(Luận văn thạc sĩ) - Nghiên cứu tạo nước hoạt hóa plasma và ứng dụng nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng của xà lách xoăn (Lactuca capitata)

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Võ Kỳ Duyên

NGHIÊN CỨU TẠO NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA VÀ ỨNG
DỤNG NÂNG CAO TỶ LỆ NẢY MẦM HẠT VÀ TĂNG
TRƯỞNG CỦA XÀ LÁCH XOĂN (LACTUCA CAPITATA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

TP. Hồ Chí Minh - 2020


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Võ Kỳ Duyên

NGHIÊN CỨU TẠO NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA VÀ ỨNG
DỤNG NÂNG CAO TỶ LỆ NẢY MẦM HẠT VÀ TĂNG
TRƯỞNG CỦA XÀ LÁCH XOĂN (LACTUCA CAPITATA)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: TS. Phạm Hữu Thiện
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Hồng Dũng

TP. Hồ Chí Minh - 2020


i

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu tạo nước hoạt hóa
plasma và ứng dụng nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng của xà lách
xoăn (Lactuca capitata)” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hướng dẫn nhiệt
tình của thầy TS. Phạm Hữu Thiện và thầy TS. Nguyễn Hoàng Dũng. Đây
khơng phải là bản sao chép của bất kì một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả
thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tơi tiến hành, trích
dẫn, tính tốn và đánh giá.
Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những nội dung mà tơi đã trình
bày ở luận văn này.
TP. Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 10 năm 2020
Người cam đoan

Nguyễn Võ Kỳ Duyên


ii
Lời cảm ơn
Em chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Thầy TS. Phạm Hữu Thiện đã tận tình hướng dẫn, bồi dưỡng kiến thức
và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn.
Thầy TS. Nguyễn Hồng Dũng đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền
đạt kinh nghiệm và luôn động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập, làm luận
văn.
Giáo sư Ahmed KHACEF - Đại học Orleans và Th.S Thân Quốc An Hạ
- Phó phòng Kỹ thuật Vật lý thuộc Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã hỗ trợ
rất nhiều về mặt chuyên mơn và các thiết bị thí nghiệm cho em hồn thành luận
văn.
Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là Phịng Đào tạo, Khoa Cơng
nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và
làm luận văn.
Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý
kiến hữu ích cho luận văn của em.
Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng và Viện Sinh học Nhiệt
đới đã giúp em có điều kiện về cơ sở vật chất cũng như thời gian để thực hiện
các thí nghiệm trong luận văn.
Các anh chị và các bạn chuyên ngành Sinh học thực nghiệm khóa
2018B, các anh chị em đồng nghiệp trong nhóm nghiên cứu plasma nơng
nghiệp tại phịng Kỹ thuật Vật Lý - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã động
viên, giúp đỡ tôi trong thời gian học tập, làm luận văn.
Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và em Hạnh Duyên đã luôn
yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập.

Nguyễn Võ Kỳ Duyên


iii

Mục lục
Trang
Lời cam đoan ...................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ............................................................... v
Danh mục các hình vẽ, đồ thị ........................................................................... vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ XÀ LÁCH XOĂN VÀ SỰ NẢY MẦM VÀ TĂNG
TRƯỞNG HẠT ................................................................................................. 3
1.1.1. Xà lách xoăn ............................................................................................ 3
1.1.2. Sự nảy mầm hạt ....................................................................................... 6
1.1.3. Sự tăng trưởng trong giai đoạn đầu của hạt .......................................... 10
1.2. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA.............................. 11
1.2.1. Giới thiệu chung về plasma và nước hoạt hóa plasma ....................... 11
1.2.2. Chế tạo nước hoạt hóa plasma ............................................................ 11
1.2.3. Sự tạo thành của các các chất có chứa gốc oxy tự do (ROS) và các chất
có chứa gốc nitơ tự do (RNS) có trong nước hoạt hóa plasma ....................... 12
1.2.4. Vai trị của nước hoạt hóa plasma đối với sự nảy mầm hạt .................. 14
1.2.5. Vai trị của nước hoạt hóa plasma đối với sự tăng trưởng trong giai đoạn
đầu của hạt ....................................................................................................... 19
1.2.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước ........................................... 19
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 22
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ......................................... 22

iv

2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU.............................................................................. 22
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 23
2.3.1. Điều chế và xác định tính chất lý hóa của nước hoạt hóa plasma ........ 23
2.3.2. Sự ảnh hưởng của nước hoạt hóa plasma đến q trình nảy mầm hạt . 24
2.3.3. Sự ảnh hưởng của nước hoạt hóa plasma đến quá trình tăng trưởng sớm
của hạt ............................................................................................................. 26
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu..................................................................... 27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 28
3.1. TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA ............... 28
3.2. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC HOẠT HĨA PLASMA ĐẾN Q
TRÌNH NẢY MẦM HẠT ............................................................................... 33
3.2.1. Kết quả chụp SEM ................................................................................ 33
3.2.2. Trọng lượng nghìn hạt........................................................................... 35
3.2.3. Tỷ lệ nảy mầm hạt ................................................................................. 36
3.3. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC HOẠT HĨA PLASMA ĐẾN Q
TRÌNH TĂNG TRƯỞNG TRONG GIAI ĐOẠN SỚM CỦA HẠT ............. 39
3.3.1. Chiều cao thân, chiều dài rễ .................................................................. 39
3.3.2. Trọng lượng khô/ trọng lượng tươi ....................................................... 43
3.3.3. Diện tích lá ............................................................................................ 44
3.3.4. Nồng độ chlorophyll trong lá ................................................................ 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 48


v

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

ABA:

Abscisic acid

Axit abxixic

DBD:

Dielectric barrier discharge

Phóng điện qua lớp điện mơi

DNA:

