Nghiên cứu tách chiết phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa từ lá sen (nelumbo nucifera geartn)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

NGUYỄN THỊ NGỌC MAI

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CAO CHIẾT CĨ
HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA TỪ LÁ SEN (Nelumbo
nucifera Geartn)

Chun ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống
Mã số: 60 54 02

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2013


Cơng trình được hồn thành tại: Trường đại học Bách Khoa – ĐHQGTPHCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: ………………………………….
TS. Ngô Đại Nghiệp
Cán bộ chấm nhận xét 1: ……………………………………..
PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu
Cán bộ chấm nhận xét 2: ……………………………………..
TS. Trần Thị Ngọc Yên
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày
29 tháng 7 năm 2013.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1 Chủ tịch Hội đồng: TS. Phạm Văn Hùng
2 Phản biện 1: PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu
3 Phản biện 2: TS. Trần Thị Ngọc Yên

4 Ủy viên: TS. Ngơ Đại Nghiệp
5 Thư ký: TS. Võ Đình Lệ Tâm
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng dánh giá LV và Trưởng khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TS. Phạm Văn Hùng

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC


ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.HCM

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Thị Ngọc Mai

MSHV: 11110207

Ngày, tháng, năm sinh: 06/02/1987

Nơi sinh: An Giang

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm và đồ uống

Mã số: 605402

I. TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tách chiết phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa
từ lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn)
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa trong lá sen và xác
định một số phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa từ cao nước của lá sen.
Nội dung nghiên cứu:

o Khảo sát một số thành phần cơ bản của lá sen
o Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu: nhiệt độ sấy, thời gian sấy
o Khảo sát q trình trích ly: tỉ lệ ngun liệu : dung mơi, nhiệt độ nước trích
ly, thời gian trích ly
o Khảo sát khả năng bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH
o Khảo sát năng lực khử
o Khảo sát tách phân đoạn từ cao nước của lá sen bằng sắc ký cột.
NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 21/01/2013
II.

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 21/06/2013

III. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. Ngô Đại Nghiệp
Tp.HCM, ngày……tháng……năm 2013
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TS. Ngơ Đại Nghiệp
TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HỐ HỌC

i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài em đã được q thầy cơ tận tình hướng
dẫn và các bạn giúp đỡ để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Ngô Đại Nghiệp đã hướng dẫn, truyền đạt
nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em và giúp em có điều kiện thuận lợi để
thực hiện luận văn.
Em xin trân trọng biết ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm
thuộc Khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM đã tận tình
giúp đỡ, truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích, để em hồn thành tốt luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn những anh, chị và các bạn thuộc phịng thí
nghiệm Hợp chất có hoạt tính sinh học – Bộ mơn Sinh Hóa – Trường Đại học Khoa
Học Tự Nhiên đã giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu tại đây.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn !

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


ii

TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, mục tiêu là tách chiết và xác định một số phân đoạn
có hoạt tính kháng oxy hóa từ lá sen. Lá sen được sấy ở 80oC trong thời gian 30
phút để đạt độ ẩm bảo quản là 5,4%. Để thu dịch chiết lá sen sử dụng nước có nhiệt
độ 80oC, với tỉ lệ so với nước là 1:25 trong thời gian 40 phút. Lá sen được xác định
tổng hàm lượng polyphenol bằng phương pháp Folin – Ciocalteau và tổng hàm

lượng flavonoid dựa trên phương pháp so màu quang học. Hàm lượng polyphenol
và flavonoid trong lá sen là 115,50 mg/g chất khô và 14,85 mg/g chất khô. Sau khi
thu được dịch chiết lá sen, tiến hành cô quay chân không để thu cao chiết. Cao chiết
tổng sẽ tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa bằng các phương pháp: Khảo sát
năng lực khử, phương pháp DPPH. Hoạt tính của cao chiết được so sánh với các
chất kháng oxy hóa (vitamin C, BHA). Kết quả IC50 của cao chiết là 13,98 µg/ml.
Cao chiết lá sen được tách phân đoạn bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng và sắc ký cột
hở với hệ dung môi chloroform : metanol có độ phân cực tăng dần, kết quả thu được
5 phân đoạn.

ABSTRACT
In this study, the target is extraction and identify antioxidant fractional
extracts on lotus leaf. Lotus leaf was dried in 80oC in 30 minutes to achieve
moisture 5.4%. To isolation lotus leaf extract use water in 80oC with rate 1:25 in 40
minutes. Lotus leaf was identified the total polyphenol content using FolinCiocalteau method and the total flavonoid content using optical colorimetric
method. Polyphenols content and flavonoids content in lotus leaves is 115.50 ng/g
dry plant material and 14.85 mg/g dry plant material. After isolation lotus leaf
extract, drying it in vacuum environment to be extractive powder. Extractive
powder were been test antioxidant activities using: Reducing power, DPPH method.
Antioxidant activities of extractive powder were compared to the antioxidants
(vitamin C, BHA). Results of extracts IC50 is 13.98 µg/ml. Extractive powder was
separated fractional extracts using thin-layer chromato-graphy and classical opencolumn chromatography with solvents (chloroform : metanol) increasing
polarization, results obtained at least 5 fractional extracts.

