Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này, trước tiên tôi xin gửi đến Ban giám hiệu_Trường
Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ nhiệm khoa Công
nghệ Thực phẩm lời cảm ơn và lòng tự hào được học tập tại Trường trong những
năm qua.
Lời cảm ơn sâu sắc xin được giành cho cô Th.S Nguyễn Thị Mỹ Trang_Bộ
môn Đảm bảo Chất lượng và An toàn Thực phẩm và Th.S Đặng Xuân Cường_
Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá
trình thực hiện đồ án này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực phẩm, các
cán bộ Phòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ_Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang đã giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Xin giành lòng biết ơn đến cha mẹ đã tạo điều kiện cho tôi được học tập
trong suốt thời gian qua.
Xin cảm ơn bạn bè đã chia sẽ cùng tôi những khó khăn trong quá trình học
tập tại trường.
Nha Trang, ngày tháng năm 2012
Người thực hiện

Nguyễn Thị Minh Trang





ii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp) 4
1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô 4
1.1.2. Đặc tính trồng trọt 5
1.1.3. Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới 5
1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng 8
1.2.1. Đặc tính của chlorophyll 8
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chlorophyll 8
1.2.3. Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll 9
1.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll 11
1.2.5. Tác dụng của chlorophyll 13
1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường: 14
1.3. Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới 16
1.3.1. Trong nước 16
1.3.2. Trên thế giới 16
1.4. Các phương pháp chiết tách và xác định chlorophyll, ưu nhược điểm 22
1.4.1. Các phương pháp chiết tách chlorophyll 23
1.4.2. Các phương pháp xác định chlorophyll 26
1.5. Mô hình thiết kế thí nghiệm Box-Behnken 28
1.5.1. Cơ sở lý thuyết 28
1.5.2. Các bước tiến hành 30
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Nguyên liệu 33

2.2. Phương pháp nghiên cứu 33
2.2.1. Phương pháp định lượng 33
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 34
2.2.3. Phân tích và xử lý số liệu 34
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 35
2.2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa 41
2.3. Dụng cụ và hóa chất 42
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43
3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa
của chlorophyll 44
3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy
hóa của chlorophyll 46
iii

3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi: nguyên liệu đến hàm lượng và hoạt tính chống
oxy hóa của chlorophyll 48
3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll sau chlorophyll 50
3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng và hoạt tính chống oxy hóa của
chlorophyll 53
3.6. Tối ưu hóa công đoạn chiết dịch chlorophyll chống oxy hóa 55
3.7. Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp 61
3.8. Đánh giá sơ bộ hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp 63
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

iv


DANH MỤC BẢNG

STT

TÊN BẢNG TRANG
1
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế
giới (1961-2007)
6
2
Bảng 1.2. Sản xuất ngô Việt Nam (1961-2007)
7
3
Bảng 1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử
chlorophyll.
10
4
Bảng 2.1. Bảng quy đổi biến mã và biến thực
41
5
Bảng 2.2.Thiết kế thí nghiệm theo biến mã và biến thực
sử dụng mô hình Box-Behnken
41
6 Bảng 3.1. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa 55
7
Bảng 3.2. Bảng thể hiện độ lệch chuẩn, độ tương tác và
F của các yếu tố
56
8
Bảng 3.3. Bảng thể hiện xác suất và hệ số mô hình của
hai hàm mục tiêu
56

v


DANH MỤC HÌNH


STT


TÊN HÌNH

TRANG

1
Hình 1.1. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt

nước biển (mg chl m
-3
).
8

2
Hình 1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll.
10

3
Hình 1.3. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường
15

4
Hình 1.4. Thống kê các phương pháp nghiên cứu
chlorophyll.
17

5
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
35

6
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại dung môi
chiết
36

7
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ dung
môi chiết

37
8 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ dung môi/
nguyên liệu
38
9

Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết
39

10
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiết độ chiết
40

11
Hình 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng
chlorophyll
44

12
Hình 3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll
44

13
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm
lượng chlorophyll
46

14
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt

46
vi

tính chống oxy hóa chlorophyll

15
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ nguyên liệu đến
hàm lượng chlorophyll
48

16
Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi đến
hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll
49

17
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng
chlorophyll
50

18
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll
51

19
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng
chlorophyll
53

20
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll
54
21

Hình 3.11. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y
1

57
22

Hình 3.12. Mô hình bề mặt 3D của hàm mục tiêu Y
2

58

23

Hình 3.13a. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố
lên hàm mục tiêu Y
1

