Cố định enzyme lactase trên chất mang alginate cmc và khảo sát tính chất của chế phẩm thu được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

MAI THỊ HẢI ANH

CỐ ĐỊNH ENZYME LACTASE TRÊN CHẤT
MANG ALGINATE- CMC VÀ KHẢO SÁT
TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 03 năm 2012


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Huỳnh Ngọc Oanh
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Phạm Văn Hùng
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.
HCM ngày 16 tháng 03 năm 2012.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. TS. Trần Bích Lam
2. PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn
3. TS. Huỳnh Ngọc Oanh
4. TS. Phạm Văn Hùng
5. TS. Phan Ngọc Hòa
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA…………


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: MAI THỊ HẢI ANH.......................................MSHV: 10110168
Ngày, tháng, năm sinh: 20/10/1984 ...........................................Nơi sinh: Nghệ An
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống .................... Mã số: 605402
I. TÊN ĐỀ TÀI:

“CỐ ĐỊNH ENZYME LACTASE TRÊN CHẤT MANG ALGINATE-CMC
VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC”
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
1. Khảo sát quá trình cố định enzyme lactase trong chất mang alginate-CMC
(Carboxyl methyl cellulose):
- Tỷ lệ về khối lượng alginate/CMC (w/w),
- Tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w).
2. Khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme lactase cố định :
- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme lactase cố định
- Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme lactase cố định
- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ban đầu đến khả năng thủy phân đường
lactose của lactase cố định
- Xác định các thông số động học của enzyme lactase tự do và cố định.

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài)
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn
Tp. HCM, ngày 16 tháng 03 năm 2012
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy – PGS.TS. Lê
Văn Việt Mẫn, người đã hướng dẫn tận tình, giúp đỡ tơi thực hiện luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể quý thầy cô Bộ môn Công nghệ thực
phẩm, Khoa Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ
Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức quý báu, tạo môi trường học tập và
nghiên cứu khoa học trong thời gian tôi theo học tại trường.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Tây
Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và vật chất để tơi hồn thành
chương trình đào tạo thạc sĩ.
Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình đã ủng hộ tơi về mặt
vật chất cũng như luôn động viên, cổ vũ tinh thần trong suốt q trình học
tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tơi xin gởi lời cảm ơn đến các anh chị và các bạn làm việc
tại Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Thực phẩm đã đồng hành và chia sẻ, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 03 năm 2012

Mai Thị Hải Anh


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Cố định lactase trong chất mang alginate-CMC làm tăng hiệu suất cố
định và hoạt tính của enzyme cố định khi so với chất mang truyền thống
(alginate). Hiệu suất cố định đạt được cao nhất là 70,23% khi tỷ lệ về khối
lượng alginate/CMC là 1.5, tỷ lệ về khối lượng chế phẩm enzyme/chất mang
là 0.2. Sự cố định lactase trong chất mang alginate-CMC không làm thay đổi
giá trị nhiệt độ tối ưu và pHopt so với enzyme tự do (550C và pH 4.5). Tuy
nhiên, lactase cố định bền nhiệt và bền pH hơn so với lactase tự do và
lactase cố định trong gel alginate. Ở nhiệt độ 550C thời gian bán hủy của
enzyme cố định trong chất mang alginate-CMC là 315 phút trong khi lactase
cố định trong gel alginate truyền thống và enzyme tự do có thời gian bán
hủy lần lượt là 248 phút và 139 phút. Ở pH 6.5, hoạt tính lactase cố định
trong gel alginate/CMC là 44.59% so với giá trị hoạt tính cực đại, trong khi
hoạt tính của lactase cố định trong gel alginate và enzyme tự do chỉ lần lượt
là 36.99% và 26.58% so với giá trị cực đại.
Chúng tôi nhận thấy, khi cố định lactase trong gel alginate và alginateCMC thì làm tăng hằng số Km lên 1.36 và 1.46 lần so với enzyme lactase tự
do. Việc bổ sung CMC cũng làm tăng nhẹ hệ số Km của lactase cố định so
với khi không bổ sung CMC. Đồng thời, vận tốc phản ứng cực đại Vm giảm
từ 105(µM/ph) ứng với lactase tự do xuống cịn 75 và 85(µM/ph) tương ứng
với lactase cố định trong gel alginate-CMC và gel alginate.


