Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ NGỌC VIỆN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐA DÒNG ĐẶC
HIỆU PHỤC VỤ SẢN XUẤT BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH
ĐỘC TỐ VI TẢO GÂY MẤT TRÍ NHỚ CHO NGƯỜI
(DOMOIC ACID)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HOÀ - 2018


vA DAo rAo
TNUOUGDAI HQC I\HATRANG

s0 crao

DUC

*

NTU

D t H9c

r{HA TRA}IG

r9t9

lf, Ncec vrEN
NGHrtn ctru THU IvHAI\ xnAnc rHn B,q, oduc DAc
nrpfpnUcv{rsa,nr xuir Be KIT puAr HrENI{HANH

rbvl rAo cAvuAr rnilyHocHtrwctrot

bqc

(DOMOICACID)

LUAN VAI\ THAC SI
^Y-

tl

Nghnh:

Cdng ngh$ sinh hgc

Mii

6042A201

s6:

I/QD-DHNT ngiy 2l /612017
1 96/QD-DHNT nsiy 09 /3 12018

Quy6t illnh giao aA ta,i:

Quy6t itinh thirnh I$p IID:

55

Nghy bfro vQ:

fil4l20r8

Nguli

hurirrrg Ofin kihoa hgc:

r. PGS.TS. vO NGoc BoI
2. TS.

oAo

vlnr rIA

Chu tich trqi OAng:
PGS.TS. IYGO UANC NCNIA.
Phdng Dho tpo sau il4i hgc:

KHANH HOA - 2018


LOI CAM DOAN
TOi xin cam doan c16y ld c6ng trinh nghiCn criu cria tdi dugc hodn
sU

thinh dudi

tdi tro cria dA tii: "llghiin cru phdt ffiAn b0 KIT phat hi€n nhanh mQt sti d\c t(i

vi tdo trong

sdn phdm thrty

sdn" do TS. Ddo ViQt Ha ldm chu nhiQm vd t6i le thdnh

vi6n tham gia. Cic sti ligu, k6t qui n0u trong lupn v[n

ldr

trung thyc

vi cl6 dugc

nhiQm eC tai cho ph6p c6ng b5 trong lufln v[n.

Kh6nh Hoi, ngAy 22 thing 3 ndm 2018

Tac giit lupn v[n

LG Nggc ViQn

111

chu

Lor cAnn oN
Pe hoen thAnh LuQn v6n

niy

Tru6c trtit tOi xin gui t6i Ban Gi6m hiQu Trucrng Dpi hqc Nha Trang, Ban Chil
nhiQm Khoa C6ng nghe ThUc phAm vlr Khoa Sau dpi hgc sg kinh trQng, nidm tu hio

dugc hqc t?p
SU

vi

nghiOn cuu t4i Trudrng trong nhirng ndm qua.

bi6t crn sAu s[c nh6t t6i xin dugc gidnh cho thAy: PG.TS. Vfr Ngqc BQi - Trucrng

khoa C6ng nghe ThUc phAm

vi

TS. Dio ViQt He - Ph6 Vien trucrng - Vien

Hii

ducrng

hqc Nha Trang dd tpn tinh hucrng d6n vd dQng vi6n t6i trong sr5t qu6 trinh thyc hien

lufln v6n.

Xin ch6n thdnh citmcrn TS. Ddo ViCt HA - chu nhiQm dA tii

c6p Nhd nudc "NghiAn

c*u phdt ffiAn bQ KIT phdt hi€n nhanh mQt sd dpc t() vi tdo trong san phdm thfiy sdn"
dA

tei ffq kinh phi, cho ph6p t6i dugc tham gia de tdi vd su dpng sti tgr', nghiCn ciru trong

b6o cito 1u0n vdn.

Xin gui ldi cim on sflu sic dtin Ban Gi6m d6c Trung t6m Phrip y Kh6nh Hoi,

dd

tao di6u kiQn vdr cho ph6p t6i dugc di hqc d€ ndng cao trinh dQ.

Xin c6m

cm

quy thAy c6 gi6o trong ViQn Cdng nghe Sinh hqc Mdi truong - Trucrng

Dpi hgc Nha Trang, cic cin b0 - phdng Hoa sinh - Vien H6i ducrng hqc Nha Trang dd
tpn tinh giirp dd

vi

tao diOu kiQn cho t6i trong s.r6t thoi gian thUc hien de tai trong thdi

gian vtra qua.

Xin c6m

crn c6c th6y cO

phin

biQn dd cho

t6i nhfmg loi khuy6n quf b6u d€ c6ng

trinh nghiCn ciru dugc hoin thenh c6 ch6t luqmg.
Dac biQt xin dugc ghi nhd tinh cdm, sg giirp dd cua gia dinh vd bpn bd lu6n ludn

chia se kip thdi ctng t6i trong qu6 trinh nghiOn cuu.

Kh6nh Hoi, ngey 22 thdng 3 ndm 2018
T6c gril luQn vdn

L0 Nggc ViQn

1V


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................... v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... ix
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ x
LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 5
1.1. ĐỘC TỚ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH
POISONING - ASP) ....................................................................................................... 5
1.1.1. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP ...................................................... 6
1.1.2. Độc tính của DA ................................................................................................... 7
1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ VI TẢO ............................................. 8
1.2.1. Thử nghiệm sinh học trên động vật ...................................................................... 8
1.2.2. Phương pháp hoá học............................................................................................ 9
1.2.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào ............................................... 10
1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................... 13
1.3. HƯỚNG NGHIÊN CỨU VỀ MIỄN DỊCH HỌC ĐỘC TỐ DOMOIC ACID ..... 14
1.3.1. Điều chế phức hợp kháng nguyên từ domoic acid.............................................. 14
1.3.2. Quy trình gây miễn dịch ..................................................................................... 20
1.3.3. Thu nhận kháng thể từ liệu pháp miễn dịch động vật ......................................... 23
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 30
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 30
2.2.1. Tạo kháng thể trên đối tượng sinh vật thử nghiệm ............................................. 30
2.2.2. Thu nhận và tinh sạch kháng thể kháng DA từ huyết thanh thỏ trắng ............... 38