58

24

Hình 3.13b. Đồ thị 2D thể hiện sự tương tác giữa 3 yếu tố
lên hàm mục tiêu Y
2

58

25
Hình 3.14. Mô hình bề mặt 2D trùng lắp của 2 hàm mục
tiêu Y
1
và Y
2

59

26
Hình 3.15. Quy trình đề xuất chiết chlorophyll từ lá bắp 61

27
Hình 3.16. Hàm lượng chlorophyll sau mỗi lần chiết 63

28
Hình 3.17. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll sau
mỗi lần chiết
63



1

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay sự biến đổi khí hậu và môi trường toàn cầu đang ở mức đáng báo
động cao. Con người luôn có thể phải tiếp xúc với phóng xạ, các bức xạ năng lượng

cao, ngộ độc, nhiễm độc thức ăn, nấm mốc, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc diệt cỏ
(dioxin), tia tử ngoại, khói thuốc lá (mỗi hơi thuốc lá sản sinh khoảng 114 gốc tự
do), stress, dư thừa chất béo…. Chính các yếu tố trên đã làm tăng nhanh quá trình
lão hóa và mắc bệnh cho con người, như ung thư, Alzehmer,….
Chuyên gia nghiên cứu về hồng huyết cầu và khoa học gia từng đoạt giải
Nobel, Bác Sĩ Hans Frischer, đã khám phá ra cấu trúc của hồng huyết cầu rất giống
như cấu trúc của Chlorophyll. Trong cơ thể con người, hồng huyết cầu có nhiệm vụ
chuyển tải dưỡng khí cho cơ thể với chất sắt (Fe) là nhân tố của hồng huyết cầu
trong khi magnesium (Mg) là nhân tố của Chlorophyll. Chính điều này giúp cơ thể
chúng ta biến đổi chlorophyll thành hồng huyết cầu làm gia tăng chỉ số hồng huyết
cầu trong cơ thể, bổ gan, hoá giải các độc tố và tiêu trừ các chất độc trong máu.
Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy, chlorophyll có tác dụng như một chất
chống oxy hoá của cơ thể, có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá (khả năng: quét
các gốc DPPH, Hydroxyl, các anion, khử sắt, tạo phức chelat với các iôn hóa trị,
oxy hóa lipid), ngừa ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, trị vết thương…
Cây bắp là một trong năm loại cây lương thực chủ đạo trên thế giới cũng như
ở Việt Nam. Năm 2009 chỉ tính riêng huyện Khánh Vĩnh, trong tổng số 2.680 ha
cây lương thực, diện tích trồng bắp trên địa bàn huyện đạt hơn 1.500 ha với năng
suất 32 – 35 tạ/ ha.
Ở nước ta cây bắp chủ yếu được trồng để lấy hạt, còn thân cây, lá cây, vỏ
bắp và lụa bắp chủ yếu được làm thức ăn gia súc hoặc tồn tại ở dạng phế liệu nông
nghiệp gây ô nhiễm môi trường. Từ lá bắp, vỏ bắp,…thu nhận chlorophyll, sau vẫn
có thể sử dụng phần còn lại để sản xuất nhiên liệu sinh học từ bã chiết.
Do vậy, tôi được Khoa Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nha Trang
phân công nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chiết xuất dịch chlorophyll chống oxy


2

hóa từ lá bắp”, với mục đích tận dụng lá bắp để thu nhận chlorophyll dùng trong

thực phẩm.
Nội dung đề tài:
1) Xác định một số thông số cho quá trình chiết rút chlorophyll chống oxy
hóa từ lá bắp: loại và nồng độ dung môi chiết, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu,
thời gian và nhiệt độ chiết;
2) Đề xuất qui trình chiết rút chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp;
3) Sơ bộ đánh giá hiệu suất thu nhận chlorophyll chống oxy hóa từ lá bắp;
Do thời gian nghiên cứu có hạn và lần đầu làm quen với nghiên cứu
chlorophyll. Do vậy đồ án này chắc hẳn sẽ còn có những hạn chế. Em rất mong
nhận được ý kiến đóng góp của quý thấy cô và bạn bè để nghiên cứu này thêm hoàn
thiện. Xin chân thành cảm ơn.

3








Chương 1
TỔNG QUAN

















4

1.1. Giới thiệu về cây ngô (cây bắp)
Ngô, bắp hay bẹ (danh pháp khoa học: Zea mays L. ssp. mays) là loại cây
lương thực thuần canh bắt nguồn ở Trung Mỹ, sau đó được trồng phổ biến ở châu
Mỹ. Cuối thế kỷ 15 đầu thế kỷ 16, khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu Mỹ,
bắp đã được trồng phổ biến trên toàn thế giới.
1.1.1. Đặc điểm hình thái cây ngô [39]
Một vài giống ngô có thể cao tới 7m, còn chiều cao các giống ngô thương
phẩm chỉ khoảng 2,5m và ngô ngọt (Zea mays var. rugosa hay Zea mays var.
saccharata) thường thấp hơn.
Cây ngô có hình thái phát triển rất khác biệt; các lá hình mũi mác rộng bản,
dài 50 – 100cm, rộng 5 - 10cm; thân thẳng, thường cao 2–3 m, nhiều mấu, với các
lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Bắp ngô ôm sát thân cây và nằm dưới lá. Khi còn
non chúng dài ra khoảng 3cm mỗi ngày. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ.
Thân cây ngô có đốt với các khớp (mấu hay mắt), các khớp cách nhau khoảng 20 –
30cm, trông tương tự thân cây tre.
Các bắp ngô (bẹ ngô) là các cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một
số lớp lá, và bao chặt vào thân. Chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu
ngô màu vàng hung từ vòng lá vào cuối của bắp ngô. Râu ngô là các núm nhụy
thuôn dài trông giống như một búi tóc, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần
sang màu hung đỏ hay hung vàng.
Trên đỉnh của thân cây là cụm hoa đuôi sóc hình chùy chứa các hoa đực,
được gọi là cờ ngô. Mỗi râu ngô đều có thể được thụ phấn để tạo ra một hạt ngô
trên bắp. Các bắp ngô non có thể dùng làm rau ăn với toàn bộ lõi và râu, nhưng khi
bắp đã già (thường là vài tháng sau khi trổ hoa) thì lõi ngô trở nên cứng và râu thì
khô đi nên không ăn được.
Các hạt ngô là các dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu
quả thông thường ở họ Hòa thảo (Poaceae), gần giống loại quả phức về cấu trúc,
ngoại trừ là các hạt riêng biệt không bao giờ hợp nhất thành một khối. Hạt ngô có
kích thước cỡ hạt đậu Hà Lan, bám chặt thành hàng tương đối đều xung quanh một

