Nghiên cứu chẩn đoán nhanh staphylococci và tính đề kháng methicillin của chúng bằng kỹ thuật PCR đa mồi

NGHIÊN cứ u CHẨN ĐỐN NHANH STAPHYLOCOCCI VÀ TÍNH ĐÈ
KHÁNG METHICILLIN CỦA CHÚNG BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI
Những người thực hiện: Trần Thanh Loan, Trương Đình An Sơn
Bộ mơn Vi sinh, Trường Đại học Kỹ thuật Y Dược Đà Nắng
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Đình Bỉnh
Bộ mơn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Huế
ĐẶT VÁN ĐỀ
stảphyỉococci ỉà một tác nhân gây nhiều nhiễm
khuẩn thường gặp, chúng có thể gây nên nhiều bệnh
lý khác nhau như nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn
da, nhiễm khuẳn đường tiết niệu, nhiêm khuẩn vết
thương, vết bỏng, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn
huyểt, viêm tủy xương.,.[2], [3], [4], [5]. Các nhiễm
khuần do staphyiococci thương điều irị khó khăn do vi
khuển kháng íhuốc, rất nhiều cac staphylococci kháng
thuốc, đa kháng thuốc được phân lập từ bệnh nhân.
Các vi khuẩn kháng Methiciliỉn íhường kháng với nhiều
thuốc khác, nên nó được xem như là “siêu vi
khuẩn”[2], [3], [6]. Việc chẩn đoản sớm sự nhiễm
khuẩn do staphylococci và tính kháng thuốc của
chúng có vai trị rất quan trọnp trong điều trị. Nhiều
nghiên cứu ứng dụng các yểu to tạo nên độc lực mạnh
cua Staphylococci như các yếu tố xâm nhiêm, sinh độc
íố, sinh các men phân huy protein, chất diệt bạch
cầu...Trong đó, FemA, Coagulase là những chỉ thị
thường dùng để phát hiện các staphylococci có độc
lực ờ các phịng thí nghiệm.

Tại Việt Nam, các nghiên cửu liên quan đến chần
đoán, phát hiện độc lực của các staphylococci và tính
kháng Methỉciliin bằng các phương pháp truyền thống,

tuy nhiên các nghiên cứu ve kỹ thuạt sinh học phân tư
đe phát hiện gen mã hóa FemA, yếu tố độc iực của
các Staphylococci như Coagulase hoặc gen mecA đề
kháng Methicillin của các staphylococci chưa có nhiều

t2]. ~
Đê tài: “Nghiên cứu chân đốn nhanh
Staphylococci và tính đề kháng Methiciliin của chúng
bằng kỹ thuật PCR đa mồi” nham mục tiêu xây dựng
quy trỉnh chẩn đốn nhanh staphylococci, xác định
gen mã hóa FemA, yếu íố độc !ực Coagulase và tinh
đề kháng kháng sinh Methicillin của chúng bằng kỹ
thuật PCR và so sánh với các phương pháp chẩn
đốn Staphylococci phịng thí nghiệm truyền thống,
phát hiện Coagulase và tính đe kháng kháng sinh
Methicilỉin của chúng.

ĐĨI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

1 . Đối tượng nghiên cứu
- 80 chủng VI khuẩn của các staphylococci gồm 45

chủng S.aureus và 35 chủng staphyococci coaguỉase
âm tính được phân iập bằng phương pháp ntioi cấy
thường quy.
- Cac chủng vi khuẩn làm chứng gồm 01 chủng s.
aureus có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+), 01
chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm
Coagulase (-), mecA (-), FemA (-).
2. Vậỉ liệu nghiên cứu

