Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β galactosidase và khảo sát một số đặc tính enzyme từ bộ sưu tập vi khuẩn lactic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN NGỌC DUY

TUYỂN CHỌN, TỐI ƯU MÔI TRƯỜNG – ĐIỀU KIỆN
LÊN MEN β-GALACTOSIDASE VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ
ĐẶC TÍNH ENZYME TỪ BỘ SƯU TẬP VI KHUẨN LACTIC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS. Nguyễn Hữu Phúc
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Phan Ngọc Hòa

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 15 tháng 08 năm 2014
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1. Chủ tịch:
PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng
2. Thư ký:
3. Phản biện 1:
4. Phản biện 2:
5. Ủy viên:

TS. Hoàng Văn Hồng
TS. Nguyễn Hữu Phúc
TS. Phan Ngọc Hịa
PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KTHH


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN NGỌC DUY

MSHV: 12310725

Ngày, tháng, năm sinh: 12/03/1989

Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh

Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học

Mã số: 60.42.80

I. TÊN ĐỀ TÀI: “Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β-galactosidase
và khảo sát một số đặc tính enzyme từ bộ sưu tập vi khuẩn lactic”
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao
 Tối ưu mơi trường lên men β-galactosidase sử dụng ma trận Plackett-Burman và
phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm (RSM-CCD)
 Tối ưu một số điều kiện lên men β-galactosidase
 Khảo sát một số đặc tính enzyme β-galactosidase và bước đầu thăm dò khả năng
ứng dụng enzyme này tạo sữa nghèo lactose
III.

NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 24/06/2013

IV.

NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 23/05/2014

V.

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS. Nguyễn Thúy Hương
Tp. HCM, ngày . . . . tháng . . . . năm 20. . . .

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA….………
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành luận văn cũng như đi đến được đoạn đường này, tôi thật sự rất
biết ơn và khắc ghi sự giúp đỡ của những người sau:
Đầu tiên, cho em gửi đến cô, PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương, người thầy hướng dẫn,
đã dạy dỗ và đồng hành cùng chúng em, từ những ngày tháng học đại học cho đến bây
giờ và mong muốn cả sau này nữa. Người cho chúng em không những con chữ, kinh
nghiệm làm việc mà hơn nữa là sự giúp đỡ, tình cảm của cô dành cho chúng em.
Em thật sự biết ơn tất cả những thầy cô, những người đã truyền đạt kiến thức chuyên
ngành, những chỉ dẫn tận tình và sự giúp đỡ trong suốt quá trình học và làm đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và hỗ trợ nhiệt tình của các cán bộ phịng thí
nghiệm bộ mơn Cơng nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa.
Em xin cảm ơn anh Tính, chị Phúc, anh Hiệp, chị Kim, chị Như, Chị Hiền, chị Hịa…
Mình xin cảm ơn các bạn Trung, Kỳ Văn, Thiện, Khánh Vân, em Tú, Thanh… Những
người bạn đã đồng hành, giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc, bài vở và chia sẻ cùng
tôi không biết là bao nhiều niềm vui và cả những chuyện buồn.
Em xin gửi đến các thầy cô phản biện, các thầy cô trong hội đồng đã dành thời gian
quý báu để đọc và nhận xét luận văn này.
Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ, gia đình và Pé của tôi. Những người quan trọng

nhất đã động viên tinh thần và hỗ trợ mọi mặt để tôi an tâm thực hiện đề tài.
Lời cuối, một lần nữa tôi xin gửi đến tất cả những người yêu thương sự biết ơn chân
thành nhất.

i


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Enzyme β-galactosidase là một trong những loại enzyme quan trọng được sử dụng
trong quá trình chế biến các sản phẩm từ sữa. Ngồi ra, enzyme này cịn có nhiều ứng
dụng khác trong các lĩnh vực cơng nghiệp, y học, thực phẩm… Do đó, cần phải có một
nguồn thu enzyme với số lượng lớn, thời gian sản xuất ngắn, hoạt tính cao, ổn định và
phù hợp với việc sản xuất ở quy mô công nghiệp. Trong nghiên cứu này, với đề tài
“Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β-galactosidase và khảo sát một
số đặc tính enzyme từ bộ sưu tập vi khuẩn lactic”, được thực hiện nhằm mục đích sàng
lọc để tuyển chọn ra chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao; tiến hành
tối ưu môi trường và điều kiện lên men thu nhận enzyme này bằng cách sử dụng ma
trận Plackett-Burman và phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm
(RSM-CCD); sau đó, nghiên cứu một số đặc tính của enzyme β-galactosidase thu được
và bước đầu đánh giá khả năng ứng dụng enzyme này tạo sản phẩm sữa nghèo lactose.
Kết quả thu được, trong bộ sưu tập bảy chủng vi khuẩn lactic đã được định danh và bảo
quản đông sâu, chúng tôi đã tuyển chọn được chủng Lactobacillus acidophlus AS186
cho kết quả hoạt tính β-galactosidase cao nhất. Ma trận Plackett-Burman đã đánh giá
mức độ ảnh hưởng của các thành phần mơi trường MRS cảm ứng q trình lên men
β-galactosidase; theo đó lactose, cao nấm men và tri-ammonium citrate là ba thành
phần có tác động cao. Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng và
phương án cấu trúc có tâm (RSM-CCD) đã tìm ra giá trị tối ưu của lactose 27,89 g/L;
cao nấm men 11,81 g/L và tri-ammonium citrate 4,91 (g/L) cho hoạt tính enzyme cao
nhất theo mơ hình 27,66 U/100 mL. Đồng thời, kết quả thực nghiệm cho hoạt tính
enzyme 28,18 U/100 mL sau 24 giờ lên men, đạt độ tương đồng cao so với mơ hình.