5

lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10 – 25cm, có khoảng 200 -
400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng, khi được nghiền
thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì. Tuy nhiên, chúng không
có gluten như lúa mì nên có độ trương nở nhỏ hơn khi sử dụng cho các thức ăn dạng
nướng [39].
1.1.2. Đặc tính trồng trọt [39]
Ngô cần thời gian ban đêm dài và ra hoa trong môi trường phù hợp với nhiệt
độ lớn hơn 10°C (50°F) và biên độ ảnh hưởng này được quyết định theo di truyền
và được điều chỉnh bởi hệ thống sắc tố thực vật. Tính chu kỳ theo ánh sáng có thể bị
sai lệch đối với các giống cây trồng ở khu vực nhiệt đới (thời gian ban ngày kéo dài
làm cho cây phát triển rất cao và không đủ thời gian ra hoa, tạo hạt trước khi bị chết
vì sương giá). Tuy nhiên, đặc tính này hữu ích khi sử dụng ngô làm nguồn cung cấp
nhiên liệu sinh học
Do ngô chịu lạnh kém nên ở khu vực ôn đới, ngô thường được trồng vào
mùa xuân. Hệ thống rễ nông, nên phụ thuộc nhiều vào độ ẩm của đất. Là một loại
thực vật C4 (thực vật có cơ chế quang hợp C4), nên chúng sử dụng nước hiệu quả
hơn so với thực vật C3 như (cỏ linh lăng hay đậu tương). Chúng nhạy cảm nhất với
khô hạn khi trổ bắp, lúc hoa (râu) ngô đã sẵn sàng cho việc thụ phấn. Tại Hoa Kỳ,
vụ thu hoạch bội thu theo truyền thống được dự đoán là khi ngô "cao ngang đầu gối
vào ngày 4 tháng 7", mặc dù các giống lai ghép hiện nay nói chung đều vượt quá tỷ
lệ phát triển này. Ngô sử dụng để làm cỏ ủ chua được thu hoạch khi cây còn non và
bắp chưa già. Ngô ngọt được thu hoạch khi hạt ở "giai đoạn sữa", sau khi thụ phấn
nhưng trước khi hình thành tinh bột, ở Mỹ là vào khoảng cuối mùa hè, đầu đến giữa
mùa thu [39].
1.1.3. Sản lượng ngô trong nước và trên thế giới [38]
 Trên thế giới
Ngô là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (riêng tại Hoa

Kỳ, sản lượng là khoảng 270 triệu tấn/ năm). Các giống ngô lai được ưa chuộng hơn
so với các giống ngô thông thường, do năng suất cao.


6

Ngành sản xuất ngô trên thế giới tăng liên tục từ đầu thế kỉ 20 đến nay, nhất
là trong hơn 40 năm gần đây, ngô là cây trồng có tốc độ tăng trưởng về năng suất là
cao nhất trong các cây lương thực chủ yếu. Năm 1961, năng suất ngô trung bình của
thế giới chỉ chưa đến 20 tạ/ha, năm 2004 đã đạt 49,9 tạ/ha. Năm 2007, theo Bộ
Nông nghiệp Hoa Kì (USDA), diện tích ngô đã vượt qua lúa nước với 157 triệu ha,
năng suất 4.9 tấn/ha và sản lượng đạt kỉ lục với 766,2 triệu tấn.
Kết quả trên có được trước hết là nhờ ứng dụng rộng rãi lý thuyết ưu thế lai
trong chọn tạo giống, đồng thời không ngừng cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh
tác. Đặc biệt, từ 10 năm nay, cùng với những thành tựu mới trong chọn tạo giống lai
nhờ kết hợp phương pháp truyền thống với công nghệ sinh học thì việc ứng dụng
công nghệ cao trong canh tác ngô đã góp phần đưa sản lượng ngô thế giới vượt lên
trên lúa mì và lúa nước. Với 52% diện tích trồng bằng giống được tạo ra bằng công
nghệ sinh học, năng suất ngô nước Mỹ năm 2005 đạt hơn 10 tấn/ha trên diện tích 30
triệu hecta. Năm 2007, diện tích trồng ngô chuyển gen trên thế giới đã đạt 35,2 triệu
ha, riêng ở Mỹ đã lên đến 27,4 triệu ha, chiếm 73% trong tổng số hơn 37,5 triệu ha
ngô của nước này [38].
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới (1961-2007)
Năm

