Thực hành vi sinh vật thực phẩm lê nhã uyên, nguyễn thị thanh hải

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
Viện Công nghệ sinh học và Môi trường

……………..

Th.S LêNhãUyên
Th.S Nguyễn Thị Thanh Hải

Tài liệu

THỰC HÀNH VI SINH VẬT THỰC PHẨM
(Lưu hành nội bộ)

Nha Trang, 2019
1


MỤC LỤC
PHẦN 1: CÁC KỸ THUẬT VI SINH CƠ BẢN .......................................................................... 3
Bài 1: AN TỒN PHỊNG THÍNGHIỆM .................................................................................. 3
Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT .................................................... 5
Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT.................... 12
Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT .................................................................. 18
Bài 5: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU.......................................................... 25
PHẦN 2: CÁC NHÓM VI SINH VẬT CẦN KIỂM TRA TRONG MẪU THỰC PHẨM…26
Bài 6: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ (TPC – Total Plate count) ................................... 27
Bài 7: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COLIFORM, FECAL COLIFORM VÀ ESCHERICHIA
COLI .............................................................................................................................................. 29
Bài 8: KIỂM TRA SALMONELLA TRONG MẪU THỰC PHẨM.........................................32
Bài 9: KIỂM TRA VIBRIO TRONG MẪU THỰC PHẨM ..................................................... 35
Bài 10: KIỂM TRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM ...................... 38

Bài 11: KIỂM TRA LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM .................... 40
Bài 12: KIỂM TRA CLOSTRIDIUM sp. TRONG THỰC PHẨM…………………………..42
PHẦN 3: MỘT SỐ TEST SINH HOÁ QUAN TRỌNG……………………………………...43
PHẦN 4: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP .......................................................... 54
PHỤ LỤC ...................................................................................................................................... 55

2


PHẦN 1: CÁC KỸ THUẬT VI SINH CƠ BẢN
Bài 1: AN TỒN PHỊNG THÍNGHIỆM
1.1. Quy tắc làm việc trong phịng thínghiệm vi sinh
1.1.1. Nội quy phịng thínghiệm
(1) Tham dự đầy đủ các bài thínghiệm theo chương trình quy định. Trước khi đến phịng
thínghiệm, sinh viên cần chuẩn bị đầy đủ nội dung lýthuyết bài thínghiệm sắp làm.
(2) Tuân thủ đúng thời khóa biểu thực hành đã được sắp xếp
(3) Phải mặc áo bảo hộ (blouse) khi làm việc trong phòng thínghiệm. Tóc phải được cột,
bọc gọn tránh nhiễm vi sinh vàsém cháy do lửa đèn cồn
(4) Không ăn uống, hút thuốc trong phịng thínghiệm. Khơng đưa tay lên sờ miệng
(5) Khơng được đem canh cấy vi sinh, hốchất, dụng cụ ra khỏi phịng thínghiệm trừ khi
được phép của giáo viên hướng dẫn.
(6) Cần cóýthức tiết kiệm mơi trường, hóa chất, vật liệu khi thực hiện thínghiệm.
(7) Khi làm việc với các trang thiết bị, dụng cụ cần cẩn thận, nhất là đối với kính hiển vi.
Khi chưa biết cách vận hành, sinh viên phải hỏi giáo viên hướng dẫn hoặc người phụ
trách.
(8) Khi thực hiện các bài thínghiệm vi sinh, sinh viên cần tuân thủ đúng các kĩ thuật vô
trùng vàkhử trùng để tránh lây nhiễm vi sinh vật.
(9) Khi thực hiện thínghiệm, sinh viên làm việc theo nhóm, sau đó phân tích kết quả thí
nghiệm.
(10) Dọn dẹp, lau chùi sau khi làm việc. Các trang thiết bị, dụng cụ, hoáchất sau khi

dùng xong phải để đúng nơi quy định
(11) Nhóm trực nhật cótrách nhiệm kiểm tra các vịi nước, kiểm tra tình hình sử dụng
điện của các trang thiết bị, tắt điện, tắt quạt trước khi ra về.

MỘT SỐ LƯU Ý VỚI SINH VIÊN NHẰM ĐẠT KẾT QUẢ TỐT TRONG
THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC.
Trước khi làm thínghiệm:
- Cần tìm hiểu mục đích, u cầu vànội dung bài thực hành.
- Nắm vững lýthuyết liên quan đến các thínghiệm.
- Đọc cẩn thận các bước tiến hành thínghiệm và cách đọc kết quả.
Trong quátrình thực hành:
- Cần thực hiện đúng các thao tác và các bước của thínghiệm để đạt được mục đích
vàyêu cầu đã đề ra.
Sau mỗi bài thực hành:
- Phải làm đầy đủ các bài tường trì
nh, trả lời các câu hỏi vàbài tập ở phần cuối bài.
1.1.2. Kĩ thuật vôtrùng, khử trùng:
Một số thuật ngữ cần phân biệt:
Vô trùng là1 quátrình màtất cả các vi sinh vật sống bị pháhuỷ. Các vi sinh vật này bị
giết bởi hơi nóng áp lực hay ở nhiệt độ cao trong điều kiện khơ, hay đốt thành tro. Nếu chúng
ta nói một vật vơ trùng, chúng ta hiểu rằng vật đó hồn tồn khơng có các vi sinh vật sống.
Nói chung khi nói đến sự vơ trùng, ý nói đến sự an tồn phịng thínghiệm, chủ yếu chúng ta
3


nói đến vơ trùng bởi hơi nóng áp lực bằng autoclave. Phương pháp khử trùng cơ bản là đốt
cháy các tác nhân khử trùng hoặc đốt thành tro. Tất cả các chất thải sinh học phải được đốt
cháy kỹ trước khi thải bỏ.
Khử trùng là q trình trong đó các sinh vật không sinh bào tử, sinh dưỡng bị pháhuỷ.
Các tác nhân gây được quátrình này gọi làchất khử trùng hay chất giết khuẩn. Các tác nhân

như vậy chỉ được sử dụng cho các vật dụng do chúng độc với mô người và động vật.
Nhiễm trùng được xác định khi cósự phát triển (nhân lên) của các vi sinh vật trong mô
của cơ thể. Thuật ngữ vô trùng dùng để chỉ bất cứ quá trình nào mà ngăn cản sự xâm nhập
của các tác nhân nhiễm trùng vào mô vô trùng, do vậy ngăn ngừa sự nhiễm trùng. Các kỹ
thuật vô trùng chỉ những thao tác màcác nhàvi sinh vật học dùng để loại tất cả các vi sinh
vật khỏi môi trường nhiễm hay mô sống tiếp xúc. Các chất kháng khuẩn làcác hố chất
(thường làcác chất khử khuẩn hồtan) cóthể sử dụng an tồn cho bên ngồi cơ thể nhằm phá
huỷ hay ức chế các vi khuẩn sinh dưỡng.
Khi thực hiện các bài thínghiệm vi sinh, sinh viên cần tuân thủ các thao tác thực hiện đúng
kỹ thuật để khơng gây tạp nhiễm ảnh hưởng đến thínghiệm hay khơng gây phân tán vi sinh vật ra
môi truờng xung quanh. Các kĩ thuật đó bao gồm kĩ thuật vơ trùng đối với dụng cụ thínghiệm,
mơi trường ni cấy vi sinh vật; tuân thủ kĩ thuật khử trùng đồi với tay người nghiên cứu, bàn
làm việc để tránh gây nhiễm trùng Việc này liên quan đến thực hiện các kỹ thuật vơ trùng, khử
trùng vàthực hành phương tiện an tồn phịng thínghiệm.
Khi bắt đầu làm vệc với các canh cấy vi khuẩn trong các bài thực hành, sinh viên phải học
các kỹ thuật. Một số điều cơ bản chúng ta phải tuân theo:
- Rửa tay
Trước khi bắt đầu làm việc, người làm phải rửa tay, sau đó sử dụng các dung dịch sát
khuẩn vàlau khô bằng giấy lau. Kết thúc công việc, trước khi rời phịng thínghiệm, chúng ta
phải rửa tay bằng xàphòng.
- Khử trùng mặt bàn làm việc
Bắt đầu buổi làm việc, người làm phải lau bàn bằng chất diệt khuẩn nhằm loại bụi bẩn
trên mặt bàn, làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn vào canh cấy. Kết thúc công việc, trước khi
rời phịng thínghiệm, cần khử trùng lại để bảo vệ cho nhóm thực tập tiếp theo.
- Sử dụng đèn cồn (đèn gas)
Trong phịng thínghiệm vi sinh đèn cồn được sử dụng để khử trùng vòng cấy của que cấy,
miệng bình, miệng ống nghiệm. Để khử trùng vịng cấy cần đốt cho đến khi nóng đỏ sau đó để
cho vòng cấy nguội bằng cách giữ vòng cấy một thời gian ở vùng vôtrùng xung quanh ngọn lửa.
Cần lưu ý, để an tồn khi sử dụng đèn cồn, khơng di chuyển đèn cồn đang cháy, không
chụm hai đèn cồn với nhau để châm lửa, không dùng miệng thổi tắt đèn cồn, muốn tắt thìphải