v


2.2.3. Thử nghiệm phân tích độc tố ASP trong sản phẩm thuỷ sản bằng phương pháp

ELISA ........................................................................................................................... 41
2.3. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG................................................................ 43
2.3.1. Hoá chất .............................................................................................................. 43
2.3.2. Thiết bị ................................................................................................................ 44
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU...................................................................... 44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 45
3.1. TẠO KHÁNG THỂ TRÊN ĐỐI TƯỢNG SINH VẬT THỬ NGHIỆM .............. 45
3.1.1. Điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên khơng hồn
chỉnh domoic acid ......................................................................................................... 45
3.1.2. Hoạt tính kháng thể kháng độc tố domoic acid trong huyết thanh thỏ trắng theo
thời gian ........................................................................................................................ 51
3.2. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ KHÁNG DA TỪ HUYẾT THANH
THỎ TRẮNG ............................................................................................................... 53
3.2.1. Thu nhận kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng .............................. 53
3.2.2. Tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng .............................. 53
3.2.3. Hiệu giá kháng thể .............................................................................................. 57
3.2.4. Tính đặc hiệu của kháng thể thu nhận từ liệu pháp miễn dịch ........................... 58
3.3. THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ ASP TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA.................................................................................. 59
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 63
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
-NH2

: Nhóm amin sơ cấp

-NO3

: Nhóm nitrate

=NH

: Nhóm amin thứ cấp

AOAC

: Association Of Analytical Communities (Hiệp hội các nhà hố học phân
tích chính thức).

ASP

: Amnesic Shellfish Poisoning (Độc tố gây mất trí nhớ tạm thời)

BSA

: Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò)

CBB

: Coomassie Brilliant Blue

CE

: Capillary Electrophoresis (Điện di mao quản)

COOH

: Nhóm cacboxyl

đ.v.c

: đơn vị Cacbon

DA

: Domoic acid

DANIDA

: Danish International Development Agency (Cơ quan Phát triển Quốc tế
Đan Mạch)

DMF

: N,N- dimethylformamide

DMSO

: Dimethyl Sulfoxide

DSP

: Diarrhetic Shellfish Poisoning (Độc tố gây tiêu chảy)

DSS

: Disuccinimidyl Suberate

EDC

: N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbant Assay (Phương pháp miễn dịch học liên
kết enzym)

FCA

: Freund’s Complete Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh)

FIA

: Freund’s Incomplete Adjuvant (Tá chất Freund khơng hồn chỉnh)

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HPLC-UV

: High Performance Liquid Chromatography with Ultra Violet detection
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phát hiện bằng tia cực tím)

IAC

: Immunoaffinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch)

ID

: Intradermal (trong da)

IM

: Intramuscular (trong cơ)

vii


IOC

: Intergovernmental Oceanographic Committee (Uỷ ban Hải dương học
Liên chính phủ)

IP

: Intraperitoneal (trong màng bụng)

IV

: Intravenous (trong tĩnh mạch)

JSPS

: Japan Society for the Promotion of Science (Cơ quan Phát triển Khoa

học Nhật Bản)

LC

: Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)

LOD

: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

MBA

: Mouse Bioassay (Thử nghiệm sinh học trên chuột)

mg/mL

: milligam/ milli Lít

NAFIQAD

: National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department (Cục
Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản)

NHS

: N-Hydroxysuccinimide

NMDA

: N-methyl-D-aspartate

NSP

: Neurotoxic Shellfish Poisoning (Độc tố thần kinh)

OD

: Optical Density (Mật độ quang)

OPD

: Ortho-phenylenediamine

P

: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

PBS

: Phosphate Buffer Saline

Plys

: Polylysin

PSP

: Paralytic Shellfish Poisoning (Độc tố gây liệt cơ)

PVDF

: Polyvinylidine Fluoride

RIA

: Radio Immuno Assays (Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ)

SC

: Subcutaneous (dưới da)

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di
Polyacrylamide với SDS)
STX

: Saxitoxin

TLC

: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

UV

: Ultra Violet (Cực tím)

µg/g

: microgam/ gam

µg/mL

: microgam/ milli Lít

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thể tích tiêm tối đa của hỗn hợp kháng nguyên/tá dược trên một vị trí tiêm ở
các loài động vật khác nhau .......................................................................................... 22
Bảng 2.1. Sơ đồ mơ tả một phép phân tích ASP-ELISA trên bản nhựa 96 giếng ........ 42
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hàm lượng DA (mg) trong phức hợp DA-DSS và hiệu suất
phản ứng ....................................................................................................................... 45
Bảng 3.2. Hàm lượng BSA (mg) trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA và hiệu
suất phản ứng ................................................................................................................ 48
Bảng 3.3. Kết quả phân tích độc tố DA trong mẫu Hàu Hương bằng kit ASP-ELISA (do
đề tài Nhà nước thử nghiệm chế tạo) ............................................................................ 60

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hố học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid ................... 5
Hình 1.2. Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA bằng cách sử dụng DSS làm
cầu nối giữa nhóm imino của DA và nhóm cacboxyl của protein tải ........................... 17
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp Domoic acid - Disuccinimidyl suberate (DADSS) .............................................................................................................................. 18
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với Bovine serum albumin (BSA) . 19

Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc điều chế phức hợp kháng ngun DA-DSS-BSA từ kháng
ngun khơng hồn chỉnh DA ...................................................................................... 31
Hình 2.2. Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng ngun khơng
hồn chỉnh DA .............................................................................................................. 34
Hình 2.3. Sơ đồ gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand với phức hợp .................. 36
Hình 2.4. Sơ đồ nguyên tắc thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA
trong huyết thanh thỏ bằng phản ứng ELISA ............................................................... 37
Hình 2.5. Sơ đồ tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ bằng sắc ký ái lực
Sepharose EAH 4B với pha rắn DA ............................................................................. 39
Hình 3.1. Phổ tử ngoại (UV) của phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA .................. 48
Hình 3.2. Hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA trong huyết thanh thỏ trắng New Zealand
từ sau tháng thứ 4 đến sau tháng thứ 12 của liệu pháp miễn dịch với liều 500 µg phức
hợp kháng ngun DA-DSS-BSA ................................................................................ 51
Hình 3.3. Sắc ký đồ của 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand sau khi qua cột sắc
ký ái lực miễn dịch (pha rắn DA-DSS) với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2
mL ................................................................................................................................. 54
Hình 3.4. Sắc ký đồ kháng thể chuẩn kháng DA 1 mg/mL sau khi qua cột sắc ký ái lực
miễn dịch với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2 mL (Đào Việt Hà và Phạm
Xuân Kỳ, 2017) ............................................................................................................ 55
Hình 3.5. Hình ảnh gel SDS-PAGE (sau khi nhuộm CBB) và màng PVDF sau Western
Blot: 1) kháng thể kháng DA chuẩn, 2) chế phẩm kháng thể thu nhận từ huyết thanh thỏ
sau tinh chế qua cột IAC ............................................................................................... 56
Hình 3.6. Hiệu giá kháng thể kháng DA của huyết thanh thỏ trắng New Zealand thu
nhận bằng liệu pháp miễn dịch ..................................................................................... 57

