Nghiên cứu khả năng kháng nấm aspergillus niger của nano chitosan ứng dụng trong bảo quản thanh long

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HUỲNH CÔNG TÀI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM
ASPERGILLUS NIGER CỦA NANO CHITOSAN ỨNG
DỤNG TRONG BẢO QUẢN THANH LONG

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số: 60 54 01 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2015


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – HCM
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học : TS. Trần Bích Lam

Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS. Nguyễn Hoài Hƣơng

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 05 tháng 01 năm 2016
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. GS. TS. Đống Thị Anh Đào

- Chủ tịch hội đồng

2. PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng

- Phản biện 1

3. TS. Nguyễn Hồi Hƣơng

- Phản biện 2

4. TS. Tơn Nữ Minh Nguyệt

- Ủy viên

5. TS. Trần Thị Ngọc Yên

- Ủy viên thƣ ký

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Huỳnh Công Tài

MSHV: 13111027

Ngày, tháng, năm sinh: 16/09/1989

Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 60 54 01 01

I. TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu khả năng kháng nấm Aspergillus niger của nano
chitosan ứng dụng trong bảo quản thanh long”
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
-

Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ion với sodium
tripolyphosphate

-

Xác định ngƣỡng gây bệnh của nấm Aspergillus niger trên quả thanh long
Bình Thuận

-

Khảo sát khả năng ức chế của nano chitosan lên sự sinh trƣởng và phát triển

của A.niger trong điều kiện in vitro

-

Đánh giá ảnh hƣởng của nano chitosan đến sự sinh trƣởng và phát triển của
A.niger ở điều kiện in vivo trên quả thanh long Bình Thuận

-

Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nano chitosan thông qua sự
thay đổi các chỉ tiêu hóa lý của quả trong quá trình bảo quản

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/07/2015
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 04/12/2015
V.

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS. Trần Bích Lam

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

Tp. HCM, ngày……tháng…….năm 2015
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
(Họ tên và chữ ký)

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)


i

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đƣợc luận văn này tơi đã nhận đƣợc rất nhiều sự động viên,
giúp đỡ của nhiều cá nhân và tập thể.
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Bích Lam, ngƣời
đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tơi trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin cùng bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới các thầy cơ thuộc bộ mơn Cơng
nghệ thực phẩm, Khoa Kỹ thuật Hóa học trƣờng Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí
Minh, đã trang bị cho tôi những kiến thức bổ trợ vô cùng có ích để thực hiện luận
văn của mình.
Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu và ban chủ nhiệm khoa cơng nghệ thực
phẩm trƣờng Cao Đẳng Nghề TP. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi
nhất về trang thiết bị trong thời gian tôi thực hiện luận văn.
Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời đã ln bên
tơi, động viên và khuyến khích tơi trong q trình thực hiện luận văn của mình.
Tháng 12 năm 2015
Học viên

Huỳnh Cơng Tài


ii

ABSTRACT
In recent decades, thanks to its safety to the consumer, the using of biology
based coating in general and of chitosan nanoparticles based coating in specific
have been getting concern from many researchers around the world. In this study,
the inhibitory effect of chitosan nanoparticles on Aspergillus niger was investigated
both in the in vitro and in vivo experiments. Then, the quality of dragon fruits
coated with chitosan nanoparticles was evaluated after storaged at 150C for 35 days.

The result gained from in vitro experiment indicated that chitosan nanoparticles at
the same concentration 0,04%, with particle size 42 nm had the best inhibitory
effect on A.niger at 79,26%, while the other two size 157 nm and 241 nm had lower
inhibitory effect at 56,30% and 58,89% respectively. In the in vivo experiment, with
the same droplet size 42 nm, chitosan nanoparticles at 0,14% concentration showed
the best inhibitory effect among the investigated concentration points: 0% ; 0,06% ;
0,08% ; 0,1% ; 0,12% ; and 0,14%. After storaged at 150C and 85% relative
humidity for 35 days, the dragon fruits coated with chitosan nanoparticles at 0,14%
concentration and 42 nm droplet size got the weight loss ratio, pH, total soluble
solid content and vitamin C loss ratio, decreased by 45,6% ; 4,3% ; 4,8% and 34,1%,
respectively over the control. The changing in total sugar and reducing sugar took
place with a slower speed compared with the control. The dragon fruits treated with
chitosan nanoparticles also has better appearance. The results of this study show
that chitosan nanoparticles is probably used in preservation to maintain the quality
of dragon fruit for 35 days at 150C.


iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Trong nhiều thập niên trở lại đây, phƣơng pháp bảo quản rau quả sử dụng
màng bao sinh học nói chung và màng bao chitosan nói riêng đƣợc rất nhiều sự
quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới, nhờ vào mức độ an tồn của nó
đối với ngƣời tiêu dùng. Trong nghiên cứu này, tôi thực hiện khảo sát đánh giá khả
năng kháng nấm Aspergillus niger của nano chitosan trong cả hai điều kiện in vitro
và in vivo, đồng thời đánh giá kết quả bảo quản thanh long có xử lý nano chitosan
trong 35 ngày ở 150C. Kết quả thu đƣợc trong thí nghiệm in vitro là ở cùng nồng độ
0,04% nano chitosan có kích thƣớc hạt 42 nm cho hiệu lực ức chế A.niger là 79,26%
tốt hơn ở hai kích thƣớc 157 nm và 241 nm có hiệu lực ức chế lần lƣợt là 56,30% và
58,89%. Trong thí nghiệm in vivo, ở cùng kích thƣớc hạt 42 nm, nano chitosan có