dùng nắp chụp đậy lại.
- Pipette.
Pipette dùng để chuyển canh cấy phải sử dụng thiết bị hút cơ học, không sử dụng miệng
để hút.
1.1.3. Xử lýcanh cấy vi sinh vật
Thải bỏ canh cấy
Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật trước khi thải bỏ phải được hấp khử trùng (autoclave) ở
1210C / 15 phút để giết chết vi sinh vật.
Xử lý khi làm đổ canh cấy
4


Tất cả các trường hợp sự cố làm đổ canh cấy vi sinh vật phải báo cáo ngay với giáo viên
hướng dẫn. Mặc dù đa số các vi sinh vật sử dụng trong các bài thực hành làkhông gây bệnh,
nhưng có một số ít gây bệnh. Do vậy, chúng ta phải xử lýtất cả các trường hợp sự cố làm đổ dịch
cấy, phịng khi có liên quan đến vi sinh vật gây bệnh. Biện pháp xử lý:
+ Tất cả áo bảo hộ, vải lau dính dịch cấy phải được đem autoclave.
+ Dùng giấy, vải thấm dịch sát khuẩn đặt vào vùng canh cấy đổ.
+ Đổ thuốc sát khuẩn quanh nơi có canh cấy vi sinh, để hạn chế lây lan ra xung
quanh vàkhơng khí.
+ Dùng kẹp (loại cóthể hấp tiệt trùng được) gắp giấy, vải lau bỏ vào dụng cụ chứa
đựng đem autoclave (autoclave cả kẹp gắp)
(Tương tự, đối với hốchất gây nguy hiểm đến người như gây kích ứng cơ thể, gây tổn
thương da hay gây ung thư ... phải báo cáo ngay với giáo viên hướng dẫn để cóbiện pháp xử lý
thích hợp)
1.2. Sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phịng thínghiệm vi sinh
- Thiết bị dập mẫu
- Tủ sấy dụng cụ
- Nồi hấp vôtrùng
- Tủ ủ ấm vi sinh

- Cân phân tích
- Tủ lạnh
- Kính hiển vi
- Máy lắc các loại

Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT
2.1. Dụng cụ, mơi trường, hóa chất
2.1.1. Dụng cụ:
- Kính hiển vi quang học
- Lame, lamen
- Bình nước rửa
- Giấy thấm
- Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt
2.1.2. Mơi trường, hóa chất:
- Nước muối sinh lý
- Thuốc nhuộm các loại: tím Violet, lugon, Xanh Methylene, Fucshine, Cồn.
- Dầu soi kính
- Ống giống vi khuẩn lactic, vi khuẩn Gram (-), nấm men, nấm mốc.
2.2. Phương pháp làm tiêu bản
2.2.1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi
.
Cách làm tiêu bản giọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.
5


Đặt lákính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh khơng tạo thành bọt khí. Muốn
vậy để một mép lákính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lákính xuống.
- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
Cách làm tiêu bản giọt treo

Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và
phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích.
- Dùng phiến kính đặc biệt cóphần lõm hình trịn ở giữa.
- Bơi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lákính.
- Thận trọng xoay ngược lákính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên phần
lõm của phiến kính.
-

Hình 1: Phương pháp làm tiêu bản giọt treo
2.2.2. Phương pháp làm tiêu bản cố định
Phương pháp vôtrùng tạo vết bôi:
- Lắc đều ống nghiệm để vi khuẩn lơ lửng trong ống, chú ý không làm ướt nút ống
nghiệm.
- Hơ đỏ đầu que cấy vàphần kim loại. Hơ nóng phần tay cầm.
- Mở nút ống nghiệm và hơ nóng miệng ống. Khơng đặt nút xuống bàn.
- Làm nguội đầu que cấy ít nhất 5 giây, lấy một vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật, tránh
chạm đầu que cấy vào thành ống nghiệm.
- Hơ nóng miệng ống nghiệm lần nữa.
- Đậy nút ống nghiệm và đặt lên giá.
- Đặt vịng cấy chứa vi khuẩn chính giữa vịng mục tiêu đã được định sẵn thành vòng tròn
trên phiến kính.
- Hơ que cấy lại trước khi chuyển vịng cấy khác từ canh cấy hoặc đặt sang chỗ khác.
Phương pháp cố định tế bào:
6


Đối với mẫu lấy từ môi trường dịch lỏng:
- Đặt 2 vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật vào chính giữa vịng trịn mục tiêu
- Tán đều vi sinh vật khắp vùng của vịng mục tiêu. Vết bơi làm khơở nhiệt độ phịng.

Đối với mẫu lấy từ mơi trường rắn: Đặt 2 vịng que cấy nước vào chính giữa vịng trịn
mục tiêu, sau đó đưa sinh khối vi sinh vật vào giữa tán đều và làm tương tự.
Đưa phiến kính qua ngọn lửa vài lần để tiêu diệt vàgắn vi khuẩn vào phiến kính.

Hình 2: Phương pháp làm tiêu bản cố định

Hình 3: Làm tiêu bản cố định từ môi trường lỏng và môi trường rắn
7


Nhuộm đơn:
- Đặt tiêu bản lên cầu thuỷ tinh (đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thuỷ tinh).
- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Xanh Methylene, để yên 1 phút.
- Rửa vết bơi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dịng nước chảy nhẹ qua
vết bơi đến khi nước chảy ra khơng cịn màu nữa.
- Dùng giấy thấm khôtiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn
- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 40) rồi chuyển sang vật kính (x 100) dùng dầu soi.