x


Hình 3.7. Kết quả phản ứng ELISA giữa kháng thể kháng DA thu nhận được với DA
chuẩn và một số chất có cấu trúc hố học tương tự DA (KA: Kainic acid; Glu: Glutamic

acid; Asp: Aspartic acid; GABA: Gamma-Aminobutyric acid; Pr: proline; HyPr:
hydroxyproline) ............................................................................................................ 58

xi


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát
hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)
Giới thiệu về đề tài và mục tiêu nghiên cứu
Các nhà khoa học đã phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA) trong các
loài hai mảnh vỏ tại vùng biển Châu Á và Việt Nam, với hàm lượng vượt ngưỡng giới
hạn an toàn của độc tố này trong sản phẩm thuỷ sản là 20 µg/g mô mềm (AOAC, 1990).
Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám sát
độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC).
Bên cạnh những ưu điểm, MBA và HPLC có những hạn chế nhất định và cần thiết có
một phương pháp thử nghiệm sinh học khác ưu việt hơn để thay thế.
Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant
Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương
pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA. Để có kit thử nhanh ELISA cho độc tố
DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại độc tố DA.
Một khó khăn rất lớn khi tạo kháng thể kháng độc tố DA là động vật bậc cao chỉ sản
sinh được kháng thể kháng lại những độc tố có bản chất protein. Trong khi đó, DA có
khối lượng phân tử thấp, khơng thuộc nhóm protein nên cơ thể sinh vật khơng có hiệu
ứng miễn dịch khi bị tiêm trực tiếp độc tố. Muốn tạo được hiệu ứng miễn dịch của sinh
vật thử nghiệm đối với DA, trước tiên phải điều chế một phức hợp kháng nguyên từ DA
có bản chất là bán kháng nguyên (hapten) bằng cách gắn kết độc tố này với một loại
protein thích hợp, sao cho trong phức chất tạo ra vừa có tính chất kháng ngun từ độc

tố (DA), vừa có tính sinh miễn dịch của một phân tử protein.
Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về điều chế phức
hợp kháng nguyên từ DA, sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA và kế thừa kết
quả nghiên cứu của Takata (2006), nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện
nhanh độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với
mục đích điều chế được phức hợp kháng nguyên Domoic acid - Bovine Serum Albumin
(DA-BSA) có tính sinh miễn dịch từ kháng ngun khơng hồn chỉnh DA; thu nhận
được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng New Zealand.
xii


Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu sử sụng các phương pháp hoá sinh truyền thống và hiện đại như
ELISA, HPLC, sắc ký ái lực miễn dịch (IAC), điện di Western Blot với các bước điều
chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA (Domoic acid - Disuccinimidyl Suberate Bovine Serum Albumin) có tính sinh miễn dịch hồn chỉnh; sau đó gây miễn dịch trên
đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng nguyên DA-BSA; thu nhận
kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng. Đối tượng nghiên cứu là
DA; BSA và thỏ trắng (Oryctolagus cuniculus) dòng New Zealand, được ni theo quy
trình ni động vật thí nghiệm của Viện Vắc-xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Sử dụng
phần mềm Microsoft Excel xử lý số liệu thống kê trong nghiên cứu.
Kết quả thu được
1) Luận văn đã xây dựng được quy trình 02 bước phản ứng và điều chế được phức
hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA với hiệu suất đạt 18,42%. Sản phẩm kháng nguyên
cộng hợp DA-DSS-BSA có tỉ lệ gắn kết 7,8 phân tử DA với 01 phân tử BSA.
2) Luận văn đã sử dụng phức hợp DA-DSS-BSA để gây đáp ứng miễn dịch trên
thỏ trắng New Zealand và nhận thấy với liều phức hợp sử dụng 500µg, thỏ trắng New
Zealand có đáp ứng miễn dịch sau 05 tháng thí nghiệm và đạt khả năng đáp ứng miễn
dịch cao nhất ở thời điểm sau 06 tháng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy
các cá thể thỏ trắng khác nhau có sự đáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng liều DADSS-BSA sử dụng và có 01 trong số 09 thỏ thử nghiệm có hoạt tính kháng thể cao nhất
(mức hiệu giá kháng thể: 12800).

3) Luận văn đã tiến hành tinh chế kháng thể bằng phương pháp sắc ký ái lực với
pha rắn DA và thu được 1,2 mg kháng thể từ 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand
đã đáp ứng miễn dịch. Kháng thể thu được có tính đặc hiệu với DA và đạt độ tinh sạch
để sử dụng làm vật liệu cho sản xuất bộ kit ELISA dùng phát hiện độc tố từ nhuyễn thể
2 mảnh vỏ.
Từ khoá: Domoic acid, bovine serum albumin, ELISA, kháng thể đa dòng

xiii


LỜI MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Takata và cộng sự (2009) phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA)
trong loài nhuyễn thể Spondylus tại vùng biển châu Á bao gồm Nhật Bản, Thái Lan,
Philippin và Việt Nam. Tiếp theo, Đào Việt Hà và cộng sự (2009) cũng cơng bố đã
phát hiện độc tố này trong lồi hai mảnh vỏ Spondylus versicolor sống tại đầm Nha
Phu, Khánh Hịa, Việt Nam với hàm lượng lên tới 150 µg/g mơ mềm trong khi giới
hạn an tồn của độc tố DA trong sản phẩm thuỷ sản là 20 g/g mô mềm (AOAC,
1990). Những phát hiện này cho thấy nguy cơ tích luỹ độc tố DA trong sinh vật biển,
đặc biệt là các lồi nhũn thể thân mềm, có thể dẫn đến tình trạng ngộ độc thực
phẩm cho cộng đồng. Hiện nay, việc kiểm sốt chất lượng, an tồn thực phẩm trong
tất cả các công đoạn sản xuất thủy sản đang được đẩy mạnh vì đây là một trong
những tiêu chuẩn cần thiết phục vụ nhu cầu thị trường quốc tế và trong nước.
Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám
sát độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC).
MBA được một số quốc gia khu vực Đông Nam Á lựa chọn là phương pháp giám sát
độc tố DA quốc gia do một số ưu điểm của kỹ thuật MBA là thời gian thử nghiệm nhanh
(trong vịng 24÷48 tiếng), giá thành rẻ (khoảng 20 USD/thử nghiệm). Tuy vậy, MBA

