Xác định một số biến thể glucose 6 phosphate dehydrogenase ở trẻ sơ sinh tại bệnh viện phụ sản quốc tế sài gòn bằng phương pháp multiplex pcr và giải trình tự gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM HOÀNG ANH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ BIẾN THỂ GLUCOSE-6-PHOSPHATE
DEHYDROGENASE Ở TRẺ SƠ SINH TẠI BỆNH VIỆN
PHỤ SẢN QUỐC TẾ SÀI GÒN BẰNG PHƢƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 420 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 05 năm 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

PHẠM HOÀNG ANH

IDENTIFICATION OF GLUCOSE-6-PHOSPHATE
DEHYDROGENASE VARIANTS IN NEWBORNS AT
SAI GON INTERNATIONAL OBSTETRICS AND
GYNAECOLOGY HOSPITAL BY MULTIPLEX
PCR AND DNA SEQUENCING METHODS
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 420 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 05 năm 2017


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
ĐƠN VỊ DI TRUYỀN HỌC - BỆNH VIỆN PHỤ SẢN QUỐC TẾ SÀI GÕN VÀ
PHÕNG SINH HỌC PHÂN TỬ - CÔNG TY CỔ PHẦN CÔNG NGHỆ
SINH HỌC BIONET (HÀ NỘI)
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học 1 : .....................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học 2 : .....................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 1 : ...........................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Cán bộ chấm nhận xét 2 : ...........................................................................
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị và chữ ký)
Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. HCM
ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)
1. ..............................................................
2. ..............................................................
3. ..............................................................
4. ..............................................................
5. ..............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: PHẠM HOÀNG ANH

MSHV: 1570251

Ngày tháng năm sinh: 05/12/1990

Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số:

I. TÊN ĐỀ TÀI:
“Xác định một số biến thể Glucose-6-phosphate dehydrogenase ở trẻ sơ sinh
tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn bằng phƣơng pháp Multiplex PCR và
giải trình tự gen”.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Xác định tỷ lệ thiếu men G6PD ở trẻ sơ sinh tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài
Gịn.
Phân tích và xác định một số dạng biến thể G6PD ở trẻ sơ sinh mắc bệnh bằng
phƣơng pháp Multiplex PCR.

Kiểm định, đánh giá sự tƣơng đồng các kết quả phân tích đột biến của phƣơng
pháp Multiplex PCR bằng kỹ thuật giải trình tự gen và xác định các trƣờng hợp
đồng và dị hợp tử - ý nghĩa trong tƣ vấn tiền hôn nhân.
II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
IV. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS.BS. NGUYỄN MINH HÙNG, TS. LUYỆN
QUỐC HẢI.
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1
(Họ tên và chữ ký)

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2

(Họ tên và chữ ký)

Tp. HCM, ngày… tháng… năm 2017
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƢỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Bách Khoa TP.
HCM đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Xin gởi lời biết ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các
thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt những năm qua.
Xin trân trọng cám ơn Ban Giám Đốc, Phòng Kế Hoạch Tổng Hợp, Đơn vị Di
truyền học - Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn và Phòng sinh học phân tử - Công

ty cổ phần Công nghệ Sinh học Bionet Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện
luận văn này.
Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.BS. Nguyễn Minh Hùng Trƣởng Khoa Cận Lâm Sàng kiêm Trƣởng đơn vị Di truyền, TS. Luyện Quốc Hải Giám đốc Công ty cổ phần Bionet Việt Nam và PGS.TS. Lê Phi Nga - Trƣờng Đại
học Bách Khoa TP. HCM, các thầy cơ đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những bài
học quý giá trong suốt quá trình làm đề tài, cùng với những kiến thức thực tế sẽ là
những hành trang cùng tiến bƣớc trong suốt cuộc đời của tôi.
Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến CN. Trần Thị Ánh Nguyệt, ThS. Trần Quang
Vinh, CN. Lê Thị Loan, KTV. Hồ Thị Ngọc Nga, KTV. Huỳnh Thanh Gioãn, CN.
Đỗ Thị Thu Mai và CN. Vũ Thị Thanh Hoan cùng với toàn thể nhân viên Khoa Xét
Nghiệm - Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gịn đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và
chia sẻ không chỉ về mặt chun mơn mà cịn về các khía cạnh khác của cuộc sống.
Xin cảm ơn đến các bạn học viên cao học ngành Cơng nghệ Sinh học khóa 2015
đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, Con thành kính khắc ghi cơng ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong
gia đình ln tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.


