 1,9%, CV là 4,5% [34].


Hình 1.3 So sánh hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích bằng chiết lỏng – lỏng và dùng
IAC [34]
Các kết quả thu đƣợc bằng cách áp dụng LLE và IAC, tất cả thơng số khơng có sự khác biệt
đáng kể, quy trình dùng LLE có thể so sánh với các phƣơng pháp thông thƣờng dựa trên
ISO14501. Tuy nhiên, quy trình dùng LLE nhìn chung có độ chính xác tốt hơn, với tất cả các
giá trị trung bình gần nhau (Hình 1.3).
Gần đây nhất tháng 10/2015, Nicolás Michlig và các đồng nghiệp đã dùng phƣơng pháp
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe - nguyên lý là chiết lỏng – lỏng
nhƣng có thêm bƣớc làm sạch) để chiết Aflatoxin M1 trong sữa. Với hiệu suất thu hồi 70–95 %,
% RSD < 15 %, LOD là 0.002 μg/ L, LOQ là 0.007 μg/ L) [35].
Muối đƣợc cho vào trong quá trình chiết tách [33, 34, 35] để tăng khả năng chiết tách vì làm
tăng độ mạnh ion nên trong luận văn này chúng tơi thêm muối vào q trình chiết.
Trong tất cả các dung mơi đƣợc trình bày thì ethyl acetate đƣợc xem là thân thiện với môi
trƣờng và giá thành rẻ hơn so với các dung mơi cịn lại.
Phƣơng pháp này có ƣu điểm là rẻ tiền, thiết bị đơn giản, qui trình xử lý nhanh do đó trong luận
văn này chúng tôi chọn phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng bằng ethyl acetate.


1.1.6.2. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng:

Sắc ký lớp mỏng (Thin-layer chromatography-TLC):
Sắc ký lớp mỏng cũng đƣợc biết đến nhƣ sắc ký phẳng và là một trong những kỹ thuật đƣợc sử
dụng rộng rãi trong phân tích Aflatoxin. TLC là một kỹ thuật sắc ký đƣợc sử dụng cho việc
tách, đánh giá độ tinh khiết.
Sắc ký lớp mỏng bao gồm một pha tĩnh cố định trên một tấm thủy tinh hoặc nhựa và dung môi
nhƣ là một pha động. Các mẫu là chất lỏng hoặc là đƣợc hòa tan trong dung môi dễ bay hơi
đƣợc chấm trên tấm sắc ký đƣợc đặt thẳng đứng trong một bể chứa dung môi và dung môi di
chuyển lên các tấm bằng mao dẫn. Khi dung môi di chuyển đến một giới hạn nhất định của pha
tĩnh, tấm sắc ký sẽ đƣợc lấy ra khỏi bể chứa dung môi. Sự phân tách sau đó đƣợc quan sát bằng
ánh sáng cực tím hoặc bằng cách phun thuốc thử thích hợp.
Hàm lƣợng Aflatoxin của dung dịch mẫu có thể đƣợc xác định bằng cách cho chuẩn chạy song
song với mẫu. Các thành phần khác nhau trong một hỗn hợp di chuyển trên tấm sắc ký ở mức
độ khác nhau do sự khác biệt trong sự phân bố của chúng trong pha động và pha tĩnh. Giá trị Rf
cho mỗi điểm đƣợc tính tốn là tỷ lệ của khoảng cách (cm) từ đầu đến trung tâm của điểm mẫu
và khoảng cách (cm) từ đầu đến vị trí giới hạn (điểm dừng của dung mơi). Rf là viết tắt của
“ratio of fronts” hay “retardation factor”. Rf là đặc trƣng cho một hợp chất theo pha động di
chuyển trên pha tĩnh. Đối với mục đích nhận danh, giá trị Rf của chuẩn đƣợc so sánh với mẫu.
Dùng phƣơng pháp TLC để bán định lƣợng dựa trên sự phát quang của chất phân tích dƣới đèn
UV, so sánh màu sắc của chất phân tích trong mẫu và dãy chuẩn có nồng độ biết trƣớc.
Một số phƣơng pháp đã đƣợc phát triển cho việc dùng TLC xác định các độc tố Aflatoxin [36].
Tấm silica (pha tĩnh) đƣợc sử dụng chủ yếu. Pha động chủ yếu là hỗn hợp dung môi của
chloroform và một lƣợng nhỏ methanol hoặc acetone. Ngoài ra, một số hỗn hợp dung mơi hữu
cơ ít độc hại cho mơi trƣờng (ví dụ nhƣ toluene/ethyl acetate-hoặc acetone/iso-propanol) cũng
đƣợc sử dụng [36]. Aflatoxin là chất phát quang mạnh (phát hiện ở λ = 365 nm hoặc phát xạ λ
= 430 nm) do đó có thể dễ dàng đƣợc phát hiện bởi đầu dò huỳnh quang. Sắc ký lớp mỏng là
phƣơng pháp AOAC chuẩn để phân tích Aflatoxin từ năm 1971 [37].
Một ứng dụng điển hình của TLC trong phân tích Aflatoxin là của Van Egmond và các đồng
nghiệp (1978). Các tác giả xác định Aflatoxin M1 trên tấm sắc ký mỏng từ phản ứng của
Aflatoxin M1 với axit trifluoroacetic (TFA) với pha động là chloroform-methanol-acetic acid-