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

GA:

Gibberellic acid

Axit gibberellic

PAW:

Plasma activated water

Nước hoạt hóa plasma

RNA:

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

RNS :

Reactive nitrogen species

Các chất chứa ni-tơ có hoạt tính

ROS :

Reactive oxygen species

Các chất chứa oxy có hoạt tính

SEM:

Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét


vi
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1. Hình ảnh minh họa hình dáng rễ (s), thân (b), lá (c) và hoa (d) của xà
lách xoăn ........................................................................................................... 4

Hình 1.2. Sự hình thành và phân giải của NO trong thực vật ....................... 14
Hình 1.3. Q trình đồng hóa Nitơ trong thực vật ........................................ 16
Hình 2.1: Hoa chứa hạt xà lách xoăn ………………………………….........21
Hình 2.2: Sơ đồ chế tạo PAW (trái) và hình vẽ minh họa sơ đồ
(phải)...............................................................................................................22
Hình 2.3: Các bước tiến hành theo dõi sự ảnh hưởng của PAW đối với sự nảy
mầm và tăng trưởng hạt xà lách xoăn ............................................................. 27
Hình 3.1: Sự thay đổi nồng độ của NO3-, H2O2, O3- trong nước khi thay đổi thời
gian hoạt hóa plasma ……………………..…………………………………27
Hình 3.2: Sự thay đổi độ dẫn điện của nước khi tăng thời gian hoạt hóa plasma
......................................................................................................................... 31
Hình 3.3: Sự thay đổi pH trong nước khi tăng thời gian hoạt hóa plasma .... 32
Hình 3.4: pH của PAW trong 60 phút hoạt hóa plasma……………..………32
Hình 3.5: Ảnh SEM bề mặt hạt sau 2 giờ ngâm với các mẫu nước khác
nhau ................................................................................................................. 34
Hình 3.6: Trọng lượng nghìn hạt của các mẫu sau 2 giờ ngâm với nước cất và
các mẫu nước hoạt hóa plasma ở thời gian khác nhau.................................... 35
Hình 3.7: Tỷ lệ nảy mầm hạt (Rg) trong 3 ngày đầu…………………………36
Hình 3.8: Các chỉ số nảy mầm hạt vào ngày thứ 3......................................... 38
Hình 3.9: Sự hình thành cây con từ hạt ngâm với P15 sau 0 giờ (a) 3 giờ (b), 6
giờ (c) và 24 giờ (d)…………………………………………………………..39
Hình 3.10: Chiều dài phơi sau 24 giờ theo dõi ............................................... 40
Hình 3.11: Chiều chiều cao thân và chiều dài rễ sau 3 ngày theo dõi ........... 41


vii
Hình 3.12: Hình ảnh các mẫu cây sau 7 ngày theo dõi .................................. 42
Hình 3.13 : Hình dạng rễ ở của cây P5 (trái) và P30 (phải) sau 3 ngày theo dõi
......................................................................................................................... 42
Hình 3.14: Tỷ lệ trọng lượng khơ và trọng lượng tươi sau 7 ngày theo dõi

…………………………………………………………………………….....43
Hình 3.15: Diện tích sau 7 ngày theo dõi ....................................................... 44
Hình 3.16: Ảnh chụp các mẫu lá sau 7 ngày theo dõi ……………………....44
Hình 3.17: Nồng độ chlorophyll trong lá được đo sau 7 ngày theo dõi ........ .45


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hiện nay, các nhà khoa học đã nghiên cứu được rất nhiều cách để kích
thích hạt nảy mầm nhanh như sử dụng từ trường [1], xử lý siêu âm [2] và sử
dụng ô-zôn, tia UV hay plasma nguội hay nước hoạt hóa plasma (Plasma
activated water – PAW) [3]. Ở mỗi phương pháp đều có các ưu, nhược điểm
khác nhau. Tuy nhiên, nước hoạt hóa plasma (PAW) có nhiều ưu điểm hơn như
thân thiện với mơi trường, thời gian xử lí ngắn, tiết kiệm năng lượng, khơng
gây hại cho hạt, thực vật cũng như sức khỏe con người. Chính vì thế mà trong
những năm gần đây việc áp dụng PAW trong nơng nghiệp, cụ thể là kích thích
nảy mầm vầ tăng trưởng đang trở thành xu hướng nghiên cứu mới của các nhà
khoa học trên thể giới. Mặt khác, hiệu quả kích thích nảy mầm và tăng trưởng
thực vật của PAW phụ thuộc vào thành phần và nồng độ các chất có trong
PAW, vì thế việc nghiên cứu chế tạo PAW để ứng dụng trong tăng trưởng thực
vật là một hướng nghiên cứu theo kịp xu hướng thế giới.
Xà lách xoăn (Lactuca capitata) được chọn đối tượng nghiên cứu vì đây
là loại thực vật có: độ nhạy của hạt giống cao, tốc độ mầm nhanh, sự tăng trưởng
tuyến tính, khơng nhạy cảm với sự khác biệt pH trong phạm vi rộng [4]. Ngồi
ra, xà lách xoăn cịn là một loại rau ăn sống có giá trị kinh tế cao.
Chính vì những luận điểm trên mà đề tài “Nghiên cứu tạo nước hoạt hoá
plasma và ứng dụng nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng của xà lách
xoăn (Lactuca capitata)” hứa hẹn sẽ có hiệu quả kinh tế mà vẫn đảm bảo an
toàn cho cây trồng, con người, vật ni, mơi trường và có thể áp dụng vào thực

tiễn với quy mô lớn.
2. Mục tiêu đề tài
Tối ưu hóa điều kiện chế tạo nước hoạt hóa plasma và đánh giá hoạt tính
của nước hoạt hóa plasma đối với sự nâng cao tỷ lệ nảy mầm hạt và tăng trưởng
trong giai đoạn sớm của xà lách xoăn (Lactuca capitata).
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Nước hoạt hóa plasma


2
Phạm vi nghiên cứu: Các mẫu nước plasma chế tạo bằng phương pháp
plasma nguội tại phịng thí nghiệm về Plasma nơng nghiệp thuộc phịng Kỹ
thuật Vật lý - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài
Ý nghĩa khoa học: Xác định được vai trị của nước hoạt hóa plasma đối
với sự nảy mầm và tăng trưởng xà lách xoăn (Lactuca capitata).
Ý nghĩa thực tiễn: Tìm ra một kỹ thuật mới để ứng dụng kích thích nảy
mầm và tăng trưởng các giống thực vật có hạt khó nảy mầm.