TÓM TẮT
Thiếu men G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) là một căn bệnh ở hồng
cầu phổ biến nhất ở châu Phi, các nƣớc Đông Nam Á và vùng Địa Trung Hải. Bệnh
thiếu men G6PD là bệnh lý di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X, do
vậy tỷ lệ mắc bệnh của nam giới thƣờng cao hơn nữ giới. Hiện nay, căn bệnh này đã
ảnh hƣởng đến khoảng 400 triệu ngƣời trên toàn thế giới với tỷ lệ từ 0,1% đến 30%
tùy thuộc vào từng đất nƣớc, dân tộc. Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh thiếu men G6PD
từ 0,5% đến 31% dao động theo vùng miền, dân tộc. Có hơn 160 dạng biến thể đột
biến G6PD khác nhau gây ra mức độ thiếu men và biểu hiện bệnh lý khác nhau.
Phƣơng pháp Multiplex PCR đƣợc sử dụng để xác định một số biến thể G6PD
sau khi đã trải qua giai đoạn sàng lọc ban đầu cho 5.034 trẻ sơ sinh (dân tộc Kinh)
tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn từ 1/1/2015 đến 30/11/2016. DNA từ các
mẫu máu khơ của trẻ mắc bệnh đƣợc tách chiết, sau đó thực hiện phản ứng

Multiplex allele specific PCR dùng bộ kit đa mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để phát
hiện 8 dạng đột biến cơ bản ở khu vực Đông Nam Á. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc chạy
điện di để xác định các dạng đột biến trên gel agarose 3%. Sau đó, tiếp tục giải trình
tự gen cho 5/27 ca có đột biến để kiểm định kết quả giữa hai phƣơng pháp. Ngồi
ra, kết quả giải trình tự gen cịn giúp xác định các trƣờng hợp đồng và dị hợp tử,
điều này rất có ý nghĩa cho tƣ vấn tiền hơn nhân sau này.
Từ kết quả sàng lọc cho thấy có tổng cộng 38/5.034 (0,8%) ca có nguy cơ cao
thiếu men G6PD gồm 34 bé trai và 4 bé gái. Trong 33 mẫu đồng ý tham gia nghiên
cứu phân tích gen G6PD đã xác định 15 ca đột biến Viangchan, 5 ca đột biến
Kaiping, 3 ca đột biến Canton, 3 ca đột biến Union, 1 ca đột biến Mahidol và 6 ca
khơng tìm thấy đột biến trong 8 dạng đột biến hay gặp ở khu vực Đông Nam Á. Mặt
khác, khi tiến hành giải trình tự gen thì cho kết quả hoàn toàn tƣơng đồng với
phƣơng pháp Multiplex PCR. Ngoài ra còn xác định đƣợc kiểu gen ở các trƣờng
hợp thiếu men đã xác định đƣợc đột biến. Trong đó, 2 mẫu có đột biến G6PD
Canton ở 2 bé gái đều có kiểu gen dị hợp, khơng có trƣờng hợp đồng hợp.


SUMMARY
G6PD deficiency is the most common erythrocyte enzyme deficiency disease in
Africa, Southeast Asia and the Mediterranean region. It is an X-linked recessive
hereditary disease, which has difference between its severe by race or gender.
Currently, it is reported that 400 million people have G6PD deficiency from 0,1% to
30% according to the country. In Viet Nam, the prevalence of it varies from 0,5% to
31% in different ethnic groups and areas. There are many variants that cause
different levels of enzyme deficiency and various disease manifestations.
The G6PD variants were identified in dried blood spot samples collected from
5.034 newborns (2.632 males and 2.402 females, Kinh ethnic) at Sai Gon
International Obstetrics and Gynaecology Hospital used Multiplex PCR method
after the screening tests were done. DNA of the deficient samples were extracted,
and then Multiplex allele specific PCR reactions were done using the primers were

designed to specifically detection Southeast Asia region types of eight G6PD
mutations. PCR products were analyzed by using 3% agarose gel electrophoresis.
After DNA sequencing was completed, we would assess the correlations between
the results of the two methods. In addition, DNA sequencing results also help to
identify homozygous and heterozygous cases, this is significant for premarital
counseling later.
Five G6PD variants were observed in 33 deficient subjects agreed to join this
research with prevalence of 0,8% (38 cases included 34 males and 4 females). The
results showed that Viangchan mutation (15/33) was the most common variant
detected, followed by Kaiping (5/33), Canton (3/33), Union (3/33) and Mahidol
(1/33). We found not mutations in 6 cases among 8 common variants in Southeast
Asia and these cases need further study. By using DNA sequencing, we confirmed
the similar results between the two methods. Besides, the genotype of G6PD
deficiency cases also were identified. Especially, two Canton samples of females
have heterozygous genotypes without the homozygous case.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do chính tơi thực hiện, dƣới sự
hƣớng dẫn của TS.BS Nguyễn Minh Hùng - Trƣởng khoa Cận Lâm Sàng kiêm
Trƣởng đơn vị Di truyền tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn và TS. Luyện
Quốc Hải - Giám đốc Công ty cổ phần Sinh học Bionet Việt Nam (Hà Nội).
Các số liệu, hình ảnh và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và
chƣa từng đƣợc cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả


MỤC LỤC
Trang
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... i

Danh sách các bảng .................................................................................................... ii
Danh sách các hình.................................................................................................... iii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu ..............................................................................................................2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN .........................................................................................3
2.1. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh .............................................................................3
2.1.1. Khái niệm sàng lọc sơ sinh ..........................................................................3
2.1.2. Mục đích .....................................................................................................3
2.1.3. Quy trình xét nghiệm ...................................................................................3
2.1.4. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới và ở Việt Nam ........................4
2.1.4.1. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới .........................................4
2.1.4.2. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh ở Việt Nam ..........................................4
2.2. Bệnh thiếu men G6PD ........................................................................................4
2.2.1. Khái niệm .....................................................................................................4
2.2.2. Dịch tễ học ...................................................................................................6
2.2.3. Cơ chế gây bệnh ...........................................................................................6
2.2.4. Phân loại .......................................................................................................8
2.2.5. Triệu chứng lâm sàng ...................................................................................9
2.2.6. Quy trình chẩn đốn ...................................................................................11
2.2.7. Phƣơng pháp phòng tránh và điều trị .........................................................11
2.3. Di truyền bệnh thiếu men G6PD .......................................................................12
2.4. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen ..................................................................13
2.4.1. Các kỹ thuật dựa trên PCR đơn thuần........................................................13
2.4.2. Kỹ thuật giải trình tự gen ...........................................................................13
2.4.3. So sánh phƣơng pháp Multiplex allele specific PCR và giải trình tự gen .13


2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc .......................................................14
2.5.1. Các nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................14

2.5.2. Các nghiên cứu ở nƣớc ngoài ....................................................................16
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................20
3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát...............................................................................20
3.2. Vật liệu nghiên cứu ...........................................................................................21
3.2.1. Cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang ....................................................................21
3.2.2. Phƣơng pháp lấy mẫu máu gót chân trên thẻ giấy Whatman 903 .............21
3.2.3. Dữ liệu gen G6PD ......................................................................................22
3.2.4. Phân tích thống kê ......................................................................................22
3.2.5. Dụng cụ, sinh phẩm - hóa chất và trang thiết bị ........................................22
3.2.5.1. Dụng cụ ...............................................................................................22
3.2.5.2. Sinh phẩm - hóa chất ..........................................................................22
3.2.5.3. Trang thiết bị .......................................................................................23
3.3. Phƣơng pháp phân tích ......................................................................................23
3.3.1. Xét nghiệm sàng lọc thiếu men G6PD .......................................................23
3.3.1.1. Mục đích .............................................................................................23
3.3.1.2. Nguyên lý của kỹ thuật .......................................................................23
3.3.1.3. Thành phần hóa chất ...........................................................................24
3.3.1.4. Chuẩn bị thuốc thử ..............................................................................24
3.3.1.5. Quy trình xét nghiệm ..........................................................................24
3.3.1.6. Phân tích kết quả .................................................................................25
3.3.2. Kỹ thuật Multiplex PCR ............................................................................25
3.3.2.1. Quy trình tách chiết DNA ...................................................................25
3.3.2.2. Quy trình Multiplex PCR ....................................................................27
3.3.2.3. Quy trình điện di .................................................................................29
3.3.3. Phƣơng pháp giải trình tự gen (DNA squencing) ......................................30
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................31
4.1. Kết quả ..............................................................................................................31
4.1.1. Kết quả sàng lọc bệnh thiếu men G6PD ....................................................31

4.1.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu khô trên thẻ Whatman 903 31
4.1.3. Kết quả xác định các biến thể G6PD bằng phƣơng pháp Multiplex PCR .32
4.1.4. Kết quả giải trình tự gen G6PD .................................................................34
4.2. Thảo luận ...........................................................................................................39
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................47
5.1. Kết luận .............................................................................................................47
5.2. Kiến nghị ...........................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................48
PHỤ LỤC .................................................................................................................52


i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA

: DeoxyriboNucleic Acid

ELISA

: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

G6PD

: Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase

NADP+

: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

NST

: Nhiễm sắc thể

OD

: Optical Density

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PSQTSG

: Phụ Sản Quốc Tế Sài Gòn

RFLP

: Restriction Fragment Length Polymorphism

SLSS

: Sàng lọc sơ sinh

SNP

: Single-Nucleotide Polymorphism

SPSS

: Statistical Package for the Social Sciences

SSCP

: Single-Strand Conformation Polymorphism

TAE

: Tris-Acetate-EDTA

UV

: UltraViolet

WHO

: World Health Organization - Tổ chức y tế thế giới


ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Các biến thể G6PD phổ biến đƣợc phân tích ............................................8
Bảng 2.2: Phân nhóm bệnh thiếu men G6PD theo WHO ...........................................9
Bảng 2.3: So sánh phƣơng pháp Multiplex PCR và giải trình tự gen .......................14