nƣớc (92 + 8 + 2). Nhƣng phƣơng pháp này thƣờng không đƣợc dùng để định lƣợng do hạn chế
về độ chính xác [38, 39].
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Presure liquid chromatography - HPLC):
Phƣơng pháp này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi do tính chính xác, độ nhạy, độ chọn lọc, thu
hồi và độ tin cậy cao hơn so với phƣơng pháp TLC. Phƣơng pháp HPLC đã đƣợc dùng để phân
tích tất cả các độc tố nấm mốc quan trọng trong ngũ cốc và các nông sản khác.

Hình 1.4 Sơ đồ các thành phần chính của một hệ thống HPLC
[ />Trong HPLC, một pha động (chất lỏng hoặc dung môi) đƣợc sử dụng để di chuyển mẫu qua
cột, pha tĩnh cố định trong cột. Các chất phân tích sẽ phân bố khác nhau trong pha động và pha
tĩnh dẫn đến sự tách các hợp chất.
Hai cột thƣờng dùng trong HPLC là cột pha thƣờng và cột pha đảo. Trong sắc ký bình thƣờng,
một pha tĩnh cực phân cực ví dụ: gel silica và một dung mơi khơng phân cực ví dụ hexane đƣợc
sử dụng. Trong khi sắc ký pha đảo (RP-HPLC) thì cột sẽ chứa pha tĩnh khơng phân cực (nhƣ
cột C-8 hoặc C-18 hydrocarbon) và pha động phân cực (nƣớc, methanol hoặc acetonitrile).
Các đầu dò thƣờng dùng là đầu dò UV (Ultraviolet), đầu dò DAD (Diode Array Detector), đầu
dò huỳnh quang FLD (Fluorescence detector) và đầu dò khối phổ MS (Mass Spectrometry).
Aflatoxin đƣợc dẫn xuất tạo thành hợp chất phát huỳnh quang và đƣợc phát hiện bằng đầu dò
huỳnh quang. Độ nhạy phƣơng pháp cao, giới hạn phát hiện có thể trong phạm vi của
microgram/kg.
Sự lựa chọn của đầu dị thƣờng phụ thuộc vào tính chất của mẫu. RP-HPLC thƣờng đƣợc thực
hiện để xác định độc tố Aflatoxin trong thực phẩm và dẫn suất đƣợc thực hiện với các axit


mạnh hoặc chất oxy hóa ví dụ Br2, I2 hoặc axit trifluoro-acetic. Hệ thống HPLC cho kết quả
dƣới dạng sắc ký đồ. Một sắc ký đồ cho hai loại các thơng tin phân tích: định tính (dựa vào thời
gian của chất) và định lƣợng (dựa vào diện tích của peak). Tuy nhiên thì việc dùng đầu dị UV
hay huỳnh quang này cũng có mặt hạn chế:
Phải tạo dẫn xuất để tăng độ phát quang của chất phân tích.