3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ XÀ LÁCH XOĂN VÀ SỰ NẢY MẦM VÀ TĂNG
TRƯỞNG HẠT
1.1.1. Xà lách xoăn

Xà lách xoăn (Lactuca savita var capitata L.) thuộc họ hoa cúc, lồi
Lactuca, có lồi mang 8 hoặc 9 cặp nhiễm sắc thể, có lồi mang 17 cặp nhiễm

sắc thể, tên khoa học là Lactuca sativa, thực vật bậc cao, lớp 2 lá mầm, có lồi
là cây 1 năm, có lồi là cây 2 năm.
Xà lách là thực vật thượng đẳng có đơn vị phân loại như sau:
Ngành hạt kín

: Angiospermatophyta

Lớp hai lá mầm

: Dicotyledoneae

Bộ cúc

: Alerales

Họ cúc

: Compositae

Chi

: Lactuca

Giống xà lách

: Lactuca sativa L

Đặc điểm thực vật
Rễ: rễ xà lách thuộc loại rễ chùm, phân bố chủ yếu ở tầng đất 0 – 20cm.
Tuy nhiên bộ rễ có thể nhìn rõ thấy 2 phần: rễ chính là rễ thẳng phát triển làm

nhiệm vụ giữ cây, bám vào đất chắc hơn, ngoài ra còn làm nhiệm vụ hút nước
và dinh dưỡng cho cây. Từ rễ chính mọc ra rất nhiều rễ phụ để hỗ trợ cây bám
đất, hút nước và khoáng chất [5].
Thân: thuộc loại thân thảo, mềm, rất ngắn, không phân nhánh, phát sinh
các lá mọc sít nhau. Thân là nơi kết nối bộ rễ và lá, vận chuyển chất khoáng,
chất hữu cơ do bộ rễ hút lên đến lá tổng hợp nuôi cây [5].
Lá: lá cây mọc dày lên trên trục thân với số lượng lá rất lớn, lá sắp xếp
theo hình xoắn ốc, lúc đầu mật độ lá rất dày, giai đoạn sau thưa dần. Lá ngồi
có màu xanh đậm, xanh hoặc xanh nhạt; Lá trong có màu xanh nhạt, xanh trắng


4
hoặc trắng ngà. Các lá phía trong mềm, chứa nhiều chất dinh dưỡng hơn các lá
phía ngồi. Bề mặt lá lồi lõm, gấp khúc [5].
Hoa: Chùm hoa dạng đầu, chứa số lượng lớn các hoa nhỏ kết chặt với
nhau trên một đế hoa. Hoa có 5 đài, 5 nhị cái và 2 lá noãn, hoa tự thụ, hạt phấn
và lá nỗn có độ hữu thụ cao. Hoa nở từ lúc có ánh sáng mặt trời đến trưa, thụ
phấn tốt nhất lúc 9- 10 giờ sáng [5].
Quả: Loại quả bế, hạt khơng có nội nhũ [5].

Hình 1.1. Hình ảnh minh họa hình dáng rễ (s), thân (b), lá (c) và hoa (d) của
xà lách xoăn
Thành phần hóa học:
Thành phần hóa học của xà lách xoăn (Lactuca capitata): trong 100 gam
(g) lá của cây bao gồm 96% nước, 1,4 g protein, 2,9 g carbohydrate, 1,3 g chất
xơ, 0,2 g chất béo và 1,2 g tro. Xà lách xoăn chứa hầu hết các loại vitamin và
đặc biệt giàu vitamin A, C, K, niacin và folate và nhiều khoáng chất như canxi,
sắt, phốt pho, natri và kali (Cơ sở dữ liệu dinh dưỡng USDA, 2016). Số liệu về
thành phần hóa học của xà lách xoăn được thể hiện trong bảng 2.

5
Bảng 1: Giá trị dinh dưỡng trong 100g xà lách xoăn
Thành phần

Lượng

Đơn vị

Thành phần

Lượng

Đơn vị

Calo(kcal)

14

K.cal

Protein

1.4

g

Lipid

0,2

g

Vitamin A

7.405

IU

Cholesterol

0

mg

Canxi

36

mg

Natri

28

mg

Vitamin D

0

IU

Kali

194

mg

Vitamin C

0

mg

Cacbohydrat

2.9

g

Sắt

0.9

mg

Chất xơ

1.3

g

Vitamin B6

0.1

mg

Đường thực phẩm

0.8

g

Magie

13

mg

Nguồn: Từ USDA (U.S Department of Agriculture)

