Ảnh hưởng nồng độ enzyme và mật độ tế bào nấm men đến quá trình đường hóa và lên men đồng thời để thu nhận ethanol từ gạo tấm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

TRẦN THỊ MỘNG TRINH

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ ENZYME VÀ MẬT ĐỘ TẾ BÀO
NẤM MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN
ĐỒNG THỜI ĐỂ THU NHẬN ETHANOL TỪ GẠO TẤM

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
Mã số chuyên ngành: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2017


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS. TS LÊ VĂN VIỆT MẪN
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Trần Bích Lam

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS. TS. Lê Nguyễn Đoan Duy

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. HCM
ngày 12 tháng 01 năm 2017.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. PGS. TS. Hoàng Kim Anh .............................Chủ Tịch
2. TS. Trần Bích Lam ........................................Phản biện 1

3. PGS. TS. Lê Nguyễn Đoan Duy ......................Phản biện 2
4. TS. Lại Quốc Đạt ...........................................Ủy viên
5. TS. Võ Đình Lệ Tâm .....................................Ủy viên, thư ký
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỢI ĐỜNG

TRƯỞNG KHOA


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỢNG HỊA XÃ HỢI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

KHOA

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: TRẦN THỊ MỘNG TRINH
Ngày, tháng, năm sinh: 14/04/1990

MSHV:7141019
Nơi sinh:Vĩnh Long

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm .................................... Mã số: 60540101
I. TÊN ĐỀ TÀI: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME VÀ MẬT ĐỘ TẾ

BÀO NẤM MEN ĐẾN QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ĐỒNG
THỜI ĐỂ THU NHẬN ETHANOL TỪ GẠO TẤM

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Nhiệm vụ


Khảo sát ảnh hưởng nồng độ alpha - amylase đến quá trình đường hóa và lên
men đồng thời để thu nhận ethanol từ gạo tấm.



Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucoamylase đến quá trình đường hóa và lên
men đồng thời để thu nhận ethanol từ gạo tấm.



Khảo sát ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến quá trình đường hóa và lên
men đồng thời để thu nhận ethanol từ gạo tấm.

Nội dung


Xác định hàm lượng ethanol trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời
dưới điều kiện tác động của nồng độ enzyme alpha - amylase.



Xác định hàm lượng ethanol trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời
dưới điều kiện tác động của nồng độ enzyme glucoamylase.



Xác định hàm lượng ethanol trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời
dưới điều kiện tác động của mật độ tế bào nấm men.

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/07/2016
III. NGÀY HỒN THÀNH NHIỆM VỤ: 4/12/2016
IV. CÁN BỢ HƯỚNG DẪN: GS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Tp. HCM, ngày 03 tháng 01 năm 2017.
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành

nhất đến GS. TS. Lê Văn Việt Mẫn là người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn
thành luận văn và truyền đạt cho tôi những phương pháp kinh nghiệm trong quá trình
nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Huỳnh Trung Việt và
Cô Nguyễn Thị Thanh Phượng cán bộ quản lý phòng thí nghiệm đã tận tình giúp đỡ,
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý Thầy Cô đã giảng dạy tôi trong suốt
thời gian học tập tại trường Đại học Bách Khoa nói chung và quý Thầy Cô trong bộ
môn Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng, đã dùng tâm huyết của mình để truyền đạt vốn
kiến thức chuyên ngành cũng như những kĩ năng trong cuộc sống. Những kiến thức
đó là nền tảng để tôi có thể hoàn thành luận văn, hoàn thành chương trình học và là
hành trang để tôi vững tin bước vào cuộc sống sau này. Con cũng không quên lời cảm
ơn sâu sắc đến Cha Mẹ, những người đã sinh ra, nuôi dưỡng và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để con có thể hoàn thành ước mơ, có thêm động lực, niềm tin trong quá
trình thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin cảm anh Lê Hoàng Sơn người đã giúp đỡ
tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu của luận văn. Cuối cùng tôi xin cảm ơn các anh
chị, bạn bè trong phòng thí nghiệm cũng như lớp cao học 2014 đợt II đã luôn động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài ở phòng thí nghiệm.
Xin gởi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc nhất
TP. Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 01 năm 2017
Học viên thực hiện

