Nghiên cứu thu nhận và cố định enzyme glucoamylase và pectinase theo kĩ thuật clea

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

--------------------

TRẦN THỊ LINH GIANG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ CỐ ĐỊNH ENZYME
GLUCOAMYLASE VÀ PECTINASE THEO KĨ THUẬT
CLEA (CROSS-LINKING ENZYME AGGREGATES)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2014


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG – HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS. Huỳnh Ngọc Oanh

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS. TS Nguyễn Tiến Thắng

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Võ Đình Lệ Tâm

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM
ngày 14 tháng 8 năm 2014.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. Chủ tịch hội đồng: PGS. TS Nguyễn Đức Lượng.
2. Thư ký hội đồng: PGS. TS Nguyễn Thúy Hương.
3. Ủy viên phản biện 1: PGS. TS Nguyễn Tiến Thắng.
4. Ủy viên phản biện 2: TS. Võ Đình Lệ Tâm.
5. Ủy viên hội đồng: TS. Huỳnh Ngọc Oanh.
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA

i


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

HVTH: Trần Thị Linh Giang

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Trần Thị Linh Giang.

MSHV: 12310727.

Ngày, tháng, năm sinh: 18/12/1989.

Nơi sinh: Daklak.

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học.

Mã số : 60 42 80.

TÊN ĐỀ TÀI:

I.

Nghiên cứu thu nhận và cố định enzyme glucoamylase và pectinase theo kĩ
thuật CLEA.
II.

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Nhiệm vụ:
– Tìm hiểu và thực hiện kĩ thuật cố định CLEA trên hai đối tượng là
glucoamylase và pectinase.
– Đồng thời khảo sát tính chất của enzyme cố định dạng CLEA.
Nội dung:
– Khảo sát các điều kiện tối ưu để cố định enzyme glucoamylase và
enzyme pectinase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger bằng kĩ thuật

CLEA, bao gồm các yếu tố: nồng độ tay gắn glutaraldehyde, nhiệt độ
cố định, thời gian cố định.
– Khảo sát tính chất của enzyme cố định dạng CLEA thu nhận từ vi sinh
vật, bao gồm: cấu trúc của khối CLEA, khả năng tái sử dụng đối với cơ
chất riêng biệt của từng enzyme, khả năng hoạt động dưới ảnh hưởng
của pH và nhiệt độ.
– Bước đầu ứng dụng enzyme dạng CLEA xử lý hai loại dịch quả là củ

III.
IV.

năng và thơm, đánh giá dựa trên hai chỉ tiêu hàm lượng đường và độ
đục của sản phẩm.
NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 20/01/2014
NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 20/06/2014

V.

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS. Huỳnh Ngọc Oanh.

ii


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

Tp. HCM, ngày 6 tháng 8 năm 2014
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TS. Huỳnh Ngọc Oanh

TRƢỞNG KHOA
(Họ tên và chữ ký)

iii


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Ngọc Oanh.
Em cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi được thực hiện luận văn với sự
hướng dẫn tận tình của Cơ. Xin cảm ơn Cô đã dành nhiều thời gian, công sức
và ln giúp em có được định hướng đúng đắn trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả Thầy Cô và anh chị trong phịng
thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa Thành
phố Hồ Chí Minh đã chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện
đề tài.
Cảm ơn em Trương Thủy Tiên, sinh viên ngành Cơng nghệ Sinh học khóa
2010, đã khơng quản ngại khó khăn, thời gian để đồng hành, hỗ trợ tôi thực
hiện các nghiên cứu.
Xin cảm ơn các bạn trong lớp cao học Cơng nghệ Sinh học khóa 2012 đã quan
tâm, đóng góp ý kiến và đồng hành cùng tơi trong suốt thời gian làm thí
nghiệm.

Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Ban Giám hiệu Trường Đại
học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh, Phịng Đào tạo Sau đại học và các
phòng ban chức năng khác của Trường; đặc biệt là Khoa Kĩ thuật Hóa học đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sự
khuyến khích, ủng hộ đã dành cho tơi trong chặng đường dài để hoàn thành
được đề tài nghiên cứu này.
Chân thành cám ơn!
TP.HCM, ngày 6 tháng 8 năm 2014
Học viên thực hiện

Trần Thị Linh Giang

iv


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

TĨM TẮT
Đề tài được thực hiện với mục tiêu tìm hiểu và thực hiện kĩ thuật cố định
CLEA trên hai đối tượng là glucoamylase và pectinase. Đồng thời khảo sát
tính chất của enzyme cố định dạng CLEA.
Trong nghiên cứu, chúng tôi đã ứng dụng kĩ thuật CLEA để cố định hai loại
enzyme, glucoamylase và pectinase, từ dịch enzyme thô thu nhận từ môi
trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger. Kết quả nghiên cứu cho thấy: khi
bổ sung vào dịch enzyme ethanol 96O với tỉ lệ 2:1 (tác nhân tủa:dịch enzyme),
ở 3 – 5OC trong 15 phút và 7% glutaraldehyde, khuấy đều giữ ở nhiệt độ 5OC
trong 2 giờ; hiệu suất cố định protein là 45,06% và hiệu suất cố định enzyme

glucoamylase là 37,85%
Việc khảo sát tính chất của enzyme cố định dạng CLEA được thực hiện dựa
vào hình chụp SEM của khối enzyme dạng CLEA, khảo sát khả năng tái sử
dụng và khảo sát khả năng ổn định hoạt tính dưới ảnh hưởng của pH/to. Kết
quả từ hình chụp SEM cho thấy kích thước các khối glucoamylase CLEA đạt 5
– 20 µm. Enzyme cố định từ dịch nuôi cấy sử dụng đến lần thứ 8 vẫn cịn giữ
được 70% hoạt tính. Tại pH 8, hoạt tính glucoamylase cố định từ dịch nuôi cấy
là 40%. Glucoamylase cố định từ môi trường nuôi cấy có khả năng ổn định
hoạt tính tốt khi phản ứng ở nhiệt độ cao.
Quá trình cố định enzyme pectinase từ dịch nuôi cấy với nồng độ
glutaraldehyde là 10%, cũng thu được kết quả khả quan: hiệu suất cố định
protein là 66,67% và hiệu suất cố định enzyme pectinase là 57,61%. Kích
thước pectinase CLEA đạt 5 – 50µm. Enzyme pectinase cố định từ dịch
enzyme thu nhận từ môi trường nuôi cấy cũng cho thấy khả năng tái sử dụng
và khả năng ổn định hoạt tính dưới ảnh hưởng của pH/nhiệt độ tốt. Pectinase
cố định từ dịch nuôi cấy sau 6 lần sử dụng vẫn cịn trên 95% hoạt tính.
Kết quả bước đầu ứng dụng enzyme cố định dạng CLEA trong xử lý nước quả
cho thấy hàm lượng đường của dịch quả tăng lên và độ đục giảm đi sau khi xử
lý với enzyme cố định dạng CLEA. Ở lần sử dụng thứ 6, hoạt tính của enzyme
glucoamylase cố định từ mơi trường ni cấy vẫn cịn biểu hiện cao, hàm
lượng đường tăng trên 70% so với lượng đường tăng ở lần sử dụng đầu tiên.
Enzyme pectinase cố định từ dịch nuôi cấy cho thấy ở lần sử dụng thứ 6, độ

v


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

đục giảm trong nước quả vẫn đạt khoảng 40% so với độ đục giảm ở lần sử
dụng đầu tiên.
Kết quả thí nghiệm đã cho thấy kĩ thuật CLEA hiệu quả hơn đối với nguồn
enzyme chưa trải qua quá trình tinh sạch. Làm nổi bật lên điểm quan trọng của
kĩ thuật CLEA là kết hợp quá trình thu nhận và cố định enzyme vào cùng một
bước, bỏ qua bước tinh sạch, làm tăng hiệu quả cố định enzyme.