cũng có khá nhiều nhược điểm như sai số khá lớn (± 20%) và phụ thuộc vào chất lượng
nguồn sinh vật giống - dòng chuột nhắt trắng Swiss swiss (được cung cấp bởi một số cơ
sở y tế như Viện Vắc-xin, Viện Vệ sinh Dịch tễ…). Hiện nay, dịng chuột trắng này có
nguy cơ bị thối hóa do được giữ và nhân giống bằng phương pháp lai cận huyết trong
một thời gian rất dài. Trong phương pháp MBA, sức khỏe của sinh vật thử nghiệm là
điều kiện quan trọng đảm bảo tính chính xác của kết quả. Nghiên cứu của Đào Việt Hà
và cộng sự trong suốt 15 năm gần đây cho thấy, khi sử dụng dòng chuột nhắt trắng Swiss
swiss tại Việt Nam thường bắt gặp những kết quả không ổn định, dẫn đến sai số rất lớn.
Hơn nữa, theo xu hướng hiện nay trên thế giới, nhiều quốc gia không ủng hộ việc sử
dụng sinh vật sống trong các thí nghiệm độc tính cấp (gây chết cho sinh vật thử nghiệm).
Mặt khác, giới hạn phát hiện của MBA đối với độc tố DA là 150 µg/g, trong khi ngưỡng

1


an toàn thực phẩm của độc tố này trong sản phẩm hải sản lại là 20 µg/g. Do vậy, khơng
thể sử dụng MBA để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm của độc tố DA trong các sản
phẩm thuỷ sản. Trong khi đó, phương pháp xác định hàm lượng DA bằng HPLC lại khá
tốn kém, đòi hỏi đầu tư thiết bị chun biệt, người phân tích cần có kiến thức cơ bản tốt
và được huấn luyện, đào tạo trong thời gian dài (đôi khi tới vài năm) mới vận hành, sử
dụng thành thạo hệ thống và cho kết quả chính xác. Chính vì thế, việc tìm kiếm một
phương pháp thử nghiệm sinh học khác, ưu việt hơn để thay thế MBA tại Việt Nam là
cần thiết.
Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant
Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương
pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA, hứa hẹn là một trong kỹ thuật được
AOAC lựa chọn là phương pháp chuẩn quốc tế do những điểm ưu việt về giới hạn phát
hiện thấp, độ chính xác cao hơn hẳn MBA. Việc tìm tịi, phát triển phương pháp đánh
giá nhanh độc tố này là cấp thiết khơng chỉ với Việt Nam. Để có kit thử nhanh ELISA
cho độc tố DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại

độc tố DA. Trong khi đó, độc tố DA có khối lượng phân tử thấp (312 đ.v.c), khơng có
bản chất protein nên không thể tạo hiệu ứng miễn dịch khi được đưa vào cơ thể động
vật. Để có được phản ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng độc tố DA từ động vật thử
nghiệm, cần phải có một kháng ngun thích hợp mang tính chất độc tố DA và protein
thích hợp cho quá trình sản sinh kháng thể. Mặt khác, liều miễn dịch, cách gây miễn
dịch, thời gian ủ cũng là những chỉ tiêu rất quan trọng trong cơ chế tạo miễn dịch của
sinh vật thử nghiệm.
Thuỵ Điển, và gần đây là Nhật Bản đã nghiên cứu phát triển bộ kit ELISA dùng
cho độc tố gây mất trí nhớ tạm thời (Amnesic Shellfish Poisoning - ASP) (ASP-ELISA),
nhưng cho đến hiện nay vẫn chưa có sản phẩm thương mại. Đối với Việt Nam, nếu sử
dụng kit ELISA của nước ngoài sẽ gặp phải khó khăn do giá thành quá cao (khoảng 20
triệu đồng/ kit/ 26 - 28 mẫu) và đòi hỏi phải đặt hàng với số lượng đủ lớn để hãng sản
xuất chấp nhận chi phí vận chuyển quốc tế. Mặt khác, quá trình vận chuyển trong nội
địa Việt Nam khó đáp ứng được yêu cầu về nhiệt độ bảo quản theo quy định (4 - 100C),
gây ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả.
Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về sản xuất kháng
thể đa dòng kháng độc tố DA, nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện nhanh
2


độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản với giá thành dự kiến giảm một nửa so với bộ
kit thương mại có nguồn gốc nhập ngoại, đáp ứng nhu cầu thị trường Việt Nam về an
toàn thực phẩm biển một cách chủ động; từ sự tài trợ kinh phí của chủ nhiệm đề tài
“Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện nhanh một số độc tố vi tảo trong sản phẩm thủy
sản” thuộc “Chương trình trọng điểm ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông
nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020”, chúng tôi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện
nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)”.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung

Thu nhận được kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh
độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid).
Mục tiêu cụ thể
- Điều chế được phức hợp kháng nguyên DA-protein tải có tính sinh miễn dịch từ
kháng ngun khơng hồn chỉnh DA.
- Thu nhận được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ.
3. Nội dung của đề tài
1) Điều chế phức hợp kháng ngun DA-protein tải có tính sinh miễn dịch hoàn
chỉnh;
2) Gây miễn dịch trên đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng
nguyên DA-protein tải;
3) Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng.
4. Phạm vi nghiên cứu
- Điều chế phức hợp kháng nguyên bằng cách cộng hợp phân tử DA với protein
tải BSA thơng qua cầu nối hố học DSS.
- Thực nghiệm gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand.
- Thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu sau liệu pháp miễn dịch.
- Thử nghiệm sử dụng kit ELISA được chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng độc tố
DA thu nhận được để phân tích độc tố DA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ.