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


iii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, không sao
chép của ai. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được
đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của luận
văn.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Ngọc Mai

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


iv

MỤC LỤC
ĐỀ MỤC ........................................................................................................... Trang
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU...........................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ..........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................1
1.3. Tính thực tiễn và ý nghĩa của đề tài nghiên cứu ................................................2
1.4. Nội dung khảo sát...............................................................................................2
1.5. Giới hạn của đề tài .............................................................................................2
1.6. Kết quả dự kiên ..................................................................................................3
1.7. Nơi thực hiện đề tài ............................................................................................3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN...................................................................................4
2.1. Giới thiệu về cây sen ..........................................................................................4

2.2. Các hợp chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên .........................................6
2.3. Các cơng trình nghiên cứu trước đây ...............................................................12
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................15
Sơ đồ nghiên cứu .....................................................................................................15
3.1. Vật liệu dùng trong nghiên cứu ........................................................................16
3.2. Các phương pháp nghiên cứu...........................................................................17
3.3. Quy trình điều chế cao lá sen dự kiến ..............................................................23
3.4. Tiến hành khảo sát ...........................................................................................24
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................30
4.1. Kết quả khảo sát một số thành phần cơ bản trong lá sen .................................30
4.2. Kết quả khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu ..................................................30

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


v

4.2.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy ............................................................30
4.2.2. Kết quả khảo sát thời gian sấy ...........................................................33
4.3. Kết quả khảo sát điều kiện trích ly hợp chất kháng oxy hóa trong lá sen .......35
4.3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ ngun liệu : dung mơi trích ly (w/v) .............35
4.3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ trích ly ......................................................37
4.3.3. Kết quả khảo sát thời gian trích ly .....................................................39
4.4. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng oxy hóa của cao tổng ..................................41
4.4.1. Kết quả kiểm tra hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao tổng ...........41
4.4.2. Kết quả khảo sát năng lực khử của cao tổng .....................................43
4.5. Kết quả khảo sát tách phân đoạn của cao tổng (cao nước của lá sen) .............44
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................49

5.1. Kết luận ............................................................................................................49
5.2. Kiến nghị ..........................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... I
PHỤ LỤC .............................................................................................................. IV

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cây sen và lá sen .......................................................................................5
Hình 2.2: Cấu trúc của flavonoid ..............................................................................9
Hình 2.3: Cơng thức cấu tạo của tannin gallic ........................................................10
Hình 2.4: Cơng thức cấu tạo của chlorophyll a và b ...............................................12
Hình 3.1: Phản ứng bắt gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hóa .........................17
Sơ đồ 3.1: Quy trình thực nghiệm, tiến hành các khảo sát .....................................15
Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế cao tổng bằng nước dự kiến ....................................24
Sơ đồ 3.3: Quy trình điều chế cao tổng ...................................................................28
Hình 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng flavonoid và polyphenol ..31
Hình 4.2: Sự ảnh hưởng của thời gian sấy đến hàm lượng flavonoid và polyphenol
.................................................................................................................................34
Hình 4.3: Sự ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : nước đến hàm lượng flavonoid và
polyphenol trong dịch chiết .....................................................................................36
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ nước trích ly đến hàm lượng flavonoid và
polyphenol ...............................................................................................................38
Hình 4.5: Sự ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng flavonoid và
polyphenol ...............................................................................................................40

Hình 4.6: Cao tổng của lá sen ................................................................................41
Hình 4.7: Năng lực khử của cao tổng, vitamin C và BHA .....................................44
Hình 4.8: Kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC) của các phân đoạn và cao tổng ...........46

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1: Một số thành phần cơ bản trong lá sen ...................................................30
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát nhiệt độ sấy lá sen .......................................................31
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của thời gian sấy đến độ ẩm, hàm lượng flavonoid và
polyphenol ...............................................................................................................33
Bảng 4.4: Kết quả khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi trích ly (w/v) ..................36
Bảng 4.5: Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến q trình trích ly ..................................38
Bảng 4.6: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến q trình trích ly ......40
Bảng 4.7: Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao tổng ...........................................42
Bảng 4.8: Nồng độ IC50 của cao tổng, vitamin C và BHA .....................................42
Bảng 4.9: Năng lực khử của cao tổng, vitamin C và BHA .....................................43
Bảng 4.10: Kết quả sắc ký cột silica gel 60 trên cao nước (0,5g) của lá sen ..........45
Bảng 4.11: Khả năng bắt gốc tự do DPPH của các phân đoạn của cao chiết .........47

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

viii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHA:

Butylated hydroxyanisole.