Trần Thị Mộng Trinh

I


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Để khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme và mật độ tế bào nấm men đến quá
trình đường hóa và lên men đồng thời để thu nhận ethanol. Gạo tấm, chế phẩm α amylase, glucoamylase và nấm men Kluyveromyces marxianus được sử dụng. Nội
dung nghiên cứu của luận văn gồm có 3 phần chính.
Phần 1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ alpha - amylase đến quá trình đường hóa
và lên men đồng thời. Chúng tôi đánh giá sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến độ
nhớt và chỉ số DE của dung dịch khi kết thúc giai đoạn dịch hóa, nồng độ ethanol,
hàm lượng tinh bột sót theo thời gian.
Phần 2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucoamylase đến quá trình đường hóa và
lên men đồng thời. Chúng tôi đánh giá sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến nồng
độ ethanol và hàm lượng tinh bột sót theo thời gian.
Phần 3. Khảo sát ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến quá trình đường hóa
và lên men đồng thời. Chúng tôi đánh giá sự ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men
ban đầu đến sự sinh trưởng của nấm men, nồng độ ethanol và hàm lượng tinh bột sót
theo thời gian.
Kết quả nghiên cứu cho thấy với nồng độ alpha - amylase 10,9 IU/g, nồng độ
glucoamylase 7,3 IU/g và mật độ nấm men ban đầu 107 tế bào/mL, quá trình đường
hóa và lên men đồng thời kết thúc sau 72 giờ, lượng ethanol cực đại là 47,98 g/L,
hiệu suất sinh ethanol là 36,38%.

II


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

ABTRACT
This study focused on the effects of enzyme and yeast cell concentration on the
silmultaneous saccharification and fermentation of starch material for ethanol

production. Broken rice, alpha - amylase, glucoamylase and Kluyveromyces
marxianus were used.The research counts of 3 sections.
Section 1. Effects of alpha - amylase concentration on SSF. The impacts of
enzyme concentration on the viscosity and DE value of the slurry at the and of the
starch liquefaction and on the ethanol and residual starch content during the SSF were
investigated.
Section 2. Effects of glucoamylase concentration on SSF. The impacts of
enzyme concentration on the ethanol and residual starch content during the SSF were
examined.
Section 3. Effects of yeast cell concentration on SSF. The impacts of pitching
rate on the yeast growth, ethanol and residual starch content during the SSF were
evaluated.
The appropriate conditions were alpha – amylase concentration of 10,9 IU/g,
glucoamylase concentration 7,3 IU/g and yeast cell concentration of 107 cell/mL.
Under these condition, the SSF lasted for 72h, the maximum ethanol content and yield
were 47,98 g/L and 36,38%, respectively.

III


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả
nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn. Các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc.

Học viên thực hiện luận văn

Trần Thị Mộng Trinh

IV


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. I
TÓM TẮT LUẬN VĂN ................................................................................. II
ABTRACT .................................................................................................... III
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................... IV
DANH MỤC HÌNH ................................................................................... VIII
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... IX
DANH MỤC KÍ TỰ VIẾT TẮC ................................................................. XI
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU............................................................................. 1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
2.1.

Nguyên liệu sản xuất............................................................................ 3

2.1.1. Nguyên liệu gạo tấm ......................................................................... 3
2.1.2. Nấm men Kluyveromyces marxianus ................................................ 6
2.1.3. Hệ enzyme amylase .......................................................................... 7
2.1.3.1. Enzyme alpha - amylase (α - 1,4 glucan - glucanhydrolase) ........ 7
2.1.3.2. Enzyme glucoamylase ................................................................ 8

2.2.

Cơ sở lý thuyết của quá trình đường hóa và lên men đồng thời để sản

xuất ethanol .......................................................................................................... 9
2.2.1.

Cơ sở lý thuyết .............................................................................. 9

2.2.1.1. Quá trình hồ hóa và dịch hóa ................................................... 9
2.2.1.2. Quá trình đường hóa và lên men đồng thời ............................ 10
CHƯƠNG 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 13
3.1. Nguyên liệu .......................................................................................... 13
3.1.1. Gạo tấm .......................................................................................... 13
3.1.2. Nấm men ........................................................................................ 13
3.1.3. Chế phẩm alpha - amylase .............................................................. 13

V


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

3.1.4. Chế phẩm glucoamylase ................................................................. 13
3.1.5. Hóa chất ......................................................................................... 14
3.2. Nội dung ............................................................................................... 14
3.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 17
3.3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nồng độ alpha - amylase đến quá trình
đường hóa và lên men đồng thời để thu nhận ethanol. ..................................... 17