Diện tích
(1000 ha)
Năng suất
(tấn/ha)
Sản lượng

(1000 tấn)
1961 104,8 2,0 204,2
2004-2005 145,0 4,9 714,8
2005-2006 145,6 4,8 696,3
2006-2007 148,6 4,7 704,2
2007-2008 157,0 4,9 766,2

 Trong nước
Năng suất ngô của Việt Nam những năm 1960 chỉ đạt trên 1 tấn/ha, với diện
tích hơn 200 ngàn hecta. Đến đầu những năm 1980, năng suất cũng chỉ đạt 1,1
tấn/ha và sản lượng hơn 400.000 tấn do vẫn trồng các giống ngô địa phương với kĩ


7

thuật canh tác lạc hậu. Từ những năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm cải tạo Ngô
và Lúa mì Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến đã được đưa vào trồng ở
nước ta, góp phần nâng năng suất lên gần 1,5 tấn/ha vào đầu những năm 1990. Tuy
nhiên, ngành sản xuất ngô ở nước ta thật sự có những bước tiến nhảy vọt là từ đầu
những năm 1990 đến nay, gắn liền với việc không ngừng mở rộng giống ngô lai ra
sản xuất, đồng thời cải thiện các biện pháp kĩ thuật canh tác theo đòi hỏi của giống
mới.
Năm 1991, diện tích trồng ngô lai chưa đến 1% trên hơn 400.000 hecta trồng
ngô. Năm 2007, giống lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta. Năng
suất ngô nước ta tăng nhanh liên tục với tốc độ cao hơn trung bình thế giới trong
suốt hơn 20 năm qua. Năm 1980, năng suất ngô nước ta chỉ bằng 34% so với trung
bình thế giới (11/32 tạ/ha), năm 1990 bằng 42% (15,5/37 tạ/ha), năm 2000 bằng
60% (25/42 tạ/ha), năm 2005 đạt 73% (36/49 tạ/ha) và năm 2007 đã đạt 81%
(39,6/49 tạ/ha). Năm 1994, sản lượng ngô của Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn,
năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn và năm 2007, chúng ta đạt diện tích, năng suất và

sản lượng cao nhất từ trước tới nay. Diện tích là 1.072.800 ha, năng suất là 39,6
tạ/ha, sản lượng vượt ngưỡng 4 triệu tấn là 4.250.900 tấn [38].
Bảng 1.2. Sản xuất ngô của Việt Nam (1961-2007)
Năm 1961 1975 1990 1994 2000 2005 2007
Diện tích
(1000 ha)
229,20

267,00

432,00 534,60 730,20 1052,6 1072,8
Sản lượng
(1000 tấn)

260,10

280,60

671,00 1143,9 200,.9 3787,1 4250,9
Năng suất
(tạ/ha)
11,4 10,5 15,5 21,4 25,1 36,0 39,6



8

1.2. Chlorophyll, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng
1.2.1. Đặc tính của chlorophyll
Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyll) là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá

cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn lam. Lượng chlorophyll có trong tế bào phụ thuộc
vào lượng sinh khối [25]. Chúng là phân tử sinh học rất quan trọng, quyết định đến
quá trình quang hợp của cây, giúp cây tổng hợp năng lượng từ ánh sáng.
Chlorophyll hấp thụ mạnh ánh sáng màu xanh dương, tiếp đến màu đỏ nhưng kém
hấp thụ ánh sáng màu lục trong dải quang phổ ánh sáng. Do đó, màu các mô chứa
chlorophyll có màu xanh lá cây [30].

Hình 1.1. Sự phân bố chlorophyll trung bình trên bề mặt nước biển
(mg chl m
-3
)
1.2.2. Lịch sử nghiên cứu chlorophyll
Chlorophyll được phân lập lần đầu bởi Joseph Bienaimé Caventou and Pierre
Joseph Pelletier vào năm 1817 [6].
Năm 1913, Richard Willstatter, nhà hóa học người Đức đã chỉ ra tất cả các
năng lượng sống đều nhờ mặt trời. Cây xanh có một cách nào đó để giữ năng lượng
mặt trời. Năm 1919, ông đã giải thích được chức năng của chất giữ năng lượng mặt


9

trời chính là Chlorophyll. Thực vật bậc cao có lá xanh đã tự mình hấp thụ được
năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ trong cơ thể.
Cấu trúc tổng quát của chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm 1940
và đến năm 1960 cấu trúc lập thể của chlorophyll a đã được làm sáng tỏ hoàn toàn.
1.2.3. Cấu trúc và quá trình sinh tổng hợp chlorophyll
 Cấu trúc chlorophyll
Cấu trúc chung của chlorophyll được làm sáng tỏ bởi Hans Fischer vào năm
1940. Năm 1960, hầu hết các lập thể của chlorophyll đã được biết đến, Robert
Burns Woodward đã xuất bản một tổng hợp tổng số về phân tử. Năm 1967, việc giải