2.1. Hóâ Chat, sinh phẩm

- Các loại môi trường nuôi cáy và thực hiện kháng
sinh đồ: Mơi trường ni cấy: íhạch máu, thạch
thưởng, Chapman, BHI, Muelíer HỈnton Agar, mơi
ỉrường sinh vậí hóa học...
- Các loại vật iíệu khác: Thuốc nhuộm Gram, Huyết
tương thỏ, H20 2 3%, Nước muối sinh lý vô khuẩn, các
loại đĩa kháng sinh Oxacillin và Cefocitin.
- Các loại hóa chất để thực hiện PCR: Agarose,
duncj dịch điện di, Ethidium Bromide, thang DNA
chuan.
2.2. Thiết bị, dụng cụ
- Các loại thiết bị: Tu ấm 350C và 370C, máy iắc
rung (Vortex), tủ lạnh, các loại máy ly tâm, tủ an íồn
sinh học, máy luân nhiệt, buồng điện di, bàn đèn đọc
kết quả điện di...
- Các loại dụng cụ: Đèn cồn, kẹp đĩa kháng sinh,
thước đo đường kính vỏng ức chế, khuyên cấy, tăm
bông vô khuẩn, các loại vật iỉệu đề thực hiện PCR...
3.
Phương pháp nghiên cứu
3.1. Kỹ thuật nuôĩ cắy và định danh vi khuẩn
Staphylococci
Các bệnh phẩm được cấy trên các môi trường đặc,
lỏng tùy theo yêu cầu kỹ thuật của từng loại mẫu
ngNệm. Khi có khuẩn lạc nghi ngờ (màu vàng trên
Chapman, tan máu B trên thạch máu...), làm phiến
phếí nhuộm Gram kiểm tra hình thải. Tiến hành phân
lập và định danh theo quy trình truỵền thống chẩn

đốn các Staphylococci là: cầu khuan Gram dương
đứng đám, catalase dương tính, xác định
Staphylococci khi có các tiêu chuẩn sau: sắc íố vàng,
lên men đường mannit, có coagulase dương tính. Các
Síaphyiococci coagulase âm tính khi có hay khơng lên
men đường mannit, coaguỉase âm [2J,[333.2. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn staphylococci
kháng Methicillin qua trung gian mecA bằng kỹ
thuật sử dụng đĩa Cefoxitin (Theo CLSl 2011): Với
khoanh giấy cefoxitin 30ụg tren môi trường Mueiler
Hinton Agar, trong Điều kiện nuôi cấy: 33-35 °c/16 18 giờ. Đọc kết quả: ắ 21 mm = mecA diPơng tính; ằ
22 mm = mecA âm tính. [1]
3.3. S ử dụng kỹ thuật PCR tìm gen mã hóa
FemA, Coagulase và gen mecA
- Tách chiết DNA từ khuẩn lạc staphylococci:
Tách chiết DNA bằng phương pháp nhiệt. DNA
của vi khuẩn sẽ được chuẩn b ĩ bằng cách lấy 1
khuẩn lạc cho vào ống eppendorf có chứa 250 MÍ
nước cẩt. Huyền dịch vi khuẩn này sẽ được chưng
cách thủy ở nhiệt độ 990C trong 10 phút. Sau đo
quay ly íam 10.000 vổng/phút trorìg 10 phút. Bỏ phần
cặn lắng, lấy phần dịch noi đề sử dụng cho phản ứng
PCR [2], ự ], [8].

514


- Cặp mồi (Primers): Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tt

Primers

Coagulase 5'-ATAGAGATGCTGGTACAGG-3’
5'-GCTTCCGAĨTGTTCGATGC-3
mecA 5-CCTAGTAAATGCTCCGGAA-3’
2
5’-CTAGTCCATTCGGTCCA-3
FemA 5'-AAAAAAGCACATAACAAGCG-3‘
3
5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3'
* Thực hiện phẫn ứng PCR

Một phản ứng PCR y=25|il gồm: 1.5mM MgC!2,
200 ịjM mỗi loại dNTP, 0,625 unit Taq DNA
polymerase, 0,5ụM mỗi mồi, Taq buffer, nưởc cất 2
iần*
Các bước tiến hành: Đối với mỗi mẫu, thực hiện
như sau: 20|il mix PCR pha ở trên + 5ịi\ dịch DNA tách
chiết, cho vao eppendorf 0,2mi. Đặt chường trình cho
máy iuân nhiệt hoạt động:________________________
Bước 1:
95°c
5 phút
1 chu kỳ
95°c
30 giây
Bước 2:
51°c
40 chu kỳ
30 giâv
72°c
30 giây

Bước 3:
72°c
6 phút
1 chu kỳ

sân phấm

Chức nănq

Tham khảo từ

603-872

Coaguíase

Hookey eí ai. (1998) [3]

314

MRSA

Nizami Duran (2012) [6]

132

S.aureus

Nizami Duran (2012) [6]

Điện di để phát hiện sản phẩm PCR: sản phẩm tạo

thành được điện di ờ điện thế 80V, trên thạch agarose
1 % nhuộm với chất màu huỳnh quang tự nhiên và đọc
kết quả ở buồng đọc huỳnh quang. Sự hiện diện cua
sản phẩm sẽ được so sánh với thang mẫu ĐNA ladder
100bp.
4.
X ử lý số liệu: Xử lý các số liệu thu thập đưực
bằng phương pháp thống kê y học. Độ nhạy và độ đạc
hiệu của các thử nghiệm tính theo cơng thức của bảng
2x2 ià: Độ nhạy = a/a+c; Độ đặc hiệu = d/b+d [9].