3.3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase đến quá trình
đường hóa và lên men đồng thời để thu nhận ethanol ...................................... 18
3.3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men đến quá trình đường
hóa và lên men đồng thời để thu nhận ethanol ................................................. 19
3.4. Phương pháp phân tích .......................................................................... 19
3.4.1. Phương pháp phân tích ................................................................... 19
3.4.1.1. Hàm lượng ethanol ................................................................... 19
3.4.1.2. Hàm lượng tinh bột................................................................... 20
3.4.1.3. Độ nhớt .................................................................................... 20
3.4.1.4. Chỉ số đương lượng đường khử DE (Dextrose Equivalent) ....... 20
3.4.1.5. Hàm lượng chất khô ................................................................. 20
3.4.1.6. Mật độ tế bào............................................................................ 21
3.5. Cơng thức tính tốn ............................................................................... 21
3.5.1. Xác định tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men ..................... 21
3.5.2. Tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình ......................................... 21
3.5.3. Hiệu suất sinh tổng hợp ethanol ...................................................... 21
3.5.4. Xác định hàm lượng tinh bột sót ..................................................... 22
3.5.5. Xác định tốc độ chuyển hóa tinh bột ............................................... 22
3.6. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 22
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................... 23
4.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme alpha - amylase........................... 23
4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylase đến độ nhớt của dung
dịch sau khi dịch hóa....................................................................................... 23

VI


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

4.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylase đến chỉ số DE của
dung dịch sau khi dịch hóa .............................................................................. 24
4.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme apha - amylase đến hàm lượng ethanol
trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................. 25
4.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylase đến hàm lượng tinh
bột sót trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời .................................. 28
4.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase.............................. 30
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng ethanol
trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................. 30
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng tinh bột
sót trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ........................................ 33
4.3. Khảo sát ảnh hưởng mật độ tế bào nấm men ......................................... 35
4.3.1. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu đến sự sinh trưởng
của nấm men trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ........................ 35
4.3.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến nồng độ ethanol trong quá
trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................................. 37
4.3.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến hàm lượng tinh bột sót
trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................. 40
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 43
5.1. Kết luận ................................................................................................ 43
5.2. Kiến nghị .............................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45
PHỤ LỤC ...................................................................................................... 54
PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG .............................................................. 60

VII


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cấu tạo của hạt gạo . ................................................................................ 3
Hình 2.2. Các sản phẩm của quá trình chà xát gạo .................................................. 4
Hình 3.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 15
Hình 3.2. Quy trình thu nhận ethanol ..................................................................... 16
Hình 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylase đến độ nhớt của dung dịch
khi kết thúc giai đoạn dịch hóa ........................................................................ 23
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylase đến chỉ số DE của dung
dịch khi kết thúc dịch hóa ............................................................................... 24
Hình 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylase đến nồng độ ethanol thu
được trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời .................................... 25
Hình 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylasae đến hàm lượng tinh bột
sót thu được trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ......................... 29
Hình 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng ethanol trong
quá trình đường hóa và lên men đồng thời ...................................................... 30
Hình 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến hàm lượng tinh bột sót
trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................. 33
Hình 4.7. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu đến đường cong sinh trưởng
của nấm men trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời. ....................... 35
Hình 4.8. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men Kluyveromyces marxianus đến nồng
độ ethanol trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời. ........................... 38
Hình 4.9. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến hàm lượng tinh bột sót trong quá
trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................................. 41
Hình A1. Nhớt kế Ostwald .................................................................................... 54
Hình A2. Đường chuẩn glucose dùng để xác định nồng độ đường khử .................. 56
Hình A3. Hệ thống sắc ký khí ................................................................................ 58
Hình A4. Kết quả sắc ký đồ khi xác định nồng độ ethanol bằng phương pháp sắc ký

khí .................................................................................................................. 59

VIII


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của gạo tấm ............................................................. 5
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ alpha - amylase đến nồng độ ethanol cực đại và
thời gian đường hóa và lên men đồng thời ...................................................... 26
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ alpha - amylase đến tốc độ sinh ethanol trong quá
trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................................. 27
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha - amylase đến hiệu suất sinh tổng
hợp ethanol trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời .......................... 28
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến nồng độ ethanol cực
đại và thời gian đường hóa và lên men đồng thời ............................................ 31
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến tốc độ sinh ethanol
trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ............................................. 32
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến hiệu suất sinh tổng hợp
ethanol trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời ................................. 32
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase đến tốc độ sử dụng tinh bột
....................................................................................................................... 34
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên lượng tế bào cực đại của nấm
men Kluyveromyces marxianus trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời.
....................................................................................................................... 36
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên tốc độ sinh trưởng của nấm men
Kluyveromyces marxianus trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời. .. 37

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến nồng độ ethanol cực đại của
nấm men Kluyveromyces marxianus trong quá trình đường hóa và lên men đồng
thời. ................................................................................................................ 39