vi


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

SUMMARY
The thesis was conducted to find out and carry out CLEA method on objects,
glucoamylase and pectinase. At the same time, we survey properties of
enzyme in CLEA.
In the study, we applied CLEA method to immobilize two enzymes,
glucoamylase and pectinase, from crude enzyme solution obtained from semisolid culture of Aspergillus niger. Research results showed: when added
ethanol 96O to crude enzyme solution with a 2:1 ratio (precipitation agent:
enzyme solution), in 15 minutes at 3 – 5OC and 7% glutaraldehyde, stirred,
kept at 5°C in 2 hours; Protein immobilization yield was 45.06% and enzyme
immobilization yield was 37.85%.
Survey the properties of enzyme in CLEA was based on image of enzyme in
CLEA by SEM, reuse and activity stability under the influences of pH and
temperature abilities. Size of immobilized glucoamylase in CLEA was 5-20
μm. Immobilized enzyme from the culture medium could be retained 70%
activity after using 8 times. At pH 8, activity of glucoamylase immobilized
from the culture medium was 40%. Activity stability of glucoamylase

immobilized from the culture medium was good at high temperatures.
Immobilization pectinase from the culture medium with 10% glutaraldehyde
also obtained good results: Protein immobilization yield was 66.67% and
enzyme immobilization yield was 57.61%; Size of immobilized pectinase in
CLEA reached 5 - 50μm. The enzyme pectinase immobilized from culture
medium also showed reuse and structural stability under the influences of pH
and temperature abilities well. Immobilized enzyme from the culture medium
could be retained 95% activity after using 6 times.
Initial results of application immobilized enzyme (CLEA) in treatment fruit
juice showed that the sugar content of the juice increased and turbidity
decreased after treatment with immobilized enzyme in CLEA. In the 6th time
use, the enzyme glucoamylase immobilized from culture medium still made
sugar content of juice increased over 70% compared to the increasing content
of sugar in the first use. Pectinase immobilized from the culture medium also
showed good results, at 6th time use, juice’s reducing turbidity was achieved
by 40% compared with reducing turbidity in first time use.
vii


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

Experimental results showed that CLEA method expressed more effectiveness
with crude enzyme. Highlight the important feature of this method is
combining enzyme precipitation and immobilization into the step and skiping
enzyme purification, the enzyme can be immobilized directly from crude
enzyme solution high-effectively.

viii

Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của học viên Trần Thị Linh
Giang với sự hướng dẫn của TS. Huỳnh Ngọc Oanh. Các số liệu và kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác
giả khác trong bất kỳ cơng trình nào trước đây.

Người hướng dẫn khoa học

Tác giả luận văn

TS. HUỲNH NGỌC OANH

TRẦN THỊ LINH GIANG

ix


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................. 2
2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học ......................................................................................... 3
5. Ý nghĩa thực tiễn ......................................................................................... 3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ................................................................................. 4
1.1 Enzyme cố định ........................................................................................... 5
1.1.1 Khái niệm enzyme cố định.................................................................... 5
1.1.2 Đặc điểm của enzyme cố định............................................................... 5
1.1.3 Các phƣơng pháp cố định enzyme ....................................................... 6
1.2 Cố định enzyme bằng phƣơng pháp cross-linking enzyme aggregates
(CLEA) .................................................................................................................. 7
1.2.1 Phƣơng pháp cross-linking enzyme aggregates ( CLEA).................... 7
1.2.2 Liên kết giữa glutaraldehyde với enzyme ............................................ 9
1.2.3 Phạm vi ứng dụng của kĩ thuật cố định CLEA.................................. 12
1.2.4 Một số cơng trình nghiên cứu về kĩ thuật CLEA............................... 13
1.3 Đối tƣợng liên quan trong nghiên cứu ...................................................... 15
1.3.1 Tổng quan về nấm mốc Aspergillus niger .......................................... 15
1.3.2 Enzyme glucoamylase ......................................................................... 17
1.3.3 Enzyme pectinase ................................................................................ 19
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 24
2.1. Vật liệu ....................................................................................................... 25
2.1.1 Chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu .......................................... 25
2.1.2 Enzyme thƣơng mại ............................................................................ 25
2.1.3 Nguyên liệu .......................................................................................... 25
2.1.4 Hóa chất............................................................................................... 25
2.2. Phƣơng pháp.............................................................................................. 25
x

Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

2.2.1 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein ........................................ 25
2.2.2 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme glucoamylase.................... 26
2.2.3 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme pectinase .......................... 26
2.2.4 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng glutaraldehyde ........................... 26
2.2.5 Phƣơng pháp xác định độ đục của mẫu dịch quả .............................. 26
2.2.6 Cách tính các đại lƣợng trong kết quả ............................................... 26
2.3. Nội dung ..................................................................................................... 27
2.3.1 Khảo sát điều kiện cố định enzyme bằng kĩ thuật CLEA ................. 28
2.3.2 Khảo sát tính chất của enzyme cố định dạng CLEA ......................... 30
2.3.3 Bƣớc đầu ứng dụng hai enzyme glucoamylase và pectinase đã đƣợc
cố định theo kĩ thuật CLEA trong sản xuất nƣớc quả ................................ 31
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................................... 33
3.1. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme thu nhận từ môi trƣờng
nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger ................................................................... 34
3.2. Khảo sát quá trình cố định enzyme glucoamylase ................................... 35
3.2.1 Khảo sát khả năng tủa enzyme từ dịch enzyme bởi các tác nhân tủa
............................................................................................................. 35
3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ glutaraldehyde đến quá trình cố
định enzyme glucoamylase bằng kĩ thuật CLEA .............................. 36
3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian cố định đến quá trình cố định
enzyme glucoamylase bằng kĩ thuật CLEA ....................................... 39
3.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ cố định đến quá trình cố định
enzyme glucoamylase bằng kĩ thuật CLEA ....................................... 41
3.2.5 Khảo sát khối glucoamylase CLEA dƣới kính hiển vi điện tử quét .. 42

3.2.6 Khảo sát khả năng tái sử dụng của glucoamylase dạng CLEA ........ 44
3.2.7 Khảo sát khả năng hoạt động của enzyme glucoamylase dạng CLEA
dƣới ảnh hƣởng của pH và nhiệt độ .................................................. 47
3.3. Khảo sát quá trình cố định enzyme pectinase .......................................... 50
3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ của glutaraldehyde đến quá trình cố
định enzyme pectinase bằng kĩ thuật CLEA ..................................... 50
3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian cố định đến quá trình cố định
enzyme pectinase bằng kĩ thuật CLEA.............................................. 53

xi


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

3.3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ cố định đến quá trình cố định
enzyme pectinase bằng kĩ thuật CLEA.............................................. 54
3.3.4 Khảo sát khối pectinase CLEA dƣới kính hiển vi điện tử quét ........ 55
3.3.5 Khảo sát khả năng tái sử dụng của pectinase dạng CLEA ............... 57
3.3.6 Khảo sát hoạt động của enzyme pectinase dạng CLEA dƣới ảnh
hƣởng của pH và nhiệt độ .................................................................. 59
3.4. Bƣớc đầu ứng dụng hai enzyme glucoamylase và pectinase đã đƣợc cố
định theo kĩ thuật CLEA trong sản xuất nƣớc quả ........................................... 61
3.4.1 Xác định hàm lƣợng đƣờng và độ đục ban đầu của dịch quả ........... 61
3.4.2 Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định dạng CLEA trong xử lý
dịch quả ............................................................................................... 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 66
1. Kết luận ...................................................................................................... 67
2. Kiến nghị .................................................................................................... 67

xii


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Các phương pháp cố định enzyme ................................................. 6
Hình 1.2: Minh họa các tiến trình xảy ra trong cố định enzyme bằng kĩ thuật
CLEA............................................................................................................ 7
Hình 1.3: Cấu tạo phân tử của (poly)glutaraldehyde ..................................... 11
Hình 1.4: Phản ứng tạo liên kết giữa glutaraldehyde và enzyme .................... 11
Hình 1.5: Quá trình hình thành khối enzyme CLEA ...................................... 12
Hình 1.6: Phản ứng chuyển đổi benzaldehyde thành acid S-mandelic............ 13
Hình 1.7: Nấm mốc Aspergillus niger ........................................................... 16
Hình 1.8: Sơ đồ phân giải của glucoamylase ................................................. 17
Hình 1.9: Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase.................................... 18
Hình 1.10: Mơ hình hoạt động của hệ enzyme pectinase ............................... 21
Hình 2.1: Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm ............................................. 27
Hình 2.2: Quy trình cố định enzyme .............................................................. 28
Hình 3.1: Dịch enzyme pectinase (a) và glucoamylase (b) thu nhận từ môi
trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger .................................................. 34
Hình 3.2:Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến khả năng cố định
glucoamylase ................................................................................................ 37
Hình 3.3: Glucoamylase và pectinase sau quá trình kết tủa............................ 38
Hình 3.4: Enzyme glucoamylase dạng CLEA từ mơi trường ni cấy ........... 38
Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian cố định đến khả năng cố định
glucoamylase ................................................................................................ 40

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng cố định glucoamylase ......... 42
Hình 3.7: Hình ảnh CLEA của glucoamylase dưới kính hiển vi điện tử quét
(SEM) ........................................................................................................... 43
Hình 3.8: Glucoamylase thương mại sau khi cố định 2 giờ và enzyme CLEA
thu được ........................................................................................................ 43
Hình 3.9: Khả năng tái sử dụng theo mẻ của glucoamylase cố định dạng
CLEA............................................................................................................ 45
Hình 3.10: Khả năng tái sử dụng liên tục của glucoamylase cố định dạng
CLEA............................................................................................................ 46
Hình 3.11: Khả năng hoạt động của glucoamylase cố định dạng CLEA dưới
ảnh hưởng của pH ......................................................................................... 48
xiii


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

Hình 3.12: Khả năng hoạt động của glucoamylase cố định dạng CLEA dưới
ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................. 49
Hình 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến khả năng cố định
pectinase ....................................................................................................... 51
Hình 3.14: Enzyme pectinase cố định bằng kĩ thuật CLEA từ mơi trường ni
cấy ................................................................................................................ 52
Hình 3.15: Ảnh hưởng của thời gian cố định lên khả năng cố định pectinase 53
Hình 3.16: Ảnh hưởng của nhiệt độ cố định đến khả năng cố định pectinase . 55
Hình 3.17: Hình ảnh CLEA của pectinase dưới kính hiển vi điện tử quét
(SEM) ........................................................................................................... 56
Hình 3.18: Pectinex sau 2 giờ cố định và tủa CLEA thu được ....................... 56
Hình 3.19: Khả năng tái sử dụng theo mẻ của pectinase cố định dạng CLEA 58

Hình 3.20: Khả năng hoạt động của pectinase cố định dạng CLEA dưới ảnh
hưởng của pH ................................................................................................ 59
Hình 3.21: Khả năng hoạt động của pectinase cố định dạng CLEA dưới ảnh
hưởng của nhiệt độ ........................................................................................ 60
Hình 3.22: Lượng đường trong dịch củ năng trước và sau khi xử lý với enzyme
glucoamylase cố định .................................................................................... 63
Hình 3.23: Lượng đường trong dịch thơm trước và sau khi xử lý với enzyme
glucoamylase cố định .................................................................................... 63
Hình 3.24: Độ đục của dịch củ năng trước và sau khi xử lý với enzyme
pectinase cố định dạng CLEA ....................................................................... 64
Hình 3.25: Độ đục của dịch thơm trước và sau khi xử lý với enzyme pectinase
cố định dạng CLEA....................................................................................... 65

xiv


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các enzyme được cố định thành công bằng kĩ thuật CLEA ........... 12
Bảng 2.1: Các nghiệm thức tiến hành khảo sát khả năng tủa enzyme ............ 29
Bảng 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trong dịch enzyme thô .... 34
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khả năng tủa enzyme glucoamylase và pectinase
của ethanol 96O, polyethylene glycol và (NH4)2SO4 ...................................... 35
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến khả năng cố định
glucoamylase ................................................................................................ 36
Bảng 3.4: Hàm lượng glutaraldehyde trong nước rửa của glucoamylase dạng
CLEA............................................................................................................ 39