Bảng 3.1: Cỡ mẫu trẻ sơ sinh trong nghiên cứu cắt ngang .......................................21
Bảng 3.2: Các thành phần hóa chất đƣợc sử dụng trong xét nghiệm sàng lọc .........24
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng Multiplex PCR ......................................................28
Bảng 3.4: Chu trình nhiệt chạy Multiplex PCR ........................................................28
Bảng 4.1: Kết quả phân tích hoạt tính enzyme G6PD (U/g Hb)...............................31
Bảng 4.2: Tỷ lệ giữa nam và nữ bị bệnh thiếu men G6PD .......................................31
Bảng 4.3: Các biến thể G6PD ở trẻ sơ sinh thiếu men tại bệnh viện ........................32
Bảng 4.4: Kiểu gen của 2 đột biến Canton ở 2 bé gái thiếu men G6PD. ..................39
Bảng 4.5: Tỷ lệ thiếu men và các biến thể G6PD ở Việt Nam so với một số nƣớc
nhƣ Myanmar, Campuchia, Malaysia, Trung Quốc và Thái Lan. ............................45


iii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Bé sơ sinh đang đƣợc lấy máu làm xét nghiệm SLSS ................................3
Hình 2.2: Cấu trúc enzyme Glucose-6-phosphate dehydrogenase .............................5
Hình 2.3: Bé sơ sinh đang đƣợc chiếu đèn..................................................................5
Hình 2.4: Bản đồ tỷ lệ phân bố bệnh thiếu men G6PD ở nam giới ........................... 6
Hình 2.5: G6PD xúc tác NAPD+ thành NAPDH trong con đƣờng
pentose phosphate. ..................................................................................................... 7
Hình 2.6: Vị trí gen G6PD trên NST giới tính X ....................................................... 7
Hình 2.7: Bản đồ vị trí phân bố 13 exons của gen G6PD .......................................... 7
Hình 2.8: Một số thực phẩm cần tránh đối với bệnh nhân thiếu men G6PD ........... 10
Hình 2.9: Quy trình chẩn đốn bệnh thiếu men G6PD ............................................ 11
Hình 2.10: Sơ đồ di truyền bệnh thiếu men G6PD .................................................. 12
Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng qt ..................................................................... 20
Hình 3.2: Q trình lấy máu gót chân ở trẻ sơ sinh ................................................. 21
Hình 3.3: Mẫu máu khơ của bệnh nhân ................................................................... 22

Hình 3.4: Các đột biến G6PD phổ biến ở Đơng Nam Á đƣợc phân tích ................. 30
Hình 4.1: Điện di sản phẩm PCR để xác định các dạng biến thể G6PD. ................ 33
Hình 4.2: Hình điện di của 5 dạng biến thể G6PD đƣợc phân tích.......................... 33
Hình 4.3: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 6 của một bé trai
(BG6_150103) có đột biến G6PD Mahidol ............................................................. 34
Hình 4.4: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé trai
(BG6_160303) có đột biến G6PD Kaiping .............................................................. 35
Hình 4.5: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé trai
(BG6_160202) có đột biến G6PD Canton. .............................................................. 36
Hình 4.6: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé gái
(BG6_150201) có đột biến G6PD Canton. .............................................................. 37
Hình 4.7: Kết quả giải trình tự một đoạn DNA trên exon 12 của một bé gái
(BG6_150303) có đột biến G6PD Canton. .............................................................. 38


1

Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Thiếu men G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) là một bệnh lý di truyền
lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X [4, 29, 32]. Trên thế giới hiện nay có
khoảng 400 triệu ngƣời mắc phải với tần suất mắc bệnh từ 0,1%-30%. Tại Việt
Nam, tỷ lệ mắc bệnh là khoảng 0,5%-31% và có thể cao hơn ở các nhóm dân tộc
thiểu số miền núi phía Bắc [3, 12, 19, 21]. Ngƣời bị thiếu men G6PD sẽ có hiện
tƣợng tán huyết khi ăn đậu tằm hoặc sử dụng một số sản phẩm, dƣợc phẩm chứa các
chất có tính oxy hóa mạnh [4, 38, 42]. Thiếu máu do tán huyết gây vàng da sơ sinh
kéo dài, nếu nặng hơn có thể gây ra những biến chứng ở thần kinh, chậm phát triển
tâm thần, vận động là các vấn đề lớn gặp phải khi trẻ bị thiếu men G6PD. Tuy
nhiên, ngƣời bệnh cũng có thể hồn tồn khơng có biểu hiện gì về mặt lâm sàng (thể
nhẹ) và bệnh thiếu men G6PD này hiếm khi dẫn đến tử vong [38, 42, 43].

Các nghiên cứu cho thấy, căn nguyên gây bệnh thiếu men là do các đột biến trên
gen G6PD, tuy nhiên, không phải bất kỳ biến đổi trên gen nào cũng gây bệnh. Hiện
nay, các kỹ thuật sinh học phân tử, trong đó có Multiplex PCR và giải trình tự gen
có khả năng phát hiện các đột biến cao giúp chẩn đoán bệnh đạt hiệu quả hơn so với
các phƣơng pháp khác.
Có nhiều dạng đột biến gen G6PD khác nhau và tùy từng loại biến thể mà gây ra
các mức độ thiếu men và biểu hiện bệnh lý khác nhau [4]. Do đó, đề tài “Xác định
một số biến thể G6PD ở trẻ sơ sinh tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn bằng
phương pháp Multiplex PCR và giải trình tự gen” đƣợc thực hiện. Hiểu rõ cơ chế
phân tử của bệnh tật để phòng ngừa, tiên lƣợng và điều trị hiệu quả luôn là mơ ƣớc
của giới y khoa để từng bƣớc tiến tới cá nhân hóa trong điều trị bệnh. Đối với trẻ bị
thiếu men G6PD nếu đƣợc phát hiện sớm và kết hợp với việc phòng tránh những
thức ăn và các tác nhân gây tán huyết thì trẻ hồn tồn có một cuộc sống khỏe mạnh
bình thƣờng [1, 41, 42].