IX


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

Bảng 4.11. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến tốc độ sinh ethanol của nấm
men Kluyveromyces marxianus trong quá trình đường hóa và lên men đồng thời.
....................................................................................................................... 39
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp ethanol
của nấm men Kluyveromyces marxianus trong quá trình đường hóa và lên men
đồng thời. ........................................................................................................ 39
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu đến tốc độ sử dụng tinh
bột .................................................................................................................. 41

X


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

DANH MỤC KÍ TỰ VIẾT TẮC
DE

: Dextrose Equivalent

DNS

: 3,5 - dinitrosalicylic acid

IU

: International Unit

SHF

: Ceparate Hydrolysis and Fermentation

SSF

: Simultaneous Saccharification and Fermentation

XI


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
Gạo là lương thực chính ước tính của khoảng 3,5 tỷ người trên toàn thế giới. Ở
Châu Á, gạo cung cấp đến 50% lượng calo trong chế độ ăn uống hàng ngày và là một
nguồn protein quan trọng cho hàng triệu người [1]. Sản lượng lúa trên thế giới chiếm
khoảng 380 triệu tấn mỗi năm [2]. Theo thống kê của viện khoa học kỹ thuật miền

Nam, tính đến cuối năm 2015, sản lượng lúa ở Việt Nam sản xuất được khoảng 45
triệu tấn lúa. Quá trình chà xát lúa cho ra phụ phẩm là gạo tấm. Gạo tấm có giá thành
rẻ hơn 14 - 20% so với giá gạo chính phẩm. Hiện nay gạo tấm được sử dụng làm
lương thực cho người, làm thức ăn gia súc và đặc biệt là được sử dụng làm nguyên
liệu để sản xuất rượu ethanol.
Để sản xuất ethanol, có 2 phương pháp phở biến. Một là phương pháp đường
hóa và lên men riêng biệt được sử dụng ở quy mô công nghiệp. Hai là phương pháp
đường hóa và lên men đồng thời được sử dụng ở quy mô làng nghề; khi đó bánh men
có chứa cả nấm mốc và nấm men.
Phương pháp đường hóa và lên men đồng thời tại các làng nghề Việt Nam và
một số nước đang phát triển có một số nhược điểm: tinh bột trong nguyên liệu chưa
qua quá trình dịch hóa nên hiệu suất thủy phân tinh bột không cao, thời gian thủy
phân tinh bột kéo dài. Bên cạnh đó, hoạt tính amylase do nấm mốc sinh ra không cao
do quá trình sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc không được tối ưu hóa. Ngoài ra,
quá trình lên men diễn ra trong điều kiện không có điều nhiệt nên hoạt tính lên men
của nấm men Saccharomyces cerevisiae bị giảm đi do nấm men này không lên men
tốt khi nhiệt độ tăng lên 35 - 400C.
Để khắc phục những nhược điểm trên, một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng
tinh bột đã qua hồ hóa và dịch hóa để đường hóa và lên men đồng thời. Bên cạnh đó,
các chế phẩm thương mại amylase và nấm men chịu nhiệt được thử nghiệm sử dụng
để sản xuất ethanol từ nguyên liệu giàu tinh bột. Tại Việt Nam đến nay chưa có các
công bố khoa học về vấn đề này.

Trang 1


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu sử dụng loài
Kluyveromyces marxianus và chế phẩm amylase để đường hóa và lên men đồng thời
với mục đích thu nhận ethanol từ gạo tấm.

Trang 2


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1.

Nguyên liệu sản xuất

2.1.1. Nguyên liệu gạo tấm
Theo thống kê của cục xúc tiến thương mại Việt Nam, tính đến tháng 1 năm
2016, sản lượng lúa ở nước ta xấp xỉ 45 triệu tấn/năm; trong đó, gạo tấm chiếm
khoảng 15% trọng lượng lúa, tức khoảng 6,75 triệu tấn/năm.
Từ những thống kê trên, ta thấy rằng tổng sản lượng gạo tấm hàng năm tại Việt
Nam là rất lớn. Việc sử dụng gạo tấm để sản xuất rượu ethanol có thể xem là một
trong những hướng đi phù hợp nhằm tận dụng nguồn phụ phẩm này.
Hình 2.1 trình bày cấu tạo của hạt gạo.