DPPH:

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

TCA:

Acid trichloroacetic.

TLC:

Thin layer chromatography

IC50:

Half maximal inhibitory concentration

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


-1-

CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sen là loài thực vật được trồng ở nhiều nơi trên thế giới như Ấn Độ, Nhật Bản,
Trung Quốc, Việt Nam… Là loại cây dễ trồng và sinh trưởng rất nhanh, thích hợp
với điều kiện khí hậu của Việt Nam. Ở nước ta, Đồng Tháp có thể xem là nơi có
diện tích trồng sen nhiều nhất. Tuy nhiên, không chỉ riêng Đồng Tháp mà ở nhiều
nơi khác cây sen cũng mang lại giá trị kinh tế khá cao cho người dân. Vì vậy, có thể
nói đây là nguồn nguyên liệu khá dồi dào và có quanh năm khơng theo mùa như
một số loại cây trái khác ở Việt Nam.
Đã từ lâu, cây sen được con người sử dụng làm thực phẩm cũng như làm thuốc
Đông Y. Hầu hết các bộ phận của sen đều được khai thác sử dụng như: hoa, hạt, lá
non, thân rễ… Theo Đơng Y thì lá sen có chứa nhiều hợp chất alkaloid (nuciferin,
nor-nuciferin, roemerin,…) dùng để chữa bệnh mất ngủ, chảy máu chân răng, xuất
huyết dưới da… (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3].
Ngồi thành phần alkaloid, trong lá sen cịn chứa các hợp chất có khả năng
kháng oxy hóa rất tốt cho sức khỏe của con người nhưng vẫn chưa được ứng dụng
nhiều trong chế biến thực phẩm. Hiện nay, lá sen chỉ được sử dụng một phần rất
nhỏ trong y học cũng như trong thực phẩm (bao gói thực phẩm để lấy hương, sấy
khô...), trong khi đây lại là phần chiếm tỉ lệ cao nhất của cây sen.
Những nghiên cứu trong nước về thành phần chất kháng oxy có trong lá sen cịn
rất hạn chế. Trong khi đó, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu của các nhà khoa học
trên thế giới về hợp chất polyphenol và flavonoid trong lá sen và chứng minh được
các hợp chất này có hoạt tính kháng oxy hóa [9,14,15,17,18,19,20,21].
Vì vậy, nếu tách chiết được thành phần có khả năng kháng oxy hóa từ lá sen để
ứng dụng vào thực phẩm sẽ không những giúp nâng cao giá trị của lá sen mà còn là
cơ sở khoa học chứng minh lá sen có tác dụng tốt cho sức khỏe.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài là nhằm tách chiết và xác định một số phân đoạn có hoạt
tính kháng oxy hóa trong cao lá sen.
HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


-2-

1.3. Tính thực tiễn và ý nghĩa của đề tài nghiên cứu
Lá sen khi trưởng thành cần phải cắt bỏ để kích thích sự phát triển của cây sen.
Lúc này, nó lại trở thành nguồn phế liệu của người trồng sen. Ngồi ra, với điều
kiện sống ơ nhiễm như hiện nay thì vấn đề bảo vệ sức khỏe trước những tác động
xấu của môi trường đang rất được quan tâm, việc nghiên cứu tìm ra các các chất có
khả năng kháng oxy hóa từ nhiều nguồn khác nhau cũng góp một phần nhỏ mang
lại lợi ích chung cho xã hội.
Do đó, nghiên cứu tách chiết phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa từ lá sen có
thể mang lại những lợi ích như:
 Tăng giá trị sử dụng cho một nguồn nguyên liệu dồi dào mà hiện nay vẫn
chưa được khai thác đúng mức.
 Hợp chất kháng oxy hóa sau khi tách chiết có thể ứng dụng trở lại vào
thực phẩm để bảo vệ sức khỏe cho con người giúp chống lại các gốc tự do.
1.4. Nội dung khảo sát
 Khảo sát một số thành phần cơ bản của lá sen
 Khảo sát quá trình sấy lá sen
- Khảo sát nhiệt độ sấy lá sen
- Khảo sát thời gian sấy
 Khảo sát điều kiện trích ly hợp chất kháng oxy hóa trong lá sen
- Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi
- Khảo sát nhiệt độ nước trích ly
- Khảo sát thời gian trích ly
 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao lá sen
- Khảo sát khả năng bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH

- Khảo sát năng lực khử
 Khảo sát tách phân đoạn từ cao nước của lá sen bằng sắc ký cột.
1.5. Giới hạn của đề tài
Đề tài giới hạn trong phạm vi nghiên cứu phương pháp tách chiết phân đoạn
cao chiết có chứa các hợp chất kháng oxy hóa (hợp chất phenol, flavonoid, …) có

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngơ Đại Nghiệp


-3-

trong lá sen dưới dạng cao chiết, nhằm chứng minh hoạt tính kháng oxy hóa của các
hợp chất này hướng đến sử dụng lá sen trong công nghiệp giải khát.
1.6. Kết quả dự kiến
Thu được phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa từ lá sen và chứng
minh được sự có mặt của các hợp chất kháng oxy hóa trong cao chiết lá sen.
1.7. Nơi thực hiện đề tài
Phịng thí nghiệm hợp chất có hoạt tính sinh học thuộc Bộ Mơn Sinh Hóa
của Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


-4-

CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN

2.1. Giới thiệu về cây sen
2.1.1. Nguồn gốc
Phân lớp (Nelumbonidae)
 Bộ: Sen (Nelumbonales)
 Họ: Sen Nelumbonaceae
 Chi: Nelumbo Adans
 Loài: Nelumbo nucifera Gaertn (cây sen)
Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn
Tên tiếng anh: Sacred lotus, Chinese water-lily,…
Cây sen là một trong những loại thực vật hạt trần phát triển rất sớm trên trái đất.
Cây sen có nguồn gốc ở Châu Á, xuất phát từ Ấn Độ (Makino, 1979), sau đó lan
qua Trung Quốc và vùng đơng bắc Úc Châu. Cây sen là loại thủy sinh được tiêu thụ
mạnh ở Châu Á.
Sen được trồng nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật
Bản, Hàn Quốc, các nước Đông Nam Á, Nga và một số nước Châu Phi. Sen cũng
được trồng ở Châu Âu và Châu Mỹ nhưng với mục đích trang trí hơn là thực phẩm.
Ở Việt Nam, cây sen được trồng phổ biến ở các tỉnh: Đồng Tháp, Vĩnh Long,
Trà Vinh,… Trong đó, Đồng Tháp là tỉnh có diện tích trồng sen để lấy hạt đứng đầu
cả nước.
2.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây sen mọc dưới nước, sống nhiều năm. Thân rễ hình trụ, mọc bị lan trong
bùn. Lá hình trịn mọc lên khỏi mặt nước. Cuống dài có gai nhỏ, đính giữa phiến lá,
mép lá uốn lượn tròn. Hoa to màu hồng hay trắng, có mùi thơm. Nhiều lá nỗn chứa
trong một đế hoa chung hình nón ngược sau thành quả có vỏ cứng màu nâu đen.
Cây sen được trồng ở các ao, hồ khắp nơi trong nước ta.

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

-5-

2.1.3. Phân loại

Hình 2.1: Cây sen và lá sen

Dựa vào công dụng, cây sen được chia làm 3 loại:
 Loại sen cho củ: thường cho hoa màu trắng, có một ít hoa màu đỏ. Nhóm
sen này ít bơng và gương.
 Loại sen cho gương: giống này được trồng phổ biến ở Đồng Tháp.
 Loại sen cho hoa để trang trí: loại này bơng có nhiều màu nhưng ít được
trồng ở nước ta.
2.1.4. Thời gian sinh trƣởng và phát triển của sen:
Thời gian sinh trưởng và phát triển của sen từ 4 – 5 tháng, phụ thuộc vào từng
loại giống:
 Nếu sử dụng giống bằng cây con gieo từ hạt thì thời gian từ khi nẩy mầm
đến khi thu hoạch là 5 tháng.
 Nếu sử dụng giống bằng ngó sen thì thời gian từ khi nẩy mầm đến khi
thu hoạch là 4 tháng [7].
2.1.5. Thành phần hóa học của cây sen
Lá sen chứa alkaloid (0,77 – 0,84%), gồm có nuciferin, nor-nuciferin, roemerin,
anonain, liriodenin, pronuciferin, O-norciferin, armepavin, N-nor-armepavin,
methyl-corlaurin, nepherin, dehyroemerin, dehyronuciferin, dehydroanonain, Nmethlisocorlaurin. Trong đó, nuciferin là alkaloid chính. Ngồi ra, lá sen cịn có
flavonoid (quercetin, isoquercitrin), tannin, chlorophyll, acid hữu cơ. Hàm lượng
alkaloid trong lá sen thay đổi theo tuổi và thời vụ thu lá.