Tuy nhiên, hoạt tính enzyme β-galactosidase cao nhất đạt được 28,42 U/100 mL sau 20
giờ lên men ở các điều kiện lên men tối ưu: tỷ lệ cấy giống 5% (v/v); pH ban đầu môi
trường lên men 6,5-7,0 và nhiệt độ lên men 32°C. Một số đặc tính của enzyme
β-galactosidase từ chủng Lb. acidophilus AS186 đã được khảo sát và cho kết quả: pH

ii


tối ưu 6,6-7,4; nhiệt độ phản ứng tối ưu 35-37°C; ion Mg2+ 1-10 mM giúp làm tăng
hoạt tính enzyme và các hằng số động học Michaelis-Menten Vmax và Km được xác định
lần lượt là 1,71 μmol/phút và 1,66 mM. Sau đó, các chế độ bảo quản enzyme được
khảo sát, kết quả xác định được chế phẩm bảo quản lạnh đông enzyme β-galactosidase
trong glycerol cho hiệu quả cao hơn cả với hoạt tính enzyme cịn lại sau bốn tuần đạt
70,04% so với ban đầu. Trong thí nghiệm thăm dị khả năng ứng dụng enzyme
β-galactosidase thu nhận từ chủng Lb. acidophilus AS186 tạo sữa nghèo lactose, kết
quả xác định được enzyme β-galactosidase cho hiệu suất thủy phân lactose đạt 69,95%
và sản phẩm sữa nghèo lactose thử nghiệm đảm bảo các chỉ tiêu hóa lý – vi sinh.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i
TÓM TẮT LUẬN VĂN............................................................................................. ii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................ix
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................................xii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN....................................................................................... 3
1.1. Enzyme β-galactosidase......................................................................................... 3

1.1.1. Hiện tượng không dung nạp lactose ................................................................. 3
1.1.2. Giới thiệu enzyme β-galactosidase .................................................................. 4
1.1.3. Thủy phân lactose bằng enzyme β-galactosidase ............................................. 5
1.1.3.1. Cơ chế phản ứng ....................................................................................... 5
1.1.3.2. Thủy phân lactose trong sữa bằng enzyme ................................................. 6
1.1.3.3. Thủy phân lactose trong whey bằng enzyme.............................................. 6
1.1.4. Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase ......................................................... 7
1.1.5. Ứng dụng của enzyme β-galactosidase ............................................................ 9
1.1.5.1. Ứng dụng β-galactosidase trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa
.............................................................................................................................. 9
1.1.5.2. Ứng dụng β-galactosidase trong công nghiệp ............................................ 9
1.1.5.3. Sản xuất Galacto-oligosaccharide bởi β-galactosidase ............................. 10
1.1.5.4. Ứng dụng β-galactosidase trong y học ..................................................... 11
1.2. Vi khuẩn lactic..................................................................................................... 12
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic............................................................................... 12
1.2.2. Nhóm Lactobacillus ...................................................................................... 13
1.2.3. Vai trò và sự sinh tổng hợp các hợp chất sinh học bởi vi khuẩn lactic trong
thực phẩm ............................................................................................................... 14

iv


1.2.4. Khả năng hấp thu lactose của các chủng probiotic Lactobacillus ................... 16
1.2.5. Cơ chế vận chuyển lactose ở vi khuẩn lactic .................................................. 16
1.3. Một số phương pháp phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme ...................................... 17
1.3.1. Các phương pháp cơ học ............................................................................... 18
1.3.1.1. Phương pháp nghiền ................................................................................ 18
1.3.1.2. Phương pháp đồng hóa ............................................................................ 19
1.3.1.3. Phương pháp sóng siêu âm ...................................................................... 20
1.3.2. Các phương pháp không phải cơ học ............................................................. 20

1.3.2.1. Phương pháp vật lý (sốc thẩm thấu)......................................................... 20
1.3.2.2. Phương pháp hóa học .............................................................................. 21
1.3.2.3. Phương pháp sinh học ............................................................................. 21
1.4. Các hướng nghiên cứu liên quan đến đề tài .......................................................... 22
1.4.1. Một số giống vi khuẩn lactic sinh tổng hợp β-galactosidase........................... 22
1.4.2. Tối ưu các thành phần môi trường và điều kiện lên men β-galactosidase ....... 23
1.4.3. Ứng dụng enzyme β-galactosidase tạo sản phẩm sữa nghèo lactose ............... 26
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ......................................................... 28
2.1. Địa điểm – Thời gian thực hiện............................................................................ 28
2.2. Vật liệu – Hóa chất – Thiết bị – Mơi trường ........................................................ 28
2.2.1. Giống vi sinh vật ........................................................................................... 28
2.2.2. Hóa chất ........................................................................................................ 28
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................ 28
2.2.4. Môi trường .................................................................................................... 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 29
2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................... 29
2.3.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 30
2.3.2.1. Khảo sát đặc điểm đại thể – vi thể của các chủng vi khuẩn lactic............. 30
2.3.2.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao ......... 30

v


2.3.2.3. Xác định vị trí β-galactosidase của tế bào vi khuẩn lactic ........................ 31
2.3.2.4. Tối ưu phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm ............................. 32
2.3.2.5. Tối ưu một số thành phần môi trường MRS cảm ứng β-galactosidase theo
phương pháp cổ điển – tối ưu đơn yếu tố ............................................................. 32
2.3.2.6. Tối ưu thành phần môi trường MRS cảm ứng lên men β-galactosidase từ
chủng Lb. acidophilus AS186 sử dụng ma trận Plackett-Burman và phương pháp
bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm ............................................................ 34

2.3.2.7. Tối ưu điều kiện lên men β-galactosidase từ chủng Lb. acidophilus AS186
............................................................................................................................ 38
2.3.2.8. Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme β-galactosidase ......................... 39
2.3.2.9. Khảo sát các chế độ bảo quản chế phẩm enzyme β-galactosidase ............ 40
2.3.2.10. Bước đầu khảo sát khả năng ứng dụng enzyme β-galactosidase tạo sữa
nghèo lactose ....................................................................................................... 40
2.3.3. Phương pháp phân tích .................................................................................. 40
2.3.3.1. Phương pháp vi sinh ................................................................................ 40
2.3.3.2. Phương pháp hóa lý ................................................................................. 42
2.3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................... 47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ – BÀN LUẬN ................................................................... 48
3.1. Đặc điểm đại thể – vi thể của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu .................... 48
3.2. Sàng lọc chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase................................. 50
3.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao ..................... 52
3.3.1. Đường cong sinh trưởng của Lb. casei VTCC 186 và Lb. acidophilus AS186
trên môi trường MRS cơ bản ................................................................................... 52
3.3.1.1. Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào vi sinh vật ........ 52
3.3.1.2. Đường cong sinh trưởng của Lb. casei VTCC 186 và Lb. acidophilus
AS186 .................................................................................................................. 53
3.3.2. Đường cong sinh trưởng và đường cong hoạt tính β-galactosidase của Lb.
casei VTCC 186 và Lb. acidophilus AS186 trên môi trường MRS cảm ứng............ 55
3.3.2.1. Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào vi sinh vật ........ 55
vi


3.3.2.2. Đường cong sinh trưởng và hoạt tính β-galactosidase của Lb. casei VTCC
186 và Lb. acidophilus AS186 ............................................................................. 57
3.4. Xác định vị trí β-galactosidase của tế bào Lactobacillus acidophilus AS186 ....... 60
3.5. Tối ưu phương pháp phá vỡ tế bào thu β-galactosidase bằng sóng siêu âm .......... 61
3.5.1. Khảo sát năng lượng phát sóng siêu âm ......................................................... 61

3.5.2. Khảo sát chế độ xử lý .................................................................................... 62
3.6. Tối ưu một số thành phần môi trường MRS cảm ứng β-galactosidase theo phương
pháp cổ điển – tối ưu đơn yếu tố ................................................................................. 64
3.6.1. Tối ưu nồng độ lactose cho quá trình lên men β-galactosidase ....................... 64
3.6.2. Tối ưu nồng độ glucose cho quá trình lên men β-galactosidase ...................... 65
3.6.3. Tối ưu nồng độ peptone cho quá trình lên men β-galactosidase ..................... 66
3.6.4. Tối ưu nồng độ cao thịt cho quá trình lên men β-galactosidase ...................... 67
3.6.5. Tối ưu nồng độ cao nấm men cho quá trình lên men β-galactosidase ............. 68
3.6.6. Tối ưu nồng độ tri-ammonium citrate cho quá trình lên men β-galactosidase 69
3.6.7. Tối ưu nồng độ CH3COONa.H2O cho quá trình lên men β-galactosidase ...... 70
3.7. Tối ưu thành phần môi trường MRS cảm ứng lên men β-galactosidase từ chủng
Lactobacillus acidophilus AS186 sử dụng ma trận Plackett-Burman và phương pháp bề
mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm........................................................................ 70
3.7.1. Sàng lọc các thành phần môi trường quan trọng theo ma trận Plakett-Burman
................................................................................................................................ 71
3.7.2. Tối ưu giá trị của ba yếu tố theo phương pháp bề mặt đáp ứng và thiết kế cấu
trúc có tâm .............................................................................................................. 74
3.8. Tối ưu một số điều kiện lên men β-galactosidase từ chủng Lactobacillus
acidophilus AS186 ..................................................................................................... 82
3.8.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống ...................................................................... 82
3.8.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu môi trường lên men ............................................ 84
3.8.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men ................................................................... 85
3.9. Khảo sát lại thời gian lên men β-galactosidase trên môi trường và điều kiện lên
men đã tối ưu của chủng Lactobacillus acidophilus AS186 ........................................ 87
vii


3.10. Nghiên cứu một số đặc tính của enzyme β-galactosidase từ Lactobacillus
acidophilus AS186 ..................................................................................................... 88
3.10.1. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính β-galactosidase ......................................... 88

3.10.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính β-galactosidase .................. 90
3.10.3. Động học phản ứng thủy phân ONPG của enzyme β-galactosidase ............. 92
3.10.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính β-galactosidase ................ 94
3.11. Khảo sát các chế độ bảo quản của các chế phẩm enzyme β-galactosidase .......... 96
3.12. Bước đầu thăm dò khả năng ứng dụng enzyme β-galactosidase từ Lactobacillus
acidophilus AS186 tạo sữa nghèo lactose ................................................................... 97
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ............................................................. 100
4.1. Kết luận ............................................................................................................. 100
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 101
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 102
PHỤ LỤC................................................................................................................ 103
CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ ..................................................................... 123
LÝ LỊCH TRÍCH NGANG .................................................................................... 124

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các mức của 10 thành phần mơi trường trong thiết kế Plackett-Burman ....35
Bảng 2.2. Mã hóa thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman .........................36
Bảng 2.3. Nồng độ ba yếu tố dùng trong RSM-CCD .................................................. 37
Bảng 2.4. Mã hóa thiết kế thí nghiệm theo CCD .........................................................37
Bảng 2.5. Cách pha dung dịch ONP để dựng đường chuẩn ........................................42
Bảng 2.6. Cách chuẩn bị mẫu thử xác định hoạt tính enzyme β-galactosidase ............43
Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn lactic ...........................48
Bảng 3.2. Hình ảnh đại thể và vi thể của các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu..........49
Bảng 3.3. Chủng vi khuẩn lactic và hoạt tính β-galactosidase ....................................50
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc thành phần mơi trường lên hoạt tính β-galactosidase theo
ma trận Plackett-Burman ...........................................................................................72
Bảng 3.5. Kết quả phân tích hồi quy các yếu tố theo Plackett-Burman .......................73

Bảng 3.6. Kết quả thực nghiệm và dự đốn thí nghiệm tối ưu thành phần mơi trường
theo CCD ...................................................................................................................75
Bảng 3.7. Kết quả phân tích hồi quy các yếu tố thành phần môi trường theo CCD .....75
Bảng 3.8. Phân tích thí nghiệm tại tâm thiết kế...........................................................76
Bảng 3.9. So sánh tính ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn
Student ......................................................................................................................77
Bảng 3.10. Hoạt tính β-galactosidase trên môi trường đã tối ưu.................................81
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của một số ion kim loại lên hoạt tính β-galactosidase .............94
Bảng 3.12. Chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của sản phẩm sữa nghèo lactose thử nghiệm .....98

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tỷ lệ người bị dị ứng lactose trên thế giới .................................................... 3
Hình 1.2 a.) Cơ chế thủy phân và hấp thu lactose và b). Bệnh tiêu chảy do khơng dung
nạp lactose .................................................................................................................. 4
Hình 1.3. Phản ứng thủy phân lactose bởi β-galactosidase .......................................... 5
Hình 1.4 a). Cơ chế thủy phân lactose bởi β-galactosidase và b). Cơ chế phản ứng
chuyển nhóm galactosyl bởi β-galactosidase ............................................................... 6
Hình 1.5. Sinh tổng hợp các phân tử sinh học của vi khuẩn lactic và gen liên quan ... 15
Hình 1.6. Các phương pháp phá vỡ tế bào vi sinh vật ................................................ 18
Hình 3.1. Hoạt tính β-galactosidase của các chủng vi khuẩn lactic ........................... 51
Hình 3.2. Đường tương quan tuyến tính giữa mật độ Lb. casei VTCC 186 và OD610nm52
Hình 3.3. Đường tương quan tuyến tính giữa mật độ Lb. acidophilus AS 186 và
OD610nm ..................................................................................................................... 53
Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng của Lb. casei VTCC 186 trong 36 giờ ................. 54
Hình 3.5. Đường cong sinh trưởng của Lb. acidophilus AS186 trong 36 giờ ............. 54
Hình 3.6. Đường tương quan tuyến tính giữa mật độ Lb. casei VTCC 186 và OD610nm56
Hình 3.7. Đường tương quan tuyến tính giữa mật độ Lb. acidophilus AS186 và OD610nm

.................................................................................................................................. 56
Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng và hoạt tính β-galactosidase của Lb. casei VTCC
186 trong 36 giờ ........................................................................................................ 58
Hình 3.9. Đường cong sinh trưởng và hoạt tính β-galactosidase của Lb. acidophilus
AS186 trong 36 giờ.................................................................................................... 58
Hình 3.10. Phần trăm hoạt tính β-galactosidase trong tế bào Lb. acidophilus AS186 60
Hình 3.11. Ảnh hưởng của năng lượng sóng siêu âm đến hoạt tính β-galactosidase .. 61
Hình 3.12. Ảnh hưởng của các chế độ siêu âm đến hoạt tính β-galactosidase............ 63
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến quá trình lên men β-galactosidase ... 64
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến quá trình lên men β-galactosidase .. 66

x


Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến quá trình lên men β-galactosidase .. 67
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ cao thịt đến quá trình lên men β-galactosidase .. 68
Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến quá trình lên men
β-galactosidase ......................................................................................................... 69
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ tri-ammonium citrate đến quá trình lên men
β-galactosidase ......................................................................................................... 69
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ CH3COONa.H2O đến quá trình lên men
β-galactosidase ......................................................................................................... 70
Hình 3.20. Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính β-galactosidase ............. 73
Hình 3.21. Ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến hoạt tính β-galactosidase ........... 76
Hình 3.22. Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn sự phụ thuộc của hoạt tính β-galactosidase
vào nồng độ lactose và cao nấm men; tri-ammonium citrate được cố định 4 g/L ....... 79
Hình 3.23. Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn sự phụ thuộc của hoạt tính β-galactosidase
vào nồng độ lactose và tri-ammonium citrate; cao nấm men được cố định 10 g/L ..... 80
Hình 3.24. Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn sự phụ thuộc của hoạt tính β-galactosidase
vào nồng độ cao nấm men và tri-ammonium citrate; lactose được cố định 25 g/L ..... 80

Hình 3.25. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến quá trình lên men β-galactosidase ..... 83
Hình 3.26. Ảnh hưởng của pH mơi trường đến q trình lên men β-galactosidase .... 85
Hình 3.27. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men β-galactosidase ............... 86
Hình 3.28. Mật độ tế bào và hoạt tính enzyme β-galactosidase của chủng Lactobacillus
acidophilus AS186 theo thời gian trên môi trường và điều kiện lên men tối ưu ......... 87
Hình 3.29. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính β-galactosidase ..................................... 89
Hình 3.30. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính β-galactosidase .............. 91
Hình 3.31. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc ban đầu phản ứng ............... 92
Hình 3.32. Đồ thị biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk ...................................... 93
Hình 3.33. Hoạt tính của các chế phẩm enzyme β-galactosidase theo thời gian......... 96

xi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ATCC:

American Type Culture Collection

BOD:

Biochemical Oxygen Demand

CCD:

Central Composite Design

COD:

Chemical Oxyzen Demand

ĐC:

Đối chứng

GOS:

Galacto-oligosaccharide

HPLC:

High Performance Liquid Chromatography

Klu.

Kluyveromyces

Lb.:

Lactobacillus

Lc.:

Lactococcus

MT:

Môi trường

ONP:

Ortho-Nitrophenol

ONPG:

Ortho-Nitrophenyl-β-galactoside

PEP-PTS:

phosphoenol pyruvate-dependent phosphotransferase system

RSM:

Response Surface Methodology

Sac.

Saccharomyces

SDS:

Sodium Dodecyl Sulphate

sp./ ssp.:

species/ subspecies

Strep.:

Streptococcus

STT:

Số Thự Tự

TN:

Thí nghiệm

TSS:

Total Suspended Solids

VSV:

Vi sinh vật

VTCC:

Vietnam Type Culture Collection

v/v:

volume/ volume

w/v:

weigh/ volume

xii

MỞ ĐẦU


MỞ ĐẦU
Enzyme β-galactosidase (β-D-galactoside galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thường
gọi lactase, một trong những loại enzyme quan trọng được sử dụng trong quá trình chế
biến các sản phẩm từ sữa. Enzyme này thủy phân liên kết β-D-galactoside từ đầu
không khử của các galactoside giải phóng ra β-D-galactose và phần cịn lại từ
oligosaccharide,

polysaccharide,

glycolipid,

glycopeptide,

glycoprotein

và

mucopolysaccharide [67]. Ngồi ra, enzyme này cịn có nhiều ứng dụng khác trong các
lĩnh vực công nghiệp, y học, thực phẩm… Do đó, cần phải có một nguồn thu enzyme
với số lượng lớn, thời gian sản xuất ngắn, hoạt tính cao, ổn định và phù hợp với việc
sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Enzyme từ những vi sinh vật khác nhau sẽ có những tính chất khác nhau; từ đó có
những hướng ứng dụng khác nhau. Các ứng dụng của enzyme thường được quyết định
vào khoảng pH hoạt động của chúng. Dựa vào đặc điểm này mà enzyme được phân
thành enzyme hoạt động ở pH acid từ nấm sợi, enzyme hoạt động ở pH kiềm từ nấm