Việc xác định hợp chất chỉ dựa vào thời gian lƣu nên đối với nền mẫu phức tạp sẽ dễ tạo
mẫu dƣơng tính giả do có hợp chất nào đó trong nền mẫu trùng thời gian lƣu với chất
cần phân tích.
Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):
Phƣơng pháp này đƣợc dùng để phân tích Aflatoxin vì có các ƣu điểm: đơn giản, dễ sử dụng,
nhạy và khả năng tƣơng thích của nó. Nó đƣợc chia làm 2 loại:
Cạnh tranh trực tiếp với enzyme liên kết miễn dịch: kháng thể đặc biệt đƣợc phủ lên một
pha rắn nhƣ một tấm microtiter
Cạnh tranh gián tiếp với enzyme liên kết miễn dịch: liên hợp protein-độc tố đƣợc phủ
lên tấm microtiter.
Trong thực tế thì ELISA cạnh tranh trực tiếp đƣợc dùng nhiều hơn. Phƣơng pháp này phát hiện
và định lƣợng các kháng nguyên (Aflatoxin) trong mẫu bằng cách sử dụng một loại enzyme và
kháng thể đặc hiệu. Các liên kết enzyme dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể [40].
Kháng nguyên sản xuất kháng thể khi đƣợc đƣa vào máu ấm động vật. Trong khi đó, kháng thể
là các glycoprotein đƣợc sản xuất nhƣ là kết quả của một phản ứng miễn dịch. Kháng thể đối
với Aflatoxin đƣợc phủ ở các giếng trong dải microtiter. Aflatoxin tự do và Aflatoxin enzyme
liên hợp cạnh tranh các kháng thể trong giếng.
Bƣớc rửa để loại bỏ bất kỳ enzyme liên hợp không ràng buộc. Sau đó chất nền hoặc thể nhiễm
sắc đƣợc thêm vào các giếng và ủ. Các enzyme liên hợp chuyển đổi nhiễm sắc không màu
thành màu xanh. Dung dịch ngừng phản ứng đƣợc cho vào dẫn đến sự thay đổi màu sắc từ xanh
sang màu vàng. Sau đó, các giếng này đƣợc đƣa vào máy quang phổ để đo ở bƣớc 450 nm.
Tuy nhiên nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là dễ bị nhiễm mẫu chéo và có khả năng cho mẫu
dƣơng tính giả [41] nên thƣờng dùng để phân tích sàng lọc trƣớc khi định lƣợng bằng LC-MS
Sắc ký lỏng ghép khối phổ:


Sắc ký lỏng với đầu dò khối phổ (LC-MS) gần đây đƣợc phát triển trong việc phát hiện các độc
tố Aflatoxin và là một trong những kỹ thuật tiên tiến nhất. Trong LC-MS, mẫu đi vào buồng
ion hóa thơng qua một máy phun sƣơng. Có một số kỹ thuật ion hóa, cụ thể là electrospray,
nhiệt phun, hóa chất và nguyên tử bắn phá nhanh. Phân mảnh diễn ra trong buồng va chạm.

Các mảnh vỡ sau đó đi vào vùng chân khơng sâu và đầu dị sẽ đọc các tín hiệu này. Do phƣơng
pháp này định danh và định lƣợng dựa trên các mảnh ion của phân tử (cùng với thời gian lƣu)
nên có các ƣu điểm hồn tồn có thể đáp ứng đƣợc yêu cầu trong phân tích độc tố nhƣ: độ
nhạy, độ chọn lọc, độ chính xác cao đáp ứng đƣợc yêu cầu MRL thấp. Hơn nữa, theo Ủy ban
Châu Âu 2002/657/EC (2002) thì một phƣơng pháp xác định dựa trên khối phổ (MS) sẽ là phù
hợp nhất do khả năng cung cấp đầy đủ thông tin [39].Bên cạnh đó các nhƣợc điểm của phƣơng
pháp này là: chi phí đầu tƣ ban đầu đắt tiền, đòi hỏi kỹ thuật của ngƣời sử dụng.
Trong luận văn này chúng tôi chọn phân tích Aflatoxin M1 trong sữa bằng phƣơng pháp LCMS/MS.
1.1.7. Giới thiệu chung về phƣơng pháp sắc ký: [42]
1.1.7.1. Định nghĩa:
Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906): Sắc là một phƣơng pháp tách trong đó các cấu tử của
một hỗn hợp đƣợc tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống đang chảy.
Định nghĩa của IUPAC (1993): Sắc ký là một phƣơng pháp tách trong đó các cấu tử đƣợc tách
đƣợc phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn pha kia chuyển động
theo một hƣớng xác định.
1.1.7.2. Phân loại:
Ngƣời ta phân loại các phƣơng pháp sắc dựa vào cơ chế hoạt động sắc : hấp phụ, phân bố, trao
đổi ion… và vào tính chất của pha tĩnh cũng nhƣ phƣơng pháp thể hiện sắc ký. Ví dụ:
- Phƣơng pháp sắc ký lỏng rắn trên cột, phƣơng pháp sắc ký phân bố khí lỏng trên cột.
- Phƣơng pháp sắc ký phân bố lỏng lỏng trên bản phẳng hai chiều.
- Phƣơng pháp sắc ký phân bố lỏng lỏng pha ngƣợc áp suất cao trên cột…
Cơ chế sắc ký có nhiều nhƣng để thực hiện q trình sắc ký thì chỉ có hai dạng: dạng cột và
dạng bản phẳng (bản kính, polime, kim loại, giấy).
Trong sắc ký cột, pha tĩnh đƣợc giữ trong một cột ngắn và pha động đƣợc cho chuyển động qua
cột bởi áp suất hoặc do trọng lực. Trong sắc ký bản mỏng, pha tĩnh đƣợc phủ trên một mặt