Hình 4: Phương pháp nhuộm đơn
Nhuộm Gram
Các kỹ thuật nhuộm dùng trong việc nhận diện vi khuẩn chưa biết. Nhuộm gram làmột
thínghiệm quan trọng trong PTN vi sinh vật. Mặc dùkỹ thuật này khá đơn giản, nhưng cần tiến
hành thínghiệm cẩn thận.
Chúý: (1) không làm vết bôi quádày
(2) Chú ý bước tẩy màu.
(3) Canh cấy của vi khuẩn gram dương già có khuynh hướng mất màu nhanh hơn
canh cấy non, khiến chúng xuất hiện gram âm thay vìvi khuẩn gram dương. Để cókết quả đáng
tin cậy nên sử dụng một canh cấy khoảng 16 giờ. Một điểm khác cần chúý, vài lồi Bacillus có
thử nghiệm nhuộm gram thay đối: đơi khi bắt màu gram dương, đôi khi bắt màu gram âm.
Các bước thực hiện nhuộm Gram:

1. Phủ crystal violet lên vết bơi vàgiữ trong 20 giây.
2. Sử dụng bình nước cất rửa sạch vết thuốc nhuộm trong một thời gian ngắn, làm ráo nước
thừa.
3. Phủ vết bôi với dung dịch iodine của gram vàgiữ 30 giây - 1 phút.
4. Đổ hết dung dịch iodine của gram vàgiội tràn vết bôi với ethyl alcohol 95% trong 10-20
giây. Đây là bước quyết định. Vết bôi dày sẽ cần khoảng thời gian lâu hơn vết bơi mỏng.
Sự mất màu xuất hiện khi dịng chảy từ phiến kính hịa tan thuốc nhuộm khơng cịn màu.
5. Dừng hoạt động của alcohol bằng cách rửa phiến kính với nước trong bình rửa vài phút.
6. Phủ safranin trên vết bôi vàgiữ trong 20 giây.
7. Rửa nhẹ nhàng trong vài giây, thấm khơbằng giấy thấm vàkhơng khíkhơ.
8. Kiểm tra phiến kính dưới dầu soi kính.
8


Hình 5: Phương pháp nhuộm Gram

Hình 6: Một số hình ảnh các kiểu nhuộm quan sát tế bào vi khuẩn
2.3. Kính hiển vi:
Hiện nay có rất nhiều loại kính hiển vi, một số loại được dùng phổ biến trong phòng thí
nghiệm vi sinh vật: kính hiển vi trường sáng, kính hiển vi trường tối, phản pha, vàhuỳnh quang;
trong bài này chỉ trình bày kính hiển vi trường sáng. Nếu trước đây bạn đã tìm hiểu về kính hiển
vi, thìbài này sẽ khơng cónhiều thơng tin cung cấp cho bạn; tuy nhiên nếu đây là lần đầu tiên tìm
hiểu về vi sinh vật, bạn cần đọc kỹ để sử dụng đúng kính hiển vi.

9


Trong kính hiển vi trường sáng, tia sáng đi trực tiếp từ nguồn đến mắt người màkhông bị
lệch hướng do tấm mờ nằm giữa tụ quang. Đây là loại kính được học sử dụng đầu tiên dành cho
người bắt đầu học về sinh học, thường đuợc sử dụng trong phòng thínghiệm vi sinh vật.

Tất cả các loại kính hiển vi trường sáng có cấu trúc chung, hơi khác về hệ thống cơ. Bài
tập sẽ giúp bạn hiểu rõvề loại kính hiển vi tại phịng thínghiệm.
2.3.1. Các bộ phận chính của kính hiển vi
Khung đỡ gồm chân vàthân kính
Bàn soi cóbộ phận kẹp lam kính, vít trượt điều chỉnh vị trílam kính trên bàn soi.
Hệ thống thấu kính gồm thị kính, vật kính vàtụ quang.
Ốc chỉnh kính: ốc chỉnh kính thơvàốc chỉnh kính tinh.

Hình 7: Các bộ phận chính của kính hiển vi.

2.3.2. Các thao tác chăm sóc kính hiển vi
Kính hiển vi làdụng cụ cần được chăm sóc đặc biệt để
tránh hư hỏng hệ thống quang học và cơ học. Các thao tác sử
dụng kính cần được thực hiện đúng theo chỉ dẫn sau:
Vận chuyển: Khi chuyển kính hiển vi từ vị trínày sang vị trí
khác trong phịng thínghiệm, phải đỡ dụng cụ bằng cả hai tay.
Nếu chỉ cầm 1 tay thìrất dễ va chạm vào vật dụng khác. Mỗi
lần di chuyển chỉ được phép cầm 01 kính hiển vi
Ngăn nắp: Giữ nơi soi kính ngăn nắp, cất sách vở, dụng cụ
khơng cần thiết. Vùng soi kính gọn gàng, ngăn nắp sẽ ít xảy ra
sự cố hơn.
Dây điện: Dây dẫn điện bóng đèn kính hiển vi rất dễ làm sinh
viên vấp, kéo kính hiển vi rơi xuống đất. Chú ý dây điện sao
cho mọi người đi lại trong phịng thínghiệm khơng bị vấp.

10

Hình 8: Hai tay đỡ dụng cụ một
cách chắc chắn trong khi di
chuyển kính hiển vi.

Lau chùi thấu kí
nh: Bắt đầu buổi thínghiệm kiểm tra xem các thấu kính đã sạch hay chưa. Khi
sử dụng dầu để soi kính, cuối buổi thínghiệm phải lau vật kính bằng các dụng dịch lau kính
(nước ấm xà phịng, xylene, alcohol, cũng có thể dùng acetone nhưng chú ý acetone là dung mơi
mạnh cóthể làm tan keo gắn các thấu kính). Giấy lau sử dụng loại chun dùng, khơng tạo xơ bụi
khi lau, giấy sạch khơng bám bụi vìcóthể làm trầy sướt kính. Bạn phải tuân theo sự chỉ dẫn của
Giáo viên phụ trách.
Bảo vệ chống bụi: Hầu hết các dụng cụ trong phịng thínghiệm đều cótấm che phủ nhằm bảo vệ
dụng cụ khỏi bụi. Cuối buổi làm việc, cần đậy lại để chống bụi.
2.3.3. Cách điều chỉnh kính hiển vi
Độ phóng đại: Độ phóng đại cuối cùng của ảnh soi
được bằng độ phóng đại của thị kính nhân với độ phóng đại
của vật kính.
Soi kí
nh ở vật kính có độ phóng đại thấp: thường
dùng vật kính 10x. Gồm các bước sau:
- Kẹp tiêu bản lên bàn soi đúng vị trí, chú ý mẫu
cần soi ở mặt trên.
- Bật nguồn sáng, chỉnh ở mức ánh sáng vừa phải
(chỉnh nguồn, tụ quang),
- Chỉnh mẫu soi đến vị trítrung tâm nguồn sáng.
Hình 9: Kẹp tiêu bản
- Quay vật kính có độ phóng đại cần
soi vào đúng vị trí (lưu ý chốt định
vị vào đúng vị trí)
- Hạ vật kính xuống hoặc nâng bàn
soi lên vị trínhất định tuỳ theo kính
hiển vi (vị trí này đã được định

trước khơng qgần lam kính)
- Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật
kính (hoặc nâng bàn soi) cho đến
khi ảnh xuất hiện.
- Dùng ốc tinh chỉnh để có được ảnh
rõnhất.
- Dùng ốc điều chỉnh thanh trượt bàn
Hình 10: Đường đi của ánh sáng
soi để di chuyển lam kính tìm hình
cần soi.
Soi kí
nh ở vật kính có độ phóng đại cao hơn: thường dùng vật kính 40x.
- Sau khi chỉnh ở vật kính 10x cóảnh rõ, bạn xoay vật kính 40x đến vị trícần soi.
- Chỉ dùng ốc chỉnh tinh để chỉnh cho ảnh rõ (khơng được dùng ốc thỉnh thơ)
Soi kí
nh ở vật kính dầu: vật kính 100x
- Giữa vật kính vàtiêu bản códầu soi kính (chiết suất dầu soi kính bằng chiết suất thuỷ
tinh)
- Lưu ý: Khoảng cách giữa vật kính vàtiêu bản rất nhỏ nên rất dễ bị vỡ tiêu bản do vật
kính chạm vào tiêu bản, gây hỏng vật kính.

11


Hình 11: Sơ đồ giải thích lýdo dùng dầu soi kính.
Khi sử dụng xong kính hiển vi:
1. Lấy lam kính ra khỏi bàn soi.
2. Nếu dùng vật kính dầu, lau dầu khỏi vật kính bằng giấy lau vàdung dịch lau theo quy
định của phịng thínghiệm.
3. Xoay vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất về vị trísoi kính.

4. Các bộ phận di chuyển được đưa về vị trícao nhất.
5. Điều chỉnh thanh trượt trên bàn soi về vị tríở giữa.
6. Phủ tấm chống bụi.
7. Cất vào đúng nơi quy định.

Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
3.1. Dụng cụ, mơi trường, hóa chất
- Ống nghiệm (ф16mm, ф 20mm dài 15cm), đĩa petri, pipet, bình tam giác.
- Cốc đong, bình định mức, que khuấy thủy tinh, bình cồn 700, đèn cồn, giá đỡ.
Các dụng cụ thủy tinh cần được làm sạch, dùng cây cọ ống nghiệm chùi rửa với chất tấy
rửa. Súc rửa hai lần, đầu tiên với nước vòi, cuối cùng với nước cất để giũ sạch các dấu vết của
chất tẩy rửa. Đặt dốc ngược chúng lên giá để khô. Không dùng khăn lau khô dụng cụ.
- Môi trường:
Lượng môi trường pha chế cần dùng nên xác định rõ, tránh dư thừa hoặc phải thời gian
bảo quản dài.
Đo lường một lượng nước đủ để làm mơi trường. Các thể tích mơi trường u cầu trong
một ống nghiệm như sau:
Ống mơi trường để rót vào đĩa Petri:
12 ml
Ông thạch đứng
6 ml
Ống thạch nghiêng
4 ml
Ống canh trường
5 ml
Ống canh trường lên men
5-7 ml
3.2. Cách chuẩn bị dụng cụ
3.2.1. Bao gói dụng cụ
a/ Nguyên tắc

- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch vàkhơ.
- Bao gói phải kín vàcẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vôtrùng của dụng cụ trong
lớp giấy gói vàlấy ra sử dụng dễ dàng.
b/ Phương pháp bao gói dụng cụ:
12


Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu:
- Làm nút bơng: cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet.
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ khác.
Cách làm nút bơng
- Với các ống nghiệm:
+ Lấy một ít bơng khơng thấm nước cuộn lại.
+ Dùng que tre ấn vào giữa cuộn bông.
+ Đẩy cuộn bông này gập đôi và từ từ vào miệng ống nghiệm.
u cầu:
Nút có kích thước và độ chặt vừa phải.
Đầu nút trịn, gọn, phần ngồi lớn hơn phần trong.
Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng
- Với các chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự nhưng sử dụng
lượng bông nhiều hơn
- Với các pipet: dùng một sợi dây thép nhỏ nhét một ít bơng vào đầu lớn của pipet để hạn
chế khơng khíbên ngồi khi hút vào pipet
Cách bao gói dụng cụ
Với các dụng cụ sau khi làm nút bông cần bao gói phần có nút bơng bằng giấy báo để khi
khử trùng nút bông không bị ướt và đảm bảo điều kiện vôtrùng tốt hơn. Cách làm như sau:
- Cắt các đoạn băng giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao gói.
- Quấn quanh phần đầu cónút bơng.
- Cột lại thật chặt
u cầu:

- Phần giấy bao bên ngồi phải chặt vàkín
- Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt
- Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô.
Với các dụng cụ như pipet, que trang phải dùng giấy bao kín tồn bộ. Cóthể dùng hộp nhôm để
đựng các dụng cụ trên để khử trùng.
3.2.2. Các phương pháp vô trùng dụng cụ
a/ Nguyên tắc
- Sau khi vôtrùng cần đảm bảo:
+ Sự vôtrùng tuyệt đối cho dụng cụ vàvật phẩm
+ Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật
- Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho con người
Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của VSV bị tiêu diệt dễ dàng trong khi các bào
tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó
Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:
- Tính chất mơi trường
- Số lượng tế bào
- Độ pH của vật cần khử trùng
Do vậy để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất vàkhoảng thời
gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt tồn bộ VSV vàbào tử của chúng cótrong dụng cụ cần khử
trùng.
b/ Phương pháp vô trùng dụng cụ:
* Phương pháp nhiệt khô
(1) Khử trùng bằng tủ sấy:
- Được thực hiện trong tủ sấy
- Cách tiến hành:
13


+ Đặt các dụng cụ đã được bao gói vào tủ sấy
+ Bật công tắc tủ hoạt động

+ Điều chỉnh thời gian vànhiệt độ thích hợp (1600C trong 2h hoặc 1800C trong 30
phút)
+ Tắt tủ sấy, để nguội tới 600C rồi mở tủ lấy dụng cụ ra. Tránh mở tủ lấy dụng
cụ khi nhiệt độ tủ còn cao sẽ làm dụng cụ thủy tinh dễ vỡ
+ Các dụng cụ sau khi sấy màgiấy bao có màu hơi vàng là đạt yêu cầu. Nếu giấy
bao cómàu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm bông vàgiấy biến thành gondron (hợp chất
cótính sát trùng) thìkhơng thể sử dụng dụng này để nuôi cấy VSV được.
(2) Khử trùng bằng cách đốt que lửa nóng đỏ:
- Phương pháp này dùng để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam
giác sau khi lấy nút bông ra.
- Cách khử trùng:
+ Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại đến 3 – 4 lần. Với các dây
mayxo ở đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy.
+ Đợi dụng cụ nguội mới được sử dụng để tránh vỡ vàvi khuẩn không bị tiêu diệt
khi lấy giống.
* Khử trùng bằng sức nóng ướt
(1) Đun cách thủy ở nhiệt độ thấp (phương pháp khử trùng Pasteur)
Phương pháp này thường được dùng để khử trùng nhanh các thực phẩm dễ biến tính ở
nhiệt độ cao. Phương pháp này chỉ cótác dụng ức chế VSV khơng cóbào tử.
Cách tiến hành: Đun nóng mơi trường lên 65 – 700C trong 15 – 30 phút
(2) Hấp cách quãng 1000C (phương pháp Tyndal)
Phương pháp này dùng để khử trùng một số loại mơi trường ni cấy men bánh mì, men
gia súc, mốc làm nước chấm....chứa nhiều đường. Kết quả: môi trường vừa được khử trùng vừa
được đảm bảo không thay đổi chất lượng.
Cách khử trùng:
- Hấp ở 1000C trong 30 phút.
- Lấy ra để tủ ấm 24 giờ để cho bào tử vi khuẩn phát triển
- Hấp môi trường lần thứ hai ở 1000C trong 30 phút tiêu diệt các bào tử vừa nẩy mầm.
- Lặp lại quátrình này 3 lần
(3) Khử trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất cao (Autoclave)

Phương pháp này được thực hiện trong nồi hấp vôtrùng ở áp suất cao. Đó là thiết bị làm
bằng kim loại cótính chịu nhiệt cao cókhả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ vàthời gian
Nguyên tắc hoạt động của thiết bị làlàm tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước dưới áp
suất lớn hơn áp suất khíquyển. Khi áp suất tăng, nhiệt độ trong nồi cũng tăng, an tồn thiết bị
được kiểm sốt hệ thống van rất chặt chẽ.
Phương pháp khử trùng bằng hơi nước bão hòa ở áp suất cao là phương pháp phổ biến và
hiệu quả nhất trong các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và
bào tử của vi sinh vật.
3.3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Hầu hết các thínghiệm vi sinh đều cần sử dụng các mơi trường cho qtrình ni cấy vi
sinh vật. Thơng thường các thínghiệm sử dụng mơi trường tổng hợp dạng khơ đã được chuẩn bị
sẵn. Tuy nhiên, cóthể trong một số trường hợp bạn cần một vài môi trường đặc biệt mà đã khơng
được chuẩn bị sẵn, sinh viên trong nhóm phải cùng nhau chuẩn bị.
3.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng cần thiết của vi khuẩn