KẾT QUẢ NGHIỀN cứu
1. Tính chất sỉnh vật học của các staphylococci phân lập được
Bảng 1. Tính chất sinh vật học của các staphylococci
Tính chất
Vi khuẩn
'
S. aureus
Staphylococci coagulase
âm tính

Câu khuấn Gram (+)
n
%
45
100,0
35

100,0

Catalase (+) Mannit (+)
n
%
n
%
45 100,0 45 100,0
35

100,0

14

40,0

Coagulase (+)
n
%
45
100,0

0

0

Tan máu {+)
n
%
39
86,7

sẳc íố vànq
n
%
45 100,0

28

29

80,0

82,9

Các Staphylococci được định danh và xác định độc
Bảng 3. Kiểu gen mã hóa chủng vi khuẩn, độc lực
lực bằng phướng pháp truyền thống dựa vào tiêu bẩn
và kháng Methiucillin cùa các chủng staphylococci
nhuộm Gram, tính chất Caíalase dương tính, làm đơng
khảo sát
Các chủng
huyết tương, lên men đường Mannit, tính chất tan máu
FemA mecA Coagulase
Số chủng thử
vi khuẩn
và khuẩn íạc có sắc tố màu vàng.
í+ì í-ì (+) {-) í+ì
(-)
45
45 0 •40 5 45
2.

Đặc điểm kiểu hình và kĩểu gen về độc iực và S.aureus
0
sta coa (-)
35
3 32 15 10
3
32
kháng Methiciliin của hai nhóm staphylococci
Tổng cộng
80
48 32 55 25 48
32
khảo sát
100,0% chủng có S.aureus có Coagulase dương
Bảng 2. Tính kháng thuốc Methiucillin của các
tính với thử nghiệm Coagulase trên phiến kính đều có
gen mã hóa Coagulase, các staphylococci Coaguiase
Tính
kháng
Methiciilin
bằng
test
Số
Các chùng vi
Cefoxitin qua trung gian mecA
âm tỉnh (thử nghiệm Coagulase trôn phiến kính và
chủng
khuẩn
Khánq
Nhạy

trong ống nghiệm) có 8,6% (3 chủng) có gen mã hóa
thừ
N
%
n
%
Coagulase.
S.aureus
45
40
88,9
5
11,1
100,0% chủng có s.aureus có Coaguiase dương
sta coa (-)
35
15
42,9
20
57,1
tính với thử nghiệm Coagulase trên phien kính đều có
Tống cộng
80
55
68,8
25
31,2
gen mã hóa FemA, các staphylococci Coagulase âm
tính (thử nghiệm Coagulase tren phiến kính và trong
trung gian mecA qua test Cefoxitin kết quà cho thấy

ống nghiệm) có 8,6% (3 chùng) có gen mã hóa FemA.
các chùng S.aureus kháng Cefoxitin đếrì 88,9%, các
88,9% chủng có S.aureus có gen mã hóa mecA,
chùng staphylococci coaguiase âm tính kháng
các Staphylococci Coagulase âm tính có 42,9% (15
Cefoxitin chi CO 42,9%. Tỳ !ẹ đề kháng chung của các
chủng) có gen mã hóa mecA.
chủng Staphylococci là 68,8%.

515


1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1314 15

Lane 7: DNA ladder.
Lane 14 chủng s.aureus kháng Methiciilin (chứng
dương có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+).
Lane 15: Chung V! khuẩn Streptococcus pyogenes
(chứng âm có Coagulase (-), mecA (-), FemA (-),
Lanes 2, 3, 9: chủng vi khuẩn có Coagulase (+),
mecA (+), FemA (+).
Lanes 1,2, 3, 5, 6, 8, 9 ,1 1 ,1 2 , 13: chùng vi khuẩn
có FemA (+).
Lanes 4, 10: chủng vi khuẩn chứng Ps.
aeruginosa, E.coli CÓ FemA (-).
Bảng 4. Đánh giá giá trị của các kỹ thuật xác định
Coaguíase của các chủng S.aureus
"■\i$ếí quả PCR
Test Coagầse^,
S.aureus