ABSTRACT
Immobilizezation of lactase in alginate-CMC carrier increased the yield
of protein fixation and the catalytic activity in comparison with enzyme

immobilization in conventional carrier (alginate gel). The highest protein
immobilization achieved 70.23% when the weight ratio of alginate/CMC
was 1.5 (w/w) and the weight ratio of enzyme/alginate-CMC mixture was
0.2 (w/w). The immobilization of lactase did not change the optimum
temperature and pH of the biocatalyst (Topt: 550C and pH: 4.5). However,
the immobilized lactase was more stable at high pH and temperatures than
the free enzyme. At 550C, the half-life of immobilized lactase in alginateCMC gel was 315 minutes while the half-life of immobilized lactase in
alginate gel and of free enzyme is 248 minutes and 139 minutes,
respectively. At pH 6.5, the relative activity of immobilized lactase in
alginate/CMC gel was 44.59% of maximum activity value, while that of
immobilized lactase in alginate gel and of free enzyme was 36.99% and
26.58% of maximum.
The constant Km increased to 1.36 and 1.46 times for the fixed lactase
in calcium alginate gel and alginate-CMC gel, respectively in comparison
with that of the free enzyme. The addition of CMC to alginate gel slightly
increased Km. The maximum reaction rate, Vm of the free lactase decreased
from 105 (μM/min) to 75 and 85 (μM/min) when the enzyme was fixed in
alginate-CMC and alginate gel, respectively.


MỤC LỤC
MỤC LỤC .......................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................iii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... iv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ vi
Chương 1. GIỚI THIỆU .................................................................................... 1
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
2.1. Enzyme lactase ........................................................................................ 3
2.2. Kỹ thuật cố định enzyme ......................................................................... 6
2.2.1. Định nghĩa về enzyme cố định .............................................................. 6

2.2.2. Các phương pháp cố định enzyme lactase ............................................. 6
2.2.3. Tính chất của enzyme lactase cố định ................................................... 9
2.2.4. Chất mang alginate và carboxylmethyl cellulose (CMC) .................... 13
Chương 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................... 23
3.1. Nguyên liệu và hóa chất......................................................................... 23
3.2. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 24
3.3. Bố trí thí nghiệm .................................................................................... 24
3.4. Phương pháp cố định lactase trong gel alginate-CMC ........................... 28
3.5. Phương pháp phân tích .......................................................................... 28
3.6. Cơng thức tính tốn ............................................................................... 31
3.7. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 33
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 34
4.1. Nghiên cứu cố định lactase trong chất mang alginate-CMC ................... 34
4.1.1. Xác định tỷ lệ alginate/CMC............................................................... 34
4.1.2. Xác định tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w) ............................. 38
4.2. Nghiên cứu tính chất của chế phẩm lactase cố định trong chất mang
alginate-CMC ............................................................................................... 40
4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cố định................. 40
i


4.2.1.1. Xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme lactase cố định ....... 40
4.2.1.2. Xác định độ bền nhiệt của enzyme lactase cố định ........................... 42
4.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cố định......................... 45
4.2.2.1. Xác định pH hoạt động tối ưu của enzyme lactase cố định ............... 45
4.2.2.2. Xác định độ bền pH của enzyme lactase cố định .............................. 47
4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ban đầu đến khả năng thủy phân đường
lactose của lactase cố định ............................................................................ 49
4.2.4. Xác định thông số động học của enzyme tự do và enzyme cố định ..... 52
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 55

5.1. Kết luận ................................................................................................. 55
5.2. Kiến nghị ............................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 57
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 63

ii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ Alginate/CMC đến hiệu suất cố định protein và
hoạt tính lactase sau cố định............................................................................. 34
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang (w/w) đến hiệu
suất cố định protein và hoạt tính enzyme lactase cố định ................................. 38
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme lactase tự do và cố
định.................................................................................................................. 40
Bảng 4.4. Thời gian bán hủy và hệ số ức chế k của enzyme lactase tự do và cố
định trong chất mang alginate-CMC và alginate ở ba nhiệt độ khác nhau ........ 45
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme lactase tự do và cố định ..... 45
Bảng 4.6. Thời gian bán hủy và hệ số ức chế k của enzyme lactase tự do và cố
định trong chất mang alginate-CMC và alginate ở ba giá trị pH khác nhau ...... 49
Bảng 4.7. Nồng độ dung dịch đường glucose trong dung dịch phản ứng thủy
phân đường lactose bởi xúc tác lactase tự do và lactase cố định sau 15 phút phản
ứng................................................................................................................... 50
Bảng 4.8. Giá trị Km và V m của enzyme tự do và cố định ................................. 54

iii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Mơ hình trung tâm xúc tác của β–galactosidase từ A. oryzae ............. 3