thích lập thể còn lại cuối cùng đã được hoàn thành bởi Ian Fleming [9]. Chlorophyll
f được công bố tồn tại ở vi khuẩn lam và các vi sinh vật hiếu khí khác có khả năng
hình thành stromatolites, năm 2010 [5]. Chlorophyll có công thức phân tử là
C
55
H
70
O
6
N
4
Mg và cấu trúc 2-formyl-chlorophyll đã được phân tích dựa trên NMR,
quang học và phổ khối [24].
Chlorophyll có nhân porphyrin. Nhân porphyrin do 4 vòng pyrol liên kết
nhau qua cầu nối ethyl tạo thành vòng kín với tâm là Mg. Bên cạnh đó còn có vòng
phụ thứ 5. Nhân porphyrin có 2 gốc rượu methanol (CH
3
OH) và fythol (C
20
H
39
OH)
nối nhau tại vị trí C10 và C7, và 10 nối đôi tạo cơ sở cho quá trình quang hóa.
Sự khác nhau giữa chlorophyll a và chlorophyll b là tại vị trí C7 ở
chlorophyll a là nhóm -CH
3
, còn ở chlorophyll b là nhóm -CHO [33].


10

Cấu trúc chlorophyll a Cấu trúc chlorophyll b Cấu trúc chlorophyll d
Hình 1.2. Cấu trúc các phân tử chlorophyll
Một số cấu trúc khác nhau của chlorophyll được tóm tắt dưới bảng sau:
Bảng 1.3. Các cấu trúc khác nhau của phân tử chlorophyll

Diệp lục tố a

Diệp lục tố b

Diệp lục tố
c1
Diệp lục tố
c2
Diệp lục tố d

Công
thức
phân
tử
C
55
H
72
O
5
N

4
Mg
C
55
H
70
O
6
N
4
Mg
C
35
H
30
O
5
N
4
Mg
C
35
H
28
O
5
N
4
Mg
C

54
H
70
O
6
N
4
Mg
Nhóm
C3
-CH=CH
2
-CH=CH
2
-CH=CH
2
-CH=CH
2
-CHO
Nhóm
C7
-CH
3
-CHO -CH
3
-CH
3
-CH
3

Nhóm
-CH
2
CH
3
-CH
2
CH
3
-CH
2
CH
3
-CH=CH
2
-CH
2
CH
3



11

C8
Nhóm
C17
-
CH
2

CH
2
COO
-Phytyl
-
CH
2
CH
2
COO
-Phytyl
-
CH=CHCOO
H
-
CH=CHCOO
H
-
CH
2
CH
2
COO
-Phytyl
Liên
kết
C17-
C18
Đơn Đơn Kép Đơn Kép
Tần

suất
Phổ biến
Đa s
ố thực
vật
Các lo
ại tảo
khác nhau
Các lo
ại tảo
khác nhau
Vi khu
ẩn lam
(cyanobacteri
a)

 Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll
Ở thực vật, chlorophyll có thể được tổng hợp từ succinyl-CoA và glycine,
mặc dù tiền chất trước đó để hình thành chlorophyll a và b là protochlorophyllide.
Trong thực vật hạt kín, bước cuối cùng trong quá trình chuyển đổi
protochlorophyllide thành chlorophyll, có sự phụ thuộc vào ánh sáng và thực vật có
màu nhạt nếu được trồng trong bóng tối. Thực vật không mạch và các loại tảo xanh,
có một enzyme bổ sung không phụ thuộc vào ánh sáng và phát triển màu xanh ngay
cả trong bóng tối. Chlorophyll được gắn kết với protein và có thể chuyển năng
lượng hấp thụ theo hướng yêu cầu [13].
1.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll
Chlorophyll và các dẫn xuất của nó được biết đến là các chất có hoạt động
chống oxy hóa. Việc tiêu thụ các loại rau lá, giàu chlorophyll và các dẫn xuất của nó
như chlorophyllin, có liên quan đến việc giảm một số loại bệnh ung thư. Vì vậy,
việc áp dụng một chế độ ăn uống giàu chlorophyll có thể ngăn ngừa hoặc trì hoãn

sự khởi đầu của một số bệnh như ung thư, đó là các biểu hiện lão hóa được gây ra
bởi các gốc tự do.Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng, các dẫn xuất của


12

chlorophyll, như chlorophyllin, đã cho thấy hoạt tính chống oxy hóa ít nhất là như
vitamin C. Các chức năng của chlorophyll đối với động vật được biết đến là giúp ức
chế quá trình peoroxy hóa lipid và bảo vệ ty thể khỏi sự hư hại gây ra bởi các gốc tự
do khác nhau và các loại phản ứng oxy hóa khác. Chlorophyllin cũng được báo cáo
là giúp ngăn chặn các bức xạ gây biến đổi DNA và tổn thương màng ty thể [37].
Chất chống oxy hóa và hoạt động antimutagenic của các dẫn xuất của
chlorophyll trong chế độ ăn uống đã được đánh giá. Hoạt tính chống oxy hóa được
xác định bằng khả năng của mỗi hợp chất sau đây trong việc nhặt gốc tự do như
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-
sulfonate) (ABTS +) . Hoạt động Antimutagenic đã được khảo nghiệm với một
chủng vi khuẩn vi hình gây đột biến đảo ngược, bằng cách sử dụng vi khuẩn
Salmonella typhimurium TA100 và benzo[a]pyrene như một chủng thử nghiệm và
gây đột biến tương ứng. Các chất dẫn xuất của chlorophyll a đã cho thấy là có khả
năng bắt gốc tự do hiệu quả hơn so với các dẫn xuất của chlorophyll b. Hơn nữa,
các dẫn xuất kim loại tự do của chlorophyll như chlorins, pheophytins, và
pyropheophytins cho thấy có khả năng chống oxy hóa thấp hơn các dẫn xuất kim
loại như Mg-chlorophyll, Zn-pheophytins, Zn-pyropheophytins, Cu-pheophytina,
and Cu-chlorophyllins. Những kết quả này đã chứng minh rằng các dẫn xuất của
chlorophyll trong chế độ ăn uống ở cả hai loại thực phẩm tươi và thực phẩm chế
biến, chế độ ăn uống bổ sung có tác dụng chống oxy hóa và hoạt động
antimutagenic [22].
Nghiên cứu về chlorophyll từ bột Spirulina (Spirulina sp.) đã được thực hiện
để xác định hàm lượng chlorophyll a, so sánh mô hình suy thoái và suy thoái động
học của chlorophyll a và chiết xuất thô, cũng như điều tra sự khác biệt của hoạt tính