3


5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học: đây là nghiên cứu hoàn toàn mới tại Việt Nam, không bị cạnh
tranh trên thị trường trong nước. Các quy trình cơng nghệ được triển khai tạo điều kiện
phát triển phương pháp quản lý sử dụng tốt và nâng cao giá trị nguồn tài nguyên biển.
Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài góp phần vào việc giảm thiểu nguy cơ ngộ
độc thực phẩm từ độc tố vi tảo cho cộng đồng và tránh thiệt hại về kinh tế trong lĩnh vực
xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản.

4


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH
POISONING - ASP)
Được phân lập lần đầu tiên từ loài tảo đỏ Chondria armata (Takemoto và Daigo,
1958) nhưng domoic acid (DA) chỉ được biết có nguồn gốc từ vi tảo biển khi có vụ ngộ
độc đầu tiên cho người sau do ăn Vẹm xanh Mytilus edulis xảy ra vào năm 1987, tại đảo
Prince Edwards, vùng Đông bắc Canada. Đây cũng là lần đầu tiên DA được xác nhận
gây ra triệu chứng ngộ độc mất trí nhớ tạm thời ở người. Trong vụ ngộ độc này, 03
người chết, 19 người phải điều trị tại bệnh viện (trong đó 12 người trong tình trạng ngộ
độc trầm trọng, phải chăm sóc đặc biệt) và hơn 100 người khác có các triệu chứng rối
loạn tiêu hóa và thần kinh (Wright và cộng sự, 1989). Triệu chứng lâm sàng của ngộ
độc ASP bao gồm buồn nôn, nôn mửa, đau co thắt vùng bụng, mất trí nhớ, giảm sự tỉnh
táo, lên cơn, lẫn lộn, và mất định hướng (Perl và cộng sự, 1990a, 1990b; Teitelbaum và
cộng sự, 1990; Todd, 1993). DA trong vẹm xanh gây ra vụ ngộ độc nổi tiếng tại Canada
năm 1987 được xác định do loài vi tảo silic Pseudo-nitzschia multiseries (Bates và cộng
sự, 1989). Cho đến thời điểm hiện nay trên thế giới đã xác định được ít nhất 17 lồi
Pseudo-nitzschia, 01 lồi Nitzschia và 01 lồi Amphora có khả năng sản sinh DA (IOC,
2018).

domoic acid

glutamic acid

kainic acid

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid
Domoic acid (DA) là một amino acid với khối lượng phân tử 312 đ.v.c, cơng thức
hố học C15H21NO6, có ba nhóm cacboxyl (-COOH), tồn tại ở dạng tinh thể, tan trong
nước, có tính acid. Cho đến hiện nay, 10 dẫn xuất của DA đã được phát hiện (Zaman và
5


cộng sự, 1997; Lefebvre và Robertson, 2010), nhưng các dẫn xuất này khơng có độc
tính. DA có cấu trúc hóa học tương tự như glutamic acid và kainic acid (Hình 1.1).
1.1.1. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP
Vẹm nuôi (Mytilus edulis) được lấy mẫu trong đợt bùng phát ngộ độc ASP ở
Canada (phía đơng đảo Prince Edward) trong mùa thu năm 1987 có chứa tới 790 μg
DA/g mô ướt (cả con vẹm) (lên đến 1280 μg/g trong mơ mềm và 1500 μg/g trong tuyến
tiêu hóa) (Bates và cộng sự, 1998; Todd, 1997). Từ tháng 8-10 năm 1988, DA đã được
phát hiện ở vẹm xanh và cả trong trai vỏ mềm (Mya arenaria) ở phía tây nam Vịnh
Fundy, Canada (Martin và cộng sự, 1993).
Trong tháng 10 năm 1991, DA đã được phát hiện trong trai móng tay (Siliqua
patula) từ Oregon và Washington, Hoa Kỳ. Lượng DA đạt mức cao nhất trong tuần đầu
tiên của tháng 12 năm 1991 (mức tối đa trong phần ăn được là 147 μg/g, mức trung bình
là 106 μg/g ở tất cả các bãi biển bang Washington). Lượng DA trong trai vẫn ở mức cao
hơn mức quy định cấm khai thác là 20 μg/g trong thời gian ít nhất là 6 tháng. Lượng DA
đã giảm xuống mức < 10 μg/g vào cuối mùa xuân năm 1992, lượng DA < 5 μg/g đối với
hầu hết các khu vực lấy mẫu ven biển. DA được phân bố trong nhiều bộ phận khác nhau
của trai móng tay. Mức cao nhất được tìm thấy ở chân, tiếp theo là cơ quan nội tạng và
vòi hút (hay cổ). Mức DA ở chân trai móng tay đạt 230 μg/g (Van Apeldoorn và cộng
sự, 1999).
Sò điệp sống trong vịnh (Argopecten iradians) đã được ghi nhận là có thể hấp thu
DA lên đến mức 60 μg/g trong các tuyến tiêu hóa sau khoảng 84 giờ tiếp xúc với P.
multiseries độc. Lượng DA giảm xuống mức 5 μg/g sau 48 giờ của quá trình loại bỏ độc
tố (J. Douglas và cộng sự, 1997). Trong mùa thu năm 1993, sò biển (Placopecten

magellanicus) ở vịnh Fundy, Canada đã bị chết mà không rõ nguyên nhân. Các tuyến
tiêu hóa của sị điệp có chứa 93,4 μg DA/g. Mặc dù một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ
được ghi nhận là có chứa hàm lượng DA cao mà khơng biểu hiện bất kỳ triệu chứng
nào, sị gai (Chlamys hastata) đã bị chết nhanh chóng (trong vịng 12 giờ) sau khi tiếp
xúc với các mơi trường có P. multiseries độc (J. Douglas và cộng sự, 1997). Lượng đáng
kể DA đã được tìm thấy thường xun trong tuyến tiêu hóa nhưng khơng có trong cơ
khép của sị biển ngồi khơi ở Canada tại Georges Bank, Browns Bank và Vịnh Fundy
(Stewart và cộng sự, 1998).