Dược tính
Chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa của xà lách xoăn đã được kiểm
chứng trong cả điều kiện in vitro và in vivo. Trong điều kiện in vitro cho thấy
hoạt tính chống lại gốc tự do DPPH với tỷ lệ phần trăm ức chế 40–80% ở nồng
độ dịch chiết xà lách xoăn khác nhau [6,7]; hoạt động chống oxy hóa của chiết
xuất của cây chống lại q trình peroxy hóa axit linoleic [8] và ức chế tổn
thương oxy hóa do bức xạ UV gây ra ở Salmonella typhi [18]. Với in vivo trên

mơ hình chuột thì chiết xuất methanol của lá làm tăng mức độ biểu hiện hai
enzym chống oxy hóa, catalase và superoxide dismutase (SOD) trong máu và
não của chuột bạch tạng đực và làm giảm sự hình thành malondialdehyde
(MDA) trong máu và não của chuột [9].
Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng vi-rút: Chiết xuất methanol của xà lách
xoăn có khả năng kháng các loại khuẩn như S. aureus, Streptococcus pyogenes,
B. subtillis, P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, S. pyogenes [6]. Các hợp chất xà
lách xoăn có hoạt tính làm thay đổi thành phần tế bào chất của nấm men, và
gây tổn thương đến thành tế bào của chúng. Các hoạt động kháng vi-rút của
chiết xuất L. capitata cũng chứng minh trên vi-rút cytomegalovirus ở người
[10].


6
Chống ung thư: chiết xuất xà lách xoăn ức chế sự phát triển của tế bào
bệnh bạch cầu HL-60 và tế bào ung thư vú MCF-7 bằng cách kích hoạt kinase
điểm kiểm tra 2, tạo ra chất ức chế khối u p21 và điều hòa giảm proto-oncogene
cyclin D1; ức chế sự chết của tế bào HL-60 bằng cách acetyl hóa alpha-tubulin
[11].
Xà lách xoăn cịn có một số hoạt tính sinh học khác như: giảm đau và
chống viêm của L. sativa [12,13]; Chống đông máu mạnh ngang với aspirin
[12]; Chống độc của chúng [14],…
Ngồi ra, xà lách xoăn cịn là loại rau sạch có thể ăn sống quan trọng và
phổ biến. Xà lách xoăn thường thường được sử dụng trong các món ăn như
salat, bánh mì kẹp, hăm-bơ-gơ,…
1.1.2. Sự nảy mầm hạt
1.1.2.1. Nguyên lý của sự nảy mầm hạt
Hạt là sản phẩm hình thành sau sự thụ tinh kép, gồm các thành phần:
Phôi; Chất dinh dưỡng dự trữ; Vỏ hạt: phát triển từ vỏ của nỗn
Sự nảy mầm của hạt có thể xem là bắt đầu của quá trình sinh trưởng, phát

triển của cây. Từ hạt đang ngủ nghỉ chuyển sang trạng thái nảy mầm là cả một
quá trình biến đổi sâu sắc và nhanh chóng về hố sinh và sinh lí xảy ra trong
hạt.
Sự biến đổi hóa sinh
Đặc trưng nhất của các biến đổi hóa sinh trong khi nảy mầm là sự tăng
đột ngột hoạt động thủy phân xảy ra trong hạt. Các hợp chất dự trữ dưới dạng
các polymer như tinh bột, protein, lipit… bị phân giải thành các chất monomer
như các đường đơn, axit amin, axit béo,… phục vụ cho sự nảy mầm. Chính vì
vậy mà các enzym thủy phân được hoạt hóa rất nhanh. Mức độ hoạt hóa của
các enzym thủy phân trong hạt phụ thuộc vào tính chất đặc trưng và thành phần
hóa học của hạt.
Với các loại hạt dự trữ chủ yếu là tinh bột, hoạt tính của enzym α-amylase
được tăng lên nhanh khi hạt phát động sinh trưởng. Lúc này tinh bột bị thủy


7
phân thành đường làm nguyên liệu cho hô hấp và tăng áp suất thẩm thấu trong
hạt.
Các hạt có thành phần dữ trữ chủ yếu là protein như hạt đậu đỗ thì hoạt
tính của enzym protease tăng lên mạnh mẽ hơn các enzym khác. Protein sẽ bị
phân hủy thành các axit amin, rồi các axit amin này được sử dụng để tổng hợp
các protein thứ cấp cấu tạo nên chất nguyên sinh của mầm non đang sinh
trưởng. Với các hạt nảy mầm trong tối thì axit amin có thể kết hợp với NH3 để
tạo nên các amit (asparagine, glutamin).
Với các hạt chứa nhiều lipit như hạt lạc, vừng, hướng dương, cọ dầu
…thì có hoạt tính của lipase là ưu thế. Lipit được phân hủy thành các axit béo
phục vụ cho việc khai thác năng lượng và xây dựng tế bào của cây con.
Sự tăng hoạt tính của các enzym thủy phân có lẽ chủ yếu do các enzym
này được tổng hợp mới trong lớp tế bào aleuron của hạt và cũng có thể hoạt
hóa các enzym đã có sẵn.

Sau giai đoạn nảy mầm, cây cối xuất hiện thì hoạt động tổng hợp các
chất mới cấu tạo nên tế bào mới xảy ra mạnh mẽ. Đó là sự tổng hợp protein,
axit nucleic, phospholipid, pectin, xenlulose…
Sự biến đổi sinh lý
Hô hấp: Biến đổi sinh lý là đặc trưng nhất trong quá trình nảy mầm hơ
hấp. Ngay sau khi hạt hút nước thì hoạt tính của enzym hố hấp tăng lên mạnh,
làm cường độ hô hấp của hạt tăng lên rất nhanh [15]. Hô hấp đã giúp các cây
có đủ năng lượng và các nguyên liệu cần thiết cho sự nảy mầm.
Cân bằng hooc-môn: Trong q trình nảy mần, cân bằng hooc-mơn của
trạng thái ngủ nghỉ và nảy mầm bị thay đổi [16]. Sự cân bằng hooc-mơn điều
chỉnh q trình nảy mầm là cân bằng GA/ABA. Khi hạt đang ngủ nghỉ thì hàm
lượng ABA rất cao và GA không đáng kể. Nhưng khi ta ngâm hạt, phơi phát
động sinh trưởng thì phơi tăng cường tổng hợp giberelin nên làm hàm lượng
của chúng tăng nhanh, cịn ngược lại, hàm lượng ABA giảm dần.
Vì vậy, trong thực tiễn sản xuất, việc phát ngủ nghỉ của hạt, xử lý nảy
mầm để gieo kịp thời vụ là biện pháp rất có ý nghĩa. Người ta xử lý GA hoặc