14


Bất cứ mơi trường nào phùhợp cho một nhóm vi sinh vật cụ thể đều bao gồm 7 yếu tố sau:
nước, carbon, nguồn năng lượng, nitrogen, khoáng, yếu tố sinh trưởng, pH. Vai trò của mỗi yếu
tố như sau:
Nước: Nguyên sinh chất chứa 70-85% nước. Nước trong sinh vật đơn bào gắn liền với
nước trong môi trường, các phân tử này ra vào qua màng tế bào cùng với việc vận chuyển các
chất dinh dưỡng vàbài tiết các chất ra khỏi tế bào. Hoạt động của enzyme kiểm soát các phản
ứng xảy ra trong tế bào phụ thuộc hàm lượng nước trong tế bào.
Chất lượng nước dùng trong chuẩn bị mơi trường rất quan trọng. Nước cứng có hàm
lượng ion canxi và magiê cao không được sử dụng. Phosphate của canxi vàmagiêkhơng hịa tan
cóthể kết tủa khi cómặt của peptone vàcao thịt bị. Tốt nhất ln sử dụng nước cất.
Carbon: Có2 nhóm vi sinh vật tuỳ theo nguồn carbon sử dụng gồm: Nhóm vi sinh vật tự
dưỡng (sử dụng carbon dioxide tổng hợp tất cả chất cho tế bào); Nhóm vi sinh vật dị dưỡng (sử

dụng hợp chất hữu cơ cho qtrình tổng hợp). Ngồi nguồn carbon hữu cơ, vi sinh vật tự dưỡng
cũng có thể sử dụng carbon dioxide. Nếu khínày hồn tồn loại trừ ra khỏi mơi trường của chúng,
sự phát triển của chúng bị chậm lại, đặc biệt trong giai đoạn sớm của bắt đầu một canh cấy.
Nguồn năng lượng: Gồm 2 nhóm: Vi sinh vật quang năng (photoautotrophs) cósắc tố sử
dụng nguồn năng lượng mặt trời vàvi sinh vật hóa năng (chemoautotroph) oxi hóa hợp chất vô
cơ đơn giản tạo năng lượng. Chất sinh năng lượng cần thiết cho các vi sinh vật này cóthể làcác
chất như nitrite, nitrate hoặc sulfide.
Hầu hết các vi khuẩn thuộc vào nhóm dị dưỡng hóa năng cần nguồn năng lượng hữu cơ
như glucose hoặc amino acids.
Một lượng nhỏ vi khuẩn làdị dưỡng quang năng. Các vi sinh vật đó có sắc tố quang hợp
cho phép chúng sử dụng ánh sáng mặt trời cho năng lượng. Nguồn năng lượng carbon cần làhợp
chất hữu cơ như alcohol.
Nitrogen: Vi sinh vật tự dưỡng cóthể sử dụng nguồn nitrogen vơ cơ, vi sinh vật dị dưỡng
lấy nguồn nitrogen từ amino acid vàhợp chất trung gian như peptid proteoses và peptone. Dịch
chiết thịt bò vàpeptone sử dụng trong canh dinh dưỡng cung cấp nitrogen cần thiết cho vi sinh
vật tự dưỡng phát triển trong môi trường.
Khoáng: Tất cả các vi sinh vật yêu cầu một vài nguyên tố kim loại như sodium,
potassium, calcium, magnesium, sắt, kẽm, đồng phosphor và coban cho sự sinh trưởng bình
thường. Vi khuẩn không ngoại lệ. hàm lượng yêu cầu khánhỏ.
Các yếu tố phát triển: bất cứ hợp chất cần thiết nào của vật chất tế bào màmột vi sinh
vật không thể tổng hợp từ nguồn carbon và nitrogen được phân loại làmột yếu tố phát triển. Yếu
tố phát triển có thể bao gồm amino acid hoặc vitamin. Nhiều vi sinh vật dị dưỡng thỏa mãn với
yếu tố sinh trưởng hiện diện trong dịch chiết thịt bò của canh thang dinh dưỡng. Hầu hết các vi
khuẩn gây bệnh khó tính u cầu môi trường giàu dinh dưỡng như thạch máu giàu yếu tố phát
triển.
pH: Sự phát triển của vi sinh vật trong một mơi trường cụ thể cóthể hồn tồn bị ức chế
nếu pH môi trường không nằm trong vùng giới hạn. Các enzyme vi sinh vật bị ảnh hưởng lớn bởi
yếu tố này. Hầu hết các vi khuẩn phát triển tốt nhất xung quanh pH 7, pH của canh thang dinh
dưỡng nên điều chỉnh đến pH 6,8. Mặt khác, vi khuẩn gây bệnh thường thích ứng pH kiềm hơn.
Trypticase soy broth làmột môi trường phùhợp cho nhiều vi khuẩn gây bệnh khó tính nên điều

chỉnh đến pH 7,3.
3.3.2. Các loại môi trường:
Một môi trường nuôi cấy vi sinh vật làthực phẩm cho canh cấy vi khuẩn, nấm mốc, và
các vi sinh vật khác.
15


(1) Phân chia theo trạng thái của mơi trường cóthể chia 3 dạng: lỏng, đặc vàbán
rắn.
Môi trường lỏng: được sử dụng cho việc nhân giống một lượng lớn vi sinh vật, nghiên
cứu sự lên men, vànhiều thử nghiệm khác.
Môi trường rắn: là môi trường thêm vào một tác nhân tạo đông như agar, gelatin, hoặc
silica gel vào môi trường lỏng. Một tác nhân tạo đông tốt làmột chất màkhông bị sử dụng bởi vi
sinh vật, không ức chế sự phát triển của vi khuẩn vàkhơng hóa lỏng ở nhiệt độ phịng. Agar và
silica gel khơng hóa lỏng ở nhiệt độ phịng và khơng bị sử dụng bởi nhiều sinh vật. Trái lại,
gelatin bị thủy phân bởi khánhiều vi sinh vật vàhóa lỏng ở nhiệt độ phịng.
Mơi trường rắn làcần thiết cho sự phát triển các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường khi
phân lập vi sinh vật từ canh cấy hỗn hợp.
Môi trường bán rắn: là dạng môi trường chứa tác nhân tạo đông với tỷ lệ thấp. Môi
trường này hữu ích trong việc xác định sự di chuyển của vi khuẩn.
(2) Phân chia theo thành phần môi trường:
Môi trường tổng hợp: Các mơi trường cần có các thành phần được biết chính xác đến
chi tiết. Các mơi trường thơng thường làm từ các chất hóa học có độ tinh sạch cao vàthành phần
chính xác.
Mơi trường tự nhiên: Các mơi trường như canh thang dinh dưỡng chứa các thành phần
không chính xác được gọi là mơi trường tự nhiên. Thành phần hai loại dịch chiết thịt bị và
peptone đều khơng chính xác trong canh dinh dưỡng.
(3) Căn cứ vào mục đích sử dụng: Mơi trường cơ sở (minimum medium), Mơi
trường làm giàu (enrichment medium), Môi trường giám biệt (differential medium), Mơi trường
chọn lọc (selective medium), mơi trường sinh hóa

Hai loại môi trường đặc biệt sẽ được mở rộng sử dụng trong chỉ dẫn thực hành làmôi
trường chọn lọc vàphân biệt.
Môi trường chọn lọc là mơi trường chỉ có loại vi sinh vật chính xác phát triển trên hoặc
trong mơi trường đó bởi vì(1) khơng có mặt một số chất dinh dưỡng quan trọng làm cho nó
khơng thích hợp cho hầu hết các vi sinh vật nhưng không phải tất cả hoặc (2) cósự hiện diện của
chất ức chế ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật nhất định nào đó.
Mơi trường phân biệt là mơi trường chứa các chất tạo ra một số vi khuẩn để cómột dạng
khác nhau từ các loài khác, cho phép phân biệt một trong những lồi khác.
Trong một số trường hợp mơi trường đưa vào công thức cả hai yếu tố chọn lọc vàphân
biệt. Vídụ mơi trường EMB agar, sử dụng để xác định E.coli trong phân tích nước.
3.3.3. Cách chuẩn bị mơi trường: Bao gồm các bước
Bước 1: Pha môi trường
1/ Đo lường một lượng nước đủ để làm môi trường vào bình tam giác. Chúýbình phải có
thể tích lớn hơn lượng môi trường cần pha.
2/ Xem trên nhãn hộp môi trường để xác định lượng môi trường cần pha trong 1000ml,
sau đó tính lượng mơi trường sử dụng tương ứng cần pha. Cân mơi trường vàcho vào bình pha
mơi trường. Lắc đều làm tan mơi trường. Làm nút bơng cho bình tam giác.
3/ Nấu tan môi trường trên bếp điện. Chú ý, mơi trường có thể sơi trào ra khỏi dụng cụ
chứa đựng. Cẩn thận lắc nhẹ, tránh môi trường bị cháy dưới đáy bình chứa đựng.
4/ Giữ nhiệt độ mơi trường khoảng 600C để tránh bị đông đặc. Môi trường sẽ đông đặc
khoảng 400C.
16