Hình 2.2. Phản ứng thủy phân đường lactose với xúc tác lactase ....................... 3
Hình 2.3. Phương pháp bẫy enzym .................................................................... 6
Hình 2.4. Phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị ................................. 7
Hình 2.5. Phương pháp cố định bằng liên kết chéo ............................................ 7
Hình 2.6. Cấu hình của 2 gốc monomer trong phân tử acid alginic .................. 13
Hình 2.7. Các dạng phân đoạn trong phân tử acid alginic................................. 15
Hình 2.8. Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp .................................. 16
Hình 2.9. Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong .. 16
Hình 2.10. Cấu tạo phân tử CMC ..................................................................... 20
Hình 2.11. Cấu tạo phân tử CMC có DS bằng 1 ............................................... 20
Hình 3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ............................................................... 24
Hình 3.2. Enzyme được nhốt trong hạt gel alginate sau khi cố định ................. 28
Hình 3.3. (a) Cơng thức cấu tạo hóa học của Coomassie Brilliant Blue G-250,
(b) Phổ hấp thu ánh sáng của Coomassie Brilliant Blue khi không liên kết
(đường màu đỏ) và khi liên kết với protein (đường màu xanh)......................... 29
Hình 3.4. Cơ chế định lượng protein bằng thuốc thử Bradford ......................... 29
Hình 4.1. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ alginate/CMC đến hiệu suất cố
định (trái) và hoạt tính của lactase cố định (phải) ............................................. 34
Hình 4.2. Hình SEM quan sát hình thái bề mặt và mặt cắt hạt gel .................... 37
Hình 4.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm enzyme/chất mang
(w/w) đến hiệu suất cố định protein và hoạt tính của lactase cố định ............... 39
Hình 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme lactase tự do và cố
định.................................................................................................................. 41
Hình 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của lactase tự do, lactase cố định
trong gel alginate-CMC và lactase cố định trong gel alginate ở 550C, 600C, 65 0C
......................................................................................................................... 43

iv

Hình 4.6. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của lactase tự do và cố định .......... 46
Hình 4.7. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của lactase tự do, lactase cố định
trong gel alginate-CMC, lactase cố định trong gel alginate .............................. 48
ở pH 4.5, pH 5.5, pH 6.5 .................................................................................. 48
Hình 4.8. Đồ thị biểu diễn nồng độ dung dịch đường glucose trong dung dịch
phản ứng thủy phân đường lactose bởi xúc tác lactase tự do và lactase cố định
sau 15 phút phản ứng. ...................................................................................... 51
Hình 4.9. Đồ thị Lineweaver-Burk của lactase tự do và cố định....................... 53

v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BSA: Bovine serum albumin
CMC: Carboxylmethyl cellulose
DEAE-cellulose: Diethylaminoethyl cellulose
G: Guluronic
GOS: Galacto-oligosaccharides
GDL: β-glucono--lactone
Km: Hằng số Michaelis - Menten
M: Manuronic
ONPG: o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside
PEI : Polyethyleneimine
pH opt : pH tối ưu
POD: peroxidase
PVA: Polyvinyl alcohol
SEM: Scanning Electron Microscope
Topt: Nhiệt độ tối ưu
U: Unit

Vm: Vận tốc cực đại

vi


Chương 1. GIỚI THIỆU
Lactase (β-Galactosidase) là chế phẩm enzyme quan trọng trong công
nghiệp để thủy phân đường lactose trong sữa và whey. Một số người tiêu dùng
khơng thể tiêu hóa được đường lactose có trong sản phẩm sữa do cơ thể của họ
thiếu enzyme lactase thủy phân loại đường này. Ngồi ra, chế phẩm lactase cịn
được sử dụng trong sản xuất các galacto-oligosaccharide là một prebiotic có lợi
cho sức khỏe.
Chế phẩm enzyme lactase đã được sử dụng với quy mô lớn ở dạng tự do
và cố định. Tuy nhiên, enzyme lactase cố định tỏ ra ưu việt hơn enzyme lactase
tự do. Đó là do:
- Chất mang đóng vai trị như một tác nhân bảo vệ enzyme chống lại các
ảnh hưởng bất lợi từ môi trường như nồng độ cơ chất cao, sự thay đổi pH, nhiệt
độ, sự có mặt của các chất ức chế như galactose, ion kim loại…
- Khoảng nhiệt độ hoạt động của enzyme cố định rộng hơn, nhờ đó cải
thiện khả năng ứng dụng của chế phẩm trong thực tiễn.
- Dễ dàng thu hồi sản phẩm, giảm bớt cơng đoạn phân riêng, do đó giảm
chi phí về thiết bị và năng lượng.
- Có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần trong khi vẫn đảm bảo được hoạt
tính sinh học ổn định.
- Có thể sử dụng cho quá trình sản xuất liên tục.
Bên cạnh những yêu cầu chung của một chất mang như thân thiện với môi
trường, kĩ thuật cố định đơn giản, bền và có khả năng tái sử dụng tốt thì chất
mang cần có giá thành thấp và dễ tìm để góp phần làm tăng hiệu quả kinh tế cho
quy trình sản xuất.