nồng độ 0,14% cho hiệu quả ức chế A.niger tốt hơn các nồng độ còn lại là : 0,12% ;
0,10% ; 0,08% ; 0,06%. Sau 35 ngày bảo quản ở 150C kết hợp nhúng nano chitosan
có nồng độ 0,14% và kích thƣớc hạt 42 nm thì thanh long có tỉ lệ hao hụt khối
lƣợng, pH, hàm lƣợng chất khơ hịa tan và tỉ lệ hao hụt vitamin C giảm lần lƣợt là
45,6%; 4,3%; 4,8% và 34,1% so với mẫu đối chứng. Sự biến thiên hàm lƣợng
đƣờng khử và đƣờng tổng cũng diễn ra chậm hơn. Ngoại quan của quả có xử lý
nano chitosan là khá tốt so với mẫu đối chứng. Kết quả thu đƣợc cho thấy nano
chitosan có khả năng đƣợc ứng dụng trong bảo quản thanh long nhằm kéo dài thời
gian bảo quản lên 35 ngày ở 150C.


iv

LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ
Tác giả xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các
kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ
bất kỳ một nguồn nào và dƣới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài
liệu đã đƣợc thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng yêu cầu.
Tháng 12 năm 2015
Học viên

Huỳnh Công Tài


v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
ABSTRACT ............................................................................................................... ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................... iii
LỜI CAM ĐOAN CỦA TÁC GIẢ ........................................................................... iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... xi
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................2
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................2
4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...........................................................3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4
1.1. Tổng quan về quả thanh long ở Việt Nam ........................................................4
1.2.Thực trạng bảo quản thanh long ở Việt Nam ....................................................6
1.2.1. Xử lý nhiệt trƣớc khi bảo quản..................................................................6
1.2.2. Bảo quản ở nhiệt độ thấp ...........................................................................7
1.2.3. Xử lý thuốc ................................................................................................7
1.3.Tổng quan về nấm mốc Aspergillus niger .........................................................8
1.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................8
1.3.2. Đặc điểm hệ sợi nấm .................................................................................9
1.3.3. Cấu tạo cơ quan sinh sản ...........................................................................9
1.4. Tổng quan về chitosan và nano chitosan ........................................................10
1.4.1. Tổng quan về chitosan.............................................................................10
1.4.2. Hoạt tính và cơ chế kháng khuẩn của chitosan .......................................11
1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn của nano chitosan...............................................13


vi

1.4.4. Độc tính của chitosan ..............................................................................14
1.4.5. Các phƣơng pháp tạo nano chitosan........................................................14
1.5. Những cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài .........................................18
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................21
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................................21
2.1.1. Nguyên liệu thanh long.............................................................................21
2.1.2. Nguyên liệu chitosan ................................................................................21
2.1.3. Nấm mốc Aspergillus niger ......................................................................21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................22
2.2.1. Sơ đồ tiến trình nghiên cứu ......................................................................22
2.2.2. Bố trí thí nghiệm.......................................................................................22
2.2.2.1. Thí nghiệm xác định ngƣỡng gây bệnh nhân tạo của nấm A.niger trên
quả thanh long ....................................................................................................22
2.2.2.2. Thí nghiệm xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát
triển của nấm A.niger trong điều kiện in vitro ...................................................23
2.2.2.3. Khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của nano chitosan trong điều
kiện in vivo trên quả thanh long .........................................................................25
2.2.2.4. Khảo sát hiệu quả bảo quản thanh long ở điều kiện 150C kết hợp với
màng bao nano chitosan .....................................................................................26
2.2.3. Phƣơng pháp tạo nano chitosan ................................................................27
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích đƣờng khử, đƣờng tổng ......................................30
2.2.4.1. Thiết bị và hóa chất ...............................................................................30
2.2.4.2. Phƣơng pháp phân tích đƣờng tổng ......................................................30
2.2.4.3. Phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử .....................................................31
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng vitamin C ..........................................33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ....................................35
3.1. Kết quả thí nghiệm tạo nano chitosan .............................................................35
3.2. Kết quả thí nghiệm xác định ngƣỡng gây bệnh nhân tạo của nấm A.niger trên
quả thanh long. .......................................................................................................37
3.3. Kết quả thí nghiệm xác định khả năng ức chế của nano chitosan lên sự phát

triển của nấm mốc A.niger trong điều kiện in vitro...............................................39


vii

3.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng kháng nấm A.niger của nano chitosan
trong điều kiện in vivo trên quả thanh long ...........................................................43
3.5. Kết quả khảo sát thời gian bảo quản thanh long bao nano chitosan ở điều kiện
150C 45
3.5.1. Sự hao hụt khối lƣợng ..............................................................................46
3.5.2. Sự thay đổi pH ..........................................................................................49
3.5.3. Sự thay đổi hàm lƣợng chất rắn hòa tan ...................................................50
3.5.4. Sự thay đổi hàm lƣợng vitamin C ............................................................52
3.5.5. Sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng khử, đƣờng tổng ......................................54
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 58
4.1. Kết luận ...........................................................................................................58
4.2. Kiến nghị.........................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................60
Phụ lục A: CÁC PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ...........................67
Phụ lục B: SỐ LIỆU THƠ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM .............................................71
Phụ lục C: CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ...............................78