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

-6-

Trong tâm sen có nhiều alkaloid (0,85 – 0,96%), trong đó có liensinin,
isoliensinin,

neferin,

lotusin,

nuciferin,

pronuciferin,

methylcorypallin,

demetylcorlaurin [3].
2.1.6. Một số ứng dụng của cây sen
 Ứng dụng trong dược liệu: Từ lâu cây sen đã được sử dụng trong một số bài
thuốc Đông Y để điều trị một số bệnh như mất ngủ, thần kinh suy nhược, cầm
máu,... Thành phần alkaloid trong cây sen đã được tách chiết và ứng dụng rất nhiều
trong các sản phẩm thuốc như: Sevona (Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 25 thành
phố Hồ Chí Minh sản xuất) gồm có cao lá sen và một số dược liệu khác; trà thuốc
Seivo (Trường Đại học dược Hà Nội được Bộ Y tế cấp phép sản xuất sản phẩm này)
chứa cao tâm sen, cao củ bình vơi và cao ích mẫu; thuốc an thần Seroga (Xí nghiệp
Dược phẩm Trung ương 25 thành phố Hồ Chí Minh sản xuất) gồm có: cao tâm sen,
cao củ bình vơi, cao nhân hạt táo và cao thiên ma.
 Một số bộ phận trong cây sen đã được dùng làm nguyên liệu trong chế biến
thực phẩm như: củ sen, ngó sen, hạt sen, nhụy hoa để ướp hương cho trà xanh.

2.2. Các hợp chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên
Trong tự nhiên có nhiều hợp chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật
như các loại cây, quả,..v.v., hay có nguồn gốc từ động vật như dầu cá chứa omega –
3, omega – 6, ..v.v. Một số loại hợp chất kháng oxy đã trở nên thông dụng và được
đề cập đến rất nhiều trong việc bảo vệ sức khỏe con người, phải kể đến như:
Vitamin E, vitamin C, anthocyanin, catechin, tannin, omega (loại 3,6,9),…Nhưng
trong bài nghiên cứu này chỉ quan tâm đề cập đến một số hợp chất có hoạt tính
kháng oxy hóa có thể có trong lá sen.
2.2.1. Gốc tự do và cơ chế tác động của chất kháng oxy hóa
2.2.1.1. Sự hình thành gốc tự do của oxy trong sinh học
Định nghĩa gốc tự do: là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà
lớp điện tử ngoài cùng của chúng có chứa điện tử khơng cặp đơi. Gốc tự do có thể
mang điện tích dương, điện tích âm hoặc khơng mang điện tích.

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngơ Đại Nghiệp


-7-

Đặc tính của phản ứng oxy hóa – khử trong cơ thể là chỉ có thể trao đổi một
điện tử, có nghĩa là oxy trong chuỗi hơ hấp của tế bào cũng chỉ nhận từng điện tử
một. Sự chuyển hóa của oxy chủ yếu theo các phản ứng sau:
4 O2

+

4e
4H+

4O2˙¯ +

2H2O2 + 2O2

4O2˙¯

=

SOD

2H2O2 + 2O2

Catalase

2H2O + O2

SOD
Catalase

O2 + 4H+ + 4e

2 H2 O

Vì O2˙¯ và H2O2 liên tục sinh ra và liên tục bị phá hủy nên ở điều kiện bình
thường chúng tồn tại ở nồng độ cân bằng rất nhỏ. Tuy nhiên, q trình chuyển hóa
này gây ra các phản ứng phụ.
 Vì có chuyển động nhiệt nên chúng vẫn có thể tương tác với nhau mà
khơng cần enzyme xúc tác, xảy ra phản ứng phụ như sau:
2O2˙¯

1

+

2H → H2O2 +

1

O2

O2 là một dạng oxy đơn bội có năng lượng cao và rất độc hại, có khả

năng phản ứng rất mạnh mẽ.
 Phản ứng phụ đáng chú ý nữa là phản ứng Haber – Weiss, xảy ra giữa
superoxide và hydrogen peroxide tạo nên gốc hydroxyl ˙OH và oxy đơn bội.
O2˙¯ + H2O2 →

1

O2 + C + OH¯ (1)

Bình thường phản ứng (1) xảy ra chậm, nhưng nếu có ion kim loại
chyển tiếp như sắt và đồng xúc tác, phản ứng xảy ra nhanh hơn.
Oxy đơn bội và gốc hydroxyl đều có khả năng phản ứng mạnh và rất độc hại,
chúng là ngun nhân chính gây ra q trình peroxi hóa các chất. Gốc hydroxyl rất
dễ phản ứng với những phân tử cạnh nó, tạo ra sự polymer hóa:
R1H + ˙OH

→ R1˙ +

H2 O

R2H + ˙OH

→ R2˙ +

H2 O

R1˙

+

R2˙ → R1 - R2

Khi R1H là một cao phân tử sinh học (protein, AND,…), còn R2H là một chất
dị sinh (xenobiotic) thì sẽ có liên kết đồng hóa trị giữa hai chất đó, từ đó có thể tạo
ra những tế bào lạ trong cơ thể. Đối với các lipid, một gốc ˙OH hay một gốc R˙ bất
HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