1


Alginate là một chất mang phổ biến, được ứng dụng nhiều để cố định
enzyme và tế bào vi sinh vật. Bên cạnh những ưu điểm như phương pháp cố
định đơn giản, rẻ tiền thì độ bền cơ học và hiệu quả cố định enzyme lactase
trong chất mang này chưa cao, đặc biệt là có sự thất thốt protein enzyme trong
q trình hình thành gel (Dashevsky, 1998; Bakken và cộng sự, 1992;
Champluvier và cộng sự, 1988).
Cellulose và dẫn xuất của nó như carboxylmethyl cellulose (CMC),
Diethylaminoethyl cellulose (DEAE-cellulose), triacetate cellulose, diacetate
cellulose… được sử dụng rộng rãi làm chất mang để cố định tế bào vi sinh vật
và enzyme do tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ.
Phương pháp tạo gel gồm hỗn hợp của cellulose và các polymer tự nhiên
khác được nhiều nhà khoa học quan tâm trong thời gian gần đây vì dễ thực hiện,
chi phí thấp và có thể tạo ra những chất mang có cấu trúc mới (Bakken và cộng
sự, 1992).
Trong luận văn này, chúng tôi thử kết hợp CMC cùng alginate làm chất
mang mới dạng gel để cố định enzyme lactase. Chúng tơi sẽ so sánh hoạt tính
enzyme lactase cố định trên chất mang mới (alginate-CMC) và hoạt tính lactase
cố định trên chất mang truyền thống (alginate) để đánh giá khả năng sử dụng
hỗn hợp alginate và CMC làm chất mang trong lĩnh vực cố định enzyme và ứng
dụng enzyme cố định trong công nghệ thực phẩm.

2


Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Enzyme lactase
Enzyme lactase được tìm thấy phổ biến trong tự nhiên: động vật, thực vật

và vi sinh vật. Các chế phẩm lactase hiện nay chỉ được thu nhận từ vi sinh vật.
Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme lactase gồm có vi khuẩn (E.coli…), nấm
men (Kluyveromyces lactics…) và nấm mốc (A. oryzae, A. niger…) (Parmjit và
cộng sự, 2010).
Danh pháp: Mã enzyme lactase: 3.2.1.23 (3 - Hydrolases, 2- Glycosylases,
1 - Glycosidases , 23 - Lactase hoặc beta-galactosidase)

Hình 2.1. Mơ hình trung tâm xúc tác của β–galactosidase từ A. oryzae
Enzyme lactase xúc tác phản ứng thủy phân cắt liên kết β-glycoside trong
lactose thành 2 monosaccharide là galactose và glucose.

Hình 2.2. Phản ứng thủy phân đường lactose với xúc tác lactase
Một vài lợi ích chính của sự thủy phân lactose:
3


Lợi ích về mặt sức khỏe: Những người thiếu β-galactosidase trong ruột non
khơng tiêu hóa được lactose trong các sản phẩm sữa. Vấn đề này sẽ được khắc
phục nếu lactose trong sản phẩm sữa đã được thủy phân bởi β-galactosidase để
tạo thành đường glucose và galactose (Garrett và cộng sự, 2002). Một thuận lợi
khác là khi thủy phân lactose sẽ kèm theo sự hình thành đồng thời của galactooligosaccharides (GOS), được xem là thành phần prebiotic.
Lợi ích trong cơng nghệ thực phẩm: Hàm lượng lactose cao trong các sản
phẩm sữa như kem, sữa cô đặc và một số sản phẩm tráng miệng từ sữa có thể
làm xuất hiện các tinh thể lactose như các hạt sạn trong sản phẩm. Việc dùng
β-galactosidase sẽ ngăn ngừa sự kết tinh của các phân tử đường lactose, do đó
cải thiện các chỉ tiêu hóa lý và cảm quan của các sản phẩm sữa như tăng khả
năng tiêu hóa, tăng tính đồng nhất…Ngồi ra, sự thủy phân lactose trong whey,
sẽ biến đổi whey thành syrup và có thể được dùng trong các ngành cơng nghiệp
bánh kẹo, thức uống khơng cồn hoặc có cồn nhẹ (Parmjit và cộng sự, 2010).
Các chế phẩm enzyme lactase từ những lồi vi sinh vật khác nhau sẽ có

những tính chất khác nhau. Bảng 1.1 tổng hợp các tính chất quan trọng của
enzyme lactase từ các loài vi sinh vật khác nhau (Otieno, 2010).