Chúý: Cần đọc kỹ yêu cầu về chế độ khử trùng môi trường trên nhãn hộp.
Bước 2: Điều chỉnh pH:
Mặc dù môi trường khôchứa tác nhân đệm giữ pH của mơi trường ở khoảng mong muốn,
pH mơi trường cóthể thay đổi so với trạng thái trên nhãn chai. Trước khi được rót ống, nên kiểm
tra pH mơi trường và điều chỉnh pH nếu có.
Nếu cósẵn dụng cụ đo pH và đã chuẩn, dùng nó để đo pH của mơi trường. Nếu cần điều

chỉnh pH dùng HCl hoặc NaOH. Nếu không có dụng cụ đo pH, có thể dùng giấy đo pH. Cách
điều chỉnh pH:
Vật liệu: cốc đong chứa môi trường, chai 1N và0,1N của HCl vàNaOH, que khuấy thủy
tinh, giấy đo pH, dụng cụ đo pH (không bắt buộc).
1/ Xác định pH môi trường bằng giấy đo pH
2/ Nếu pH quácao, thêm HCl để giảm pH. Nếu lượng môi trường quánhiều dùng 1N HCl.
Nếu pH sai khác ít, dùng 0,1N HCl. Khuấy trộn giọt thêm vào để hòa tan vào môi
trường bằng que khuấy thủy tinh.
3/ Nếu pH quá thấp, thêm NaOH từng giọt để tăng pH. Nếu pH sai khác ít dùng
0,1NNaOH, sai khác nhiều dùng 1NNaOH. Khuấy trộn đều giọt thêm vào bằng đũa
thủy tinh.
Bước 3: (Nếu có)
Rót ống nghiệm:
1/ Rót vào một ống nghiệm lượng mơi trường được đo chính xác. Ống này làm mốc để rót
các ống nghiệm khác.
2/ Rót phễu vàqtrình rót ống kiểm tra mức độ phù hợp, giữ ống hướng dẫn bên cạnh
các ống sẽ rót tiếp theo để giúp bạn xác định lượng môi trường vào trong mỗi ống
nghiệm.
3/ Nếu môi trường chứa agar cần giữ cốc chứa mơi trường nóng ở trạng thái lỏng.
4/ Nếu ống nghiệm được sử dụng trong lên men kiểm tra đặc tính sinh hơi, thêm một
durham vào mỗi ống ở thời điểm này, miệng ống quay xuống dưới.
Đậy nắp ống nghiệm:
Thơng thường nắp plastic thích hợp cho mọi trường hợp. Tất cả các nắp đậy đầu ống
nghiệm córãnh nhỏ bên trong tạo khoảng trống cho phép hơi nước thốt ra trong qtrình thanh
trùng. Nếu dùng nắp vặn plastic, nắp không được vặn chặt, trước khi thanh trùng nới nắp vặn một
phần vịng xoay. Cóthể dùng nút bông làm đúng kỹ thuật cho các ống nghiệm.
Bước 4: Thanh trùng:
Các môi trường chuẩn bị xong cần thanh trùng ngay lập tức. Vi sinh vật trên thành ống,
trong nước cất, trong môi trường làm khô sẽ bắt đầu phát triển trong khoảng thời gian ngắn ở
nhiệt độ phòng, pháhủy môi trường.

Trước khi thanh trùng, các ống nghiệm cần đặt trong dụng cụ chứa dạng lưới cóghi nhãn
bên ngồi. Nhãn cần thể hiện loại môi trường, ngày thanh trùng, người làm.
Thanh trùng thực hiện trong nồi thanh trùng.
Hướng dẫn sử dụng nồi thanh trùng:
- Kiểm tra thực hành với dạng nồi thanh trùng cụ thể. Hồn thành qtrình thanh trùng ở
1210C. Để đạt được nhiệt độ đúng cần chuẩn bị khơng gian cho sự thốt khí
. Một số thiết
bị cũ cần cho hơi nước thoát ra cửa sổ.
17


Khơng để qtải lỗ thốt khí.Khơng nên thử nhìn mơi trường trong nồi. Cần giữ khoảng
cách giữa các dụng cụ chứa đựng cho sự lưu thơng hơi nóng.
- Điều chỉnh thời gian thanh trùng với kích cỡ bình chứa. Các bình chứa nhỏ cóthể thanh
trùng 10-15 phút. Một nồi thanh trùng đầy cóthể mất 30 phút hồn tất.
Bước 5: Sau khi thanh trùng:
Thạch nghiêng: Cần đặt gần như nằm ngang ống ngay khi lấy trong nồi thanh trùng ra.
Quá trình đơng đặc xảy ra trong vịng 30 -60 phút.
Mơi trường khác: Các dạng môi trường trong ống nghiệm lỏng, thạch đứng ... cần để
nguội ở nhiệt độ phòng sau khi lấy ra khỏi nồi thanh trùng.
Cách đổ môi trường vào đĩa petri: Tồn bộ q trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong
tủ cấy vôtrùng vàgồm các thao tác sau:
- Khử trùng bàn làm việc, tay với cồn 700
- Đốt đèn cồn. Chúýmọi thao tác thực hiện gần đèn cồn tránh nhiễm khuẩn.
- Mở bao giấy gói các đĩa petri.
- Tay phải cầm bình chứa mơi trường cónhiệt độ khoảng 450C. Tay trái mở nút bơng của bình.
- Hơ miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn.
- Mở hénắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót mơi trường vào đĩa petri.
- Đậy nắp đĩa lại, xoay tròn nhẹ đĩa để môi trường được phân phối đều bên trong đĩa.
- Để yên cho môi trường đông đặc.

- Lật ngược đĩa lại vàbảo quản.
Chú ý:
- Thao tác đổ môi trường phải nhanh vàkhéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn.
- Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm. Thơng thường cứ khoảng 100 ml môi
trường sẽ phân phối được 7 - 8 đĩa.
- Sau khi phân phối môi trường vào đĩa petri, kiểm tra lại xem mơi trường cóbị nhiễm khuẩn sau
1 – 2 ngày.
- Ghi chú môi trường (tên môi trường, ngày khử trùng, hạn sử dụng)
Bước 6: Bảo quản:
Sau khi môi trường đông đặc, bảo quản trong tủ lạnh hoặc chỗ mát. Khi bảo quản thời
gian dài ở nhiệt độ phịng mơi trường sẽ bị mất nước. Mơi trường có thể giữ ở nhiệt độ tủ lạnh
hàng tháng.
Trước khi sử dụng, cần kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường bằng cách đặt môi trường
vào tủ ấm 370C trong thời gian nhất định. Loại bỏ môi trường bị nhiễm khuẩn vàchỉ sử dụng môi
trường đạt yêu cầu.
-

Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT
4.1. Dụng cụ - Hóa chất, nguyên vật liệu
2. Dụng cụ
- Que cấy đầu trịn, đầu nhọn, que cấy móc.
- Que trang, ống hút chia độ 1ml.
- Ống nghiệm, giá để ống nghiệm, đĩa petri.
- Đèn cồn, hộp quẹt
1. Hóa chất, ngun liệu
- Mơi trường thạch đứng, thạch đĩa, thạch nghiêng để nuôi cấy vi sinh vật.
18


- Các ống giống nấm men, nấm mốc, vi khuẩn.