Hình 2.1. Cấu tạo của hạt gạo [3].
Tên khoa học của gạo: Oryza sativa var indica/japonica.
Giới (Regnum): Plantae.
Ngành (Division): Magnoliophyta.
Lớp (Classis): Liliopsida (Monocotyledones)

Bộ (Ordo): Poales (bộ hòa thảo, bộ cỏ, bộ lúa).
Họ (Familia ): Gramineae (họ hịa bản), Poaceae.
Phân họ (Subfamilia): Oryzoideae.
Tơng (Tribus): Oryzeae.
Trang 3


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

Chi (Genus, pog): Oryza.L.
Loài (Species,sp,Bug): O.Sativa.L.
Thứ, chủng, loại (varietas,var,Cultiva,Klona): Indica & japonica [4].
Gạo (Oryza sativa var indica): hạt gạo gồm có ba thành phần chính là nội nhũ,
mầm và lớp vỏ cám.
Nội nhũ là thành phần cơ bản cấu tạo nên hạt thóc và có giá trị sử dụng cao nhất.
Nội nhũ hạt gạo được cấu tạo từ các tế bào lớn có thành mỏng chứa đầy các hạt tinh
bột (70 ÷ 82%). Trong nội nhũ, glucid chiếm tới 90% chủ yếu là tinh bột, trong khi
đó trong toàn hạt gạo, lượng glucid chỉ chiếm khoảng 75%.
Nội nhũ được chia thành 2 vùng: vùng gần vỏ hạt gọi là lớp subaleurone và
vùng nội nhũ tâm hạt. Tùy theo giống, điều kiện canh tác và bảo quản mà nội nhũ có
thể là “trắng trong” hay “trắng đục”. Các giống lúa hạt dài có phần nội nhũ thường ở
dạng “trắng trong”, còn các giống lúa hạt ngắn có phần nội nhũ ở dạng “trắng đục”.
Các giống lúa với phần nội nhũ “trắng đục” thường có một vệt trắng ở giữa hạt hay
phía bên hạt và được gọi là bạc bụng, khi xay xát dễ bị nát và khi nấu thì lâu chín [4].
Hình 2.2. Giới thiệu các sản phẩm của quá trình chà xát gạo.

Hình 2.2. Các sản phẩm của quá trình chà xát gạo [2]
Gạo tấm là tên gọi để chỉ một loại gạo do phần đầu xay xát bị vỡ ra. Tên tiếng

anh của gạo tấm là broken rice
Thành phần hóa học của gạo tấm được trình bày trong bảng 2.1.
Trang 4


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

Bảng 2.1. Thành phần hóa học của gạo tấm
Thành phần

Giá trị (% khối lượng)

Tinh bột

75,21 ± 0,1

Độ ẩm

11,6 ± 0,4

Cellulose

0,7

Protein

8,75

Muối khoáng

0,46

Tinh bột: là thành phần quan trọng nhất trong gạo tấm để sản xuất ethanol. Hàm
lượng tinh bột trong gạo tấm càng cao thì lượng rượu thành phẩm sẽ càng cao. Nhìn
chung, gạo tấm có hàm lượng tinh bột cao hơn so với đại mạch, bắp nếp và bắp ngọt
[5]. Một trong những tính chất quan trọng của tinh bột trong sản xuất ethanol là nhiệt
độ hồ hóa. Nhiệt độ hồ hóa càng thấp thì trong sản phẩm quá trình thủy phân tinh bột
sẽ ít tốn chi phí về năng lượng sử dụng [6, 7]. Nhiệt độ hồ hóa của tinh bột gạo dao
động trong khoảng 61 - 780C [8, 9]. Nhiệt độ hồ hóa của tinh bột gạo cao hơn so với
tinh bột bắp và tinh bột khoai tây [10]. Tinh bột bắp và khoai tây là những loại nguyên
liệu được sử dụng để sản xuất rượu ethanol phổ biến tại Hoa Kỳ và Châu Âu [11, 12].
Cellulose: là một polysaccharide, có công thức (C6H10O5)n mà n biến thiên từ
7000 - 15000. Cellulose là polymer mạch thẳng của β - D - glucose, chúng liên kết
với nhau bởi liên kết β - 1,4 glycoside. Kiểu liên kết này đối lập với liên kết α - 1,4 glucoside có trong tinh bột, glycogen và các carbohydrat khác. Cellulose tham gia
cấu tạo nên thành tế bào với chức năng bảo vệ và tạo nên độ vững chắc cho mô tế bào
thực vật. Cellulose có khả năng sinh ethanol nhưng phải chuyển cellulose thành
đường đơn giản như hexose. Cellulose không tan trong nước, trong dung môi hữu cơ
và các dung dịch kiềm loãng. Cellulose có thể phân hủy thành glucose khi đun nóng
với acid hoặc kiềm. Cellulose khi bị thủy phân hoàn toàn sẽ tạo thành đường hòa tan
D - glucose. Nguyên liệu giàu cellulose cũng được sử dụng để sản xuất ethanol [13].
Protein: trong hạt gạo gồm có albumin, glubomin, prolamin và glutelin. Phần
lớn các protein này không hòa tan được vào môi trường lên men.