chống oxy hóa của chlorophyll khi có chiếu xạ hoặc không có chiếu xạ. Hoạt tính
chống oxy hóa của chlorophyll a được xác định bằng cách phương pháp DPPH. Kết
quả cho thấy rằng hoạt tính chống oxy hóa của chlorophyll a được tăng lên sau 60
phút chiếu xạ [28].


13

Hoạt động của chất chống oxy hóa của chiết xuất trà xanh hoặc trà có nguồn
gốc polyphenol đã được nghiên cứu rộng rãi. Tuy nhiên, hoạt động của chất chống
oxy hóa trong các phần không có polyphenolic của trà xanh thì ít được phân tích.
Trong nghiên cứu này, họ đã phân tích hoạt động chống oxy hóa của các phần
không chứa polyphenolic của phần trà xanh còn lại (Camellia sinensis) sau khi chiết
xuất bằng nước nóng bằng việc sử dụng phương pháp clorua nhôm. Phần không
chứa polyphenolic của trà xanh còn lại gây ra sự ức chế đáng kể đối với
hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic theo cách phụ thuộc vào liều. Khi tập
trung các phần không chứa polyphenolic được áp dụng cho tấm silicagel TLC và
phát triển, sáu điểm màu đã được quan sát, chúng được cho là chlorophyll a và b,
pheophytins a và b, carotenoid, như beta-carotene và lutein. Mặc dù tất cả các sắc tố
đều biểu hiện hoạt động của các chất chống oxy hóa quan trọng, mức độ của hoạt
động ức chế chống lại hydroperoxide của chlorophyll a> lutein> pheophytin a>
chlorophyll b> beta-carotene > pheophytin b. Những kết quả này cho thấy rằng
phần không chứa polyphenolic trong phần trà xanh còn lại, có hoạt tính ức chế
mạnh chống lại hệ hydroperoxide từ sự oxy hóa axit linoleic, nó có nguồn gốc từ
hoạt động chống oxy hóa của chlorophyll a và b, pheophytins a và b, beta-carotene
và lutein. Phát hiện này cũng có nghĩa là sự kết hợp của các phần polyphenol tan
trong nước với các sắc tố chống oxy hóa có trong phần không chứa polyphenolic
của trà xanh, sẽ có hiệu quả hơn để ngăn chặn các bệnh mãn tính [14].
1.2.5. Tác dụng của chlorophyll
Chlorophyll được đăng kí như một phụ gia thực phẩm ( chất nhuộm màu) và

số E của nó là E140. Các đầu bếp sử dụng chlorophyll để tạo màu sắc đa dạng cho
thực phẩm và các loại đồ uống có màu xanh lá cây như mì ống và absinthe [2]
Chlorophyll không tan trong nước nên đầu tiên nó được trộn với một lượng nhỏ dầu
thực vật để có được những giải pháp mong muốn. Chiết xuất chlorophyll lỏng được
coi là không ổn định và luôn luôn biến đổi cho đến năm 1997, khi Frank S.& Lisa
Sagliano sử dụng việc làm đông khô chlorophyll lỏng tại trường đại học tại Florida,
ổn định nó ở dạng bột, bảo quản và để sử dụng trong tương lai.


14

Ngoài ra, chlorophyll còn có nhiều tác dụng trong y học [36] :
- Giúp cải thiện tính năng tinh lọc máu tự nhiên của cơ thể.
- Chống thiếu máu ,vi chất trong quá trình tạo hemoglobin.
- Tăng số tế bào hồng cầu, làm các tế bào mạnh thêm.
- Tăng lượng máu.
- Tăng cường các phản ứng miễn dịch chủ yếu trong cơ thể.
- Chống lại các chất độc tố/ Chống lại chất gây ung thư.
- Giúp cơ thể thải loại các chất cặn bã.
- Ngăn ngừa sự suy hô hấp.
- Làm dịu thấp khớp.
- Giúp phòng chống các bệnh tim mạch, các dấu hiệu sớm tuổi già.
- Tăng cường chức năng thận và bàng quan.
- Giảm giãn tĩnh mạch.
- Tăng cường chức năng tiêu hoá.
- Chống táo bón bằng việc tăng cường sự lưu thông của đường mật.
- Cải thiện tình trang đái tháo đường.
- Chống các bệnh về tuyến giáp.
- Tăng cường chức năng gan và cải thiện vấn đề gan.
- Giảm chóng mặt.