Coagulase (+)
Staphylococci
Cốgúlase (-)
Tổng cộng

Có gen mã
hóa
Coagulase

Khơng có gen
mã hóa
Coagulase

Tổng
cộng

45

0

45

3

32

35

48

32

80

Độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định
Coagulase cùa staphylococci là 93,8%, kỹ thuật
truyền thống cũng đã bỏ sót 3 chủng staphylococci
có gen mã hóa Coagulase. Độ đặc hiẹu cua kỹ thuật
truyen thống xác định Coagulase của các chủng
Staphylococci là 100 ,0%.
Bảng 5. So sánh các kỹ thuật xác định tính kháng
Methiciliin của S.aureus
PCR
Kỹ thuật
Tồng
MecA (+)
MecA {-)
Cefoxitin (+)
40
0
40
Cefoxitin (-)
0
5
5
40
Tống
5
45

Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện
tính kháng Methicillín ờ s.aureus !à 100,0%, độ đặc
hiệu là 100,0%.
Bảng 6. So sánh các kỹ thuật xác định íính kháng
Methicillỉn của staphylococci coagulase âm tính
Kỹ thuật
Cefoxitin (+)
Cefoxitin (-)
Tống

PCR
MecA (+)
15

0
15

MecA (-)

0
20
20

Tồng
15

20
35

Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện

tính kháng Methiciilin ở staphylococci coagulase âm
tính là 100,0%, độ đặc hiệu là 100 ,0%.
BÀN LUẬN
Nghiên cứu 80 chùng của các staphylococci
được định danh và xác định độc lực bằng phương
pháp truyền thống dựa vào tiêu bản nhuộm Gram,
tính chất Catalase dương tính, làm đơng huyết
tương, lên men đường Manrtit, tính chất tan máu và
khuẩn lạc có sắc tố màu vàng. Dựa vào các tính chất
này, chúng ta đã có thể định danh khá chính xác
S.aureus và các staphylococci coagulase âm tính.
Thời gian để định danh hết 40-48 giờ.
Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi để xác định gen mã
hóa FemA, ịoaguiase và gen mecA đề kháng
Meíhicĩllin của các chủng vi khuẩn cùa hai nhóm
Staphylococci, kết quả có 48 chủng vi khuẩn của các
Staphylococci có gen mã hóa Coaguiase, chiếm
60,0%, trong đó 100 ,0% chủng s.aureus có
Coagulase dương tính với thử nghiệm Coaguiase
trên phiến kính đều có gen mã hóa FemA,
Coaguiase, tuy nhiên với các chủng staphylococci
Coagulase âm tính (cả với thử nghiệm òoagulase

516


trên phiến kính và trong ống nghiệm) lại có đến 8,6%
(3 chủng) có gen ma hóa ồoagúlase đồng thời
chúng cũng có gen mã hóa FemA. Qua so sánh íhẩy
độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định

Coagulase cho thấy với cả 2 nhóm staphylococci là
93,8%, trong đó đối với S.aureus thì độ nhạy đến
100,0% và độ đặc hiệu thì với nhóm staphylococci
coagulase âm tính là 100,0%, tuy nhiên, kỹ thuật này
không xác định được gen coagulase nên khi dùng
PCR thi có 3 chùng có gen Coaguỉase.
Sử dụng kỹ thuật kháng sinh đồ khuếch tán trên
thạch theo phương phập Kirby-Bauer để xác định
tính kháng Methicillin bằng đĩa kháng sinh Cefoxitin
1qua ỉrung gian MecA, kết quả là các chủng s.aureus
có 88,9% kháng Coxiỉin, cịn các chủng
Staphylococci coagase âm tính kháng Cefoxitin !ai
đến 42,9%.
Kết quà PCR xác định gen mecA, chúng tôi nhận
thấy 88,9% các chủng s.aureus có gen mecA và
42,9% các Staphylococci coaguiase âm tính có gen
mecA. Qua so sánh thấy độ nhạy cùa kỹ thuật dùng
dĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin ở
S.aureus và staphylococci coagulase âm tính là
100,0%, độ đặc hiệu íà 100,0%. Tác giả
Venkatakrỉshna Rao (2011) đã đánh giá hiệu quả của
phương pháp khoanh giấy khuếch tán với đĩa
Cefoxitin 30 jjg, kết quả ghi nhận độ nhạy và độ đặc
hiệu của đĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin
qua trung gian mecA cỏ cả độ nhạy và độ đặc hiệu íà
100% [7].
Chúng tơi đã xây dựng được quy trình PCR đa
mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coagulase và
gen mecA của các staphylococci bằng kỹ thuật đa
mồi. Chúng tôi lựa chọn thiết kế 3 cặp mồi để xác