Trang 5


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

2.1.2. Nấm men Kluyveromyces marxianus
Từ những năm 80 của thế kỷ 20, lên men ethanol ở nhiệt độ cao đã được nhiều
nhà khoa học quan tâm. Nhiều loài nấm men chịu nhiệt được phát hiện như
Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis [14]. Trong số các loài nấm men
chịu nhiệt, Kluyveromyces marxianus được đánh giá là loài nấm men sinh trưởng tốt
và lên men hiệu quả ở nhiệt độ cao. Nấm men này có khả năng sinh trưởng trong
khoảng nhiệt độ từ 400C đến 500C và lên men hiệu quả trong khoảng nhiệt độ từ 380C
đến 450C. Khi được so sánh với loài nấm men Saccharomyces cerevisiae truyền
thống, Kluyveromyces marxianus thể hiện khả năng sinh tổng hợp ethanol nhiều hơn
khi lên men ở nhiệt độ cao [14, 15]. Ngoài ra, Kluyveromyces marxianus còn có khả
năng sử dụng nhiều nguồn cơ chất. Nhiều loại đường như xylose, lactose, cellobiose
có thể được chuyển hóa thành ethanol bởi nấm men Kluyveromyces marxianus.
Trong ngành công nghiệp sản xuất ethanol, Saccharomyces cerevisiae là loài vi
sinh vật truyền thống. Chuyển hóa đường thành ethanol với hiệu suất khá cao là ưu
điểm nổi bật của Saccharomyces cerevisiae so với các loài vi sinh vật lên men ethanol
khác [16]. Tuy nhiên nấm men Saccharomyces cerevisiae chỉ sinh trưởng và sinh
tổng hợp ethanol tốt ở giá trị nhiệt độ xấp xỉ 300C. Khi nhiệt độ môi trường cao hơn
350C, nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh trưởng chậm [17]. Do đó, quá trình
lên men ethanol sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cần hệ thống để ổn định
nhiệt độ lên men, từ đó làm gia tăng giá thành sản phẩm. Trên cơ sở đó, việc sử dụng
nấm men chịu nhiệt để lên men ethanol là một giải pháp triển vọng [18]. Nấm men
Kluyveromyces marxianus là loài chịu nhiệt, sinh trưởng và lên men ethanol trong
điều kiện nhiệt độ cao hơn nấm men Saccharomyces cerevisiae. Lane (2011) đã đánh
giá sự sinh trưởng của nấm men Kluyveromyces marxianus trong khoảng nhiệt độ từ
240C đến 480C. Thí nghiệm được tiến hành trên 13 chủng Kluyveromyces marxianus
khác nhau. Khi tăng nhiệt độ môi trường lên 420C, 13 chủng Kluyveromyces
marxianus đều sinh trưởng và phát triển tốt. Trong môi trường mật rỉ, Kluyveromyces
marxianus sinh trưởng và lên men tốt trong khoảng nhiệt độ từ 40 0C đến 500C [19],

lượng ethanol đạt 75 - 95% so với giá trị lý thuyết [20]. Nấm men này cũng sinh
trưởng tốt trong dịch whey khi nhiệt độ lên men tăng đến 450C [21].
Trang 6


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

Các nhà khoa học đã thử nghiệm sử dụng Kluyveromyces marxianus trong quá
trình lên men ethanol theo nhiều phương pháp khác nhau, từ lên men tĩnh với nồng
độ cơ chất cao [22, 23] đến lên men tĩnh có bổ sung cơ chất [24], lên men liên tục
[25], lên men hai giai đoạn [26]. Kết quả cho thấy Kluyveromyces marxianus đều có
khả năng lên men ethanol tốt trong khoảng nhiệt độ 40 - 450C.
Năm 2004, M. Ballesteros và cộng sự đã sử dụng nguyên liệu lignocellulose để
đường hóa và lên men đồng thời nhằm mục đích thu nhận bioethanol. Nấm men sử
dụng là Kluyveromyces marxianus CECT 10. 875. Quá trình lên men được thực hiện
ở 420C. Kết quả cho thấy hàm lượng ethannol tối đa là 16 - 19 g/L sau 72 giờ [27].
Đến nay, chúng tôi không tìm thấy được tài liệu về quá trình đường hóa và lên
men đồng thời từ nguồn nguyên liệu giàu tinh bột để sản xuất ethanol có sử dụng nấm
men Kluyveromyces marxianus.
2.1.3. Hệ enzyme amylase
Amylase là một trong những hệ enzyme quan trọng nhất vì được ứng dụng rộng
rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công nghiệp dệt
và công nghiệp giấy. Các chế phẩm amylase từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng
phổ biến trong công nghiệp sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu giàu tinh bột [5].
Amylase là các enzyme xúc tác thủy phân tinh bột và các polyose tương tự như
dextrin và glycogen. Các enzyme chủ yếu trong nhóm này là alpha - amylase (α - 1,4
- glucan - glucanhydrolase); β - amylase (α - 1,4 - glucan - malto - hydrolase) và
glucoamylase (α - 1,4 glucan - glucohydrolase). Trong quy trình sản xuất ethanol,