4


Bảng 2.1. Các tính chất của β-galactosidase từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn
Nguồn gốc

Cơ chất lactose

Hoạt hóa bởi

Ức chế bởi

-

-

35
115
0.23-0.99 (0NPG) 200
-

K+, Mg2+
Fe2+, Zn2+, Cu2+

Ca2+, Na+, Zn, Cu
SDS
-

2
700
2
6
13
31
580
2.96
800
2.6
41.7
430

Na+, K+
Mg2+
Na+, K+, Mn2+
Na+, K+, Mn2+
EDTA
Na+, K+
EDTA

Fe2+, Ca2+, Cu2+, Zn2+
Fe2+, Ca2+, Cu2+, Zn2+
Ag3+, SDS
Fe2+, Zn2+,Cu 2+, Pb2+, Sn2+
Zn2+, Mn2+ ,Co 2+,Ca2+,Sn2+
Cr3+,EDTAc,urea, galactose PCMB
Fe3+, Cu2+, Zn2+, galactose

pHopt

Topt

Km (mM)

MkD

Nấm mốc
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae

3.5
5.0

58
55

85
50

124
90

Nấm men
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces fragilis
Sterigmatomyces elviae

6.5

6.6
6.0

37
30
60

7.2
6.5
6.2
6.2
8.0
6.5
5.0
7.0
4.8
5.0
6.0
6.5

40
50
55
55
45
50
50
70
45
60

65
55

CBS8119

Vi khuẩn
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Bacillus stearothermophilus
Lactobacillus thermophilus
Lactobacillus reuteri L103
Lactobacillus reuteri L461
Bullera singularis KCTC 7534
Bacillus stearothermophilus
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium infantis
Bacillus circulans
Bacillus coagulans

540
220
540
35
72
53
70
362
470
67
430

5


2.2. Kỹ thuật cố định enzyme
2.2.1. Định nghĩa về enzyme cố định
Các enzyme không tan là những enzyme bị giữ hoặc được cố định trong
một vùng, một khoang nhất định, khơng bị hịa tan trong các điều kiện bình
thường, vẫn giữ được khả năng xúc tác, có thể sử dụng lặp lại nhiều lần (Phạm
Thị Trân Châu và cộng sự, 2009).
Các yêu cầu của quá trình cố định enzyme
Hiệu suất cố định và hoạt tính enzyme sau khi cố định càng cao càng tốt .
Enzyme cố định có hoạt tính ổn định cao để có thể sử dụng được nhiều lần,
giảm chi phí sản xuất.
Enzyme cố định có giá thành phù hợp (Cao, 2005).
2.2.2. Các phương pháp cố định enzyme lactase
Bốn nhóm phương pháp cố định enzyme lactase:
Phương pháp hấp phụ: enzyme được gắn với giá thể nhờ hấp phụ vật lí trên
bề mặt giá thể. Phương pháp này dựa trên sự tương tác vật lý giữa chất xúc tác
sinh học và chất mang bằng các liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực Van der
Waals…
Phương pháp bẫy: enzyme được nhốt trong một cấu trúc như mạng lưới gel
hay màng polymer nhằm ngăn chặn sự giải thoát protein enzyme ra bên ngồi
cấu trúc đó nhưng vẫn cho phép cơ chất hoặc sản phẩm đi qua.

Hạt

Sợi

Màng

Hình 2.3. Phương pháp bẫy enzyme (Cao,2005)

6


Phương pháp cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị: hình thành liên
kết cộng hóa trị giữa enzyme và chất mang trong các điều kiện ơn hịa.

Hình 2.4. Phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị (Cao,2005)
Phương pháp cố định bằng liên kết chéo: là sự liên kết giữa các phân tử
enzyme khi có mặt hoặc khơng có mặt các tác nhân hóa học làm tay nối.

Hình 2.5. Phương pháp cố định bằng liên kết chéo
Một số phương pháp và chất mang để cố định chế phẩm lactase được thu
nhận từ các nguồn vi sinh vật khác nhau được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các phương pháp và chất mang cố định enzyme lactase (Parmjit
và cộng sự, 2010).
Phương pháp

Hấp phụ

Nguồn thu β-galactosidase

Chất mang

K. fragilis và K. lactis
A.oryzae

Chitosan

Nhựa Phenol-formaldehyde

A. oryzae
E.coli

Polyvinyl chloride và màng Silica
Chromosorb-W

B. circulans
B. stearothermophilus

Polyvinyl chloride và Silica
Chitosan
7


Bẫy

A. niger
K. fragilis
K. fragilis

Đá ceramic
Hạt Chitosan
Chitosan

K. lactis
Thermus sp. T2
K. fragilis
A. oryzae

CPC-silica và agarose
PEI- sepabeads, DEAE-agarose
Hạt cellulose
Celite và chitosan