men và enzyme hoạt động ở pH trung tính từ vi khuẩn [59]. β-galactosidase từ vi
khuẩn lactic thường có pH trung tính và đây là đối tượng vi sinh vật được đánh giá an
tồn, khơng sinh các độc tố lẫn vào sản phẩm đích. Chính vì thế, vi khuẩn lactic trở
thành nguồn vi sinh vật tiềm năng để thu nhận β-galactosidase, được ứng dụng trong
công nghệ chế biến các sản phẩm sữa, đặc biệt là sữa nghèo lactose. Tuy nhiên, hoạt
tính enzyme thu được từ đối tượng này thường chưa cao; do đó, cần phải có những
phương pháp giúp tối ưu các thành phần môi trường cũng như các điều kiện lên men để
thu được lượng enzyme với hoạt tính cao.
Phương pháp truyền thống được sử dụng để tối ưu thành phần môi trường nhằm đạt
được hoạt tính enzyme cao nhất thường thực hiện bằng cách tối ưu đơn yếu tố, tối ưu
từng thành phần môi trường trong khi các thành phần khác được giữ không đổi. Hơn
nữa, phương pháp tối ưu này cho kết quả thiếu thông tin về sự tương tác giữa các thành
phần trong môi trường lên men. Từ sự khác nhau của những yếu tố được tối ưu, thiết

1


kế cấu trúc có tâm giúp phân tích sự tương tác giữa các yếu tố đó, cùng với sự tác động
của những khoảng thay đổi đáng kể trên giá trị bề mặt. Gần đây, phương pháp tối ưu
môi trường sử dụng các thiết kế thực nghiệm đã được chấp nhận như một phương pháp
hiệu quả và được xem xét sử dụng cả trong những nghiên cứu lý thuyết và thực tế.
Việc áp dụng ma trận Plackett-Burman và phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu
trúc có tâm có thể giúp giảm thiểu số lượng thí nghiệm cần thực hiện trong việc tối ưu
ảnh hưởng đa yếu tố. Đồng thời cũng giúp xác định nhanh chóng và chính xác các
thành phần ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men và thông số tối ưu của các yếu tố
này [65].
Enzyme sau khi thu nhận từ các nguồn khác nhau sẽ có các đặc tính khác nhau; nhiệt
độ tối ưu, pH tối ưu, động học của phản ứng enzyme… Chính vì thế, với mỗi nguồn
enzyme thu nhận, các tác giả thường đánh giá các đặc tính của enzyme để có hướng
ứng dụng vào sản phẩm phù hợp. Một trong những hướng ứng dụng quan trọng của

enzyme β-galactosidase trong thực phẩm là sản xuất sữa nghèo lactose bằng phương
pháp enzyme. Sản phẩm sữa thủy phân lactose bằng enzyme được trông đợi nhiều
trong cơng nghiệp sản xuất sữa; điều này có ý nghĩa lớn đối với những người mắc
chứng kém hoặc không không dung nạp lactose [67].
Đề tài: “Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β-galactosidase và khảo
sát một số đặc tính enzyme từ bộ sưu tập vi khuẩn lactic” được thực hiện nhằm mục
đích sàng lọc để tuyển chọn ra chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao
từ một số chủng vi khuẩn lactic. Tiến hành tối ưu môi trường, điều kiện lên men thu
nhận enzyme này bằng cách sử dụng ma trận Plackett-Burman và phương pháp bề mặt
đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm. Sau đó, chúng tơi nghiên cứu một số đặc tính của
enzyme β-galactosidase thu được và bước đầu đánh giá khả năng ứng dụng enzyme
này trong sản xuất sữa nghèo lactose.

2


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Enzyme β-galactosidase
1.1.1. Hiện tượng không dung nạp lactose
“Lactose intolerance” là thuật ngữ diễn tả hội chứng không dung nạp được đường
lactose, một vấn đề thường gặp đối với hơn một nửa dân số trên thế giới, nguyên nhân
là do thiếu hụt enzyme β-galactosidase.
Hiện tượng thiếu hụt enzyme β-galactosidase có thể do nhiều nguyên nhân. Sự thiếu
hụt enzyme này bẩm sinh nhưng trường hợp này rất hiếm gặp, hoạt tính
β-galactosidase thấp do yếu tố di truyền. Tình trạng thiếu hụt tạm thời enzyme này do
một số tổn thương ở niêm mạc ruột, nơi mà enzyme này được sinh ra; sự tổn thương có

thể là do các bệnh viêm ruột, suy dinh dưỡng, ung thư hoặc do các độc tố… [20].

Hình 1.1. Tỷ lệ người bị dị ứng lactose trên thế giới [68]
Các triệu chứng chính khi khơng tiêu hóa được lactose gồm có đầy hơi, tiêu chảy và
đau bụng. Triệu chứng này do lactose không được tiêu hóa ở ruột non và đi vào ruột
già, tại đây các vi khuẩn sẽ lên men lactose tạo thành các acid béo mạch ngắn và các
loại khí (CO2 và H2). Các khí này là nguyên nhân gây ra chứng đầy hơi và đau căng
bụng [20].