2

1.2. Mục tiêu
Tỷ lệ thiếu men G6PD ở trẻ sơ sinh tại Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn.
Tần suất xuất hiện các biến thể G6PD ở trẻ sơ sinh mắc bệnh.
Là cơ sở để tƣ vấn tình trạng bệnh lý và di truyền cho cha mẹ của trẻ sơ sinh mắc
bệnh thiếu men G6PD.


3

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh
2.1.1. Khái niệm sàng lọc sơ sinh

SLSS là chƣơng trình thực hiện xét nghiệm thƣờng qui cho tất cả trẻ sơ sinh
nhằm phát hiện sớm các bệnh lý nội tiết và chuyển hóa ảnh hƣởng đến sự phát triển
thể chất và tâm thần của trẻ [1]. Các bệnh lý này thƣờng rất khó phát hiện trên lâm
sàng khi trẻ mới sanh, do đó cần phải thực hiện xét nghiệm sàng lọc để phát hiện.
Nếu đƣợc phát hiện sớm và điều trị ngay trong vài tuần đầu sau sanh thì bé có thể
phục hồi và phát triển bình thƣờng [1, 41, 42].
2.1.2. Mục đích
Chƣơng trình SLSS nhằm phát hiện, chẩn đoán và điều trị sớm các bệnh lý đƣợc
sàng lọc giúp các bé bị bệnh phát triển khỏe mạnh bình thƣờng, nâng cao chất lƣợng
dân số Việt Nam [41].
2.1.3. Quy trình xét nghiệm
Các bé sơ sinh sau 48 giờ tuổi sẽ đƣợc lấy 3 giọt máu ở gót chân nhỏ lên giấy
thấm máu chuyên dụng, để khô và thực hiện xét nghiệm. Thời gian tốt nhất để lấy
máu làm xét nghiệm SLSS cho bé là từ 48-72 giờ sau sanh. Kết quả xét nghiệm
sàng lọc sẽ có sau 2-3 ngày làm việc. Những trƣờng hợp bé mắc bệnh, cha mẹ bé sẽ
đƣợc mời đến bệnh viện tham vấn để biết rõ tình trạng bệnh lý và các bƣớc tiếp theo
để chẩn đốn, điều trị hoặc phịng ngừa.

Hình 2.1: Bé sơ sinh đang đƣợc lấy máu làm xét nghiệm SLSS.
(Bệnh viện phụ sản Quốc Tế Sài Gòn)


4

2.1.4. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới và ở Việt Nam
2.1.4.1. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh trên thế giới
Chƣơng trình SLSS bắt đầu từ năm 1960 tại Mỹ do bác sĩ Robert Guthrie và
nhóm bác sĩ nhi – sản khoa khởi xƣớng, sau đó nhanh chóng lan rộng qua châu Âu,
châu Úc, Nhật Bản và thực sự mang lại những hiệu quả đáng kể. Ở châu Âu, từ năm
1970, SLSS trở thành chƣơng trình quốc gia để phát hiện 6-8 bệnh lý rối loạn