Pisum sativum

Sephadex G-75 và hạt chitosan

K. bulgaricus
E. coli
A. oryzae

Gel alginate sử dụng BaCl3
Gel polyacrylamide
Nylon-6 và zeolite

Thermus aquaticus YT-1
A. oryza
Penicillium expansum F3
K.
lactis,
A.
oryzae,

Hạt agarose
Spongy polyvinyl alcohol cryogel
Calcium alginate
Gel polyvinylalcohol

Saccharomyces cerevisiae
L. bulgaricus
S. anamensis
E. coli

Vỏ trứng
Calcium alginate
Lòng trắng trứng

E. coli
A. oryzae
E. coli
K. lactis

Polyvinyl alcohol
Gel silica hoạt hoá bởi TiCl3 và FeCl3
Cyanuric chloride hoạt hoá cellulose
Bột bắp

E. coli
Liên kết cộng K. lactis
B. circulans
hoá trị
K. fragilis

Gelatin
Thiosulfinate/thiosulfonate
Eupergit C(Spherical acrylic polymer)
Silica-alumina

K. lactis
A. oryzae
A. oryzae

Bề mặt graphite
Hạt chitosan và màng nylon
Vải cotton hoạt hoá bởi tosyl chloride

A. oryzae
K. latis

Amino-epoxy sepabead
Sợi cotton

A. niger
A. oryzae

Polysiloxane-polyvinyl alcohol
Silica

A. oryzae

Gel polyvinylalcohol và Fe3O4-chitosan

8


2.2.3. Tính chất của enzyme lactase cố định
2.2.3.1. Hoạt tính xúc tác của enzyme lactase cố định

Các nghiên cứu về enzyme cố định nói chung và enzyme lactase nói riêng
đều cho thấy hoạt tính của enzyme cố định thấp hơn so với enzyme tự do, ví dụ như:
Makkar và cộng sự (1981) đã cố định enzyme β-galactosidase từ
Lactobacillus bulgaricus trong gel polyacrylamide, hoạt tính của enzyme cố
định chỉ đạt 31% so với hoạt tính của enzyme tự do.
Benevides và cộng sự (2007) cố định lactase từ E. coli lên các chất mang
khác nhau và thấy rằng hiệu suất cố định đều đạt 100%. Tuy nhiên, hoạt tính
của enzyme cố định cao nhất là ở chất mang sepharose được hoạt hóa bởi
BrCN, hoạt tính chỉ đạt 95% so với enzyme tự do. Và hoạt tính lactase cố định
thấp nhất là ở chất mang agarose được hoạt hóa bởi polyethyleneimine (PEI),
sử dụng tay nối glutaraldehyde, hoạt tính chỉ bằng 55% so với enzyme tự do.
Nguyên nhân xảy ra hiện tượng giảm hoạt tính của enzyme khi cố định
trên chất mang có thể là do:
Khi gắn enzyme vào chất mang, dưới ảnh hưởng của điện tích ở chất
mang, cấu hình của phân tử enzyme sau khi cố định bị thay đổi làm cho khả
năng xúc tác của enzyme cũng bị thay đổi.
Khi gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị, một số hóa chất
sử dụng trong q trình cố định có thể làm vơ hoạt bất thuận nghịch enzyme.
Tương tác protein-protein giữa các phân tử enzyme đã cố định làm biến
đổi một phần cấu trúc không gian của phân tử enzyme, do đó hoạt độ xúc tác
cũng giảm.
Đối với trường hợp enzyme cố định bằng phương pháp nhốt trong khuôn
gel, sự có mặt của chất mang có thể hạn chế khả năng tiếp xúc của cơ chất với
enzyme (nhất là đối với các cơ chất có kích thước phân tử lớn), do đó hoạt lực
của enzyme cố định bị giảm đi (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004; Bailey và cộng
sự, 1986).