3


Hình 1.2 a). Cơ chế thủy phân và hấp thu lactose
b). Bệnh tiêu chảy do không dung nạp lactose [20]
Những người khơng tiêu hóa được lactose do khơng tổng hợp được enzyme
β-galactosidase, vì thế sữa cần được loại lactose hoặc xử lý với β-galactosidase. Các
sản phẩm sữa khơng có lactose hoặc hàm lượng lactose thấp có thể được tiêu hóa mà
khơng có vấn đề gì đối với những người khơng dung nạp lactose. Sữa chua được tiêu
hóa tốt hơn đối với những người này, nguyên nhân do β-galactosidase của các vi khuẩn
sống trong sữa chua có thể hỗ trợ tiêu hóa lactose trong ruột [20].
1.1.2. Giới thiệu enzyme β-galactosidase
Enzyme β-galactosidase (β-D-galactoside galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thường
được gọi là lactase, một trong những enzyme quan trọng được sử dụng trong quá trình
chế biến các sản phẩm từ sữa. Enzyme này thủy phân liên kết β-D-galactoside từ đầu
khơng khử của các galactoside giải phóng ra β-D-galactose và phần galactoside còn lại
từ oligosaccharide, polysaccharide, glycolipid, glycopeptide, glycoprotein và
mucopolysaccharide. Ngồi ra, enzyme này cịn có hoạt tính chuyển nhóm galactosyl,
kết quả là tạo thành các β-galacto-oligosaccharide với các loại liên kết và mức độ
polyme hóa khác nhau. Enzyme này cịn liên quan đến sự chuyển hóa của các
galactoside phức hợp (glycoprotein và glycolipid) [20, 49, 59].

4


Hình 1.3. Phản ứng thủy phân lactose bởi enzyme β-galactosidase [20]
1.1.3. Thủy phân lactose bằng enzyme β-galactosidase
1.1.3.1. Cơ chế phản ứng
Phản ứng thủy phân lactose bằng enzyme là một trong những quy trình sinh học quan
trọng trong cơng nghệ chế biến sữa. Cơ chế thủy phân lactose bằng β-galactosidase
gồm hai phản ứng. Phản ứng thứ nhất là sự tạo thành và thủy phân phức trung gian
glycosyl-enzyme. Theo cơ chế này, trung tâm hoạt động của β-galactosidase bao gồm
hai amino acid là cystein và histidine, thực hiện chức năng tương ứng là chất cho
proton và chất nhận proton. Cystein có chứa nhóm sulphydryl (-SH) đóng vai trị như
chất cho proton và histidine có chứa nhóm imidazole đóng vai trị như tác nhân thân
hạch giúp dễ dàng cắt đứt liên kết glycoside trong suốt quá trình thủy phân (Hình 1.4a).
Phản ứng thứ hai được gọi là phản ứng chuyển nhóm galactosyl. Trong phản ứng này,
β-galactosidase chuyển gốc galactosyl từ phức trung gian đến chất nhận có chứa nhóm
hydroxyl (Hình 1.4b). Khi chất nhận là nước, phản ứng thủy phân sẽ tạo thành
galactose tự do. Tuy nhiên, trong các điều kiện nào đó, các loại đường khác cũng có
thể đóng vai trị chất nhận và hình thành nên oligosaccharide [20, 49].
a)

5


b)

Hình 1.4 a). Cơ chế thủy phân lactose bởi β-galactosidase
b). Cơ chế phản ứng chuyển nhóm galactosyl bởi β-galactosidase [20]
1.1.3.2. Thủy phân lactose trong sữa bằng enzyme

Sự thủy phân lactose bằng enzyme được quan tâm trong công nghệ chế biến sữa do
độ tan kém của lactose. Nồng độ lactose cao trong các sản phẩm sữa không lên men
như kem và sữa đặc có thể dẫn đến hiện tượng lactose kết tủa trong sản phẩm. Thủy
phân lactose trong kem và các sản phẩm bơ sữa khác giúp làm tăng độ mịn; đồng thời
giúp các sản phẩm này dễ dàng được tiêu hóa. Cũng vì lí do này mà β-galactosidase
được sử dụng trước khi cơ đặc sữa.
Ngồi ra, so với lactose thì các monosaccharide hình thành từ sự thủy phân lactose
được lên men dễ dàng hơn, do đó làm giảm giai đoạn bổ sung môi trường để đạt pH
mong muốn. Thêm vào đó, glucose và galactose làm tăng độ ngọt của sản phẩm lên
khoảng 50%. Vì vậy, nguyên liệu các chất làm ngọt sẽ được giảm bớt, giúp làm giảm
năng lượng của sản phẩm cuối cùng [67].
1.1.3.3. Thủy phân lactose trong whey bằng enzyme
Whey là phế phẩm trong công nghiệp phô mai, gây ra các vấn đề về kinh tế và môi
trường. Phô mai tạo ra một lượng lớn whey như một sản phẩm phụ mà thành phần chủ
yếu là lactose, protein và khống chất.
Một phần quan trọng của whey phơ mai được xử lý siêu lọc để tạo thành protein giàu
thành phần – whey protein đặc. Tuy nhiên, quá trình siêu lọc vẫn sinh ra một lượng lớn
permeate (vẫn chứa 4-5% lactose). Một phần của whey và whey permeate lactose có
6