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian cố định đến khả năng cố định
glucoamylase ................................................................................................ 40
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ cố định đến khả năng cố định glucoamylase
...................................................................................................................... 41
Bảng 3.7: Khả năng tái sử dụng theo mẻ của glucoamylase cố định theo kĩ
thuật CLEA .................................................................................................. 44
Bảng 3.8: Khả năng tái sử dụng liên tục của glucoamylase cố định theo kĩ
thuật CLEA ................................................................................................... 46
Bảng 3.9: Khả năng hoạt động của glucoamylase cố định dạng CLEA dưới
ảnh hưởng của pH ......................................................................................... 47
Bảng 3.10: Khả năng hoạt động của glucoamylase cố định dạng CLEA dưới
ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................. 49
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến khả năng cố định
pectinase ....................................................................................................... 50
Bảng 3.12: Hàm lượng glutaraldehyde trong nước rửa của pectinase dạng
CLEA............................................................................................................ 52
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian cố định đến khả năng cố định pectinase
...................................................................................................................... 53
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ cố định đến khả năng cố định pectinase 54
Bảng 3.15: Khả năng tái sử dụng của pectinase cố định theo kĩ thuật CLEA . 57
Bảng 3.16: Khả năng hoạt động của pectinase cố định dạng CLEA dưới ảnh
hưởng của pH ................................................................................................ 59

xv


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

Bảng 3.17: Khả năng hoạt động của pectinase cố định dạng CLEA dưới ảnh
hưởng của nhiệt độ ........................................................................................ 60
Bảng 3.18: Kết quả xác định hàm lượng đường và độ đục ban đầu của dịch quả
...................................................................................................................... 61
Bảng 3.19: Hàm lượng đường của dịch quả trước và sau khi xử lý với
glucoamylase cố định dạng CLEA ................................................................ 62
Bảng 3.20: Độ đục của dịch quả trước và sau khi xử lý với pectinase cố định
dạng CLEA ................................................................................................... 64

xvi


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A.niger: Aspergillus niger.
CLEA: cross-linking enzyme aggregates.
CLEC: cross-linking enzyme crystals.
ETM: enzyme thương mại.
ETH: enzyme thô thu nhận từ môi trường nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger.
PE: pectinesterase.
PEG: polyethylene glycol.
PEL: pectate lyase.
PG: polygalacturonase.
PL/PNL: pectin lyase.
PME: pectinmethylesterase.
Rh. delemar:Rhizopus delemar.
SEM: scanning electron microscope.

TB: trung bình.

xvii


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

MỞ ĐẦU

1


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

1. Tính cấp thiết của đề tài
Hạn chế trong việc sử dụng enzyme cho các xúc tác sinh học đó là giá thành
rất đắt (tương tự như các xúc tác hóa học). Vì vậy enzyme cố định được sử
dụng. Thơng thường sự cố định sẽ cho hiệu quả tốt hơn đối với các enzyme có
sự ổn định về hoạt tính. Việc cố định enzyme thường thực hiện bởi sự liên kết
của enzyme với mạng lưới, hoặc nhốt trong khuôn gel. Nhưng nhược điểm của
các phương pháp trên là hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất:
chất mang che lấp làm giảm hoạt tính enzyme, ví dụ như trong phương pháp
nhốt thì enzyme ở lớp vỏ ngồi gel sẽ hoạt động tốt hơn bên trong. Bên cạnh
đó, enzyme sau khi đã tinh sạch rồi mới bắt đầu cố định hoạt tính sẽ giảm đi
rất đáng kể, bởi vì thơng thường qua mỗi bước tinh sạch thì một phần của
enzyme như các tiểu cấu tử bị tách ra hoặc những yếu tố đồng hỗ trợ cho hoạt

động của enzyme bị mất đi làm giảm hoạt tính của enzyme. Kĩ thuật crosslinking enzyme aggregates (CLEA) ra đời trên lý thuyết đã giải quyết được
những bất lợi này vì kĩ thuật này đã kết hợp được quá trình tủa và quá trình cố
định vào cùng một bước, bỏ qua bước tinh sạch, giữ được hoạt tính của
enzyme sau khi cố định và qua các lần tái sử dụng, ngoài ra kĩ thuật này còn
giúp enzyme gia tăng sự ổn định về mặt hoạt tính khi pH và nhiệt độ thay đổi,
bền hơn với sự tồn tại của tác nhân phân giải protein.
Trong công nghiệp sản xuất nước quả hay rượu vang, glucoamylase và
pectinase đóng vai trị rất quan trọng và được ứng dụng rất nhiều, hai enzyme
này có tác dụng làm tăng hàm lượng đường và giảm độ đục cũng như giảm sự
lắng cặn trong sản phẩm. Do đó, việc cố định glucoamylase và pectinase đồng
thời vẫn bảo đảm giữ được hoạt tính cao trong cơng nghiệp thực phẩm là rất
cần thiết.
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận và cố định enzyme glucoamylase và
pectinase theo kĩ thuật CLEA” đã được tiến hành.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của việc thực hiện đề tài này là:
– Tìm hiểu và thực hiện kĩ thuật cố định CLEA trên hai đối tượng là
glucoamylase và pectinase.
– Đồng thời khảo sát tính chất của enzyme cố định dạng CLEA.