9

2.2.3.2. Động học của enzyme lactase cố định
Động học của enzyme cố định cũng là một vấn đề rất được quan tâm khi
nghiên cứu về enzyme cố định. Kết quả của hầu hết các nghiên cứu về enzyme
lactase cố định cho thấy động học phản ứng thủy phân lactose bằng lactase cố
định cũng tuân theo định luật Michaelis-Menten. Đa số enzyme cố định có hệ số
Km lớn hơn enzyme tự do.
Tanriseven và cộng sự (2002) đã cố định lactase từ A. oryzae trong hệ gel
alginate-gelatin. Hằng số Km của enzyme tự do và cố định lần lượt là 42mM và
51mM. Vm của enzyme tự do và cố định lần lượt là 1.30 và 0.73 (mg
glucose/phút.mg enzyme).
Grosova và cộng sự (2008) đã cố định lactase từ A. oryzae trong gel
polyvinyl alcohol (PVA) và thấy rằng giá trị Km của enzyme lactase cố định là
71mM, giá trị Km của enzyme tự do là 61mM.
2.2.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính của enzyme lactase cố định
- Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Enzyme lactase cố định cũng như enzyme lactase tự do bị giảm hoạt tính
dưới tác dụng của các chất ức chế có mặt trong mơi trường phản ứng như urea,
đường galactose, muối calcium chloride, các protease như tripsin, pepsin…Tuy
nhiên, enzyme lactase cố định tỏ ra bền hơn dưới tác dụng của các chất ức chế.
Tác giả Haider và cộng sự (2009) đã khảo sát tác dụng ức chế enzyme của
dung dịch ure nồng độ 4.0M. β-galactosidase tự do mất gần như hồn tồn hoạt
tính sau 2h ở 370C; trong khi đó, β-galactosidase cố định vẫn cịn 64% hoạt tính
so với ban đầu.
Cũng trong nghiên cứu của tác giả này, hoạt tính của β-galactosidase tự do
sẽ bị giảm 72% trong dung dịch có 5.0% galactose sau 1h ở 370C; trong khi đó,
hoạt tính của β-galactosidase cố định chỉ bị giảm đi 35% trong điều kiện tượng tự.
Haider và cộng sự (2009) cũng khảo sát tác dụng ức chế enzyme của dung
dịch calcium chloride. Khi xử lí lactase tự do với dung dịch 5.0% calcium
chloride trong 1h ở 370C sẽ làm giảm 58% hoạt tính của nó; trong khi đó, hoạt
10

tính enzyme cố định trên chất mang immunoglobulin-cellulose theo phương
pháp hấp phụ sinh học đặc hiệu chỉ bị giảm đi 29% so với ban đầu.
Ngoài ra, tác giả này cũng đã khảo sát ảnh hưởng của các protease đến hoạt
tính của enzyme lactase. Enzyme lactase cố định trên chất mang
immunoglobulin-cellulose cịn 85% và 79% hoạt tính tương ứng khi cho
enzyme tiếp xúc với dung dịch trypsin và pepsin với nồng độ 1.0mg/mL trong
thời gian 1h. Ngược lại, lactase tự do chỉ cịn 71% và 50% hoạt tính ban đầu.
Khi tiếp xúc với dung dịch trypsin và pepsin trong điều kiện tương tự nhưng
nồng độ trypsin và pepsin tăng lên 2.5mg/mL thì β- galactosidase cố định cịn
60% và 50% hoạt tính ban đầu, trong khi đó, lactase tự do chỉ cịn 27% và 20%
hoạt tính. Điều này chứng minh rằng, cố định lactase theo kiểu tương tác hấp
phụ sinh học đã ổn định hoạt tính lactase trước sự phá huỷ của các enzyme
protease.
Ngoài ra, theo Grosova và cộng sự (2008), khi bẫy β-galactosidase vào
trong PVA hydrogel sẽ loại trừ được sự ức chế enzyme bởi cả hai sản phẩm của
quá trình thủy phân lactose (glucose và galactose) so với enzyme tự do, trong đó
galactose là chất ức chế chính. Đây là ưu điểm đáng lưu ý của lactase cố định.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
Tác giả Haider và cộng sự (2009) đã cố định β-galactosidase từ Aspergillus
oryzae theo phương pháp hấp phụ sinh học đặc hiệu và nhận thấy khơng có sự
khác biệt pHopt giữa enzyme tự do và cố định, tuy nhiên enzyme cố định có
khoảng pH hoạt động rộng hơn so với enzyme tự do. Ngoài ra, enzyme cố định
bền nhiệt hơn so với enzyme tự do. Enzyme cố định cịn 87% hoạt tính ban đầu
sau 2h ở 600C trong khi ở dạng tự do, enzyme chỉ cịn lại 15% hoạt tính ở điều
kiện đó.
Tanriseven và cộng sự (2002) đã cố định lactase từ loài A. oryzae trong hệ
gel alginate-gelatin có sử dụng glutaraldehyde để làm tăng độ cứng của gel và
cũng thu được kết quả tương tự. Nhiệt độ tối thích cho cả hai loại enzym cố