8
có thể xử lý nhiệt độ thấp cho hạt để giảm hàm lượng ABA và tăng hàm lượng
GA trong phôi hạt. Khi cân bằng hooc-mơn nghiêng về phía GA thì hạt sẽ nảy
mầm.
Ngoài ra trong giai đoạn này bên trong hạt cịn có một số biến đổi sinh
lý khác như: Hoạt động chống oxi hóa tăng cường [17-19]; Các gen và protein
liên quan đến vận chuyển nước, biến đổi thành tế bào, tổ chức khung tế bào và
phân chia tế bào, khả năng tổng hợp protein, khả năng xử lý sau dịch mã và quá
trình phân giải protein mục tiêu liên quan đến nảy mầm tăng nhanh [20,21]
1.1.2.2. Diễn diến của quá trình nảy mầm
Bước đầu tiên của sự nảy mầm là giai đoạn thu nước (6 - 12 giờ tùy loại
hạt), giai đoạn I, hạt khô hấp thu nước nhanh chóng cho đến khi hạt hồn tồn

ngậm nước. Đến giai đoạn II sự hấp thu nước bị hạn chế, đối với hạt giống
khơng hoạt động hoặc chết thì giai đoạn này sẽ không thay đổi. Giai đoạn nảy
mầm kéo dài khoảng 12 - 48 giờ, trong giai đoạn này thì hấp thụ nước của hạt
gia tăng liên tục. Sự nảy mầm khi rễ mầm lú ra khỏi vỏ hạt và bắt đầu giai đoạn
tăng trưởng của cây mầm đến khi cây mầm tự dưỡng thì sự nảy mầm kết thúc
[22]. Trong các giai đoạn I và II, hạt giống có sự thay đổi chuyển hóa lớn chuẩn
bị cho sự phát triển kéo dài rễ mầm [23].
Trong giai đoạn nảy mầm, tế bào to lên làm trọng lượng tươi tăng dần,
tế bào biểu mô kéo dài và các tế bào xếp dày đặc và khơng có khoảng gian bào
[24]. Trong giai đoạn hấp thu nước, mạng lưới nội chất bắt đầu xuất hiện trong
tất cả các tế bào, số lượng ty thể, lục lạp, bộ máy Golgi… tăng lên chứng minh
tế bào biểu mô của lớp vỏ đã chuyển từ trạng thái ngủ sang trạng thái hoạt động
[25].
Các RNA được lưu trữ trong phôi trưởng thành sẽ hoạt động trong thời
gian nảy mầm. Ở cây Arabidopsis, hoạt động tổng hợp protein thấp trong 8 giờ
đầu tiên của giai đoạn hấp thu nước, sau đó tăng mạnh và đạt mức tối đa trong
thời gian từ 8 đến 24 giờ [2].
Trong quá trình nảy mầm có sự thay đổi cân bằng hooc-mơn. Sự cân
bằng hooc-mơn điều chỉnh q trình nảy mầm là cân bằng GA/ABA. Khi hạt


9
đang ngủ nghỉ, hàm lượng ABA rất cao và GA là không đáng kể. Nhưng khi
ngâm hạt, phôi phát động sinh trưởng nên tăng cường tổng hợp giberelin làm
hàm lượng của chúng tăng nhanh trong hạt còn ngược lại, hàm lượng ABA
giảm dần. Vì vậy, trong thực tiễn sản xuất, để phá ngủ nghỉ của hạt làm cho
chúng nảy mầm để gieo thì phải xử lí GA.
1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nảy mầm hạt
Sự nảy mầm hạt giống phụ thuộc vào cả điều kiện bên trong lẫn bên
ngoài. Những nhân tố bên ngoài quan trọng nhất bao gồm nhiệt độ, nước, ôxy,

và đôi khi là nhu cầu về ánh sáng [26]. Nhiều loài cây cần những điều kiện khác
nhau để có thể nảy mầm hiệu quả. Điều này thường phụ thuộc vào sự đa dạng
của hạt giống và có liên kết chặt chẽ với các điều kiện sinh thái tại nơi sống tự
nhiên của cây.
Nước
Độ ẩm là điều kiện rất quan trọng cho sự nảy mầm. Nước làm mềm vỏ
hạt nên hạt dễ thấm oxygen và carbon dioxide, đồng thời nước làm tan các chất
dự trữ và giúp chúng đi vào phản ứng biến thối. Nước lơi các chất ức chế nảy
mầm ra khỏi hạt [27]. Ngoài ra, nước cịn là dung mơi cho các phản ứng hố
sinh trong hạt đang nảy mầm và là điều kiện cần thiết cho hơ hấp của hạt. Hạt
khơ trong khơng khí có độ ẩm 10 - 14% thì ngủ nghỉ. Khi hạt hút nước đạt hàm
lượng 50 - 70% thì hạt bắt đầu phát động sinh trưởng và nảy mầm. Riêng với
xà lách xoăn thì đây là loại cây ưa ẩm nên độ ẩm đồng ruộng thích hợp nhất là
70 - 80% và độ ẩm khơng khí là 65% - 75% [27]
Nhiệt độ
Nhiệt độ cho hạt xà lách xoăn giống nảy mầm là 25 ± 2oC. Nhiệt độ ảnh
hưởng hoạt tính của enzym. Ở nhiệt độ thấp, có sự thủy phân protein thành các
axit amin và amid, thuận lợi cho việc hấp thu nước. Mặt khác, nhiệt độ còn ảnh
hưởng đến tốc độ các phản ứng hoá sinh diễn ra trong q trình nảy mầm và hơ
hấp của hạt. Khi mầm xuất hiện thì nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của
mầm.
Oxy