- Chống mất ngủ.
- Giảm thiếu máu não.
1.2.6. Một số sản phẩm về chlorophyll trên thị trường:

 Chlorophyll Fibersol Plus:
Diệp lục trong sản phẩm Chlorophyll
Fibersol Plus được lấy từ cỏ linh lăng.
Trong tiếng Arab cỏ linh lăng nghĩa là "cha
của thực phẩm", vì nó tốt cho sức khỏe, rễ


15

cây đâm sâu xuống lòng đất 30feet do vậy có thể hút rất nhiều loại chất khoáng:
Canxi, sắt, magie
- 1 gói= dinh dưỡng chứa trong 1kg rau xanh
- Cỏ linh lăng chứa hàm lượng diệp lục cao gấp 4 lần so với các loại rau thông
thường, 1 gói Chlorophyll Fibersol Plus chứa lượng dinh dưỡng có trong 1 kg rau
xanh, do vậy có thể nói rằng đây là phương pháp tự nhiên tuyệt vời để cải thiện sức
khỏe con người.
 Chiết xuất diệp lục (Liquid chlorophyll- synerry):
- Sản phẩm được nghiên cứu và sản xuất tại Mỹ. Tập đoàn Synergy -
Nature's Sunshine là nhà nhập khẩu cỏ Linh Lăng lớn nhất
toàn cầu. Tập đoàn sử dụng cỏ Linh Lăng để chiết xuất ra
chất diệp lục.
- Sản phẩm của tập đoàn chứa 8 loại Enzym cơ bản
ở dạng tự nhiên, các vi lượng và khoáng chất, hoàn toàn
không có hoá chất, chất bảo quản và độc tố gây hại cho cơ
thể người.
Ngoài ra còn một số sản phẩm khác như:

Hình 1.3. Các sản phẩm về chlorophyll trên thị trường




16

1.3. Tình hình nghiên cứu chlorophyll trong nước và trên thế giới
1.3.1. Trong nước
Nghiên cứu chlorophyll trong nước chủ yếu áp dụng cho việc đánh giá năng
suất sinh học sơ cấp ở vùng sinh thái biển ven bờ, thông qua việc đánh giá hàm
lượng chlorophyll a, số liệu được thu thập thông qua các đơn vị gam Chlorophyll
a/m
3
hay gam Chlorophyll a/m
2
.
1.3.2. Trên thế giới
Methanol được biết đến là dung môi thích hợp nhất để trích xuất chlorophyll
từ dòng Nannochloropsis gaditana, bằng cách áp dụng Lichtenthaler 1983 [21], sau
24 giờ chiết tách. Hơn nữa, ngoài khả năng ly giải của dung môi còn có việc sử
dụng các kỹ thuật bổ sung phá vỡ vách tế bào, giúp tăng năng suất chiết tách. Kĩ
thuật làm đông hay không làm đông với N
2
lỏng được cho thấy là hiệu quả hơn so
với việc sử dụng siêu âm trong 15 phút để giải nén các sắc tố bền hơn, chẳng hạn
như carotenoid. Dung môi ưa nước như methanol đóng vai trò chính trong việc
chiết tách, mà không chịu ảnh hưởng của việc sử dụng các phương pháp gián đoạn

vật lý hay cơ học.
Hầu hết các phương pháp để đánh giá chlorophyll được tìm thấy đã được
phát triển để đánh giá mức độ dinh dưỡng của các vùng biển. Chlorophyll thường là
các tham số được sử dụng như các chỉ số dinh dưỡng, chủ yếu là do mối quan hệ
giữa hàm lượng các sắc tố này với số lượng của sinh khối tảo là khá trực tiếp. Sinh
khối tảo được liên kết mạnh mẽ để có thể nhìn thấy bằng chứng của hiện tượng phú
dưỡng. Định lượng chlorophyll a sẽ dễ dàng hơn sinh khối tảo của chính nó [3, 7]và
có thể được sử dụng như một phương pháp gián tiếp để xác định số lượng sinh khối
tảo.
Nhưng khó khăn của sự đánh giá này là sự biến đổi của hàm lượng
chlorophyll a trong mỗi loài (từ 0,1 đến 9,7% trọng lượng khô tế bào), cững như
việc lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp, có tính đến sự khác biệt về sức đề
kháng của vách tế bào. Trong thực tế, nguồn gốc của vật liệu sinh học quyết định
đến việc lựa chọn phương pháp tốt nhất.