định và tự do là 50oC. Hai loại enzyme cùng có giá trị pH tối ưu như nhau là
11


4.5. Ở nhiệt độ 70oC và pH 4.5, enzyme tự do mất hết hoạt tính nhưng enzyme
cố định trong gel alginate-gelatin vẫn cịn giữ lại 27% hoạt tính ban đầu. Ở pH
9.0 và nhiệt độ 50 oC, enzyme cố định cịn 25% hoạt tính ban đầu trong khi
enzym tự do chỉ cịn lại 11.5% hoạt tính.
Grosova và cộng sự (2008) đã cố định β-Galactosidase từ Aspergillus
oryzae trong gel polyvinylalcohol. Sự cố định không làm thay đổi pHopt, nhưng
làm tăng độ bền của enzyme cố định đối với pH.
Trong một số trường hợp, phương pháp cố định enzyme bằng liên kết cộng
hố trị cũng khơng làm thay đổi Topt và pHopt của enzyme cố định và tự do. Ví
dụ như David và cộng sự (2008) khi cố định lactase trên chất mang có từ tính
polysiloxane-polyvinyl alcohol (mPOS-PVA) đã thu được quy luật tương tự.
Tuy nhiên một số cơng trình nghiên cứu cho kết quả khác biệt về nhiệt độ
và pH hoạt động tối ưu giữa enzyme tự do và enzyme cố định:
Tác giả GonzalezSaiz và cộng sự (2001) đã cố định lactase từ Escherichia
coli ATCC2757 trong gel polyacrylamide. Enzyme tự do có hoạt tính lớn nhất ở
pH xấp xỉ 8.5, cịn enzyme cố định có pHopt dịch chuyển về phía kiềm hơn và
cao hơn.
Albayrak và cộng sự (2002) đã cố định β-Galactosidase từ Aspergillus
oryzae bằng phương pháp ngưng tụ trên màng Nylon gắn glycidyl methacrylate.
Nhiệt độ tối ưu cho enzyme cố định là 660C, cao hơn so với enzyme tự do là
500C. Ngoài ra, pHopt của enzyme cố định dịch chuyển về vùng acid hơn so với
dạng tự do, pHopt của enzyme cố định là 3.5 trong khi pHopt của enzyme tự do là 4.7.
Sự thay đổi pHopt phụ thuộc vào trường tĩnh điện do chất mang tạo ra. Sự
có mặt của trường tĩnh điện mạnh làm nồng độ ion H+ gần chất mang và trong
dung dịch khác nhau. Khi lực ion của dung dịch thấp thì nồng độ ion H + gần
chất mang điện tích âm cao hơn, gần chất mang điện tích dương thấp hơn so với

trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzyme liên kết với chất mang (-) sẽ
dịch chuyển về pH kiềm hơn và ngược lại, enzyme liên kết với chất mang (+) sẽ
có pHopt dịch chuyển về phía acid hơn. Khi lực ion của dung dịch lớn, điện tích
12


của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu nên pHopt là không đổi (Phạm
Thị Trân Châu và cộng sự, 2009).
2.2.3.4. Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định
Các cơng trình nghiên cứu thấy rằng khả năng tái sử dụng của lactase cố
định khá tốt. Sau 10-15 chu kỳ sử dụng, hoạt tính enzyme vẫn cịn khá cao.
Theo Haider và cộng sự (2009), lactase cố định bằng phương pháp hấp phụ
sinh học trên chất mang immunoglobulin-cellulose sau 10 lần tái sử dụng vẫn
cịn khoảng 46% hoạt tính so với ban đầu.
Theo Magdy và cộng sự (2009), khi cố định enzyme lactase lên bề mặt gel
carageenan được phủ bởi màng chitosan và hoạt hóa bởi glutaraldehyde, sau 15
lần tái sử dụng, hoạt tính enzyme cố định cịn 97% so với ban đầu.
2.2.4. Chất mang alginate và carboxylmethyl cellulose (CMC)
2.2.4.1. Cấu tạo và đặc điểm của alginate
Alginate là một polymer sinh học có nguồn gốc từ các lồi tảo biển thuộc
họ Phaephyceae. Alginate là tên gọi chung cho các muối của acid alginic. Acid
alginic là một polymer mạch thẳng được cấu tạo từ 2 loại monomer là acid -Dmannuronic và acid -L-guluronic (Phillips và cộng sự, 2000).

H

OH

H
COOH

HO

O
OH

HOOC
OH
OH

HO
H

H

H

Acid -D-manuronic

OH

H
HO

H
H

O

H

Acid -L-guluronic

Hình 2.6. Cấu hình của 2 gốc monomer trong phân tử acid alginic.
Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block. Có 3 loại block:
Block homopolyguluronate: gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau (-GG-G-).

13