10
Nảy mầm là quá trình thu nhiệt tiêu thụ nhiều năng lượng. Ngoại trừ một
số lồi, điều kiện kị khí ức chế sự nảy mầm, oxygen là tuyệt đối cần thiết.
Lượng oxygen cần thiết cho hạt nảy mầm để hạt hơ hấp hiếu khí, tạo năng
lượng, đồng thời oxy hóa các chất ức chế phôi tăng trưởng [28].
Yếu tố khác

Ánh sáng: Với một số lồi khác ánh sáng có thể kích thích sự nảy mầm
hạt nhưng một số khác thì lại gây cản trở. Ví dụ với tia sáng đỏ (bước sóng 580
- 660 nm) kích thích sản xuất gibberellin trong sự nảy mầm của hạt thuốc lá và
xà lách xoăn [29].
Chất dự trữ trong hạt: Chất dự trữ là nguồn dinh dưỡng để nuôi cây mầm.
Nội nhũ hạt lúa đủ lớn, chứa đủ chất dinh dưỡng dự trữ thì phơi có thể chuyển
thành cây mầm khỏe mạnh [30].
Nồng độ dung dịch đất: Khi ta gieo hạt vào đất có nồng độ muối cao thì
sự nảy mầm bị ức chế vì áp suất thẩm thấu của đất có thể cao hơn áp suất thẩm
thấu của hạt, hạt không hút nước được dẫn đến quá trình nảy mầm bị cản trở.
1.1.3. Sự tăng trưởng trong giai đoạn đầu của hạt
Khi hạt nảy mầm thì rễ mầm (radicle) xuất hiện trước, sau đó đến thân
mầm. Thân mầm được bao bọc bởi một lá bao mầm (diệp tiêu), dài khoảng 1
cm. Kế đó, lá đầu tiên xuất hiện, gọi là lá thứ nhất hay lá khơng hồn tồn. Sau
đó đến lá thứ hai, lá này có đầy đủ phiến lá và bẹ lá.
Trong giai đoạn này cây con có các biến đổi bên trong như: hoạt tính biến
dưỡng của cây mầm tăng mạnh, hoạt tính biến dưỡng của mơ dự trữ giảm mạnh;
Con đường glyco giải và chu trình axit citric hoạt động ở những mức độ khác
nhau tùy hạt và các điều kiện bên ngồi; Chu trình glyoxilic hoạt động chuyển
hóa lipid thành glucid.
Sự thay đổi nồng độ của các chất liên hợp và chất chuyển hóa có nguồn
gốc từ phytohoocmon (auxin, cytokinin,…) có thể được chứng minh bằng thực
tế thơng qua việc quan sát cây con trong 7 ngày. Trong thời gian này, sự sinh
tổng hợp cũng như các hoạt động sinh học thể hiện mạnh mẽ [31]. Chính vì


11
vậy, để có kết luận tồn diện nhất về vai trị của PAW đối với sự nảy mầm hạt
thì cần phải theo dõi luôn cả sự phát triển của cây con trong 7 ngày đầu.
1.2.

TỔNG QUAN VỀ NƯỚC HOẠT HÓA PLASMA
1.2.1. Giới thiệu chung về plasma và nước hoạt hóa plasma

Plasma là trạng thái thứ tư của vật chất ngoài rắn, lỏng, khí. Khi các phân
tử và nguyên tử ở thể khí sử dụng các electron chứa năng lượng từ phóng điện
một chiều (DC) hoặc xoay chiều (AC) (tần số đến 100 kHz), phóng điện tần số
vơ tuyến (tần số dao động từ 100 kHz đến 100 MHz). Sản phẩm của q trình
phóng điện này là hỗn các điện tử tự do, ion và các hạt trung tính (nguyên tử
và phân tử ở trạng thái cơ bản hoặc ở trạng thái kích thích). Plasma nguội là
một phần của plasma, ở đây khí bị ion hố ở trạng thái khơng cân bằng, đặc
trưng bởi năng lượng electron rất cao trong khi nhiệt độ dịng khí ở nhiệt độ
thấp [31].
Plasma được chia làm hai loại là plasma nóng và plasma nguội. Plasma
nóng có phân tử, nguyên tử, ion và electron nhiệt độ như nhau, nhiệt độ rất cao
(5 x 103 – 20 x 103 K). Plasma nguội (plasma không nhiệt, plasma lạnh) có các
ion và các hạt trung hịa có nhiệt độ thấp hơn nhiều so với nhiệt độ của các
electron [31]. Vì điều kiện thí nghiệm của plasma nguội là ở nhiệt độ thấp
(không cao hơn nhiều so với nhiệt độ phịng – khoảng 600C) nên các thí nghiệm
có thể được thiết kế thực hiện trên hạt giống. Ngoài ra, các hệ thống plasma
nguội thường có phí bảo trì thấp và có chi phí năng lượng thấp.
Trong mơi trường khơng khí, plasma tồn tại các phần tử như: UV, O2-°,
O°, HO2°, N°, H°, O2+, N2+ , OH°, O3, NOx…
1.2.2. Chế tạo nước hoạt hóa plasma
Nước hoạt hóa plasma đang ngày càng trở thành một chủ đề được quan
tâm trong lĩnh vực khoa học và cơng nghệ vì chúng tạo ra các chất có chứa gốc
oxy tự do ROS và các chất có chứa gốc nitơ tự do RNS [32-36], đây là những
chất hiệu quả để thay thế nhiều loại vật liệu sinh học và hóa học [37] nên chúng
phù hợp để ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y sinh [38-41], môi
trường [42], nano [43], và nông nghiệp [44].