-8-

kỳ sẽ peroxi hóa hàng trăm phân tử acid béo chưa bão hịa có nhiều nối đơi (LH)
theo cơ chế phản ứng dây chuyền trước khi bị dập tắt.
LH

+

˙OH

→

L˙ + H2O

L˙

+

O2

→

LOO˙

LOO˙ +

LH

→

LOOH + L˙

…………………
Tóm lại, từ anion superoxide O2˙¯ được sinh ra đầu tiên sẽ tạo ra hang loạt
chất: H2O2, HO˙, 1O2, LOOH, LOO˙, L˙ và các gốc tự do khác. Các chất này đều
được gọi là các dạng oxy hoạt động và có liên quan đến nhiều bệnh lý của con
người [2].
2.2.1.2. Cơ chế tác động của chất kháng oxy hóa

Chất kháng oxy hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại
bỏ tác dụng độc hại của các dạng oxy hóa hoạt động.
Chất kháng oxy hóa có khả năng phân hủy được các peroxide, oxy đơn bội,
gốc tự do khác hoặc dập tắt gốc tự do, hoặc ngăn chặn q trình oxy hóa sinh học
do một cơ chế gián tiếp nào đó gây ra.
Nhóm các hợp chất polyphenol có 2 dạng: dạng khử và dạng oxy hóa. Dạng
khử có thể phản ứng với các gốc tự do, tạo dạng oxy hóa (quinon). Dạng oxy hóa
của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc, có khả năng phản ứng với hai gốc
tự do nữa (tuy nhiên sự chuyển hóa theo hướng này yếu).
Các polyphenol (dạng ortho) có khả năng tạo phức với ion sắt (hoặc đồng),
làm mất khả năng xúc tác của các ion kim loại này.
Một vài loại chất kháng oxy hóa (vitamin E) có khả năng dập tắt chuỗi phản
ứng oxy hóa của các acid béo chưa bão hịa nhiều nối đơi.
L˙ (hay LOO˙) + VE → LH (hay LOOH) + VE˙
L˙ (hay LOO˙) + VE˙ → LH (hay LOOH) + TQ
Trong đó:
LH: acid béo chưa bão hịa có nhiều nối đơi.
VE : vitamin E.
TQ: tocopherol quinon.
HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


-9-

Một trong những tác dụng kháng oxy hóa của vitamin C là đưa vitamin E từ
dạng từ dạng oxy hóa về dạng khử [2].
2.2.2. Flavonoid
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, có cấu trúc cơ bản là 1,3 –

diphenylpropan (có 2 vịng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên
thường được gọi là C6 – C3 – C6). Flavanoid bao gồm: flavon, flavonol, isoflavon,
chalcon, trong đó, flavon và flavonol là phổ biến trong tự nhiên [6].

Hình 2.2: Cấu trúc của flavonoid [6]
Các flavonoid thường dễ kết tinh và thường có màu. Flavon có màu vàng
nhạt hoặc màu cam; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến
cam đỏ; các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoantocyanidin, catechin kết tinh
không màu; antocyanidin thường ở dạng glycosid tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho
hoa và trái [6].
Cơ chế kháng oxy hóa của flavonoid bằng cách: loại bỏ các gốc tự do (các
anion superoxide, gốc peroxy và gốc hydroxyl), triệt tiêu oxy đơn bội, tạo phức với
ion kim loại, ức chế enzyme lipoxygenase.
Flavonoid có những nhóm – OH đóng vai trị quan trọng để triệt tiêu gốc tự
do, vị trí và số lượng các nhóm – OH ảnh hưởng đến hoạt tính của flavonoid. Mức
độ nhường điện tử tùy thuộc vào hai nhóm – OH ở vị trí ortho trên vịng benzen B,
khi có thêm một nhóm – OH ở vị trí 5’ cũng làm tăng hoạt tính kháng oxy hóa của
flavonoid. Nhóm – OH trên vịng A ở vị trí 5, 7 hoặc 7, 8 cũng làm tăng hoạt tính
kháng oxy hóa cho flavonoid.