định gen mã hóa FemA, Coaguiase và mecA có kích
thước sản phẩm khá khác biệt, chúng sẽ tách xa
nhau trong quá trinh điện di, tạo ra những băng cách
biệt nên dễ dàng nhận xét kết quả, tăng cao độ tin
cậy khi đánh giá kết quả. Các tác giả khác cũng có
gợi ý tương tự [2],[3],[43,C5],[8]. Quy trình tương đối
đơn giản, dễ thực hiện ờ tất cả các phịng thí nghiệm
hay phịng xét nghiệm có phương tiện cho PCR. Kết
quả nhanh chóng và chính xác, rát hữu ích cho lâm
sàng để kịp thời điều trị các nhiễm khuẩn do
Staphylococci. Nếu so sánh với quy trình chẩn đốn
Staphylococci và xác định tính kháng Methiciiiin theo
phương pháp truyền thống, chúng tôi nhận thấy:
- Phương pháp truyền thống: cho kết quả sớm
nhất là 40-48 giờ kể từ khi lấy mẫu nghiệm (nhuộm,
nuôi cấy, xác định coagulase, kỹ thuật đĩa kháng
sinh).
- Kỹ thuật PCR: cho kết quả sớm nhất là 20“24
giờ (nhuộm, nuôi cấy, PCR).
Với kỹ thuật 3 cặp mồi (triplex PCR) xác định gen
mã hóa FemA, Coaguiase và gen mecA cùa chúng

tơi, kết quả hồn tồn đáng tin cậy, kỹ thuật thực hiện

không quá phức tạp, các phịng thí nghiệm ở các
bệnh viện tuyến tỉnh đều có thể tiến hành được nhằm
chẩn đốn sởm, chính xác các nhiễm staphyiococci
và tính kháng thuốc của chúng để có hướng điều trị
kịp thời.
KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu 80 chủng staphylococci bằng các
phương pháp xét nghiệm vi sinh truyền thống và sử
dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã xây dựng được quy
trỉnh PCR 3 cặp mồi (tripiex PCR) để xác định gen
FemA, gen mã hóa độc lực Coagulase và gen mecA.
Quy trình có thể thực hiện được ở các bệnh viện
tuyến tỉnh để chần đốn sớm, chính xác cấc nhiễm
khuẩn do staphyiococci và tính kháng thuốc của
chúng để điều trị hiệu quả.
TA! LIỆU THAM KHẢO
1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSi)
(2011), Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing;
Twenty-First
Informational
Supplement, M 100-S21.JISSBN 1-56238-742-1)
2. Trần Thu Hoa, Đỗ Thị Lan Hương, Nguyễn Thị
Ngọc Loan, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009),
"Nghiên cứu chế tạo bộ thử nghiệm multiplex PCR phái
hiện Staphylococci đề kháng Methỉciilin”, Y học TP Hồ
Chí Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, tr. 176-180.
3. Hookey J.v, Richardson J.F and Cookson B.D
(1998), “Molecular typing of staphylococci Based on
PCR Restriction Fragment Length Poiymorphis and DNA
Sequence Analysis of the Coagulase gene”. J. of Clin.
Microbiol, Voi 36 (4), pp 1083-1089.
4. Kalhor H, Shariati L, Validi M et al (2012),
“Comparison of Agar screen and duplex PCR methods
in determination of MRSA strains isolated from nasal
carriage”. African J of Microbiology Research, Vol 6(16),

pp 3722-3726.
5. Motiagh Mohammad Reza Safari, Maesumeh
Anvari (2010), “Rapid detection of meỉhicillỉn-resistaní
Staphylococci by multiplex PCR", African Journal of
Biotechnology, Vol. 9(45), pp 7629-7631.
6. Nizami D, Burcin o , Gu!ay G.D et al. (2012),
Antibiotic resistance genes & susceptibility patterns in
Staphylococci, Indian J Med Res, 135, pp 389-396.
7. Rao Venkatakrishna, Bhat Kishore, Kugaji
Manohar, Pai Vidya, Shantaram Manjula (2011),
“Detection of Methiciliin Resistance in staphylococci:
Comparison of Disc diffusion and MIC with mecA gene
detection by PCR”, international Journal of Pharmacy
and Biological Sciences, Voi. 1, Issue 4, pp 518-521.
8. Thean Y Tan (2002), “A Comparison of PCR
detection of mecA with two standard methods of oxacillin
disk susceptibility testing for coagulase- negative
Staphylococci”, Journal of Medical Microbiology, Vol(51),
pp 83-85.
9. Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiêm vi
sinh lâm sàng. Nhà xuất bản Y học.

517