thể được tinh sạch bằng phương pháp kết tinh và được sử dụng với các dẫn xuất như
một chất bổ sung trong thực phẩm hay một tá dược trong dược phẩm. Mặc dù vậy,
47% whey được thải ra nguồn nước hay ngấm vào đất. Điều này gây ra các vấn đề về
môi trường liên quan đến công nghiệp sản xuất bơ sữa vì lactose liên quan đến chỉ số
oxi sinh hóa và hóa học (BOD/COD). Hơn 90% BOD whey được xác định là do
lactose. Vì vậy cần có quy trình cụ thể để xử lý lactose trong whey. Số lượng vi sinh
vật tận dụng lactose như nguồn carbon ít hơn số lượng vi sinh vật có khả năng chuyển
hóa glucose và galactose. Vì vậy, sự thủy phân sơ bộ lactose sẽ làm tăng hiệu suất tận
dụng lactose và các sản phẩm sinh học như các phân tử sinh học (lactate, acetate,

ethanol, buthanediol), polymer sinh học, sinh khối. Một ứng dụng khác của lactose từ
whey là sản xuất syrup tạo ngọt và galacto-oligosaccharide [67].
1.1.4. Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase
Có nhiều nguồn khác nhau để thu nhận β-galactosidase, bao gồm thực vật, động vật
và vi sinh vật. Tính chất của enzyme thu nhận từ các nguồn khác nhau có sự khác nhau
rõ rệt, enzyme thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế thấp. Trong khi
đó, enzyme thu nhận từ nguồn vi sinh vật được cho là thích hợp nhất để sản xuất
β-galactosidase ứng dụng trong cơng nghiệp. Enzyme được sản xuất bởi quá trình lên
men từ vi sinh vật có hoạt tính cao, đơn giản và ổn định. Do đó, các vi khuẩn lactic
thuộc các lồi như Lactococcus, Streptococcus và Lactobacillus được tập trung nghiên
cứu. Các vi khuẩn lactic thường an toàn nên enzyme thu nhận không cần tinh sạch quá
kỹ và một số vi khuẩn lactic thường có hoạt tính probiotic. Tuy nhiên, trên từng đối
tượng vi sinh vật khác nhau sẽ có các điều kiện tối ưu khác nhau cho việc sản xuất
enzyme. β-galactosidase được xác định có mặt ở nhiều nhóm vi sinh vật như nấm sợi,
nấm men và vi khuẩn [39].
β-galactosidase thu nhận từ nấm sợi: Những enzyme này có pH tối ưu nằm trong
vùng acid 2,5 – 5,4 và nhiệt độ tối ưu tương đối cao khoảng 50°C. β-galactosidase từ
Aspergillus niger có thể được tinh sạch bằng phương pháp sắc kí rây phân tử, sắc kí
trao đổi ion. Giá trị Km của enzyme với cơ chất lactose có giá trị trong khoảng 85 – 125
7


mmol/L, trong khi đó với cơ chất là 2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) Km
chỉ có giá trị khoảng 2,4 mmol/L. Một số chủng nấm sợi khác cũng có tiềm năng sản
xuất β-galactosidase như Alternaria alternate, Aspergillus foelidis, Asp. oryzae,
Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme, Mucor
meihei, Neurospora crassa, Penicillum canescens… [49].
β-galactosidase thu nhận từ nấm men: đây được xem là nguồn enzyme quan trọng
ứng dụng trong công nghiệp. β-galactosidase từ Kluyveromyces fragilis và
Kluyveromyces lactis có nhiều điểm tương đồng nhau, giá trị Km của enzyme thu từ

Kluyveromyces lactis với cơ chất lactose và ONPG tương ứng là 1,7 và 17,3 mmol/L.
Với pH tối ưu trung tính, enzyme từ hai chủng này thích hợp để thủy phân lactose
trong sữa và được chấp nhận về tiêu chí an tồn trong thực phẩm. Đối với
β-galactosidase từ nấm men Saccharomyces lactis, q trình tinh sạch có thể được thực
hiện bằng phương pháp sắc kí lọc gel hoặc sắc kí trao đổi ion với hiệu suất thu hồi
enzyme cao. Hoạt tính β-galactosidase đạt cực đại trong điều kiện pH 8,5; nhiệt độ
26°C và sau 30 giờ lên men. Việc bổ sung thêm lactose sau 24 giờ lên men có tác dụng
nâng cao hoạt tính enzyme. Ngồi ra, β-galactosidase cịn được thu nhận từ một số
giống nấm men như Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces
anamensis, Sac. fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, Klu. marxianus…[49].
β-galactosidase thu nhận từ vi khuẩn: Một lượng lớn các giống vi khuẩn có khả năng
sản xuất ra β-galactosidase nhưng số vi khuẩn được cơng nhận là an tồn để ứng dụng
trong thực phẩm tương đối ít. Trong số đó, Streptococcus thermophilus và Bacillus
stearothermophilus được xem là nguồn sản xuất enzyme tiềm năng. Một số giống vi
khuẩn khác có khả năng sản suất β-galactosidase như Bacillus acidocaldarius, Bacillus
subtilis, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium murisepticum, Bifidobacterium
bifidum, Streptococcus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb.
kefiranofaciens… [39, 49].
Mặc dù các đối tượng nấm men (enzyme ở dạng nội bào), nấm sợi (enzyme tiết ngoại
bào) đã được ứng dụng để sản xuất β-galactosidase trong công nghiệp, nhưng nguồn
8