người ta thường sử dụng hai chế phẩm alpha - amylase và glucoamylase [28].
Các enzyme amylase từ các nguồn sinh vật khác nhau thì có các điều kiện hoạt
động khác nhau [28].
2.1.3.1. Enzyme alpha - amylase (α - 1,4 glucan - glucanhydrolase)
Chế phẩm alpha - amylase xúc tác sự thủy phân liên kết α - 1,4 - glucoside nội
mạch trong phân tử tinh bột. Với cơ chất là amylose, alpha - amylase cho sản phẩm
thủy phân chủ yếu là maltose (khoảng 87%) và mội ít glucose (13%). Với cơ chất là
amylopectin, alpha - amylase chỉ thủy phân liên kết α - 1,4 - glucoside, không thủy

Trang 7


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

phân liên kết α - 1,6 - glucoside. Sản phẩm tạo thành là các dextrin phân tử thấp,
maltose, glucose và izomaltose; chúng không cho phản ứng màu với iod [28].
Chế phẩm alpha - amylase khó tác dụng lên tinh bột nguyên thể và tác dụng
mạnh lên tinh bột đã hồ hóa. Quá trình thủy phân xảy ra qua nhiều giai đoạn. Ở giai
đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa), chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị phân
hủy, tạo thành một lượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột giảm mạnh. Khi chuyển
sang giai giai đoạn đường hóa, các dextrin vừa tạo thành bị thủy phân, tiếp tục tạo ra
các dextrin phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose [28].
Thông thường trong một khoảng thời gian ngắn (30 - 60 phút), alpha - amylase
chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose,
khả năng dextrin hóa cao của alpha - amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy,
người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa [28].
Chế phẩm alpha - amylase của nấm mốc hoạt động tốt ở nhiệt độ 58 - 600C;
alpha - amylase của nhiều vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, chúng có thể giữ được hoạt

tính ở 70 - 900C. Tính bền nhiệt của alpha - amylase là do sự có mặt của canxi trong
phân tử enzyme. Alpha - amylase thường thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu:
alpha - amylase của nấm mốc hoạt động mạnh ở pH 4,5 - 4,9; của vi khuẩn ở pH 5,5
- 6,1. Nếu pH < 3, đa số alpha - amylase bị vô hoạt hoàn toàn, ngoại trừ alpha amylase của Aspergillus niger có thể chịu được pH 2,5 - 2,8 [28].
Chế phẩm alpha - amylase chịu nhiệt được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis hoặc Bacillus stearothermophilus. Nhiệt độ tối ưu của chúng là 90 950C. Khi gia nhiệt đến 1050C, enzyme vẫn không bị vô hoạt hoàn toàn. Enzyme này
xúc tác thủy phân liên kết α - 1,4 - glucoside ở giữa mạch phân tử tinh bột để làm
giảm độ nhớt của khối cháo trong giai đoạn hồ hóa và dịch hóa tinh bột [5, 29-31].
2.1.3.2. Enzyme glucoamylase
Enzyme này xúc tác thủy phân các liên kết α - 1,4 và cả 1,6 glucoside của phân
tử tinh bột và các polysaccharide tương tự khác.

Trang 8


GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

Sự thủy phân cơ chất dưới tác dụng của glucoamylase được tiến hành tuần tự ở
từng liên kết một, bắt đầu từ đầu không khử của mạch, tách dần từng phân tử glucose
[31].
Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”, thể hiện hoạt lực tối
đa ở vùng pH 3,5 - 5. Nhiệt độ tối ưu là 45 - 650C. Hầu hết các glucoamylase bị mất
hoạt tính khi đun nóng trên 70 0C [28].
Nếu cho cả alpha - amylase và glucoamylase cùng tác dụng đồng thời lên tinh
bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95% [5, 29, 30].
2.2.

Cơ sở lý thuyết của quá trình đường hóa và lên men đồng thời để sản xuất

ethanol
2.2.1.