4.2. Kĩ thuật vôtrùng, khử trùng
Các thủ tục hướng dẫn chi tiết đảm bảo việc duy trìmột mơi trường vơtrùng khi thao tác
cấy vi sinh vật. Cấy chuyển vô trùng từ canh cấy này sang canh cấy khác thành công khi khơng
lây nhiễm vi sinh vật trong qtrình. Qtrình cấy chuyển cóthể từ khuẩn lạc trên hộp lồng sang
ống nghiệm chứa canh trường hoặc cấy chuyển từ canh trường nuôi cấy sang nhiều loại môi
trường (rắn hoặc lỏng) cho nhiều loại xét nghiệm.
Trang thiết bị:

Hình 12: Một số dụng cụ vi sinh cơ bản
Thao tác chung:
Khử trùng khu làm việc: Đầu tiên xử lýkhu vực làm việc với một chất tẩy trùng để diệt
vi sinh vật hiện có. Bước này pháhủy được tế bào sinh dưỡng vàvirus; tuy nhiên không pháhủy
được bào tử. Chất khử trùng thường dùng làcồn 700.
Que cấy vòng và que cấy thẳng: Việc cấy chuyển các vi sinh vật được thực hiện bằng
que cấy vòng hoặc thẳng. Phải khử trùng chúng trước khi lấy vi sinh vật bằng cách nung nóng
bằng đèn cồn đến nóng đỏ.
Hơ nóng miệng ống nghiệm: Trước khi đưa que cấy đã làm nguội vào ống nghiệm chứa
môi trường, mở nắp ống nghiệm và hơ nóng miệng ống nghiệm. Sau khi lấy vi sinh vật ra khỏi
ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống lần nữa.
Cấy trên môi trường lỏng: Nếu cấy vi sinh vật vào ống mơi trường lỏng, miệng ống cần
hơ nóng trước khi đưa que cấy vào trong ống. Để cấy vi sinh vật vào môi trường, cần xoay que
cấy vài vịng trong mơi trường.
Sau khi cấy xong, que cấy được rút ra khỏi ống nghiệm, khử trùng như lúc đầu. Các dụng
cụ này không được đặt trên mép bàn. Khử trùng miệng ống nghiệm trước khi đậy nắp.
Cấy đĩa Petri: Để cấy trên đĩa, không dùng nhiệt tác dụng lên đĩa, cần dùng que cấy vịng
trong qtrì
nh cấy chuyển. Khi cấy vạch trên bề mặt môi trường cần giữ nắp đậy che phía trên,
tránh lây nhiễm vi sinh vật từ khơng khí.
Khử trùng cuối cùng: Khi cơng việc kết thúc, vùng làm việc cần được xử lý với chất

khử trùng để chắc chắn vi sinh vật tích tụ trong qtrình làm việc đều bị loại bỏ.
4.3. Các phương pháp cấy vi sinh vật:
19


4.3.1. Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác:
- Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật; ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một
chút.
- Tay trái cầm ống giống vàống môi trường. Tay phải cầm que cấy vàkhử trùng trên ngọn
đèn cồn cho đến khi nóng đỏ vịng cấy
- Dùng ngón út vàngón áp út kẹp nút bơng vào lịng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống.
- Hơ nóng để khử trùng khơng khíở miệng ống nghiệm
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi
trường để thực hiện các thao tác cấy truyền.
(1) Khử trùng khơng khívàmiệng 2 ống nghiệm, đậy nút bơng. Khử trùng lại que cấy.
Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên
- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác:
+ Hoàgiống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các cách khác nhau.
(2) Phương pháp cấy trên thạch đứng: dùng để cấy các vi sinh vật kị khí.
- Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật, đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ.
- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành
ống tuỳ yêu cầu.
- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để khơng gây nứt, vỡ mơi trường.

Hình 13: Các bước thực hiện lấy vi sinh vật từ ống canh thang

20

Hình 14: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ đĩa thạch.

Hình 15: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ ống thạch nghiêng
4.3.2. Phương pháp cấy trên đĩa pettri:
Cóthể cấy trên đĩa pettri theo 2 cách sau:
(1) Dùng que cấy đầu tròn phân lập chủng thuần khiết:
Nguyên tắc phân lập
- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.
21


- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để
thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).
Phương pháp cấy:
- Để đĩa petri lên bàn.
- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự vàyêu cầu ở phương pháp chung.
- Tay trái hémở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.
- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau (xem
hình 16)
+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
+ Theo những đường song song.
+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc.

Hình 16: Các cách cấy phân lập khác nhau trên đĩa thạch

Hình 17: Phương pháp phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
(2) Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật vàcấy một lượng khánhiều

giống. Để có mật độ vi sinh vật phù hợp cho quá trình đếm khuẩn lạc, mầu thường được pha
loãng với nồng độ phùhợp.
Phương pháp pha loãng mẫu: Chuẩn bị để có dãy pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 .... và
các nồng độ thích hợp khác, cấy chuyển 1 ml dịch pha loãng ở nồng độ trước vào 9 ml dung dịch
pha loãng. Đầu tiên dịch mẫu đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng
pipet vơtrùng (hoặc pipetman với đầu típ vơtrùng) chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa
9ml dung dịch pha loãng. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) hay
dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5-10 lần. Dung dịch mẫu này có độ pha loãng là10-1. Sau
22


đó sử dụng pipet hoặc pipetman có đầu tip khác chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ 2
chứa dung dịch pha loãng và thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha lỗng 10-2. Tiếp tục
thực hiện tương tự để có các độ pha lỗng thập phân theo cho đến độ pha loãng cần thiết. Lưu ý
nếu pipet hoặc đầu tip pipetman nguy cơ bị nhiễm trong qtrình thao tác (chạm tay, chạm mặt
ngồi ống nghiệm, mặt ngồi bình chứa...), cần phải thay pipet hoặc đầu tip vơtrùng khác.

Hình 18: Phương pháp pha lỗng mẫu
Sau khi tiến hành pha loãng mẫu theo phương pháp đã nêu trên, cần làm nhãn ghi vào đáy
đĩa Petri có mơi trường thạch các thơng tin: mẫu, nồng độ pha lỗng, ngày cấy trước khi thực
hiện các thao tác cấy.
Cách 1: Phương cấy trộn
+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 1 ml dịch nghiên cứu ở nồng độ pha lỗng phù
hợp cho vào ống nghiệm có mơi trường thạch ở nhiệt độ 45-500C.
+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.
+ Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng.
+ Xoay tròn đĩa petri cho thạch dàn đều ở đáy hộp.
+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
Cách 2: Phương pháp cấy trang
- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phùpha loãng cho lên bề mặt đĩa thạch.