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


- 10 -

Khả năng tạo phức với ion kim loại của flavonoid cần phải có cấu trúc 3’,4’dihydroxyl, quan trọng nhất là C4 quinone và C3 hoặc C5 – OH.
2.2.3. Tannin
Tannin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật. Hợp

chất này gây nên vị chát ở một số loại cây, trái. Các tannin có trọng lượng phân tử
khoảng 500 – 3000, các tannin do mang nhiều nhóm – OH nên ít nhiều hịa tan
trong nước tạo nên dung dịch nhớt.
Tannin được chia làm 2 nhóm: Tannin thủy giải được và tannin hóa đặc
- Tannin hóa đặc là sự polymer của một vài flavonol, ví dụ như catechol hoặc
epicatechol. Loại này khác với tannin thủy giải được vì nó khơng bị thủy giải dưới
tác dụng của acid vơ cơ lỗng.
- Tannin thủy giải được có cấu trúc hóa học là ester của glucose với acid
gallic, được chia làm 2 loại là tannin gallic và tannin ellagic.
 Tannin gallic có cấu trúc hóa học gồm một nhân trung tâm là đường
glucose. Các nhóm – OH tại các carbon C – 1,2,3,4 hoặc 6 chủa đường glucose này
tạo nối ester với từ 1 đến n phân tử acid gallic.
 Tannin ellagic: Do có sự hiện diện của các nối C – C trong nhân
glucose và các nối C – C giữa 2 nhân benzen của 2 phân tử acid gallic, làm cho cấu
trúc tannin thêm sát chặt, bến hơn, vì vậy độ hịa tan cũng giảm đi [6].

Hình 2.3: Công thức cấu tạo của tannin gallic [6]

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


- 11 -

2.2.4. Hợp chất phenol
Các hợp chất phenol là hợp chất trong cơng thức cấu tạo có vịng benzen
mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy (– OH). Trong tự nhiên, hợp chất phenol
gồm có: flavonoid, coumarin, các phenol đơn vịng, các polyphenol (tanin,
lignin,…). Cơ chế kháng oxy hóa của các hợp chất phenol là: vô hoạt các gốc lipid

tự do, ngăn chặn sự phân hủy các gốc hydroperoxy thành các gốc tự do [6].
Ngồi thành phần kháng oxy hóa flavonoid đã được đề cập ở mục 2.2.1, một
thành phần khác cũng có tác dụng tương tự cần phải kể đến chính là polyphenol.
Trong đó, tanin là hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều
nhóm – OH có khả năng bắt các gốc tự do. Khả năng kháng oxy hóa của polyphenol
đã được kiểm chứng qua các nghiên cứu về hoạt chất catechin có trong trà xanh của
các nhà khoa học trên thế giới.
2.2.5. Chlorophyll
Chlorophyll là một hợp chất có trong diệp lục của lá cây, giữ chức năng
quang hợp, tổng hợp năng lượng cho cây. Ngồi ra, chlorophyll cũng là một hợp
chất có hoạt tính kháng oxy, chúng có khả năng bắt các gốc tự do (M.G.Ferruzzi,
2006) [10].
Chlorophyll là sắc tố quang hợp, quyết định quá trình quang hợp của cây,
giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng. Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu
xanh dương nhưng lại hấp thụ kém ánh sáng màu lục trong dãy quang phổ của ánh
sáng. Chlorophyll là một sắc tố chlorin, các sắc tố chlorin được tạo thành thơng qua
các con đường chuyển hóa giống như các sắc tố porphyrin khác (như heme). Tại
trung tâm của vòng chlorin là một ion Mg2+ (Duble, 2010). Công thức tổng quát của
chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm 1940, đến năm 1960 cấu trúc lập thể
của chlorophyll a đã được làm sáng tỏ.
Sự khác nhau giữa chlorophyll a và b là tại vị trí C7 ở chlorophyll a là nhóm
– CH3, cịn ở chlorophyll b là nhóm – CHO (Woodward RB, 1960).

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


- 12 -

Hình 2.3: Cơng thức cấu tạo của chlorophyll a và b
2.3. Các cơng trình nghiên cứu trƣớc đây
Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về tách chiết thành phần polyphenol và
kiểm tra hoạt tính của nó từ các phần của cây sen như lá, thân rễ, đài sen.
2.3.1. Nghiên cứu về lá sen
Nhiều cơng trình nghiên cứu về tách chiết các thành phần có trong lá sen,
cũng như kiểm tra hoạt tính của cao chiết trích ly từ ethanol và methanol. Cao lá sen
trích ly bằng ethanol 60% ở nhiệt độ 80oC cho hàm lượng tổng polyphenol là 374 ±
7,5 mg/g và flavonoid là 203 ± 7,0 mg/g. Kết quả phân tích thành phần của
polyphenol bằng HPLC xác định được một số loại như: catechin rhamnoside,
miricitrin-3-O-glucoside,

hyperin,

isoquercitrin,

quercetin-3-O-rhamnoside,

astragalin, một số thành phần chưa nhận biết được. Hoạt tính bắt gốc tự do rất cao
vì giá trị IC50 của cao là 4,172 ± 0,23 µg/ml (Bo Huang và cộng sự, 2010) [14].
Về hoạt tính kháng oxy hóa của cao lá sen trích bằng methanol cũng cho khả
năng bắt gốc tự do DPPH cao, ở nồng độ 50 µg/ml thì khả năng bắt gốc tự do DPPH
là 95,1 ± 0,2 % (Ming-Jiuan Wu và cộng sự, 2003) [20].
Một cơng trình khác lại nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các điều kiện trích
ly đến hàm lượng flavonoid thu được. Kết quả nghiên cứu cho thấy dung mơi
ethanol 70% cho hiệu quả trích ly cao nhất, tác giả sử dụng phương pháp trích ly có
sự hỗ trợ của sóng siêu âm với thời gian tác động sóng siêu âm ở 25 phút cho hiệu
suất trích ly cao hơn các thời gian khảo sát cịn lại. Về tỉ lệ ngun liệu và dung mơi