6


1.1.2. Độc tính của DA
Cơ chế tác động của DA được biết đến trên các thụ thể acid amin kích thích và sự
dẫn truyền tiếp hợp. Các acid amin kích thích, đáng chú ý nhất là L-glutamate và
L-aspartate, từ lâu đã được coi là những chất có khả năng dẫn truyền thần kinh cao nhất.
Các acid amin này được ghi nhận là có thể tác động lên nhiều loại thụ quan, tính chất
đặc trưng nhất của chúng được đặt tên theo các tác nhân kích thích ngoại sinh chọn lọc
là N-methyl-D-aspartate (NMDA), kainate và quisqualate. DA là một chất tương tự
glutamate và liên kết với các thụ quan glutamate thuộc loại quisqualate bằng ái lực cao.
Glutamate cũng như phân lớp của NMDA tác động mở các kênh trên lớp màng thẩm
thấu Na+, tạo điều kiện cho các dịng Na+ có thể tràn vào và gây nên sự khử cực màng.
DA có hai đối tượng tác động chính trong hệ thần kinh trung ương; sự hình thành vùng
đồi hải mã và các khu vực liên quan đến đồi hải mã là vùng liên quan đến q trình xử
lý thơng tin của bộ nhớ, và vùng thân não. Chính vì vậy, triệu chứng mất trí nhớ trong
thời gian ngắn nhưng khơng hồi phục là biểu hiện đặc trưng của ngộ độc ASP ở người
(Perl và cộng sự, 1990b). Ở các loài gặm nhấm, DA gây ra tình trạng kém hoạt động,
lên cơn và gãi đặc trưng (Work và cộng sự, 1993) - đây là triệu chứng lâm sàng điển
hình trong phương pháp thử nghiệm sinh học trên chuột đối với độc tố này.
Có những bằng chứng chỉ ra rằng người dân sống trên đảo của Nhật Bản đã đánh

giá các chất chiết xuất từ tảo biển có chứa DA như một loại chất có giá trị. Lồi tảo đỏ
Chondria armata chứa DA đã được sử dụng để điều trị bệnh giun đũa trong nhiều thế
kỷ và là thuốc trừ sâu (Higa và Kuniyoshi, 2000). Thử nghiệm này rõ ràng đã được thực
hiện để thử nghiệm các tính chất diệt giun của DA và các đơn liều 20 mg với độ tinh
khiết không xác định được dùng cho người lớn và trẻ em mà khơng gây ảnh hưởng có
hại (Iverson và Truelove, 1994).
Tuy nhiên, DA độc với cả phần trung tâm và ngoại vi của hệ thống thần kinh ở
người. DA là một chất gây nơn nên có thể gây nơn khan cũng như ói mửa khi nó tác
động vào trung tâm gây nơn trong khu vực não thất. Nó tạo ra một hội chứng trên sợi
trục thần kinh cảm giác vận động, gây mất trí nhớ, hơn mê, co giật và tử vong. Do tác
động của nó vào bộ nhớ, trong số các tác động gây bệnh khác, ngộ độc DA được đặt tên
là ngộ độc mất trí nhớ do nhuyễn thể (ASP) (Todd, 1993; Watters, 1995). Trong đợt
bùng phát ngộ độc ASP đầu tiên vào năm 1987 tại đảo Prince Edward ở Canada, 107
trường hợp ngộ độc đã được báo cáo. Các triệu chứng ngộ độc đầu tiên được ghi nhận
7


sau khi ăn vẹm 15 phút đến 38 giờ (trung bình 5,5 giờ). Các triệu chứng thường gặp
nhất là buồn nôn (77%), nôn (76%), đau bụng (51%), đau đầu (43%) tiêu chảy (42%)
và mất trí nhớ (25%) (Todd, 1993).
Các ảnh hưởng do sự tiếp xúc lâu dài của con người với DA ở nồng độ thấp trong
vẹm hoặc cá chưa được biết đến (Van Apeldoorn và cộng sự, 1999). Một người đàn ơng
84 tuổi đã có biểu hiện động kinh sau khi nhiễm độc cấp tính DA. Một năm đầu khơng
có biểu hiện gì, nhưng sau đó ơng đã có các biểu hiện của bệnh động kinh thùy thái
dương. Ba năm rưỡi sau khi nhiễm độc cấp tính bệnh nhân tử vong do viêm phổi. Sau
khi khám nghiệm tử thi cho thấy bệnh nhân bị xơ cứng nặng cả hai bên của vùng đồi hải
mã. Điều này chỉ ra rằng vùng đồi hải mã của con người là dễ bị tổn thương với các kích
thích độc hại của thụ quan kainate (Cendes và cộng sự, 1995).
1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ VI TẢO
1.2.1. Thử nghiệm sinh học trên động vật

Ở hầu hết các nước trên thế giới, phương pháp thử nghiệm sinh học trên chuột
(Mouse Bioassay - MBA) được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu điều tra, phát hiện
và giám sát độc tố vi tảo. Mặc dù quy trình của MBA rất khác biệt tùy từng loại độc tố,
nhưng có chung một nguyên tắc cơ bản là đánh giá hiệu ứng của độc lực tổng số đối với
sinh vật thử nghiệm. Dịch chiết độc tố được tiêm vào phúc mạc chuột, sau đó quan sát
triệu chứng ngộ độc lâm sàng của chúng và so sánh với chuột tiêm độc tố chuẩn
(Hallegraeff, 1995). Tuy nhiên, điểm hạn chế của MBA là có sai số khá lớn (± 20%)
phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe của từng sinh vật thử nghiệm và chỉ cung cấp thông
tin về tổng độc lực chứ không cung cấp thông tin về thành phần và bản chất độc tố. Mặt
khác, gần đây có những ý kiến phản đối việc sử dụng sinh vật sống làm thí nghiệm độc
tính cấp (gây chết) và tình trạng tâm lý ức chế cho người thao tác thí nghiệm khi phải
giết chết một số lượng lớn sinh vật. Đối với độc tố ASP, MBA còn vấp phải một hạn
chế rất lớn là giới hạn phát hiện của phương pháp này 150 μg/g mơ mềm trong khi giới
hạn an tồn thực phẩm đối với độc tố này trong sản phẩm hải sản là 20 μg/g.
Mặc dù có khá nhiều hạn chế, nhưng phương pháp này vẫn được công nhận là
phương pháp truyền thống trong giai đoạn trước năm 2000 để điều tra tổng độc lực có
mặt trong các sản phẩm hải sản để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm cho người tiêu
dùng.