2


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung đề tài:
– Khảo sát các điều kiện tối ưu để cố định enzyme glucoamylase và enzyme

pectinase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger bằng kĩ thuật CLEA, bao
gồm các yếu tố:
+ Nồng độ tay gắn glutaraldehyde.
+
+

Nhiệt độ cố định.
Thời gian cố định.

– Khảo sát tính chất của enzyme cố định dạng CLEA thu nhận từ vi sinh vật,
bao gồm: cấu trúc của khối CLEA, khả năng tái sử dụng đối với cơ chất
riêng biệt của từng enzyme, khả năng hoạt động dưới ảnh hưởng của pH và
nhiệt độ.
– Bước đầu ứng dụng enzyme dạng CLEA xử lý hai loại dịch quả là củ năng
và thơm, đánh giá dựa trên hai chỉ tiêu hàm lượng đường và độ đục của
sản phẩm.
4. Ý nghĩa khoa học
Kĩ thuật cố định CLEA là một phương pháp cố định mới khơng cần chất
mang, bên cạnh đó phương pháp này cịn đem lại hiệu suất cao hơn nếu cố
định enzyme từ dịch enzyme thơ, rút ngắn được quy trình tinh sạch enzyme,
vừa giảm thao tác thực hiện, vừa giúp enzyme có cấu trúc ổn định, đảm bảo
được hoạt tính, đây là một hướng đi mới cho công nghệ enzyme hiện đại.
5. Ý nghĩa thực tiễn
Phương pháp CLEA có nhiều thuận lợi hơn các phương pháp cố định khác khi
đưa vào sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp, bởi vì phương pháp này đơn giản,
dễ thực hiện, linh hoạt và được tối ưu hóa, ngồi ra, ngun liệu cịn rẻ tiền, dễ
kiếm. Phương pháp này được áp dụng với nhiều loại enzyme khác nhau, kể cả
enzyme thơ, sản phẩm sau CLEA có hoạt tính ổn định, khả năng tái sử dụng và
duy trì được hoạt tính của enzyme cao, chính vì vậy góp phần làm tăng hiệu
suất và giảm chi phí sản xuất.

3


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

HVTH: Trần Thị Linh Giang

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN

4


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

1.1

HVTH: Trần Thị Linh Giang

Enzyme cố định [9, 11, 19]

Enzyme là những protein có cấu tạo phức tạp và đóng vai trị xúc tác sinh học,
có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho
các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng
trong cơ thể sống.
1.1.1 Khái niệm enzyme cố định
Enzyme cố định (hay enzyme khơng tan) là enzyme có sự tham gia hoạt động
trong một không gian bị giới hạn. Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoạt của
enzyme bằng cách gắn enzyme vào một pha cách ly tách rời khỏi pha lỏng tự
do và ở đó enzyme vẫn có khả năng tiếp xúc với các phần từ cơ chất. Pha gắn

enzyme thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa
nước.
Lợi ích của việc sử dụng enzyme cố định:
-

Giảm giá thành do enzyme được sử dụng lặp lại nhiều lần với cùng một kiểu
phản ứng xúc tác, chế phẩm bền hơn trong các điều kiện pH, nhiệt độ, áp suất
thẩm thấu tối ưu, tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự động
hóa cao.