chuyển hóa và di truyền. Đến nay có nƣớc đã thực hiện SLSS hơn 50 loại bệnh lý.
Ở châu Á, nƣớc đầu tiên là Nhật Bản thực hiện chƣơng trình SLSS từ năm 1965,
đến nay gần nhƣ 100% trẻ sơ sinh đƣợc SLSS 5 loại bệnh lý bẩm sinh. Đài Loan
đến nay đã thực hiện SLSS đƣợc 11 loại bệnh lý. Chƣơng trình SLSS đã nhanh
chóng trở thành chƣơng trình quốc gia ở hầu hết các nƣớc châu Á và trên thế giới vì
lợi ích thiết thực của nó. Từ những số liệu thống kê kết quả triển khai SLSS ở các
nƣớc tiên phong này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã ghi nhận ý nghĩa tuyệt vời
của SLSS và kêu gọi triển khai thành chƣơng trình quốc tế: “SLSS nên được trở
thành một chương trình bắt buộc vì việc chẩn đốn sớm và điều trị mang lại những
lợi ích to lớn cho trẻ sơ sinh”. Hƣởng ứng lời kêu gọi đó, phần lớn các quốc gia trên
thế giới đã triển khai SLSS nhƣ một chƣơng trình quốc gia. Số bệnh đƣợc sàng lọc
từ 2-5 bệnh ở các nƣớc Đông Nam Á và lên tới trên 50 bệnh ở các nƣớc phát triển.
2.1.4.2. Chƣơng trình sàng lọc sơ sinh ở Việt Nam
Do điều kiện kinh tế và xã hội nên chƣơng trình SLSS ở nƣớc ta phát triển chậm
hơn các nƣớc tiên tiến trên thế giới. Đến thời điểm hiện nay, nƣớc ta đã thực hiện
đƣợc xét nghiệm sàng lọc 3 loại bệnh lý có tỷ lệ cao là bệnh thiếu men G6PD, suy
giáp bẩm sinh và tăng sản tuyến thƣợng thận bẩm sinh [41].
2.2. Bệnh thiếu men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)
2.2.1. Khái niệm
G6PD có mã số E.C.1.1.1.49 là enzyme xúc tác nội bào, có tính khơng đồng nhất
và đa dạng phân tử, đƣợc cấu tạo bởi nhiều monomer với cấu trúc bậc bốn rất phức
tạp [30]. G6PD xúc tác trong con đƣờng chuyển hố pentose phosphate, tạo ra
NADPH có vai trị trong chống oxy hóa ở hồng cầu [3, 4, 33].
Bệnh thiếu men G6PD là một bệnh lý di truyền liên kết với NST giới tính X [4,
29, 32]. Bệnh phát sinh do đột biến gen G6PD trên cánh dài vùng 2 băng 8 của
nhiễm sắc thể X tại vị trí Xq28, vì vậy tần số mắc bệnh này ở nam giới thƣờng cao


5

hơn nữ giới [4, 33, 38, 42]. Gen G6PD là gen có chức năng mã hóa enzyme G6PD
giữ cho màng tế bào hồng cầu ổn định khi tiếp xúc với tác nhân oxy hóa. Đột biến
trên gen này làm cho cơ thể không sản xuất đủ hoặc làm giảm hoạt tính enzyme
G6PD thấp hơn so với ngƣời bình thƣờng, dẫn đến tế bào hồng cầu bị phá hủy, kéo
theo đó là triệu chứng thiếu máu tán huyết và vàng da bệnh lý. Ngƣời mắc bệnh
thiếu men G6PD thƣờng khơng có các biểu hiện nhƣ thiếu máu tán huyết hay vàng
da cho đến khi tiếp xúc với tác nhân oxy hóa đƣợc hấp thu từ một số loại thuốc,
thực phẩm, hoặc tác nhân bệnh truyền nhiễm và hiếm khi dẫn đến tử vong [4, 42].

Hình 2.2: Cấu trúc enzyme Glucose-6-phosphate dehydrogenase.

Hình 2.3: Bé sơ sinh đang đƣợc chiếu đèn.


6

2.2.2. Dịch tễ học
Thiếu men G6PD xảy ra với tần suất tăng ở những chủng tộc châu Phi, Nam châu
Á, vùng Địa Trung Hải và Trung Đông. Ngƣợc lại, bệnh ít gặp ở một số dân tộc nhƣ
Bắc Âu, Mỹ da đỏ, Nhật Bản, Exkimô [42]. Tần suất mắc bệnh có liên quan đến sự
phân bố của bệnh sốt rét [33, 43]. Giả thiết cho rằng những ngƣời thiếu men G6PD
có sự bảo vệ một phần trƣớc sự tấn cơng của ký sinh trùng sốt rét. Một số những
trƣờng hợp đột biến gen rải rác có thể xảy ra ở tất cả mọi ngƣời.

Hình 2.4: Bản đồ tỷ lệ phân bố bệnh thiếu men G6PD ở nam giới.
2.2.3. Cơ chế gây bệnh
Về mặt sinh học, enzyme G6PD giữ cho màng tế bào hồng cầu ổn định khi cơ thể
tiếp xúc với tác nhân oxy hóa và giảm khi hồng cầu già. Cấu trúc enzyme G6PD
gồm 515 acid amin, trọng lƣợng phân tử 59.257 dalton [32, 38]. G6PD xúc tác
nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+) thành dạng NADPH trong

con đƣờng chuyển hóa pentose phosphate và NADPH bảo vệ tế bào chống lại
những xâm hại do các tác nhân oxy hóa [32, 33]. Vì hồng cầu khơng tạo ra đƣợc
NADPH bằng bất cứ con đƣờng nào khác nên chúng dễ bị phá hủy hơn những tế
bào khác khi bị tình trạng oxy hóa [43]. Sự thiếu men G6PD ở mức độ khác nhau
đƣợc phân vào những mức độ lâm sàng nặng nhẹ tƣơng ứng khác nhau (Bảng 2.2).


7

Hình 2.5: G6PD xúc tác NAPD+ thành NAPDH trong con đƣờng pentose phosphate.