12
Đã có rất nhiều hệ thống plasma nguội được sử dụng để hoạt hóa nước
được nghiên cứu để tìm hiểu tính chất vật lý của sự phóng điện và các sản phẩm
trong nước sau hoạt hóa plasma, và để điều chỉnh cho phù hợp với các ứng
dụng cụ thể [32]. Các hệ thống này có thể được chia nhỏ thành ba nhóm chính
như
i) phóng điện trực tiếp trong pha lỏng
ii) phóng điện trong pha khí ở trên chất lỏng với các điện cực lỏng
iii) phóng điện trong các bong bóng khí trong chất lỏng.
Nhóm thứ nhất là sự phóng điện trực tiếp trong pha lỏng nên phức tạp
hơn các trường hợp cịn lại do: chất lỏng có cấu tạo đặc hơn chất khí; con đường
di chuyển tự do trung bình của các electron ngắn hơn; và tần số va chạm cao
hơn trong chất lỏng, điều này đòi hỏi nhiều năng lượng hơn [32]. Với trường
này, hầu hết các tia plasma được tạo ra được tạo ra bởi kích thích xung [46].
Trong khi đó, hai nhóm sau về nguyên tắc là phóng điện trong khí rồi chuyển
sang lỏng, nên cần ít năng lượng hơn so với nhóm đầu tiên. Các phóng điện này
có thể được kích thích bằng kích thích xung hoặc xoay chiều [32].
Thành phần các hợp chất sau phóng điện plasma trong khơng khí khi
tương tác với nước
- Thành phần hỗn hợp trước plasma: O2, N2, H2O
- Sản phẩm trung gian: OHo, Ho, Oo, No, NOo, và các ion khác
- Sản phẩm cuối cùng : H2O2, NOx, O3, HNO2, HNO3, ONOOH và các
ion
1.2.3. Sự tạo thành của các các chất có chứa gốc oxy tự do (ROS) và
các chất có chứa gốc nitơ tự do (RNS) có trong nước hoạt hóa
plasma
Hầu hết các phản ứng plasma xảy ra ở pha khí hoặc hơi. Sau khi nhận
được sự điện tử từ bên ngoài, các electron tự do và các phân tử khí chuyển động

và va chạm. Có hai loại va chạm giữa các điện tử là: va chạm đàn hồi và va
chạm không đàn hồi. Trong va chạm đàn hồi, động lượng được được phân phối
giữa các hạt va chạm, nhưng động năng của chúng hầu như không thay đổi;


13
trong khi trong va chạm không đàn hồi, động lượng được phân phối lại, một
phần nhỏ của động năng ban đầu được chuyển thành nội năng của một trong
các hạt tham gia, dẫn đến sự phân ly, kích thích hoặc ion hóa [46]. Phân ly là
phá vỡ các phân tử thành các phần cấu tạo khác nhau. Các sản phẩm phân ly
của các phân tử ban đầu đặc biệt quan trọng vì chúng có thể phản ứng hóa học
với các bề mặt tiếp xúc.
Sự phóng điện plasma khi tiếp xúc với nước có nhiệt độ electron cao hơn
đáng kể so với nhiệt độ ion và các chất trung tính. Các ion và các chất trung
tính thường duy trì ở nhiệt độ môi trường, trong khi nhiệt độ điện tử là hơn
10.0000K. Điều này tạo điều kiện cho các phản ứng gây ra sự va chạm của điện
tử làm phá vỡ các phân tử thành các sản phẩm trung hòa và ion [43]. Các phản
ứng ion - phân tử tiếp theo sau đó tạo ra các chất thứ cấp khơng có trong trong
thành phần phản ứng và sản phẩm phản ứng ban đầu.
Các sản phẩm sơ cấp trong hơi nước sau hoạt hóa plasma được tạo ra từ
các điện tử giàu năng lượng thông qua các phản ứng như [43].
e + H2O → H + OH + e
e + H2O → 2H + O + e
e + H2O → H2O + 2e
e + O2 → O2
Các loài sơ cấp hơi nước sau hoạt hóa plasma sau đó phản ứng với nhau để
tạo ra các loài thứ cấp như [43].
OH + OH + M → H2O2 + M [M - thể ba (hơi H2O)]
O + O+ M → O2 + M
O + O2 + M → O3 + M

N2 + O2 + M → 2NO + M
2NO + Oz + M → 2NO2 + M
NO + OH + M → HNO2 + M
NO2 + OH + M→ HNO3 + M


14
1.2.4. Vai trị của nước hoạt hóa plasma đối với sự nảy mầm hạt
1.2.4.1. Các ROS và RNS có trong thực vật
ROS cũng như RNS có nhiều vai trị trong sinh học thực vật gồm tham
gia vào việc phát tín hiệu, bảo vệ và tăng trưởng cây [47-52]. Trong thập kỷ
trước đã có nhiều nghiên cứu về khả năng gây hại cho cả thực vật và động vật
bởi ROS và RNS, nhưng cho đến nay thì khi sử dụng ROS và RNS ở nồng độ
thích hợp đã được các nhà khoa học chứng minh là có vai trị tích cực [53]. Gần
đây, nhóm nghiên cứu của Foyer và cộng sự [51] đã khám phá sâu hơn về vai
trò của các ROS trong cân bằng trạng thái oxy hóa khử của tế bào, điều khiển
quá trình trao đổi chất, tăng trưởng và phát triển của thực vật, cũng như chu
trình tự chết của tế bào.
Oxy được khử bởi NADPH oxidase thành anion superoxide. Sau đó, nó
có thể được tiếp tục chuyển đổi thành hydrogen peroxide (H2O2) một cách tự
nhiên hoặc bằng enzym (tức là thông qua superoxide dismutase [54], oxalate
oxidase [55] hoặc diamine oxidase [56]. H2O2 có thể tiếp tục được chuyển đổi
thành hydroxyl thông qua phản ứng Fenton.
Nitric oxide (NO) là một trong các loại nitơ phản ứng trong thực vật [52,
57,58]. Sự hình thành và phân giải NO trong tế bào được thực hiện bởi các
enzym hoặc các tác nhân nội bào khác.