8


1.2.2. Phương pháp hoá học
1.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng
Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC) bao gồm lớp
gel mỏng tráng trên bề mặt kính, hoặc nhơm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay
pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất chấm trên bản gel. TLC
thường được dùng để phân tách các chất phân tử nhỏ như các loại đường, các hợp chất
polyphenol, carotenoid,… (Phan Tuấn Nghĩa, 2012).
Quilliam và cộng sự (1998) đã áp dụng thành công phương pháp TLC với sị điệp,

trai móng tay và các mẫu cá cơm bị nhiễm độc tố DA, và đưa ra kết luận phương pháp
này có thể áp dụng thành cơng để sàng lọc thường quy các mô của nhuyễn thể hai mảnh
vỏ trong những phịng thí nghiệm khơng được trang bị hệ thống sắc ký lỏng (Liquid
Chromatography - LC). TLC là một phương pháp hóa học hữu ích để xác nhận DA trong
các mẫu xét nghiệm dương tính bởi các phương pháp thử nghiệm ví dụ như thử nghiệm
miễn dịch.
1.2.2.2. Phân tích acid amin
Các dịch chiết từ dung dịch thơ của sinh vật phù du có thể được phân tích trực tiếp
bởi một hệ thống phân tích acid amin. Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với
DA vào khoảng 1 μg/mL, khi tiêm khoảng 50 mL dịch chiết vào cột. Mặc dù giới hạn
phát hiện của phương pháp phân tích acid amin gần với các phương pháp sắc ký lỏng
kết hợp với phát hiện bằng tia cực tím (Liquid Chromatography with Ultra Violet
detection - LC-UV), nó khơng hiệu quả đối với các mẫu có chứa nồng độ cao các acid
amin tự do và thời gian phân tích thì kéo dài hơn. Chất chiết xuất từ nhuyễn thể hai
mảnh vỏ có thể được phân tích bằng phương pháp này sau q trình làm sạch cần thiết
và cơ đặc mẫu (Wright và Quilliam, 1995).
1.2.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tất cả các loại độc tố vi tảo đều có thể được phân tích về hàm lượng trong dịch
chiết bằng các phân tích hóa học như sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance
Liquid Chromatography - HPLC). Nguyên tắc của phương pháp này là tách các phân tử
độc tố dựa vào độ linh động di chuyển của chúng trong điều kiện đặc biệt về nhiệt độ,
bản chất dung dịch đệm, vận tốc dịng chảy qua cột, áp suất và bước sóng kích hoạt,
bước sóng hấp thụ đối với từng độc tố. Tùy thuộc vào trọng lượng phân tử, các dẫn xuất
9


của một độc tố sẽ có thời gian lưu khác nhau trên cột sắc ký. Sự có mặt và hàm lượng
của từng chất sẽ được xác định bằng cách so sánh với thời gian lưu của chúng với thời
gian lưu của độc tố chuẩn (Oshima, 1995). Do vậy, HPLC sẽ cung cấp thông tin về thành
phần độc tố (các dẫn xuất) và hàm lượng của chúng trong mẫu nghiên cứu. HPLC là

phân tích hóa học hiệu quả đối với độc tố gây liệt cơ (Paralytic Shellfish Poisoning PSP), độc tố gây tiêu chảy (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP), ASP do độ nhạy cao
so với MBA. Do đó phương pháp này được ghi nhận là cơng cụ phân tích quan trọng
trong nghiên cứu độc tố vi tảo. Tuy nhiên, phương pháp hóa học địi hỏi trang thiết bị
đắt tiền, thời gian thực hiện lâu, độc tố chuẩn khá đắt tiền và chỉ được cung cấp từ những
phịng thí nghiệm nhất định ở một số nước như Nhật Bản, Canada, Mỹ,...
1.2.2.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE)
Phương pháp này tương đối đơn giản cho phép phân tách nhanh chóng với độ phân
giải cao các hợp chất có cực phức tạp. Hai bể chứa chất lỏng được nối với nhau bằng
một ống mao dẫn hẹp làm bằng thủy tinh thạch anh và trong đó được làm đầy bằng bộ
đệm. Sau khi một lượng nhỏ của mẫu chiết xuất (thường là 1-10 nL) được bơm vào các
mao mạch, một điện áp khác biệt trong khoảng 20-30 kV được đặt tại các đầu của các
mao mạch. Các thành phần ion di chuyển dưới dạng các dải hẹp tới các mao mạch, cuối
cùng đi qua một máy dò (hấp thụ UV, huỳnh quang) (Wright và Quilliam, 1995).
Nguyen và cộng sự (1990) đã báo cáo về một giới hạn phát hiện khoảng 2 μg/g của chiết
xuất đã qua xử lý của mô vẹm.
1.2.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào
Thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào bao gồm miễn dịch học, enzyme và độc học tế
bào, được phân chia thành 02 nhóm là thử nghiệm cấu trúc và thử nghiệm chức năng.
Phương pháp thử nghiệm chức năng dựa vào tính chất hóa sinh của độc tố (ví dụ, cơ chế
bịt kênh trao đổi ion Na+ của độc tố PSP và độc tố thần kinh (Neurotoxic Shellfish
Poisoning - NSP), từ đó độc tố được định lượng bằng mối tương quan thuận với độc
tính đặc hiệu của chúng trong thử nghiệm (Cembella và cộng sự, 1995). Phương pháp
thử nghiệm cấu trúc dựa vào mối tương tác giữa chất được phân tích (độc tố) và yếu tố
nhận biết (ví dụ vị trí kênh trên màng tế bào thần kinh bị độc tố khoá lại). Một trong
những phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào được phát triển và ứng dụng
trong thời gian gần đây là phương pháp miễn dịch học liên kết enzyme (Enzyme Linked
Immunosorbant Assay - ELISA) theo nguyên lý xác định kiểu huyết thanh của độc tố,
10