17


Hình 1.4. Thống kê các phương pháp nghiên cứu chlorophyll
methanol
acetone
Mackinney

(1941)
Porra

(1989)

Lichtenthaler

(1983)
20 phút

24h

20 phút

24h,
8
0
C
24h

24h

2
4h

24h,

8
0
C
ST

U

F

ST

ST

ST

U

U

U

U

U

U

F

F

F

F

L
ethanol
Kaczmar

(2004)
J
effrey

(1975)
Strickland

(1968)
Unesco

(1968)
Dung môi chiết
Tương quan s
ử
dụng
Thời gian chiết
Tiêu ch
u
ẩn

(ST)
Siêu âm

(U)
Làm
đông/không
làm đông
(F)
Làm
đông/không

làm với N
2
lỏng
(FN)


18


Pepe và cộng sự [23] đã giới thiệu hai phương pháp chiết tách khác nhau cho
việc định lượng chlorophyll a. Một có liên quan đến ethanol và một là việc sử dụng
methanol lạnh. Sự khác biệt được quan sát vào năng suất chiết tách đã được giải
thích bởi các thành phần thực vật tảo phù du, theo các chủng vi tảo chiếm ưu thế.
Các phương pháp chiết tách bằng ethanol đã cho kết quả tốt hơn đối với chủng
chiếm ưu thế Chlorophyceae và Dinophyceae, trong khi phương pháp chiết tách
bằng methanol lại cho thấy là thuận lợi hơn đối với các chủng khác như
Bacillariophyceae. Điều này có nghĩa là khả năng chiết tách của dung môi phụ
thuộc vào khả năng hydrat hóa và tính thấm của thành tế bào vi tảo. Một phần từ sự
ảnh hưởng của cấu tạo thành tế bào trong sự đánh giá chlorophyll, sự biến đổi của
sắc tố trong quá trình chiết tách [21] cũng như sự ảnh hưởng của các sắc tố khác lên
sắc tố chlorophyll, có thể gây ra sự phức tạp trong việc xác định nó và dẫn đến sai
sót trong ước tính.
Louda và Monghkonsri đã so sánh ước tính quang phổ hàm lượng
chlorophyll với các kết quả thu được bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Họ
kết luận rằng đánh giá quang phổ chlorophyll bằng việc sử dụng UNESCO [32] và
phương trình của Jeffrey và Humphrey [16] đã cho kết quả tuyệt vời. Những cộng
sự trong hai nghiên cứu này cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa hai
phương pháp được giới thiệu. Phân tích quang phổ là ít tốn kém và nhanh hơn nhiều
so với phân tích HPLC, là một công cụ tốt để đánh giá thường xuyên chlorophyll.
Nannochloropsis gaditana chỉ có chlorophyll a, do đó việc đánh giá tổng số

chlorophyll là tương đương với việc đánh giá cụ thể một loại sắc tố. Có một số
phương pháp có sẵn để định lượng chlorophyll. Các bước thông thường của việc
tiến hành dựa trên quang phổ bao gồm:
1. tách các tế bào vi tảo nổi trên mặt nước
2. chiết tách các sắc tố với một dung môi hữu cơ
3. sử dụng quang phổ để xác định nồng độ của chlorophyll trong chiết tách


19

Việc lựa chọn dung môi để thúc đẩy quá trình chiết tách là một vấn đề rất
quan trọng vì nó quyết định mức độ của mối quan hệ với các thành phần hóa học
của các chất được chiết tách. Ngoài khả năng hòa tan các hợp chất được chiết tách
và định lượng, dung môi còn đóng vai trò quan trọng trong ly giải tế bào. Dung môi
tích cực hơn có thể làm tăng năng suất chiết tách đối với cả vách tế bào cứng.
Methanol là dung môi đầu tiên được sử dụng để chiết tách, nhưng do độc tính của
nó, nó đã được thay thế bằng các dung môi khác. Theo khuyến nghị Edler [20], đến
năm 1995, việc đánh giá hàm lượng chlorophyll được thực hiện bằng cách sử dụng
phương pháp chiết tách với acetone. Kể từ đó, việc sử dụng ethanol như một dung
môi chiết tách đã được đề xuất.
Trong kĩ thuật phá vỡ vách tế bào, hai nhóm chính có thể được sử dụng là:
cơ học và phi cơ học. Trong nhóm đầu tiên, siêu âm được sử dụng trong một số các
phương pháp thử nghiệm. Trong số các kĩ thuật phi cơ học của ly giải tế bào, có quá
trình hóa học liên quan đến đến dung môi sử dụng và phương pháp vật lý, chẳng
hạn quá trình làm đông hay không làm đông [5]. Quá trình cuối cùng này có thể
được thực hiện chậm hay nhanh chóng (bằng cách sử dụng nitơ lỏng) để tạo ra một
cú sốc nhiệt lớn trong vật liệu sinh học, làm tăng hiệu quả phá vỡ thành tế bào.
Thời gian tiếp xúc giữa các hợp chất tế bào được chiết tách với dung môi có
thể là yếu tố quyết định đến số lượng sản phẩm chiết. Khi ly giải tế bào, nồng độ
của dung môi không nên quá cao để tránh gây thiệt hại đến các hợp chất cần được

chiết tách. Một khoảng thời gian chiết tách dài hơn sẽ làm tăng hiệu quả của quá
trình này.
Để đơn giản hóa việc so sánh các phương pháp khác nhau và việc xác định
các ảnh hưởng của mỗi bước trong một phương pháp chiết tách, các định nghĩa sau
đây được đề xuất:
- Một phương pháp phân tích được thực hiện bởi một tập hợp các hạng mục
khác nhau hoặc các thủ tục cần thiết để hoàn thành việc đánh giá các sắc tố được
nghiên cứu.