Về mặt cấu trúc di truyền, gen G6PD nằm trên cánh dài NST X (Xq28), từ cặp
base thứ 154.531.390 đến 154.547.586, gen có 13 exons, dài khoảng 16 kb [37].
Bệnh G6PD do di truyền theo định luật Mendel hay bất thƣờng gen trên NST giới
tính X [43]. Sự đột biến ảnh hƣởng đến sự mã hóa enzyme G6PD trên nhánh xa của
NST X. Khi xảy ra đột biến trên gen G6PD sẽ dẫn tới không tổng hợp đƣợc hoặc
làm giảm quá trình tổng hợp enzyme, hoặc sai hỏng trên gen gây sai hỏng chức
năng enzyme, hậu quả là tích tụ các chất oxy hóa trong tế bào và hồng cầu, gây phá
hủy hồng cầu, làm cho cơ thể bị thiếu máu [4, 33, 43].

Hình 2.6: Vị trí gen G6PD trên NST giới tính X.

Hình 2.7: Bản đồ vị trí phân bố 13 exons của gen G6PD.
(Nguyễn Thị Huệ và cộng sự, 2013, Common mutations in G6PD of Vietnamese-Kinh
deficient patients)


8

Các nghiên cứu cho thấy, hiện nay có trên 400 vị trí đột biến đã đƣợc xác định

trên gen G6PD [43] (Phần phụ lục 4 trang 62 – Bảng một số loại đột biến được
nghiên cứu trên gen G6PD). Ở nƣớc ta đã xác định có hơn 140 vị trí đột biến trên
gen G6PD [42]. Tuy nhiên, với điều kiện kinh tế cịn khó khăn nên hiện nay chỉ có
thể phân tích trên 8 vị trí đột biến gen phổ biến nhất ở Đông Nam Á.
Bảng 2.1: Các biến thể G6PD phổ biến đƣợc phân tích.
Vị trí đột biến

Thay đổi acid amin

Exon

Mahidol

487 G A

163 Gly Ser

6

Mediterranean

563 C T

188 Ser Phe

6

Coimbra

592 C T

192 Arg Cys

6

Union

1360 C T

454 Arg Cys

11

Canton

1376 G T

459 Arg Leu

12

Kaiping

1388 G A

463 Arg His

12

Vanua Lava

383 T C

128 Leu Pro

5

Viangchan

871 G A

291 Val Met

9

Tên biến thể

Phân nhóm

II

III

2.2.4. Phân loại
Theo WHO, bệnh thiếu men G6PD đƣợc chia làm 5 nhóm (lớp) chính dựa theo
sự hoạt động của enzyme G6PD so với bình thƣờng trong tế bào hồng cầu (Bảng
2.2), có biểu hiện lâm sàng nhƣ sau:
Nhóm I: mức độ bệnh nghiêm trọng (hoạt tính enzyme <1%) kết hợp với thiếu
máu tán huyết mãn tính. Nhóm I hiếm gặp trên thế giới và bao gồm hai loại đột biến
là G6PD Buenos Aires và G6PD Durham.

Nhóm II: mức độ bệnh nghiêm trọng, hoạt tính enzyme ít hơn 10% so với bình
thƣờng, kết hợp với thiếu máu tán huyết cấp tính. Bệnh thiếu men G6PD thuộc
nhóm này gặp ở khắp mọi nơi trên thế giới và phổ biến ở các quần thể châu Á và
Địa Trung Hải. Một số đột biến thuộc nhóm II bao gồm G6PD Mediterranean,
G6PD Cassano, G6PD Santamaria.
Nhóm III: mức độ bệnh trung bình, hoạt tính enzyme từ 10-60% so với bình
thƣờng, chỉ xảy ra thiếu máu tán huyết khi tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa. Bệnh


9

thiếu men G6PD thuộc nhóm này thƣờng gặp ở những khu vực bị bệnh sốt rét, bao
gồm một số đột biến nhƣ G6PD AG6PD Seattle, G6PD Rignano.
Nhóm IV: mức độ bệnh nhẹ, hoạt tính của enzyme từ 60-90% so với bình
thƣờng, bệnh hiếm gặp trên thế giới. Một số các đột biến thuộc nhóm IV bao gồm
G6PD Mantalbano, G6PD Orissa.
Nhóm V: khơng tán huyết, hoạt tính của enzyme lớn hơn 110% so với bình
thƣờng, bệnh hiếm gặp. Về loại đột biến hiện nay còn chƣa đƣợc báo cáo.
Bảng 2.2: Phân nhóm bệnh thiếu men G6PD theo WHO.
Enzyme dạng kích hoạt

Nhóm

Mức độ

I

Nặng

< 1%

II

Nặng

< 10%

III

Trung bình

10-60%

IV

Nhẹ

60-90%

Hiếm gặp

V

Khơng tán huyết

> 110%

Hiếm gặp

(so với bình thƣờng)