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1: Diện tích và sản lƣợng thanh long tại Việt Nam .......................................5
Bảng 2. 1: Bố trí thí nghiệm xác định khả năng kháng nấm A.niger của nano
chitosan trong điều kiện in vitro................................................................................24
Bảng 2. 2: Bố trí cơng thức thí nghiệm in vivo .........................................................25

Bảng 2. 3: Bố trí thí nghiệm tạo nano chitosan .........................................................29
Bảng 2. 4: Thơng số dựng đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng đƣờng khử................32

Bảng 3. 1: Kết quả tạo nano chitosan ........................................................................35
Bảng 3. 2: Bảng kết quả tỉ lệ bệnh trong thí nghiệm xác định ngƣỡng gây bệnh .....38
Bảng 3. 3: Kết quả ảnh hƣởng của nồng độ và kích thƣớc nano chitosan lên sự nảy
mầm và phát triển của nấm mốc A.niger ..................................................................41
Bảng 3. 4: Bảng kết quả thí nghiệm xác định khả năng kháng nấm A.niger của nano
chitosan có kích thƣớc hạt 42nm trong điều kiện in vivo .........................................44
Bảng 3. 5: Bảng tỉ lệ hao hụt khối lƣợng quả qua 35 ngày bảo quản .......................46
Bảng 3. 6: Bảng thay đổi pH qua 35 ngày bảo quản ở 150C.....................................49
Bảng 3. 7: Bảng hàm lƣợng chất rắn hòa tan qua 35 ngày bảo quản ở 150C............50
Bảng 3. 8: Bảng hàm lƣợng vitamin C qua 35 ngày bảo quản ở 150C .....................52
Bảng 3. 9: Sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng khử qua 35 ngày bảo quản ở 150C..........54
Bảng 3. 10: Sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng tổng qua 35 ngày bảo quản ở 150C .......55
Bảng 3. 11: Kết quả bảo quản sau 35 ngày ở 150C ...................................................57


ix

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1: Hình thái Aspergillus sp. ............................................................................9
Hình 1. 2: Cấu tạo hóa học của chitin và chitosan ....................................................10
Hình 1. 3: Sơ đồ tạo nano chitosan bằng phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng ........14
Hình 1. 4: Sơ đồ tạo nano chitosan bằng phƣơng pháp kết tủa.................................15
Hình 1. 5: Sơ đồ tạo hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp hợp giọt nhũ tƣơng .......16
Hình 1. 6: Sơ đồ tạo nano chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ion ..........................17
Hình 1. 7: Sơ đồ tạo hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp mixen đảo.....................18
Hình 1. 8: Sơ đồ tiến trình thí nghiệm ......................................................................22

Hình 2. 1: Nguyên lý hình thành hạt nano chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ion .28
Hình 2. 2: Phƣơng trình đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng đƣờng tổng ..................31
Hình 2. 3: Phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử và thuốc thử DNS ............................32
Hình 2. 4: Phƣơng trình đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng đƣờng khử ...................33

Hình 3. 1: Nano chitosan đƣợc tạo theo cơng thức NCT 1 .......................................35
Hình 3. 2: Nano chitosan đƣợc tạo theo cơng thức NCT 2 .......................................36
Hình 3. 3: Nano chitosan đƣợc tạo theo công thức NCT 3 .......................................36
Hình 3. 4: Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả thanh long bằng bào tử nấm mốc
A.niger .......................................................................................................................38
Hình 3. 5: Kết quả thí nghiệm in vitro ở kích thƣớc nano chitosan là 42 nm ..........39
Hình 3. 6: Kết quả thí nghiệm in vitro ở kích thƣớc nano chitosan là 157 nm .........39
Hình 3. 7: Kết quả thí nghiệm in vitro ở kích thƣớc nano chitosan là 241 nm .........40
Hình 3. 8: Kết quả thí nghiệm xác định khả năng kháng nấm A.niger của nano
chitosan có kích thƣớc 42 nm trong điều kiện in vivo trên quả thanh long ..............44
Hình 3. 9: Biểu đồ tỉ lệ hao hụt khối lƣợng quả qua 35 ngày bảo quản ...................46
Hình 3. 10: Đồ thị sự thay đổi pH qua 35 ngày bảo quản ở 150C.............................49
Hình 3. 11: So sánh sự thay đổi hàm lƣợng chất rắn hòa tan qua 35 ngày bảo quản ở
150C ...........................................................................................................................51


x

Hình 3. 12: So sánh sự thay đổi hàm lƣợng vitamin C qua 35 ngày bảo quản ở 150C
...................................................................................................................................53
Hình 3. 13: Đồ thị sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng khử qua 35 ngày bảo quản ở 150C
...................................................................................................................................54
Hình 3. 14: Đồ thị sự thay đổi hàm lƣợng đƣờng tổng qua 35 ngày bảo quản ở 150C
...................................................................................................................................56

xi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA :

Potato Dextro Agar

NCT :

Xử lý nano chitosan

LD50 :

Lethal Dose

DNA :

Deoxy ribonucleic acid

RNA :