Lưu ý: có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5 ml. Tuy nhiên, thể tích mẫu cấy càng
nhỏ thìsai số cóthể xảy ra càng lớn. Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều vàkhông
nên vượt quá300.
- Sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Lưu ý rằng
que cấy gạt thuỷ tinh phải được vô khuẩn trước khi được đưa vào đĩa Petri tiếp theo,
bằng cách nhúng vào trong cồn, vẩy nhẹ để loại đi lượng cồn dư bám bằng que cấy, đốt
cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy trước khi
rồi dàn đều mẫu. Nếu thể tích chất lỏng đem cấy quánhiều, các tế bào sẽ trôi dạt trong
chất lỏng, vàsau khi tế bào phân chia, hai khuẩn lạc xuất phát từ một tế bào cóthể hình
thành gây loang bề mặt. Các đĩa thạch được chuẩn bị một ngày trước khi cấy thường hấp
thu nhanh lượng chất lỏng đem cấy. Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy
ra càng nhanh.
4.3.3. Phương pháp MPN: ( Most probable number)
- Phương pháp MPN ( phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả) cịn được gọi là
phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh
giásố lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật cóxác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị
23


thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một lọat các thí
nghiệm lặp lại ở 1 số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện
lập lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3x3 = 9 ống nghiệm.
- Quy trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau: cho vào các ống nghiệm
cóchứa các mơi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật cần định lượng một thể tích
chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha lỗng bậc 10 liên tiếp( vídụ 1/10, 1/100, 1/1000.). Ủ ở
nhiệt độ vàthời gian thích hợp.
- Dựa vào kết quả biểu kiến ( dương tính) chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần
kiểm định trong từng ống nghiệm ( thường là các hiện tượng như sinh hơi, chuyển màu mơi
trường, ..) sau đó ghi nhận hiện tượng dương tính ở từng nồng độ. Sử dụng các số liệu này và
bảng tra của Mac Crandy suy ra mật độ vi sinh vật có trong mẫu đang kiểm tra được trình bày

dưới dạng MPN/100ml, hay MPN/g mẫu.
- Độ chính xác của phương pháp MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong
mỗi độ pha lỗng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn.
- Phương pháp MPN có thể dùng để định lượng mọi nhóm vi sinh vật cóthể được ni cấy
trong mơi trường lỏng chọn lọc vàcho kết quả biểu kiến (dương tính thích hợp).
- Vídụ: sử dụng mơi trường BGBL 2% ở 37oC cóthể định lượng nhóm Coliorms, cùng mơi
trường này ở 45oC,cho phép định lượng Coliforms phân hay mơi trfường MSB cóthể dùng định
lượng Staphylococcus .
- Cần lưu ý rằng đa số các bảng tra MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100 ml
dung dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là10ml, 1ml, 0.1ml. Trên thực tế phân tích,
chúng ta khơng sử dụng các liều lượng khác nhau của mẫu như trên do nồng độ các thành phần
môi trường sẽ khác nhau nhiều ở các ống nghiệm ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích. Thơng
thường người ta sử dụng đồng loạt 1 dung tích mẫu nhất định cho các mẫu đã pha lỗng ở các
nồng độ thập phân khác nhau, vídụ, dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1,10-2, 10-3. Lượng mẫu
với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là10ml, 1ml,và 0.1ml như đã nêu trên.
- Điều đó có nghĩa là số liệu của bảng MPN ở các dung tích mẫu 10ml, 1ml, và0.1ml là
tương đương với MPN/ ml mẫu chưa pha lỗng khi 1ml của dung dịch có độ pha lỗng 10-1,10-2,
10-3, được dùng để phân tích.
- Trường hợp mật độ vi sinh vật quácao, cần phải sử dụng loạt pha loãng tiếp theo cần phải
nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha lỗng.
- Vídụ sử dụng 1ml cho độ pha loãng 10-2, 10-3 và10-4 tức làchỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở
mỗi nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy trị số tra
bảng MPN nêu trên cần được nhân thêm hệ số pha loãng là10.
4.4. Nuôi dưỡng vi khuẩn:
Nguyên tắc: Nuôi dưỡng là quá trình đảm bảo vàduy trìnhững điều kiện thuận lợi nhất cho sự
hoạt động vàsinh sản của vi khuẩn.
Tiến hành : Úp ngược các hộp Petri rồi đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ vàthời gian phù hợp cho sự
phát triển của vi khuẩn cần kiểm tra. Sau thời gian trên, ở bề mặt thạch đĩa sẽ mọc các khuẩn lạc
riêng biệt màmắt thường quan sát được.

Thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết
+ Cấy vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc tách rời vào ống môi trường thạch nghiêng.
+ Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ vàthời gian thích hợp.
+ Loại bỏ các ống bị nhiễm, chọn ra các ống cócác chủng thuần khiết.
Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của một chủng vi khuẩn mới phân lập
Cónhiều cách kiểm tra:
24


* Kiểm tra vết cấy trên môi trường thạch đĩa: nếu vết cấy cóbề mặt vàmàu sắc đồng đều, thuần
nhất chứng tỏ chủng mới phân lập thuần khiết thìgiữ lại. Nếu vết cấy khơng thuần nhất thìloại
bỏ.
* Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc cómàu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng mẫu.
+ Khơng cócác màu sắc vàsắc tố lạ.
+ Làm tiêu bản soi tươi dưới kính hiển vi thấy cóhình dạng đặc trưng như chủng mẫu.
+ Tiến hành phân lập lại trong điều kiện vơtrùng vẫn cho hình dạng khuẩn lạc tương tự.
+ Làm một số phản ứng sinh hóa định tính đặc trưng.
4.4. Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập
+ Cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (1 tháng/1lần).
+ Giữ vi khuẩn ở nhiệt độ 4-50C trong tủ lạnh hoặc phòng lạnh.
+ Trộn vi khuẩn với glycerol vôtrùng với tỉ lệ 1 : 20 vàgiữ ở nhiệt độ 3-50C.
+ Bảo quản vi khuẩn trong cát sạch đối với những chủng cóbào tử.
+ Phương pháp đông khô v.v...

Bài 5: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU
.
5.1. Dụng cụ- Mơi trường vàhóa chất
1. Dụng cụ:
Cân phân tích, bị chứa mẫu vơ trùng, dụng cụ lấy mẫu vô trùng (muỗng, kéo, pank gắp...),

keo dán nhãn..
Thiết bị, dụng cụ đồng nhất mẫu.
Tủ lạnh bảo quản mẫu.
2. Mơi trường, hóa chất:
- Dung dịch đệm phosphate
- Nước muối sinh lý
5.2. Phương pháp lấy mẫu vàbảo quản mẫu
Lượng mẫu và điều kiện lấy mẫu đem kiểm tra đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá
các chỉ tiêu vi sinh của một lô thực phẩm. Nếu mẫu lấy không thích hợp vàxử lý khơng đúng
hoặc khơng đại diện cho lơ thực phẩm, kết quả thínghiệm sẽ trở nên vơ nghĩa. Do một lô hàng
thực phẩm lớn đem phân phối dựa trên kết quả thínghiệm trên một mẫu tương đối nhỏ so với cả
lô, nên cần phải dựa vào các thủ tục lấy mẫu theo quy định. Cần cómột mẫu đại diện do tác nhân
gây bệnh hoặc độc tố phân bố rải rác trong thực phẩm hoặc tuỳ theo sự sắp xếp thực phẩm khi
vận chuyển theo đường biển phụ thuộc vào lượng vi khuẩn cótrong thực phẩm so với tiêu chuẩn
cho phép. Một số điểm cần lưu ý:
1. Lấy mẫu:
- Số lượng mẫu lấy đại diện cho lô hàng thực phẩm cần kiểm tra. Nếu có thể thu nhận tối
thiểu 100g cho mỗi đơn vị mẫu.
- Mẫu gởi đến PTN cần giữ nguyên trạng thái ban đầu, không mở bao bì đóng gói.
- Các dụng cụ lấy mẫu cần được vô trùng trong nồi hấp hoặc tủ sấy. Không nên sử dụng
cồn đốt cóthể gây nguy hiểm và khơng đủ để vôtrùng dụng cụ.
- Thùng chứa mẫu phải khôsạch, khơng rịrỉ. Cần dán nhãn mẫu rõràng, chính xác.
- Chuyển mẫu tới PTN ngay và duy trì các điều kiện bảo quản gần giống mẫu ban đầu. Ghi
lại thời gian lấy mẫu và nhận mẫu tại PTN. Đối với mẫu đông lạnh cần làm lạnh trước thùng
đựng mẫu. Các mẫu đông cần giữ trong trạng thái đông cứng liên tục. Các mẫu bảo quản lạnh cần
giữ trong đá ở 0 – 40C cho đến khi về đến PTN.
25