Tần suất

Hiếm gặp
Thƣờng xảy ra ở khắp
mọi nơi
Thƣờng gặp ở những khu
vực bị bệnh sốt rét

2.2.5. Triệu chứng lâm sàng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh thiếu men G6PD đƣợc chia ra thành 3 loại bao gồm
vàng da sơ sinh, thiếu máu do tán huyết cấp tính và thiếu máu do tán huyết mãn tính
[38, 42, 43]. Ở những trẻ bị bệnh thiếu men G6PD bẩm sinh, nguy cơ biểu hiện
vàng da sơ sinh lớn hơn nhiều so với những đứa trẻ bình thƣờng. Tần suất vàng da
sơ sinh gấp hai lần ở những trẻ nam và trẻ nữ thể đồng hợp tử có thiếu men G6PD.
Hiếm khi xảy ra ở trẻ nữ thể dị hợp tử. Enzyme G6PD rất cần thiết để xúc tác cho
phản ứng sinh hóa trong tế bào hồng cầu giúp cho màng tế bào bền vững. Nếu cơ
thể thiếu enzyme này, màng tế bào hồng cầu sẽ kém bền, dễ bị vỡ và dẫn đến hiện
tƣợng tán huyết. Nếu tán huyết kéo dài sẽ đƣa đến thiếu máu. Mặt khác nó cịn gây
tăng hàm lƣợng bilirubin trong máu ở trẻ sơ sinh. Tình trạng tăng bilirubin trong
máu có lẽ xảy ra do sụt giảm bilirubin kết hợp và khả năng thanh lọc của gan làm
tăng bilirubin gián tiếp [42]. Vàng da sơ sinh trong thiếu men G6PD xảy ra trong
vịng 24 giờ đầu, có tiền sử anh chị vàng da trƣớc đó, bilirubin tăng cao có thể gây


10

vàng da nhân. Do đó, khi trẻ sơ sinh vàng da cần theo dõi sát và điều trị chiếu đèn
hay truyền máu sớm để tránh gây vàng da nhân.
Ngƣời thiếu men G6PD có thể có triệu chứng thiếu máu tán huyết cấp tính là do

nhiễm trùng, ăn đậu tằm hay sử dụng thuốc có chất oxy hóa [42, 44]. Những bệnh
nhiễm trùng thƣờng gặp mà gây ra tình trạng tán huyết bao gồm viêm gan A và B,
cytomegalovirus, viêm phổi và sốt thƣơng hàn [42]. Trƣờng hợp ngƣời thiếu men
G6PD tiếp xúc với thuốc có chất oxy hóa mạnh thì hồng cầu sẽ bị hƣ hại và cuối
cùng là bị phá hủy. Sau thời gian từ vài giờ đến 2-3 ngày, q trình tán huyết bắt
đầu, bệnh nhân có biểu hiện vàng da và nƣớc tiểu đậm màu (màu xá xị) do
haemoglobin niệu. Trƣờng hợp tán huyết cấp tính điển hình xảy ra vào khoảng 2472 giờ sau khi tiếp xúc và giảm dần trong vòng 4-7 ngày. Nếu chức năng gan bình
thƣờng thì vàng da sẽ khơng xảy ra cho tới khi 50% số hồng cầu bị phá hủy.
Thiếu máu do tán huyết mãn tính ở ngƣời thiếu men G6PD ở mức độ nghiêm
trọng chỉ chiếm một số rất ít các trƣờng hợp [42]. Hiện tƣợng tán huyết này xảy ra
trong sự chuyển hóa hồng cầu bình thƣờng và mức độ thay đổi có thể nhẹ hay nặng.

1

2

3

4

Hình 2.8: Một số thực thẩm cần tránh đối với bệnh nhân thiếu men G6PD.
(1- Đậu Fava, 2- Rƣợu vang đỏ, 3- Dâu blueberries, 4- Đậu nành.)


11

2.2.6. Quy trình chẩn đốn
Trẻ sơ sinh sau sanh
từ 48-72 giờ

Lấy mẫu máu gót chân
lên giấy thấm
Dƣới ngƣỡng bình thƣờng lần 1
Trên ngƣỡng bình thƣờng

Xét nghiệm sàng lọc
thiếu men G6PD

Dƣới ngƣỡng bình thƣờng lần 2

Kết quả bình thƣờng

Thu thập mẫu tế bào
niêm mạc miệng

Tìm đột biến gen

Kết quả phân tích đột biến

Tƣ vấn kết quả

Hình 2.9: Quy trình chẩn đốn bệnh thiếu men G6PD tại Bệnh viện PSQTSG.
2.2.7. Phƣơng pháp phòng tránh và điều trị
Đây là bệnh di truyền do đột biến gen và hiện nay việc can thiệp vào gen để điều
trị cịn hạn chế, do đó chƣa có phƣơng pháp chữa khỏi hoàn toàn bệnh thiếu men
G6PD [42, 44]. Ngƣời bị thiếu men G6PD sẽ có cuộc sống hồn tồn bình thƣờng
nếu đƣợc phát hiện sớm và thực hiện phịng tránh với các tác nhân oxy hóa mạnh.
Có thể nói, phƣơng pháp điều trị chính đối với bệnh thiếu men G6PD là tránh
những tác nhân gây ra oxy hóa [4, 38, 42]. (tham khảo chi tiết ở Phụ lục 5 trang 66
– Danh sách thuốc và thực phẩm cần tránh khi thiếu men G6PD)