-

Tạo enzyme cố định tương đối dễ, đầu tư vào xây dựng và sản xuất tương đối
ít, sản phẩm phản ứng không lẫn lộn với enzyme (chỉ một số ít bị rửa trơi theo
dịng chảy của tác nhân), có thể dễ dàng tổ chức sản xuất các sản phẩm lên
men bằng enzyme ngoại bào như: ethanol, acid hữu cơ, aminoacid, vitamin.
Từ hai đặc điểm trên cho thấy, sử dụng enzyme khơng hịa tan có ý nghĩa kinh
tế hơn sử dụng enzyme hòa tan nhiều lần.
1.1.2 Đặc điểm của enzyme cố định
Khi gắn enzyme hòa tan vào một số chất mang, enzyme này có những đặc
điểm khác hẳn enzyme hịa tan

-

-

Hoạt tính của enzyme khơng hịa tan thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của
enzyme hịa tan cùng loại.
Enzyme khơng hịa tan có tính bền nhiệt hơn enzyme hịa tan cùng loại vì đã
được bảo vệ bởi chất mang.

Enzyme khơng hịa tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc
acid so với pH tối ưu của enzyme hịa tan chứ khơng trùng với pH tối ưu của
enzyme hịa tan cùng loại.
Enzyme khơng hịa tan có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme cùng loại.

5


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

-

HVTH: Trần Thị Linh Giang

Ta có thể tái sử dụng enzyme khơng hịa tan nhiều lần. Trong khi đó, enzyme
hịa tan chỉ có thể sử dụng một lần. Đặc điểm này rất có ý nghĩa về kinh tế khi
ta tiến hành các phản ứng theo quy mô công nghiệp.
1.1.3 Các phƣơng pháp cố định enzyme

Các phương
pháp cố định
enzyme
Các phương
pháp cho
enzyme khơng
hịa tan

Các phương
pháp cho
enzyme hịa tan

Phương pháp
nhốt enzyme

Phương pháp
tạo liên kết

Nhốt enzyme
trong gel

Tạo liên kết
chéo

Tạo liên kết
chất mang

Nhốt enzyme
trong hệ sợi

Tạo dẫn xuất

Không dẫn xuất

Hấp phụ vật lý
Liên kết ion
Liên kết kim loại
Liên kết đồng hóa
trị

Tạo màng bọc

Hình 1.1: Các phương pháp cố định enzyme

6


Luận văn Thạc sĩ khóa 2012

1.2

HVTH: Trần Thị Linh Giang

Cố định enzyme bằng phƣơng pháp cross-linking enzyme

aggregates (CLEA)
1.2.1

Phƣơng pháp cross-linking enzyme aggregates ( CLEA)

Định nghĩa phƣơng pháp CLEA [43]
Sản phẩm của phương pháp CLEA là các enzyme được gắn kết lại với nhau
bởi những liên kết chéo với tác nhân gắn nhị chức dialdehyde, sau khi đã được
tập hợp lại gần nhau, và có thể tái sử dụng được. Những năm gần đây, các
nghiên cứu đã cho thấy khả năng xúc tác rất mạnh của các enzyme liên kết
chéo này.

Hình 1.2: Minh họa các tiến trình xảy ra trong cố định enzyme bằng kĩ thuật
CLEA
Lịch sử phát triển của kĩ thuật cố định CLEA [42]
Các phương pháp cố định enzyme có thể được chia thành ba loại: liên kết với

chất mang, vi gói trong gel vơ cơ hoặc hữu cơ và liên kết chéo giữa các phân
tử enzyme. Liên kết với chất mang chắc chắn sẽ làm giảm hoạt động xúc tác
của enzyme do một lượng lớn enzyme nằm phía trong khơng tham gia xúc
tácvì bị chất mang che khuất không tiếp xúc được với cơ chất. Dạng cố định
này làm giảm năng suất sản phẩm, tăng thời gian và khơng gian xử lý cơ chất
với enzyme vì khả năng xúc tác của enzyme thấp hơn. Ngược lại, cố định
enzyme qua liên kết chéo giữa các phân tử enzyme bởi tay gắn nhị chức là một
phương pháp cố định không cần chất mang và kết quả xúc tác đảm bảo gần
như là 100% enzyme cố định đều hoạt động.
Kĩ thuật liên kết chéo enzyme, thông qua phản ứng của tay gắn, ví dụ như
glutaraldehyde với nhóm -NH2 trên bề mặt enzyme, đã được phát triển cách
đây 40 năm. Tuy nhiên, các enzyme liên kết chéo lại cho thấy khả năng duy trì
hoạt động thấp, khả năng tái sử dụng kém và ổn định cơ học thấp, và vì bản
7