phẳng thủy tinh hoặc kim loại. Thƣờng để đơn giản hóa, tuy khơng chính xác ngƣời ta gọi tắt
các phƣơng pháp sắc ký: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lớp mỏng, sắc ký
gel…Trong số các phƣơng pháp sắc ký đƣợc biết, quan trọng nhất là sắc ký hấp phụ, sắc ký

phân bố và sắc ký trao đổi ion. Dƣới đây sẽ giới thiệu một số phƣơng pháp sắc ký này nhằm
vào hai mục đích: chuẩn bị mẫu cho chất phân tích và dùng làm cột phân tích một hỗn hợp
chất.
Bảng 1.5 Phân loại các phƣơng pháp sắc ký cột
Phân loại chung

Phƣơng pháp cụ

Pha tĩnh

Kiểu cân bằng

- Lỏng đƣợc phủ
trên
một chất rắn
- Chất hữu cơ
đƣợc gắn
trên một bề mặt
rắn
- Rắn
Nhựa trao đổi ion

- Phân bố
- Phân bố giữa
chất
lỏng và bề mặt liên
kết
- Hấp phụ
Trao đổi ion

thể
Sắc ký lỏng (LC)
(Pha động : lỏng)

- Lỏng- lỏng hoặc
phân bố
- Pha lỏng liên kết
- Lỏng-rắn hoặc
hấp phụ trao đổi
ion

Sắc ký khí (GC)
(pha động: Khí)

Khí-lỏng
Lỏng đƣợc phủ
- Khí - pha liên kết trên
- Khí - rắn
một chất rắn
- Chất hữu cơ
đƣợc liên
kết trên một bề
mặt rắn
- Rắn

Sắc ký lỏng siêu
tới hạn

Pha lỏng: chất
lỏng siêu

tới hạn
(supercritical
fluid)

Chất hữu cơ đƣợc
liên
kết trên một bề
mặt rắn

Phân bố giữa khí
và
lỏng
- Phân bố giữa
lỏng và
bề mặt liên kết
- Hấp phụ
Phân bố giữa chất
lỏng
siêu tới hạn và bề
mặt
liên kết

1.1.7.3. Nguyên lý hoạt động của cột sắc ký:
Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu đƣợc vận
chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh. Mẫu đi vào tƣớng động đƣợc mang theo dọc hệ thống sắc
ký (cột, bản phẳng) có chứa pha tĩnh phân bố đều khắp. Pha động có thể là pha lỏng hoặc khí,


pha tĩnh có thể là một lớp phim đƣợc phủ trên bề mặt của chất mang trơ hoặc một bề mặt rắn.
Sự tƣơng tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và

pha tĩnh. Sự ái lực khác nhau của các chất tan trên pha tĩnh làm chúng di chuyển với những vận
tốc khác nhau trong pha động của hệ thống sắc ký. Kết quả là chúng đƣợc tách thành những dải
trong pha động và vào lúc cuối của quá trình các cấu tử lần lƣợt hiện ra theo trật tự tƣơng tác
với pha tĩnh. Cấu tử di chuyển chậm (tƣơng tác yếu) ra trƣớc, cấu tử bị lƣu giữ mạnh hơn ra sau
dƣới dạng các tách riêng rẻ (hoặc bậc thang) tùy thuộc vào cách tiến hành sắc ký và đƣợc hiển
thị dƣới dạng sắc ký đồ.

Hình 1.5 Quá trình tách sắc ký trên cột của hai chất A và B
Mẫu chứa A và B đƣợc tiêm vào cột. Khi cho một chất rửa giải bắt đầu chảy qua cột, phần của
mẫu đƣợc hòa tan trong pha động đƣợc di chuyển tại phần đầu của cột (tại thời điểm to). Ở đây
các cấu tử A và B tự phân bố giữa hai pha. Tiếp tục cho pha động đi qua cột thì nó sẽ đẩy phần