dựa vào phản ứng chuyên biệt của kháng thể với kháng nguyên (độc tố). ELISA cung
cấp thông tin về số lượng các phân tử độc tố trong mẫu thử nghiệm, trên cơ sở xác định
số phân tử tham gia phản ứng kết hợp với kháng thể đặc hiệu. Với độ nhạy tốt, thời gian
thực hiện nhanh, khơng địi hỏi trang thiết bị chuyên sâu đắt tiền, ELISA là một ứng cử
viên hứa hẹn sẽ đáp ứng yêu cầu về phương pháp ứng dụng trong điều tra nghiên cứu
và giám sát độc tố vi tảo trên thế giới. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc phản ứng
đặc hiệu giữa kháng nguyên (độc tố) và kháng thể do cơ thể sinh vật sản sinh ra nhằm
chống lại sự xâm nhập của độc tố vào cơ thể sinh vật theo cơ chế miễn dịch.
ELISA được dùng để phát hiện sự hiện diện của DA trong huyết thanh và nước
tiểu của động vật có vú được phát triển bằng cách sử dụng các kháng thể đa dịng được
sản sinh trên thỏ. Phương pháp có hiệu quả trong việc xác định nồng độ DA trong nước
tiểu chuột, với một giới hạn định lượng mức dưới là 40 ng/mL. Nồng độ DA ở huyết
tương chuột và khỉ khơng thể được xác định chính xác bằng cách sử dụng huyết thanh
miễn dịch này trong phương pháp ELISA. Hệ thống phát hiện này đã không được coi là
đối tượng để thử nghiệm sâu rộng hay để sử dụng như là một kỹ thuật thường xuyên
(Cembella và cộng sự, 1995; Smith và Kitts, 1994). Phương pháp trên có liên quan đến
nhiều bước và khơng có giới hạn phát hiện mong muốn. Ngoài ra, phương pháp phụ
thuộc vào sự bất hoạt vật lý của DA trên microplate thông qua một protein vận chuyển.
CovaLink NH® microplates đã phát triển một dự án trong đó nhóm amin thứ cấp được
dùng trong ELISA làm khớp nối peptide, steroid, oligonucleotides, và deoxyribonucleic
acid (DNA) với các bề mặt microplate một cách trực tiếp và hóa học. Việc sử dụng các
microplate CovaLink để đơn giản hóa và cải tiến phương pháp ELISA, đã dẫn đến việc
tạo ra hai phiên bản khác nhau của phương pháp ELISA, một là dựa trên tính chất vật
lý của DA, hai là dựa trên khả năng cố định hóa học của DA (Osada và cộng sự, 1995).
Các phương pháp ELISA để xác định DA trong dịch cơ thể của người và các chất
chiết xuất từ vẹm đã được phát triển bởi Smith và Kitts (1994, 1995). Các xét nghiệm
sử dụng một loại huyết thanh miễn dịch đa dòng được tạo ra ở chuột để kháng lại phức
hợp ovalbumin-DA. Thử nghiệm được sử dụng để định lượng nồng độ DA trong các
dịch lỏng trong cơ thể người với domoate tinh khiết. Các giới hạn định lượng thấp hơn
0,2 μg/mL trong nước tiểu; 0,25 μg/mL trong huyết tương và 10 μg/mL trong sữa. Giới

hạn định lượng tương đối cao trong sữa có thể là do hàm lượng chất béo cao của sữa.
Các tác giả cho rằng các mẫu sữa của con người có thể cần được tách chiết trước khi
11


phân tích (Smith và Kitts, 1994). Các thí nghiệm xác định lượng cịn lại trong cả hai
dịch chiết của mơ trai trong dung dịch nước và dung dịch acid đã chứng minh rằng nồng
độ DA có thể được đo chính xác tương ứng khoảng 8% giá trị thực tế. Giới hạn phát
hiện là 0,25 μg/mL chất chiết xuất. Giá trị này đại diện cho 0,5 μg DA/g mô vẹm khi
các chiết xuất acid được phân tích (theo AOAC) (Smith và Kitts, 1995). Khi so sánh
trực tiếp phương pháp xác định DA bằng LC và ELISA thấy có sự tương quan (r = 0,96),
mặc dù các phương pháp ELISA cho kết quả cao hơn ở hầu hết các mẫu. Điều này là do
một phần DA bị mất mát trong chiết xuất pha rắn trước khi tiến hành phương pháp
HPLC hoặc có thể là do sự hiện diện của các DA đồng phân. Đồng phân DA khơng
đồng nhất với DA thì sẽ khơng được xác định trong các phân tích LC thơng thường. Tuy
nhiên, phương pháp ELISA có thể xác định DA tổng số bao gồm một diastereoisomer
và ít nhất hai đồng phân cis-trans (Smith và Kitts, 1995).
Garthwaite và cộng sự (1998) sử dụng các kháng thể được nuôi cấy trong cừu để
kháng lại các phức hợp, liên kết thông qua các nhóm amin thứ cấp của DA, để phát triển
một phương pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp. Phương pháp ELISA có giới hạn phát
hiện dưới 0,1 ng/mL, giới hạn định lượng (Limit of Quantification - LOQ) 0,15 ng/mL
và phạm vi làm việc là 0,15-15 DA ng/mL. LOQ tương đương với 38 μg DA/kg thịt
nhuyễn thể, thấp hơn 500 lần so với giới hạn an toàn của thịt là 20 mg/kg.
Phương pháp ELISA được phát triển bởi Garthwaite và cộng sự (1998) đã được
thương mại hóa bởi Biosense®, được sản xuất dưới dạng một bộ kit, và chúng được dự
định sử dụng trong giám sát thường xuyên hàm lượng DA trong các động vật thân mềm
ni để kiểm tra xem có tn thủ các giới hạn quy định hay không. Theo các nhà sản
xuất thì phương pháp này cũng được áp dụng để định lượng DA trong các thành phần
khác. So với phương pháp ban đầu được thực hiện năm 1998, LOQ của bộ kit đã được
giảm xuống 10 μg/kg nhuyễn thể. Trong khi đó, các kháng thể được phát triển bởi

Garthwaite là kháng thể đa dòng tự nhiên, Kawatsu và cộng sự (1999) đã sản xuất được
kháng thể đơn dòng kháng lại DA và áp dụng chúng trong một phương pháp miễn dịch
cạnh tranh gián tiếp. Phạm vi xác định định lượng DA và LOQ trong nhuyễn thể đã
được ước tính là 0,15-10 DA ng/mL và tương ứng < 40 ng DA/g, do đó khá tương đồng
với các đặc tính được mô tả theo phương pháp ELISA của Garthwaite và cộng sự (1998).

12