Hình 1.2. Sự hình thành và phân giải của NO trong thực vật [51]
1.2.4.2. Vai trò của các ROS và RNS nội sinh đến sự nảy mầm và tăng
tưởng hạt

ROS và RNS đang được biết đến như một chất điều hòa quan trọng đối
với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu


15
cho thấy ROS và RNS có thể điều chỉnh sự phát triển và kéo dài của tế bào. Ví
dụ, nhóm nghiên cứu của Foreman và cộng sự [52] chứng minh rằng ở
Arabidopsis thaliana, RONS được tạo ra bởi NADPH oxidase điều chỉnh sự
mở rộng của rễ thơng qua việc kích hoạt các kênh Ca2+ kéo dài tế bào ở rễ [57].
Đột biến Arabidopsis thaliana rhd2 (rễ bị khuyết lơng) có lơng rễ ngắn và rễ
cịi cọc [59] do sự hấp thu Ca2+ bị khiếm khuyết. Forman và cộng sự [59] cho
thấy RHD2 là một NADPH oxidase, một protein chuyển các điện tử từ NADPH
đến các chất nhận điện tử để tạo thành các anion superoxide (O2-), sau đó được
chuyển thành hydrogen peroxide (H2O2) làm kích hoạt các kênh Ca2+.
Thành tế bào là một yếu tố quan trọng đối với sự đông đặc của tế bào.
Việc nới lỏng thành tế bào là cần thiết để mở rộng các tế bào. Liszkay và cộng
sự [59] báo cáo rằng các gốc hydroxyl (◦OH) được tạo ra trong rễ ngơ (Zea
mays) có vai trị trong việc nới lỏng thành tế bào và kéo dài tế bào. Họ quan sát
thấy rằng ◦OH được tạo ra trong vùng phát triển của rễ giúp nới lỏng thành tế
bào.
Sự tích tụ H2O2 trong tế bào thực vật xảy ra do quá trình trao đổi chất
bình thường, stress phi sinh học và sinh học và phản ứng với mầm bệnh. Khi
nồng độ H2O2 ở mức bình thường, nó hoạt động như một chất truyền tin thứ hai
điều chỉnh hoạt động của các phytohormone như axit salicylic, axit jasmonic,
axit abscisic và ethylene đối với sự tăng trưởng và phát triển của cây. Ở nồng
độ cao hơn hydrogen peroxide có thể gây ra stress oxy hóa bằng cách gây ra
phản ứng quá nhạy cảm để tiêu diệt mầm bệnh.
1.2.4.3. Vai trò của các ROS và RNS ngoại sinh đến sự nảy mầm và
tăng tưởng hạt
Zhou và cộng sự báo cáo rằng ROS và RNS được tạo ra trong PAW,

chẳng hạn như H2O2, NO2-, NO3-và amoniac (NH4+), có tác động tích cực đến
sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây con [60].


16

Hình 1.3. Q trình đồng hóa Nitơ trong thực vật [51]
(NR = nitrate reductase, NiR = nitrite reductase, Nase = nitrogenase,
GS = glutamine synthetase, GOGAT = glutamate synthase)
Cụ thể hơn, NO3- là nguồn cung cấp Nitơ dồi dào nhất có sẵn trong đất
canh tác trong khoảng 1-20 mM [58]. Sau khi hấp thụ, nó được đồng hóa thành
axit amin ở rễ hoặc chồi thơng qua các q trình trao đổi chất khác nhau. Thiếu
Nitơ gây ra hiện tượng úa lá ở các lá già vì N được chuyển hóa sang các lá non
[58] đổi chất và phát triển ở thực vật [61,62] nó có khả phá vỡ trạng thái ngủ
của hạt ở cây Arabidopsis, gây ra sự mở rộng của lá và điều phối sự biểu hiện
của các gen liên quan đến nitrat.
Gần đây, phương pháp xử lý H2O2 ngoại sinh cũng đã được áp dụng trên
thực vật. H2O2 ngoại sinh có thể điều chỉnh H2O2 nội sinh. Barba-Espin và cộng
sự đã chứng minh rằng H2O2 ngoại sinh làm tăng sự nảy mầm của hạt đậu, cũng
như sự phát triển của cây con. Họ cũng cho thấy rằng H2O2 và các protein cảm
ứng (14-3-3, TCTP, proteasome,...) có liên quan đến tín hiệu và sự phát triển
của thực vật, sự đơng tụ và phân chia tế bào cũng như kiểm soát chu kỳ tế bào.
Việc sử dụng H2O2 ngoại sinh đã cung cấp một hệ thống rễ khỏe hơn và tăng
sự phát triển của cây con và tăng khả năng chịu mặn ở lúa mì. Le và cộng sự
quan sát thấy rằng với nguồn cung cấp H2O2 ngoại sinh trong lúa mì, tốc độ sản
xuất anion superoxide (O2) và malondialdehyde (MDA) giảm và hoạt động của
superoxide dismutase (SOD) giảm khi phản ứng với stress muối. Hàm lượng
của MDA, một sản phẩm của q trình peroxy hóa lipid, đã được coi là một
chất chỉ thị về tổn thương do quá trình oxy hóa. Fedina và cộng sự chứng minh