Cơ sở lý thuyết

Để sản xuất ethanol từ nguyên liệu tinh bột theo phương pháp đường hóa và lên
men đồng thời, tinh bột cần trải qua 2 giai đoạn chính: giai đoạn hồ hóa và dịch hóa,
giai đoạn đường hóa và lên men đồng thời [31, 32].
2.2.1.1. Quá trình hồ hóa và dịch hóa


Hồ hóa

Đầu tiên người ta trộn tinh bột với nước theo tỉ lệ thích hợp. Ở nhiệt độ phòng,
các hạt tinh bột không hòa tan được trong nước nên chúng ta gọi hỗn hợp là huyền
phù tinh bột. Nếu chúng ta gia nhiệt huyền phù tinh bột, các phân tử nước sẽ chuyển
động nhanh hơn và có nhiều phân tử nước khuếch tán vào bên trong cấu trúc của các
hạt tinh bột. Khi nấu tinh bột với nước đến nhiệt độ 400C, hạt tinh bột bắt đầu trương
nở. Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì hạt tiếp tục trương nở, tăng đáng kể về kích thước
và thể tích. Khi nhiệt độ tăng đến giới hạn nhất định, thể tích của hạt tinh bột tăng 50
- 100 lần so với ban đầu, độ nhớt của hỗn hợp tăng đến giá trị cực đại và hiện tượng
này được gọi là hồ hóa tinh bột. Còn khoảng nhiệt độ làm xảy ra hiện tượng hồ hóa
tinh bột được gọi là nhiệt độ hồ hóa. Khi tinh bột hồ hóa, độ nhớt tăng cao sẽ gây khó
khăn cho sự khuấy trộn khối hồ tinh bột [32, 33].
Sử dụng chế phẩm alpha - amylase để hỗ trợ cho giai đoạn đầu của quá trình
thủy phân tinh bột. Khi enzyme tác dụng lên cơ chất, sản phẩm thủy phân chủ yếu
của alpha - amylase dịch hóa là các dextrin, làm giảm phân tử lượng của các sợi
Trang 9

GVHD: GS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

SVTH: TRẦN THỊ MỘNG TRINH

amylose, amylopectin, tức là làm giảm độ nhớt của tinh bột trong giai đoạn hồ hóa.
Ngoài ra sử dụng enzyme còn làm giai đoạn dịch hóa được diễn ra nhanh và dễ dàng
hơn.
Tinh bột từ những nguồn khác nhau sẽ có nhiệt độ hồ hóa khác nhau. Hạt tinh
bột với cấu trúc chặt chẽ, có ít mao dẫn và độ xốp kém sẽ hồ hóa ở nhiệt độ cao [32,
33].
 Dịch hóa
Sau giai đoạn hồ hóa tinh bột, nếu chúng ta tiếp tục gia nhiệt hỗn hợp lên đến
1000C hoặc cao hơn thì số phân tử amylose và amylopectin từ hạt tinh bột bị khuếch
tán ra ngoài dung dịch sẽ càng tăng. Sự chuyển động hỗn loạn của các phân tử tinh
bột trong hỗn hợp dưới tác dụng của nhiệt độ sẽ làm cho liên kết giữa các phân tử
tinh bột với nhau trở nên lỏng lẻo. Khi đó, cấu trúc hạt tinh bột bị phá vỡ. Kết quả là
các sợi amylose và amylopectin được giải phóng để chuyển từ dạng liên kết trong cấu
trúc hạt tinh bột sang dạng tự do. Tinh bột trở nên hòa tan trong nước, độ nhớt dung
dịch giảm đi đáng kể. Hiện tượng này được gọi là dịch hóa tinh bột [32].
Nếu nhiệt độ dịch hóa càng cao thì sự phá vỡ cấu trúc hạt tinh bột sẽ càng triệt
để, các sợi amylose và amylosepectin sẽ thoát ra hoàn toàn từ cấu trúc hạt tinh bột và
tồn tại trong dung dịch ở dạng tự do. Khi đó giai đoạn đường hóa tiếp theo sẽ diễn ra
nhanh và hiệu suất thủy phân thu được sẽ rất cao. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ dịch hóa
quá cao sẽ làm tăng chi phí năng lượng và thiết bị, đồng thời dịch thủy phân sẽ có
màu sậm so các phản ứng phân hủy của đường. Nhiệt độ dịch hóa không được vượt
quá 150 - 1600C [32].
Sử dụng chế phẩm alpha - amylase từ Bacillus licheniformis xúc tác phản ứng
thủy phân tinh bột ở nhiệt độ 95 - 1000C. Ở nhiệt độ 105 - 1080C hoạt tính của enzyme
bị giảm nhưng không bị vô hoạt hoàn toàn [31].

Các phương pháp hồ hóa và dịch hóa đang được áp dụng là phương pháp gián
đoạn hoặc phương pháp liên tục [32, 34].
2.2.1.2. Quá trình đường hóa và lên men đờng thời
Đường hóa và lên men đồng thời (SSF) lần đầu tiên được mô tả bởi Takagi và
cộng sự (1977) [35], kết hợp quá trình thủy phân cellulose với quá trình lên men để
Trang 10