Ribonucleotic acid

STPP :

Sodium tripolyphosphate

MIC :

Minimum inhibition concentration

PIRG :

Percentage inhibition of radial growth

ĐC :

Đối chứng

SEM :

Scanning electron microscope

DNS :

Dinitro salysilic acid


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thanh long là loại trái cây có giá trị dinh dƣỡng cao và ngày càng nhận
đƣợc nhiều sự quan tâm và đón nhận của các thị trƣờng tiêu thụ trên thế giới.
Cụ thể là chỉ trong đầu năm 2015 thanh long Việt Nam có thêm 3 thị trƣờng
xuất khẩu chính ngạch là Newzealand, Úc, và Ấn Độ.
Mặc dù diện tích trồng thanh long chỉ chiếm 3,1% tổng diện tích trồng cây
ăn quả của Việt Nam, nhƣng loại trái này đang đóng góp tới 55% tổng giá trị

xuất khẩu. Hiện nay thanh long Việt Nam xuất khẩu qua 40 nƣớc trên thế giới
tuy nhiên thị trƣờng xuất khẩu chính của trái thanh long vẫn là Trung Quốc
chiếm tới 70 – 80% kim ngạch xuất khẩu, các thị trƣờng khác chỉ chiếm tỉ lệ
thấp nhƣ: châu Âu 4%, Mỹ 3%, Nhật 1,5%…cho thấy sự phụ thuộc rất lớn của
thanh long Việt Nam vào thị trƣờng Trung Quốc, việc này đem đến nhiều nguy
cơ bất ổn về quá trình tiêu thụ thanh long mà nếu nhƣ chúng ta không làm chủ
đƣợc sẽ rất dễ dẫn đến ứ đọng nguồn hàng không tiêu thụ đƣợc nhƣ đã xảy ra
với một số nông sản khác. [1]
Do vậy, việc phát triển các phƣơng pháp nhằm kéo dài thời gian bảo quản
để trái thanh long Việt Nam dễ dàng tiếp cận và tăng khả năng cạnh tranh ở các
thị trƣờng xa để có thể chủ động hơn về thị trƣờng tiêu thụ thanh long của
mình đang là một vấn đề cấp thiết.
Thanh long sau thu hoạch dễ bị hƣ hỏng khi bảo quản mà chủ yếu do các
chủng nấm mốc sau gây ra: Colletotrichum gloeosporioides, Aspergillus niger,
Aspergillus flavus, Penicillium,và Botryosphaeria sp [2]. Trong đó, hƣ hỏng do
nấm mốc A.niger và bệnh thán thƣ do Colletotrichum gloeosporioides gây ra
chiếm tỉ lệ lớn. [3]
Một số phƣơng pháp xử lý thanh long sau thu hoạch hiện đang đƣợc sử
dụng ở Việt Nam nhƣ: xử lý hóa chất (carbenadazim, anolyte), chiếu xạ, xử lý
hơi nƣớc nóng…Tuy nhiên, với thực trạng về vấn đề vệ sinh an tồn thực
phẩm cũng nhƣ vấn đề ơ nhiễm mơi trƣờng thì xu hƣớng của ngành cơng
nghiệp thực phẩm nói chung hay cơng nghệ sau thu hoạch nói riêng đang


2

hƣớng tới sử dụng các phƣơng pháp sinh học, an toàn cho ngƣời sử dụng để
dần thay thế cho các phƣơng pháp hóa học, trong đó phƣơng pháp đang đƣợc
nghiên cứu rất nhiều đó là sử dụng màng bao chitosan và các chế phẩm của nó.
Chitosan là một trong những hợp chất sinh học có khả năng ứng dụng

trong bảo quản rau quả sau thu hoạch do nó có đặc tính kháng nấm, kháng
khuẩn và là một chế phẩm sinh học đƣợc xem là an toàn cho ngƣời tiêu dùng.
[4]
Một ƣu điểm nữa của việc sử dụng màng bao chitosan là nó giúp hạn chế
q trình hơ hấp, giảm đƣợc sự thay đổi màu sắc và giữ đƣợc cấu trúc của rau
quả [4]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế mạnh sự
phát triển của nấm gây thối trên trái cây. Bên cạnh đó, có nhiều nghiên cứu
cũng đã cho thấy rằng việc sử dụng chitosan dƣới dạng nano cho hiệu quả bảo
quản tốt hơn chitosan thơng thƣờng, từ đó mở ra một hƣớng nghiên cứu mới
trong quá trình ứng dụng chế phẩm sinh học chitosan vào lĩnh vực bảo quản
rau quả.
Từ những vấn đề trên, tôi quyết định thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả
năng kháng nấm Aspergillus niger của nano chitosan ứng dụng trong bảo quản
thanh long ”
2. Mục tiêu nghiên cứu
-

Xác định đƣợc khả năng kháng nấm Aspergillus niger của nano chitosan
trong điều kiện in vitro và in vivo.

-

Đánh giá khả năng bảo quản thanh long bằng màng bao nano chitosan ở
điều kiện nhiệt độ 150C.

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
-

Trái thanh long: nghiên cứu thực hiện trên quả thanh long vỏ đỏ ruột trắng
đƣợc trồng ở tỉnh Bình Thuận, là địa phƣơng có diện tích trồng và sản lƣợng

thanh long lớn nhất cả nƣớc.

-

Chủng nấm mốc Aspergillus niger có nguồn gốc từ Trung tâm nghiên cứu
và phát triển nông nghiệp cơng nghệ cao Thành Phố Hồ Chí Minh.


3

-

Chế phẩm chitosan dùng để tạo nano chitosan: dạng bột đƣợc mua từ công
ty TNHH Hùng Tiến, khu công nghiệp Trà Nóc 1, thành phố Cần Thơ. Nano
chitosan đƣợc tạo thành bằng phƣơng pháp tạo gel ion với sodium
tripolyphosphate

-

Acid acetic dùng trong thí nghiệm tạo nano chitosan: sử dụng của công ty
Merck KGaA

-

Môi trƣờng PDA: sử dụng của công ty Merck KGaA

4. Nội dung nghiên cứu
- Tạo chế phẩm nano chitosan bằng phƣơng pháp tạo gel ion với sodium
tripolyphosphate
- Xác định ngƣỡng gây bệnh của nấm Aspergillus niger trên quả thanh long

Bình Thuận.
- Khảo sát khả năng ức chế của nano chitosan lên sự sinh trƣởng và phát triển
của Aspergillus niger trong điều kiện in vitro
- Đánh giá ảnh hƣởng của nano chitosan đến sự sinh trƣởng và phát triển của
A.niger ở điều kiện in vivo trên quả thanh long Bình Thuận.
- Đánh giá hiệu quả bảo quản thanh long bằng nano chitosan thông qua sự thay
đổi các chỉ tiêu hóa lý của quả qua q trình bảo quản.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
-

Ý nghĩa khoa học: cung cấp dữ liệu khoa học về khả năng kháng nấm
Aspergillus niger của nano chitosan trong điều kiện in vitro và in vivo.

-

Ý nghĩa thực tiễn: đề xuất nồng độ nano chitosan có hiệu quả ức chế tốt nấm
mốc Aspergillus niger có thể ứng dụng nhằm kéo dài thời gian bảo quản
thanh long phục vụ cho xuất khẩu.


4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về quả thanh long ở Việt Nam
Thanh long (hay còn gọi là Pitaya theo tên Mỹ La Tinh) đã có từ rất lâu nhƣng
mới chỉ đƣợc biết đến rộng rãi trên thị trƣờng thế giới trong những thập niên gần
đây. Ba giống thanh long chính thƣờng đƣợc trồng cho mục đích thƣơng mại là
thanh long vỏ đỏ ruột trắng (Hylocereus undatus), thanh long vỏ đỏ ruột đỏ
(Hylocereus costaricensis), và thanh long vỏ vàng ruột trắng (Hylocereus
megalanthus).

Thanh long đã đƣợc ngƣời Pháp du nhập vào Việt Nam cách đây hơn 100 năm
[5]. Việt Nam hiện trồng chủ yếu là sản phẩm thanh long vỏ đỏ ruột trắng. thanh
long vỏ đỏ ruột đỏ giống Đài Loan hoặc giống Long Định 1 cũng bắt đầu đƣợc
trồng thử nghiệm tại một số vùng và đƣợc ƣa chuộng do sản lƣợng tốt hơn, màu sắc
đẹp hơn nhƣng diện tích vẫn cịn hạn chế, khơng đáng kể so với diện tích thanh long
vỏ đỏ ruột trắng. Ngồi ra, Viện Cây ăn quả Miền Nam cũng mới lai tạo thành cơng
giống thanh long Long Định 5 có vỏ đỏ ruột tím hồng và rất nhiều tính năng ƣu việt
nhƣ năng suất cao, chất lƣợng tốt, ít nhiễm cơn trùng, bệnh hại và đặc biệt là có màu
sắc đẹp. Tuy nhiên, giống này cũng chỉ mới đƣa vào sản xuất thử vào năm 2012.
Việt Nam là một trong những nƣớc có diện tích và sản lƣợng thanh Long lớn
nhất Châu Á và là nƣớc xuất khẩu thanh Long lớn nhất thế giới (Cơng ty T&C,
2012). Năm 2013, Việt Nam có 28.700 ha diện tích trồng thanh long với tổng sản
lƣợng đạt 520.000 tấn. Thanh long hiện đang đƣợc trồng ở 30 tỉnh/thành của Việt
Nam nhƣng đặc biệt phát triển ở các vùng chun canh quy mơ lớn nhƣ Bình Thuận,
Tiền Giang và Long An (Vinafruits, 2013). Ba tỉnh này chiếm 93,6% tổng diện tích
thanh long cả nƣớc và chiếm đến 95,5% tổng sản lƣợng. Trong đó, Bình Thuận là
nơi có diện tích và sản lƣợng thanh long lớn nhất (chiếm 73,2% về diện tích và 76,9%
về sản lƣợng); kế đến là Tiền Giang (10,9% về diện tích và 10,9% về sản lƣợng) và
đứng thứ ba là Long An (9,5% về diện tích và 8,1 % về sản lƣợng). Do sản xuất và
tiêu thụ thanh long đạt hiệu quả kinh tế cao trong 3 năm trở lại đây nên diện tích
canh tác tăng rất nhanh (Bình Thuận tăng 143%, Tiền Giang 169% và Long An tăng


5

190% năm 2013 so với năm 2011). Một số tỉnh phía Bắc, Trà Vinh và Vĩnh Long
cũng đã bắt đầu trồng và thu hoạch thanh long nhƣng tỷ trọng thấp (6,4%) (Sở
Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn các tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An,
2013).
Bảng 1. 1: Diện tích và sản lƣợng thanh long tại Việt Nam [6]

Địa phƣơng
Cả nƣớc
1. Bình Thuận
2. Tiền Giang
3. Long An

Diện tích
(ha)
28.700
21.000
3.139
2.748

% so với cả
nƣớc
100,0
73,2
10,9
9,5

Sản lƣợng
(tấn)
520.000
400.000
56.823
42.303

% so với cả
nƣớc
100,0

76,9
10,9
8,1

Thanh long hiện đang là mặt hàng mang lại kim ngạch xuất khẩu cao nhất
trong tất cả các mặt hàng rau quả tƣơi của Việt Nam. Mặc dù diện tích trồng thanh
long chỉ chiếm 3,1% tổng diện tích trồng cây ăn quả của Việt Nam, nhƣng loại trái
này đang đóng góp tới 55% tổng giá trị xuất khẩu rau quả. [1]
Trái thanh long Việt Nam đã có mặt ở 40 quốc gia và vùng lãnh thổ, trong đó
có cả các thị trƣờng đƣợc coi là khó tính nhƣ Mỹ, Châu Âu, Nhật Bản…Tuy nhiên
hiện nay, thanh long đạt chuẩn xuất khẩu sang các thị trƣờng khó tính và mang lại
giá trị cao nhƣ Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Châu Âu vẫn chƣa đáp ứng đủ nhu cầu của thị
trƣờng do không gom đủ hàng sản xuất đạt chuẩn mà nhà nhập khẩu mong muốn.
Tính đến cuối năm 2014, tỉnh Bình Thuận có diện tích sản xuất thanh long lớn
nhất so với cả nƣớc (24.212 ha) với sản lƣợng thu hoạch hàng năm trên 500.000 tấn.
Chỉ riêng các doanh nghiệp của tỉnh Bình Thuận trong năm 2014 xuất khẩu
vào 14 thị trƣờng, trong đó Trung Quốc là thị trƣờng tiêu thụ chủ lực (ƣớc tính 8085% sản lƣợng). Tuy nhiên, số lƣợng và kim ngạch xuất khẩu chính ngạch vào thị
trƣờng Trung Quốc chiếm tỷ trọng rất thấp (khoảng 5%) cịn hầu hết thanh long
Bình Thuận xuất khẩu sang thị trƣờng Trung Quốc theo hình thức bn bán biên
mậu chủ yếu qua cặp cửa khẩu Tân Thanh (Lạng Sơn, Việt Nam) – Pò Chài (Quảng
Tây, Trung Quốc). [1]


6

Do phụ thuộc quá nhiều vào thị trƣờng trung Quốc, dẫn đến nhiều rủi ro cho
nông dân cũng nhƣ các nhà xuất khẩu, do đó nhu cầu tìm ra hƣớng đi bền vững cho
sản xuất và kinh doanh thanh long đang ngày càng trở nên cấp thiết và rất cần nhận
đƣợc sự quan tâm của các bên liên quan trong và ngồi chuỗi cung ứng thanh long.
Thêm vào đó, để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc và xuất khẩu, Trung

Quốc đang có chính sách khuyến khích ngƣời dân phát triển trồng thanh long trên
diện tích lớn tại hai tỉnh Quảng Đơng và Quảng Tây, phía Nam Trung Quốc (diện
tích hiện nay là 20.000 ha). Mặc dù việc sản xuất thanh long tại Trung Quốc không
thuận lợi (do ảnh hƣởng bởi thời tiết, khí hậu nên năng suất và sản lƣợng thanh long
của Trung Quốc sẽ không nhiều và bị gián đoạn trong mùa lạnh); tuy nhiên đây là
thị trƣờng tiêu thụ hầu hết sản lƣợng thanh long của Việt Nam nói chung và Bình
Thuận nói riêng, do vậy trong thời gian tới, thanh long Việt Nam sẽ phải cạnh tranh
với thanh long Trung Quốc ngay tại thị trƣờng tiêu thụ, ngồi cạnh tranh về giá cả
cịn phải cạnh tranh về cả những vấn đề liên quan đến chất lƣợng cũng nhƣ rào cản
kỹ thuật trong thƣơng mại mà Trung Quốc có thể sẽ áp dụng trong tƣơng lai. [1]
1.2. Thực trạng bảo quản thanh long ở Việt Nam
Quả thanh long có thời gian tồn trữ ngắn do có cƣờng độ hô hấp cao. Nếu bảo
quản ở điều kiện thƣờng, vỏ quả sẽ bị nhăn lại chỉ sau 7 – 8 ngày bảo quản. Thành
phần hóa học của quả thay đổi nhiều trong quá trình bảo quản. [2]
1.2.1. Xử lý nhiệt trước khi bảo quản
Xử lý quả bằng hơi nƣớc nóng đƣợc ứng dụng đầu tiên ở Florida 1992 để trừ
ruồi Địa Trung Hải trên quả cam [7]. Xử lý nhiệt trƣớc khi bảo quản nhằm loại bỏ
các mầm bệnh trên bề mặt hoặc trong một vài lớp tế bào biểu bì của rau quả thƣờng
tiến hành trong thời gian ngắn (vài phút). Nhiệt đƣợc cung cấp cho rau quả theo một
vài cách: nhúng trong nƣớc nóng, bằng hơi nƣớc nóng hoặc bằng khơng khí khơ
nóng. Xử lý nhiệt bằng hơi nóng chủ yếu hiệu quả trong việc diệt cơn trùng nhƣng
khó để diệt trừ đƣợc nấm mốc; Xử lý nhiệt bằng khơng khí khơ nóng có khả năng
diệt cả cơn trùng và nấm mốc nhƣng có thể làm bỏng vỏ quả đối với những quả có
vỏ mỏng; Xử lý nhiệt bằng nƣớc nóng thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất vì nó là mơi
trƣờng truyền nhiệt hiệu quả hơn khơng khí. Xử lý nhiệt cũng đƣợc sử dụng để ức


7

chế q trình chín hoặc tạo ra sức đề kháng với tổn thƣơng lạnh và tổn thƣơng trong

vỏ trong suốt thời gian bảo quản, vì thế có thể kéo dài thời gian bảo quản và thời
gian tiêu thụ trên thị trƣờng. Xử lý quả thanh long trƣớc khi bảo quản để đảm bảo
an toàn sinh học của các nƣớc nhập khẩu, và hệ thống các siêu thị. Xử lý ở mức độ
thấp nhiệt độ ở tâm quả 46,50C trong thời gian 20 phút thì chất lƣợng quả đƣợc duy
trì. [5]
1.2.2. Bảo quản ở nhiệt độ thấp
Bảo quản ở nhiệt độ thấp là biện pháp hữu hiệu nhất trong việc hạn chế q
trình hơ hấp, hạn chế sự chín của quả và ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật, đảm
bảo kéo dài thời gian bảo quản của rau quả tƣơi. Đây là phƣơng pháp bảo quản dựa
theo nguyên lý tiềm sinh nghĩa là làm chậm, ức chế hoạt động sống của rau quả và
vi sinh vật nhờ đó làm chậm thời gian hƣ hỏng thối rữa của rau quả. Nhƣ ta đã biết
nhiệt độ môi trƣờng bảo quản càng thấp thì càng có tác dụng ức chế các q trình
sinh lý sinh hóa xảy ra trong rau quả và hoạt động của vi sinh vật. Tuy nhiên, nhiệt
độ môi trƣờng bảo quản lạnh phải từ 200C đến nhiệt độ gần điểm đóng băng của
dịch bào để tránh hiện tƣợng tổn thƣơng lạnh [8]. Quả thanh long có thể giữ đƣợc
chất lƣợng thƣơng mại trong khoảng 7 ngày ở 200C, 14 ngày ở 140C, nhƣng ở nhiệt
độ thấp hơn 60C xuất hiện hiện tƣợng tổn thƣơng lạnh với những đốm nâu trên bề
mặt quả. [9]
1.2.3. Xử lý thuốc
Dùng chế phẩm acid gibberelic với liều 2g cho 12 lít nƣớc, xịt đều quanh trái,
có tác dụng làm tai thanh long xanh hơn và cứng hơn. Xử lý trƣớc khi thu hoạch từ
1 – 3 ngày. Với cách này thanh long có thể bảo quản tƣơi đƣợc 10 – 20 ngày. [10]


8

1.3. Tổng quan về nấm mốc Aspergillus niger
1.3.1. Giới thiệu chung
Aspergillus niger là loài nấm phổ biến nhất xuất hiện trong thực phẩm, đƣợc
xác định là tác nhân gây nên bệnh mốc đen trên nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là

trên các loại rau quả sau thu hoạch. Nó cịn là loài nấm mốc xuất hiện phổ biến nhất
trên các loại hạt nhƣ: đậu phộng, ốc chó, hạt phỉ… [11]
A.niger đƣợc xem là lồi vi sinh vật có nhiều ứng dụng quan trọng nhất trong
cơng nghệ vi sinh. Nó đã đƣợc ứng dụng cho công nghệ lên men sản xuất acid citric
và các enzyme ngoại bào trong nhiều thập kỷ qua. [12]
A.niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi trên các
cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng địa lý khác
nhau trên thế giới. Hiện nay, A.niger đƣợc sử dụng chủ yếu trong công nghiệp sản
xuất enzyme (điển hình nhƣ α - amylase, glucoamylase, pectinase, protease,
cellulase), trong cơng nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất một số acid
hữu cơ nhƣ acid citric, acid gluconic… [13] [14] [15]
A.niger là loài phổ biến nhất gây bệnh thối hỏng trên nhiều loại trái cây tƣơi
và rau củ nhƣ: Táo, đào, cam, nho, dâu tây, xoài, thanh long, hành tây, tỏi, cà
chua… [3]
Theo các nghiên cứu ở thập niên 70 của thế kỷ XX, bắt đầu từ nghiên cứu
phân chia nhóm của Whittaker đến giới của Alexopolous và Mims đã đề nghị khóa
phân loại cho giới nấm nói chung và A.niger nói riêng nhƣ sau: [16]
-

Ngành: Amastigomycota

-

Ngành phụ: Ascomycotina

-

Lớp: Ascomycetes

-

Lớp phụ: Plectomycetidae

-

Bộ: Eurotiales

-

Họ: Eurotiaceae

-

Giống: Aspergillus

-

Loài: Aspergillus niger


9

1.3.2. Đặc điểm hệ sợi nấm
Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trƣởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:
-

Khuẩn ty dinh dƣỡng: khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thƣớc nhỏ,
màu trắng. Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi
trƣờng nuôi cấy để hút dƣỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng.

-

Khuẩn ty sinh sản: khuẩn ty phát triển trong khơng khí, có kích thƣớc lớn
hơn khuẩn ty dinh dƣỡng rất nhiều, trong suốt. Khuẩn ty sinh sản hƣớng vào
khơng khí để lấy oxy, có khả năng tạo bào tử khi già.
Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi: một số khuẩn ty dinh dƣỡng tạo

thành các hạch nấm làm hệ sợi ngã sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty sinh sản
hình thành các bào tử đính làm cho bề mặt khuẩn lạc có màu đen. [11]
1.3.3. Cấu tạo cơ quan sinh sản
Aspergillus niger là loại nấm khơng có giai đoạn sinh sản hữu tính, A. niger
sinh sản vơ tính chủ yếu bằng bào tử đính.

Hình 1. 1: Hình thái Aspergillus sp.
(a) khối bào tử đính, (b) bào tử đính, (c) tế bào gốc , (d) cuống thể bình và thể bình
Cơ quan sinh sản có dạng nhƣ hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính phát triển
từ một tế bào có đƣờng kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi
nấm gọi là tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi cuống không vách ngăn, kéo dài
với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình cầu, khơng màu cho đến vàng nhạt. Xung


10

quanh bề mặt túi là các cuống thể bình màu nõu, di 10 ữ 15 àm, l ni sinh ra các
thể bình. Thể bình có một tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính đƣợc tạo thành nối
tiếp nhau trong miệng thể bình thành chuỗi hƣớng gốc, khơng phân nhánh (bào tử ở
ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già).
Bào tử đính hình cầu, thƣờng dẹt, đƣờng kính 4 ÷ 5 µm, nhƣng thƣờng nhỏ hơn.
Lồi A. niger đƣợc phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử
đính màu đen. [11]

1.4. Tổng quan về chitosan và nano chitosan
1.4.1. Tổng quan về chitosan
Chitosan, một polymer sinh học đƣợc sản xuất từ chitin là thành phần có trong
vỏ các lồi giáp sát, cơn trùng, và là thành phần tham gia cấu tạo thành tế bào ở một
số loài nấm. [17]
Chitosan đƣợc tạo thành từ phản ứng deacetyl hóa chitin bằng phƣơng pháp
hóa học hoặc phƣơng pháp enzyme.

Hình 1. 2: Cấu tạo hóa học của chitin và chitosan


11

Hoạt tính sinh học, độ tinh khiết, và khối lƣợng phân tử của chế phẩm
chitosan đƣợc tạo thành phụ thuộc vào nguồn gốc và phƣơng pháp thực hiện phản
ứng deacetyl hóa chitin. Với chitosan thì tính chất hóa lý chủ yếu quyết định đến
thuộc tính chức năng của nó chính là khối lƣợng phân tử và mức độ deacetyl hóa.
[18]
Chitosan đƣợc xem là hợp chất sinh học rất ít hoặc không độc đối với con
ngƣời (LD50 = 16g/kg ở chuột), và là hợp chất sinh học có tính kháng virus, kháng
khuẩn, kháng nấm, và chống oxy hóa. [19]
1.4.2. Hoạt tính và cơ chế kháng khuẩn của chitosan
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan rất khác nhau tùy thuộc vào mức độ
deacetyl hóa, khối lƣợng phân tử, nồng độ và thời gian phơi nhiễm. [20] [21]
Hiệu quả kháng tốt nhất trên các loài vi khuẩn gram (-) nhƣ: Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens và
Vibrio parahaemolyticus. Cơ chế tác dụng chủ yếu là lên thành phần màng tế bào.
Chitosan cũng cho hiệu quả ức chế trên các loài vi khuẩn gram (+) nhƣ:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus simulans, Listeria monocytogenes, Bacillus
megaterium, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bulgaricus và Bacillus cereus.

[22]
Ngồi ra chitosan cịn cho hoạt tính kháng cả trong thử nghiệm in vitro và in
vivo trên nhiều loài nấm nhƣ : Ramularia cercosporelloides, Aspergillus niger,
Aspergillus

parasiticus,

Alternaria

alternata,

Botrytis

cinerea,

Colletrotichumgloeosporioides, Rhizopus stolonifer, Sclerotinia sclerotiorum,
Rhizoctenia solana, và Fusarium solani. [17]
Có nhiều cơ chế giải thích cho hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đƣợc đƣa ra,
và nó hoạt động theo cơ chế nào còn tùy thuộc vào đối tƣợng tác dụng và tính chất
của từng loại chitosan khác nhau. Một trong những cơ chế đƣợc giải thích rõ ràng
nhất và đƣợc cơng nhận rộng rãi nhất đó là hiệu quả ức chế có đƣợc là do sự tƣơng
tác mạnh mẽ của các nhóm amino mang điện tích dƣơng trên mạch của phân tử
chitosan và các thành phần mang điện tích âm nhƣ các protein, acid amin,