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


- 13 -

sử dụng thì ở tỉ lệ 1:30, thu được hàm lượng flavonoid cao và hiệu quả nhất (Lan
Zhang và cộng sự, 2009) [18].
Trong lá sen, ngoài thành phần polyphenol và flavonoid có hoạt tính sinh học
thì một thành phần có hoạt tính sinh học khác cũng rất quan trọng và đã được ứng
dụng nhiều trong ngành dược, đó chính là alkaloid. Cơng trình luận án Tiến sĩ của
tác giả Hoàng Thị Tuyết Nhung (Trường Đại học Dược Hà Nội, 2012) đã tách chiết
được 0,89 ± 0,04 % alkaloid toàn phần trong 70,00g bột lá sen với phương pháp
chiết nóng bằng ethanol 96o, và tác giả đã tinh chế thành cơng thành phần nuciferin
từ alkaloid tồn phần [5].
2.3.1. Nghiên cứu về một số bộ phận khác của cây sen
Kết quả nghiên cứu trên thân rễ (củ sen) cho thấy hiệu quả trích ly của dung
mơi methanol cao nhất cho hàm lượng hợp chất phenol là 20,1 mg catechin/100g
chất khô. Tuy nhiên, về khả năng bắt gốc tự do DPPH của cao trích bằng ethyl
acetate lại cao hơn so với cao trích bằng ethanol và methanol. Có thể thấy trong
thân rễ của cây sen hợp chất phenol tập trung những chất có tính phân cực trung
bình (Dongmei Yang ME và cộng sự, 2007) [17].
Về cao trích ly bằng cồn của đài sen được tách thành 4 phân đoạn khác nhau:
cao ether petroleum (PEF), cao ethyl acetate (EAF), cao n-butanol (BF) và cao nước
(AF). Cao BF cho hàm lượng phenolic cao nhất (607,6 mg/g) và hàm lượng
flavonoid là 862,7 mg/g và proanthocyanidin tổng số là 331,0 mg/g (đơn vị tính trên
khối lượng dịch chiết không phải khối lượng chất khô). Thành phần flavonoid trong
đài sen được phân tích gồm có: hyperoside (1), isoquercitrin (2), quercetin-3-O-βD-glucuronide (3), isorhamnetin-3-O-β-D-galactoside (4) và syringetin-3-O-β-Dglucoside (5).
Khả năng bắt gốc tự do của các phân đoạn cho kết quả ở phân đoạn BF có
hoạt tính cao nhất trong các phân đoạn khác vì giá trị IC50 của phân đoạn này là 5,4

± 0,3 µg/ml, hoạt tính thấp nhất là phân đoạn PEF có giá trị IC50 cao nhất là 103,4 ±
0,4 µg/ml. Trong 5 hợp chất được xác định thì hoạt tính kháng oxy hóa của 3 hợp
chất đầu (1 – 3) là cho kết quả cao với giá trị IC50 (8.9 ± 0.2, 5.2 ± 0.2, 7.5 ± 0.1
µg/ml) thấp hơn so với 2 hợp chất còn lại (Yan-Bin Wu và cộng sự, 2012) [19].
HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


- 14 -

Các cơng trình nghiên cứu đều chỉ ra rằng trong cây sen chứa nhiều hợp chất
có hoạt tính kháng oxy hóa, đặc biệt là trong lá sen. Nhưng những cơng trình này
tập trung vào phân tích thành phần và chứng minh hoạt tính, dung mơi sử dụng chủ
yếu là cao ethanol hoặc methanol để trích ly các thành phần có trong lá sen. Tuy
nhiên, các loại cao này khó có thể ứng dụng vào ngành thực phẩm vì các loại cao
này khơng tan hồn tồn trong nước.
Do đó mục tiêu của đề tài là nghiên cứu tách chiết các hợp chất bằng dung
môi nước và kiểm tra hoạt tính của cao nước, từ đó hướng ứng dụng của cao này
vào trong ngành công nghiệp nước giải khát, sản xuất nước uống có lợi cho sức
khỏe.

HVTH: Nguyễn Thị Ngọc Mai

GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp