Thu nhận và khảo sát một số tính chất của protease từ trùn quế (perionyx excavatus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
----------

TRƯƠNG THỊ THÙY LIÊN

THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA
PROTEASE TỪ TRÙN QUẾ(PERIONYX EXCAVATUS)

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2015


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
–ĐHQG -HCM
Cơng trình được hồn thành tại:
- Phịng BioLab 108B2, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa,
Thành phố Hồ Chí Minh
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. HUỲNH NGỌC OANH

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Lê Phi Nga

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Trần Bích Lam

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM, ngày
08 tháng 08 năm 2015
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1. Chủ tịch: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương
2. Phản biện 1: PGS.TS Lê Phi Nga
3. Phản biện 2: TS. Trần Bích Lam
4. Ủy viên: TS. Nguyễn Tấn Trung
5. Thư ký: TS. Hoàng Anh Hoàng
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Trương Thị Thùy Liên

MSHV: 13310304

Ngày, tháng, năm sinh: 11/09/1986

Nơi sinh: TP. Hồ chí Minh

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

Mã số: 60420201

I. TÊN ĐỀ TÀI:
“Thu nhận và khảo sát một số tính chất của protease từ trùn quế
(Perionyx Excavatus)”
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
-

Tối ưu hóa điều kiện hoạt động và thu nhận protease trùn quế

-

Khảo sát một số tính chất protease thu nhận từ trùn quế

II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài): 07/07/2014
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài):
08/05/2015
IV. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):
Tp. HCM, ngày 01 tháng 08 năm 2015
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS. HUỲNH NGỌC OANH

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến Ba Mẹ, người đã
nuôi dưỡng, chăm sóc và dạy dỗ con nên người. Cảm ơn Ba Mẹ và những người thân
yêu đã luôn đ ộng viên, tạo mọi điều kiện cho con học tập và ln bên cạnh con trong
suốt thời gian qua.
Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Huỳnh Ngọc Oanh đã
hết lịng hư ớng dẫn, tận tình giúp đỡ em về chuyên môn cũng như tinh th ần, người
luôn tạo cho em những cảm hứng, cũng như ý tưởng để làm việc và thực hiện đề tài
một cách hiệu quả nhất.
Hơn thế nữa, sự thành công của đề tài không thể thiếu sự giúp sức của các Thầy
Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách
Khoa Tp.Hồ Chí Minh đã t ạo điều kiện về trang thiết bị và giờ làm việc phù hợp nhất
cho chúng em. Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn chân thành đến cô PGS. TS. Nguyễn
Thuý Hương. Qua những kiến thức cô truyền đạt, những lời góp ý chân tình cùng tâm
huyết của một người thầy đã giúp em nói riêng, t ập thể lớp Cao học khố 2013 nói
chung trưởng thành hơn và có được thành cơng như ngày hơm nay.
Trân trọng.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015

i


TĨM TẮT
Chúng tơi khảo sát protease trùn quế trong q trình tự p hân ở điều kiện đơn giản
phù hợp qui mơ hộ gia đình ni trùn (khơng điều chỉnh nhiệt độ và pH). Kết quả ghi
nhận như sau:
-

Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động protease trong q trình tự
phân, hoạt tính riêng protease cao nhất sau 10 ngày, nồng độ pha loãng là 13%,
là 0.21 U/mg. Qua phần mềm tối ưu hóa Design Expert xác định giá trị cực đại

:nồng độ pha loãng là 13%, thời gian là 11 ngày

-

Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến việc thu nhận protease, hoạt tính riêng
protease cao nhất ở tỷ lệ dịch trùn-aceton và thời gian tủa là 1:2, 120 phút, 16.7
U/mg. Qua phần mềm tối ưu hóa Design Expert, xác định giá trị cực đại :tỷ lệ
dịch trùn-dung môi là 1:2 (v/v), thời gian là 90 phút
Protease trùn quế hoạt động tối ưu ở nhiệt độ là 45oC, pH 6.
Tinh sạch sơ bộ bằ ng sắc ký lọc gel tách được hai loại protease có hoạt tính

riêng lần lượt là 16.9,19.9 U/mg.
Bước đầu thu nhận protease dưới dạng CLEA ở điều kiện glutaraldehyde 25%
,thời gian cố định 3 giờ.

ii


ABSTRACT
We examined protease earthworm in autolysis in simple terms appropriate scale
worm farming households (not the temperature and pH). The results noted as follows:
- Single factor affecting protease activity during self- autolysis, the highest
protease activity after 10 days, the dilution ratio is 13%, 0.21 U / mg. Through
optimization software Design Expert, determines the maximum value: dilution is 13%,
11 day
- Single factor affecting the inclusion of protease, protease activity own
translation rate was highest in the earthworm-acetone and deposition time was 1: 2,
120 minutes, 16.7 U / mg. Through optimization software Design Expert, determine
the maximum value: service ratio worm-solvent is 1: 2 (v / v), the time is 90 minutes
Protease earthworm activity at the optimum temperature is 45 ° C, pH 6.

Purified by gel filtration chromatography to separate the two types of protease
activity separately respectively 16.9,19.9 U / mg.
Initial inclusion of protease as CLEA in conditions of 25% glutaraldehyde, fixed
time 3 hours.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Trương Thị Thùy Liên, học viên cao học chun ngành Cơng Nghệ Sinh
Học, khóa 2013, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí
Minh. Tơi xin cam đoan:
Cơng trình nghiên cứu này do chính tơi thực hiện, dưới sự hướng dẫn khoa học
của TS. Huỳnh Ngọc Oanh.
Các số liệu trong luận văn là hồn tồn trung thực và chưa được cơng bố ở các
nghiên cứu khác hay trên bất kỳ phương tiện truyền thơng nào.
Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm về kết quả nghiên cứu trong luận án tốt
nghiệp của mình.
Học viên

Trương Thị Thùy Liên

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
TÓM TẮT................................................................................................................. ii
ABSTRACT ............................................................................................................ iii
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iv

MỤC LỤC ................................................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. viii
DANH MỤC ĐỒ THỊ .............................................................................................. x
LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Phần 1. Tổng quan
1.1.

Trùn quế......................................................................................................... 2
1.1.1. Đặc tính sinh học ................................................................................ 3
1.1.2. Đặc tính sinh lý................................................................................... 3
1.1.3. Sự sinh sản và phát triển..................................................................... 3
1.1.4. Các nghiên cứu và ứng dụng trùn quế ............................................... 4

1.2. Tổng quan về protease .................................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu chung ................................................................................. 5
1.2.2. Phân loại protease ............................................................................... 6
1.3.

Phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme ................................................. 8

1.4.

Enzyme cố định ........................................................................................... 12

Phần 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.

Nguyên liệu ................................................................................................ 15

2.2.

Hóa chất ..................................................................................................... 15

2.3.

Thiết bị ....................................................................................................... 15

v


2.4.

Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 15

2.5.

Phương pháp phân tích............................................................................... 22

Phần 3. Kết quả và bàn luận
3.1.

Khảo sát thông số ban đầu của dung dịch trùn quế................................... 28

3.2.

Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động protease trong quá trình tự phân
.................................................................................................................... 28

3.3.

Khảo sát đơn yếu tố ảnh hưởng đến việc thu nhận protease ...................... 30

3.4.

Tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm (phần mềm Design

Expert 8.0.5.2) của giai đoạn tự phân ............................................................... 31
3.5.

Tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm (phần mềm Design

Expert 8.0.5.2) của giai đoạn thu nhận protease ............................................... 37
3.6.

Khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH đến protease trùn ................................... 41
3.6.1. Khảo sát nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đến hoạt tính protease ... 41
3.6.2. Khảo sát nhiệt độ phản ứng đến độ bền protease ......................... 42
3.6.3. Khảo sát pH ảnh hưởng đến hoạt tính protease ........................... 43
3.6.4. Khảo sát pH ảnh hưởng đến độ bền hoạt tính protease................ 44

3.7.

Tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel ...................................................... 45

3.8.

Cố định protease bằng phương pháp CLEA .............................................. 46

Phần 4. Kết luận và kiến nghị

4.1.

Kết luận ...................................................................................................... 48

4.2.

Kiến nghị .................................................................................................... 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 49
Phụ lục ................................................................................................................... 51

vi


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Đặc điểm gel sử dụng ................................................................................ 22
Bảng 2.2: Phương pháp tạo đường chuẩn hoạt tính protease ..................................... 25
Bảng 2.3: Phương pháp tiến hành hoạt tính protease ................................................. 26
Bảng 3:1: Thông số ban đầu của trùn quế với tỷ lệ pha loãng khác nhau .................. 28
Bảng 3.2: Kết quả của lọc gel của dịch trùn sau tự phân ........................................... 45
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian đến cố định protease theo kỹ thuật CLEA ........ 46
Bảng 3.4: Số lần tái sử dụng của enzyme protease theo kỹ thuật CLEA ................... 47

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình thái trùn quế ............................................................................................. 2
Hình 1.2: Các bước xúc tác cơ bản của serin protease ..................................................... 7

Hình 1.3: Phản ứng tạo liên kết giữa glutaraldehyde và enzyme .................................. 13
Hình 1.4: Quá trình hình thành khối enzyme CLEA ..................................................... 13
Hình 2.1: Các giá trị tâm điều kiện tự phân protease ..................................................... 17
Hình 2.2: Giá trị sai số ngẫu nhiên điều kiện tự phân protease ...................................... 17
Hình 2.3: Lựa chọn giá trị đầu ra điều kiện tự phân protease ........................................ 18
Hình 2.4: Ma trận quy hoạch thực nghiệm điều kiện tự phân protease.......................... 18
Hình 2.5: Các giá trị tâm điều kiện thu nhận protease ................................................... 19
Hình 2.6: Giá trị sai số ngẫu nhiên điều kiện thu nhận protease .................................... 19
Hình 2.7: Lựa chọn giá trị đầu ra điều kiện thu nhận protease ...................................... 20
Hình 2.8: Ma trận quy hoạch thực nghiệm điều kiện thu nhận protease ........................ 20
Hình 3.1: Kết quả thực nghiệm điều kiện tự phân protease theo ma trận quy hoạch .... 32
Hình 3.2: Hộp thoại Design Summary điều kiện tự phân của protease ........................ 33
Hình 3.3: Hộp thoại Anova điều kiện tự phân protease ................................................. 33
Hình 3.4: Giá trị hệ số tương quan R-Squared điều kiện tự phân protease .................... 34
Hình 3.5: Đồ thị đường cong biểu thị mối tương quan giữa thời gian-nồng độ pha lỗng.
.......................................................................................................................................... 35
Hình 3.6: Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ thời gian-nồng độ pha lỗng . 35
Hình 3.7: Phương pháp tối ưu theo thực nghiệm điều kiện tự phân protease........ ........ 35
Hình 3.8: Kết quả thực nghiệm điều kiện thu nhận protease theo ma trận quy hoạch. 36
viii


Hình 3.9: Hộp thoại Design Summary điều kiện thu nhận protease .......................... 38
Hình 3.10: Hộp thoại Anova điều kiện thu nhận protease ......................................... 38
Hình 3.11: Giá trị hệ số tương quan R-Squared điều kiện thu nhận protease ............ 39
Hình 3.12: Đồ thị đường cong biểu thị mối tương quan giữa thời gian-tỷ lệ dịch trùn và
aceton .......................................................................................................................... 39
Hình 3.13: Đồ thị đáp ứng bề mặt biểu diễn mối quan hệ thời gian-tỷ lệ dịch trùn và
aceton .......................................................................................................................... 40
Hình 3.14: Phương pháp tối ưu theo thực nghiệm điều kiện thu nhận protease ....... 40

ix


DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng nồng độ pha lỗng lên hoạt tính protease................................. 29
Đồ thị 3.2: Ảnh hưởng nồng độ pha lỗng lên hoạt tính riêng protease. ...................... 29
Đồ thị 3.3: Hoạt tính protease thu được khi tủa ở các tỷ lệ dịch trùn-aceton khác
nhau....... ........................................................................................................................ 30
Đồ thị 3.4: Hoạt tính riêng protease thu được khi tủa ở các tỷ lệ dịch trùn-aceton khác
nhau........ ....................................................................................................................... 31
Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính protease ................................................ 42
Đồ thị 3.6: Khảo sát độ biền nhiệt của protease ............................................................ 42
Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease .................................................. 43
Đồ thị 3.8: Khảo sát độ bền pH của protease ................................................................ 44
Đồ thị 3.9: Biểu đồ lọc gel ............................................................................................ 45

x


Lời mở đầu
Trùn quế là loài sinh sản nhanh, dễ dàng thu hoạch. Trùn làm tăng độ phì nhiêu
của đất. Phân trùn góp phần làm giảm mức sử dụng phân hoá học, giúp cây trồng
phát triển tốt, tăng khả năng chống sâu bệnh, giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu,
nhờ đó bảo vệ được mơi trường.
Hiện nay, trùn quế (Perionyx excavatus) đã được nuôi phổ biến ở các tỉnh đồng
bằng sông Cửu Long và các vùng lân cận Thành phố Hồ Chí Minh, nhất là có hàm
lượng đạm rất cao nên được xem là nguồn bổ sung đạm quý giá cho cây trồng, vật
nuôi. Một số nước ở Châu Á như nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc đã chiết xuất
enzyme protease ừt trùn c ó khả năng thủy phân mạnh. Enzyme này thuộc nhóm

serin protease có khả năng chịu nhiệt và bền ở pH kiềm.
Chúng tôi đã thực hiện đ ề tài “Thu nhận và khảo sát một số tính chất của
protease từ trùn quế (Perionyx Excavatus) nhằm mục đích đánh giá hoạt động
hệ protease có sẵn trong đường ruột trùn quế trong quá trình tự phân ở điều kiện
đơn giản mức độ qui mơ hộ gia đình ni trùn (khơng điều chỉnh nhiệt độ và pH)
để có thể tạo ra sản phẩm thô để bán và dự trữ (tăng thu nhập, không phụ thuộc mùa
vụ và thương lái), làm tiền đề cho việc sản xuất các sản phẩm giàu đạm.
Nội dung nghiên cứu gồm:
-

Khảo sát điều kiện hoạt động của protease trong quá trình tự phân

-

Khảo sát điều kiện thu nhận protease

-

Khảo sát một số tính chất của protease

1


Phần 1:

TỔNG QUAN


1.1.

Trùn quế

Trùn quế có hàm lượng đạm cao, sống và ẩn náu dưới các thảm thực vật dày,
dưới viên gạch, hòn đá, các mi ếng gỗ hoặc ngay dưới lớp phân, rãnh nư ớc cạnh
chuồng gia súc, gia cầm.
Phân loại:
• Ngành: Annelides
• Phân ngành: Clitellata
• Lớp: Olygochaeta
• Họ: Megascocidae
• Chi: Pheretima
• Lồi: Perionyx excavatus
Trùn quế là một trong những giống trùn đã đư ợc thuần hóa, nhập nội và đưa
vào nuôi công nghiệp với các quy mô vừa và nhỏ, dễ sinh sản, dễ bắt bằng tay, vì
vậy rất dễ thu hoạch.

Hình 1.1: Hình thái trùn quế

2


1.1.1. Đặc tính sinh học
Trùn quế có kích thước tương đối nhỏ, thân hơi dẹt, bề ngang của con trưởng
thành có thể đạt 0,1 – 0,2 cm, có màu từ đỏ đến màu mận chín (tùy theo tuổi), màu
nhạt dần về phía bụng, hai đầu hơi nhọn. Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau
bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một vành tơ.
-

Cơ thể trùn có hình thon dài nối với nhau bởi nhiều đốt, trên mỗi đốt có một
vành tơ. Trùn quế hơ hấp qua da, chúng có khả năng hấp thu oxy và thải CO 2

trong mơi trường nước.

-

Kích thước trùn quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, nước chiếm khoảng 80 –
85%, chất khơ khoảng 15 – 20%. Hàm lượng các chất (tính trên trọng lượng
chất khô) như sau: Protein: 68 –70%, lipid: 7 – 8%, chất đường: 12 –14 %,
tro 11 – 12%

- Hấp thu O 2 và thải CO 2 trong môi trường nước. Hệ thống bài tiết bao gồm
một cặp thận ở mỗi đốt, bài tiết các chất thải chứa đạm dưới dạng amoniac
và ure.
1.1.2. Đặc tính sinh lý
-

Trùn quế rất nhạy cảm, chúng phản ứng mạnh với ánh sáng, nhiệt độ và biên
độ nhiệt cao, độ mặn và điều kiện khơ hạn. Nhiệt độ thích hợp nhất với trùn
quế nằm trong khoảng từ 20 – 30oC, chúng sinh trưởng và sinh sản rất nhanh.

-

Trùn quế quế rất thích sống trong mơi trường ẩm ướt và có độ pH ổn định,
thích hợp nhất vào khoảng 7.0 – 7.5.

-

Trùn quế thích nghi với phổ thức ăn khá rộng, chúng ăn bất kỳ chất thải hữu
cơ nào có thể phân hủy trong tự nhiên (rác đang phân hủy, phân gia súc, gia
cầm…).
1.1.3. Sự sinh sản và phát triển

-

Trùn quế sinh sản rất nhanh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới tương đối ổn
định và có độ ẩm cao như điều kiện của khu vực phía Nam. Từ một cặp ban
đầu trong điều kiện sống thích hợp có thể tạo ra từ 1.000 –1.500 cá thể trong
một năm.

3


-

Trùn quế là sinh vật lưỡng tính, chúng có đai và các lỗ sinh dục nằm ở phía
đầu của cơ thể, có thể giao phối chéo với nhau để hình thành kén ở mỗi con,
kén được hình thành ở đai sinh dục, trong mỗi kén mang từ 1 – 20 trứng, mỗi
kén có thể nở từ 2 – 10 con.

-

Khi mới nở trùn con như đầu kim có màu trắng, dài khoảng 2 – 3mm, sau 5 –
7 ngày cơ thể chúng sẽ chuyển dần sang màu đỏ và bắt đầu xuất hiện một
vằn đỏ thẫm trên lưng. Khoảng từ 15 –30 ngày sau, chúng trưởng thành và
bắt đầu xuất hiện đai sinh dục và chúng bắt đầu có khả năng bắt cặp và sinh
sản
1.1.4. Các nghiên cứu và ứng dụng trùn quế
Các nước Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã nghiên cứu và

chiết tách thành công từ trùn đất (Lumbricus Rubellus) về lumbrokinase.
Một hướng nghiên cứu khác về sự ổn định và ứng dụng các serine protease

của loài trùn Lumbricus Rubellus. Kết quả cho thấy enzyme này ổn định trong dung
dịch đệm Tris-HCl 100mM trong thời gian 5 năm ở nhiệt độ phịng và có khả năng
chịu được các dung môi hữu cơ tốt, kể cả toluene và n-hexane và dịch thủy phân
chính protein của lồi trùn đất này và tạo ra dung dịch đạm có thành phần tương tự
như nước tương và được ứng dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Tương tự những nghiên cứu trên, trùn quế ở Việt Nam theo nghiên cứu của
PGS-TS Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự ở Viện Khoa học Và Cơng nghệ Việt
Nam nói rằng lồi Peryonix Excavatus chứa hàm lượng enzyme thủy phân cao hơn
loài giun khác. Vì thế các tỉnh phía Nam và đồng bằng sông Cửu Long tiến hành
nuôi trên quy mô lớn để cung cấp sinh khối trùn cho chăn nuôi và dịch trùn để bón
cây. Ngồi ra các tỉnh miền Tây sử dụng nguồn thức ăn trực tiếp từ trùn tươi cho
tôm ở giai đoạn ấu trùng, tăng sản lượng chăn ni.
Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm thị
Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành Phố
Hồ Chí Minh tiến hành “ Tinh sạch và khảo sát các đặc tính của serin protease từ

4


Trùn Quế (2007).” Bước đầu tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium
sulfat nồng độ 30-80%.
Trong nghiên cứu tại đại học Huế (2012) về tạo dòng và phân tích trình tự
serin protease của trùn quế Đoạn cDNA có kích thước 726 bp được tạo dịng với
vector pCR®2.1. Trình tự nucleotide của cDNA được so sánh với trình tự của gen
lumbrokinase của các loài giun đất Eisenia fetida, Lumbricus bimastus và
Lumbricus rubellus có độ tương đồng lần lượt là 52,02%; 50,06% và
48,03%.[1,10,11,16]
Hiện nay người nuôi trùn và người sản xuất bị động trong việc tạo các sản
phẩm từ trùn do nhiệt độ môi trường, lượng trùn khô ban đầu, pH. Vì thế để người
sản xuất tăng nguồn thu nhập cũng như chủ động việc dự trữ dịch trùn, đề tài đánh

giá hệ protease trong quá trình tự phân, tối ưu hóa bằng phần mền để dự đốn hoạt
động enzyme qua phương trình t ối ưu, đồng thời thực hiện phương pháp cố định
CLEA để hạn chế mức độ tư phân hủy của protease.
1.2.

Tổng quan về protease

1.2.1. Giới thiệu chung
Enzyme protease xúc tác q trình thủy phân có khả năng cắt mối liên kết
peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein thành các amino acid tự
do hoặc các peptide phân tử thấp.
Protease là nhóm enzyme ứng dụng rộng rãi trong các ĩnh
l v ực khác nhau
như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da,
công nghiệp sản xuất xà phịng. Nguồn thu nhận protease vơ cùng phong phú như
thực vật, động vật và vi sinh vật.[4]

5


1.2.2. Phân loại protease
1.2.2.1.

Protease được phân thành hai loại: endopeptidase và

exopeptidase
Vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase chia thành hai loại:
-

Aminopeptidase: thủy phân liên kết peptide đầu N tự do của chuỗi

polypeptide giải phóng ra amino acid/ dipeptide hoặc tripeptide.

- Cacboxypeptidase: thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide
giải phóng ra amino acid/ dipeptide
Động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase chia thành bốn loại:
(a) Serin protease: chứa nhóm –OH của gốc serin trung tâm hoạt động. Là nhóm
peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật.
Những enzyme này đều có chung một cơ chế phản ứng thủy phân thơng qua hai
bước chính (Barrett, 1994):
-

Acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với
nguyên tử cacbon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ
trợ của nhóm imidazole từ histidine.

-

Khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H 2 O theo
chiều ngược lại của bước một.

+ Các loại serin protease thơng dụng hiện nay
-

Trypsin: vị trí cắt ở Arg, Lys có ở hệ thống tiêu hóa của động vật và một
số lồi khác

-

Chymotrypsin: vị trí cắt ở Tyr, Trp, Phe có ở hệ thống tiêu hóa của động
vật và một số lồi khác

-

Plasmin: vị trí cắt ở Arg, Lys có ở máu

-

Thrombin: vị trí cắt ở Arg có ở máu

-

Lys-C: vị trí cắt Lys có ở Lysobacter enzymogene

-

Subtilisin: Tyr, Phe, Leu các chủng Bacilli khác nhau

-

Cacboxypeptidase: vị trí cắt ở đầu C các amin có ở hệ tiêu hóa động vật.
6


Hình 1.2: Các bước xúc tác cơ bản của serin protease
(b) Cysteine protease: chứa nhóm –SH trung tâm hoạt động. Nhóm này bao gồm
các protease từ thực vật; một vài enzyme từ động vật và ký sinh trùng. Các
enzyme này thường hoạt động ở pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
(c) Metallo protease: được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc, thường hoạt động ở
pH trung tính và hoạt động giảm mạnh khi có sự hiện diện của EDTA, có ion
kim loại ở tâm hoạt động.

(d) Aspartic protease: thuộc nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như
pepsin, chymotrypsin, renin; chứa nhóm COO- ở tâm hoạt động.
1.2.2.2.

Protease được phân loại theo cách đơn giản thành ba nhóm

- Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, ít ở vi khuẩn.
-

Protease trung tính: pH 7-8 có ở tế bào động vật và thực vật, vi khuản.

- Protease kiềm: pH 9-11
1.2.2.3.
-

Protease phân thành hai loại: protease nội bào, ngoại bào

Protease nội bào là những enzyme nằm trong tế bào, muốn thu nhận phải phá
vỡ tế bào.

-

Protease ngoại bào được tổng hợp bên trong tế bào và được tiết ra ngoài, dễ
dàng thu nhận.[6,7]
7


Phương pháp thu nhận và tinh sạch enzyme

1.3.

1.3.1. Nguồn nguyên liệu
Nguyên liệu từ mô động thực vật, vi sinh vật hoặc các protein tái tổ hợp cũng
là đối tượng của chiết tách và tinh sạch. Một số nguyên liệu tương đối sạch như
huyết thanh, nọc rắn và các sản phẩm ngoại bào từ vi sinh vật có thể đưa vào lọc gel
sau khi ly tâm, lọc hoặc có thể cơ đặc trước khi cho qua sắc ký cột.
Emzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại
trong tế bào. Các enzyme này thường khơng có khả năng di chuyển qua màng tế
bào. Để thu nhận enzyme nội bào, phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp.
Enzyme ngoại bào được tiết ra ngoài tế bào, chúng ta dễ dàng thu nhận trong nuôi
cấy tế bào.
1.3.2. Các phương pháp nghiền và phá vỡ tế bào
a) Phương pháp cơ học: Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy
tinh, cát thạch anh, thiết bị đồng hóa…
b) Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt.
c) Phương pháp hóa học như dùng các loại dung môi, acetone, glycerol, ethyl
acetate.
Đối với mô thực vật thì ta thư ờng thái nhỏ mẫu hoặc cho trương nước để
tăng hiệu quả phá vỡ tế bào. Mô động vật khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ mô
liên kết. Sau khi đã phá v ỡ cấu trúc tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, dung
dịch đệm hoặc muối trung tính.
1.3.3. Phương pháp thu và tinh sạch enzyme [4,6,7]
1.3.1.

Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn
lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và
bền nhiệt. Nhiệt độ của dung dịch enzyme được tăng lên 50-70oC và pH ≤ 5. Trong
điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và khơng chịu pH thấp sẽ bị biến tính.

8


Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ những enzyme
mà ta không mong muốn.
1.3.2.

Phương pháp tủa

Dịch thu nhận được ở dạng chế phẩm enzyme thơ, vì trongđó cịn ch

ứa

nước, các chất hịa tan khác từ môi trường nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô thường
chứa một lượng enzyme khơng nhiều, hoạt tính enzyme khơng cao. Vì thế chúng ta
cần tinh sạch enzyme trước khi cho vào cột sắc ký nhằm loại bỏ tạp chất, cô đặc
protein. Tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và bước ban đầu trong tinh
sạch enzyme.
Dựa vào khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau,
thường sử dụng muối (NH 4 ) 2 SO 4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này,
người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol có nhiều thuận lợi do tương đối rẻ, ít
chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do nhiệt độ bay hơi của dung
môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phương pháp sấy
nhẹ. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý
đến nhiệt độ, ta bắt buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 –
10oC. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định
bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung

dịch enzyme.
Bước tiếp theo của quá trình tinh sạch sơ bộ là ly tâm, khi ly tâm cần chú ý
đến nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, thơng thường q trình ly tâm được
thực hiện ở nhiệt độ 4oC.
Theo nghiên cứu của Viện sinh học Hàn Quốc sử dụng phương pháp tủa
bằng ammonium sulfate để tinh sạch protease từ trùn Lumbricus rubellus(2003).
Theo một phương pháp khác được sử dụng trong việc tinh sạch serin protease là tủa
bằng aceton của Phan Thị Bích Trâm (2007). [8,13]
9


1.3.3.

Phương pháp sắc ký lọc gel

Sắc ký là phương pháp phân tách quan trọng nhất trong nghiên cứu sinh học
vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng
định lượng và định tính. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha đ ộng và mẫu cần phân
tách. Tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như
nguyên liệu cho pha tĩnh và pha động.
(a) Nguyên tắc: là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử
lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra, bằng cách cho
chúng đi qua cột gel.
(b) Một số thông số vật lý của phương pháp
+ Giới hạn tách: Là khối lượng phân tử (MW) nhỏ nhất không chui vào
bên trong hạt gel.
+ Phạm vi tách: Thí dụ Sephadex G-30 có giới hạn tách từ 3.000-60.000
Da, có nghĩa là các phân t ử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được
phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-30.
+ Độ ngậm nước: Là trọng lượng nước mà 1g bột gel khơ hút nước.

+ Thể tích nền: Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khơ hấp thụ khi
trương nở trong nước. G-30 có thể tích nền 11 ml/g gel khơ.
+ Hạt gel: hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định bằng
mesh hoặc đường kính hạt theo µm.
+ Thể tích trống: Là tổng thể tích khơng gian bao quanh hạt gel trong
cột.
+ Thể tích thổi: Là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách ra khỏi
cột.
(c) Đặc tính hóa học của các loại gel:
+ Dextran: Có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia
(Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Sephadex. Giới hạn tách
của gel dextran 600.000 Da.

10


+ Gel

polyacrylamide: Tạo bởi q trìnhđ

ồng polymer hố của

acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp –
Biogel –P là tên thương mại)
+ Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo
từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết
hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio-Rad cung cấp
agarose với tên thương mại là Bio-gel A.
+ Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel,
nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose

cho phép sử dụng áp suất để tách.
(d) Ưu điểm:
+ Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử
sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH.
+ Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng
pI và dễ dàng khử muối.
(e) Nhược điểm:
+ Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài)
+ Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.
+ Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó
đạt được sản phẩm tinh khiết hồn toàn.
Theo nghiên cứu của Viện sinh học Hàn Quốc sử dụng phương pháp sắc ký
tương tác kỵ nước, sắc ký lọc gel trên cột Sephacryl S-200 và sắc ký ái lực để tinh
sạch protease từ trùn Lumbricus rubellus(2003). Theo một phương pháp khác được
sử dụng trong việc tinh sạch serin protease là sắc ký trao đổi ion trên cột Unosphere
Q, sắc ký tương tác k ỵ nước trên cột Phenyl sepharose và sắc ký lọc gel trên cột
Sepharose 12 của Phan Thị Bích Trâm (2007). [8,13]
Protease của trùn quế tự phân sau q trình bảo quản, vì thế chúng tơi sử
dụng phương pháp cố định bằng phương pháp CLEA vùa thu nhận vừa tạo dạng
khơng hịa tan.

11