Sử dụng một số hệ IZOZYM để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (22.06 MB, 46 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

. . . Q

SỬ

DỤNG M ỘT SỐ HỆ IZOZYM B Ê NGHIÊM

• • •

cứu

ĐA DẠNG D I TRUYỂM

ỏ m ộ t

s ố LO À I CÂY DƯỢC U Ệ U

BẢN B ỊA Ỏ V IỆ T MAM

MẢ SỐ: QT - 04 -15

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: THS. HỒNG THỊ HỊA

Các cán bộ tham gia: TS. Đinh Đoàn Long
KTV. Trần Thị Nhuận
ThS. Phạm Thanh Huyền

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

BÁO CÁO TÓM TẮT
1.Tên đề tài:

SỬ DỤNG MỘT SỐ HỆ IZOZYM ĐỂ NGHIÊN c ứ u ĐA DẠNG DI TRUYỂN ở

MỘT SỐ LOAI CÂY DƯỢC LIỆU BẢN ĐỊA Ở VIỆT NAM

# Mã số: QT - 04 - 1 5

2. Chủ trì đề tài: ThS. Hoàng Thị Hoà
3. Các cán bộ tham gia: TS. Đinh Đoàn Long

KTV. Trần Thị Nhuận 
ThS. Phạm Thanh Huyền

4. Mục đích và nội dung nghiên cứu:

Mục đích:

Góp phần xác định tính đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân
loại loài và mối quan hệ di truyền giữa một số loài cây dược liệu bản địa ở
Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu:

- Chọn và thu thập mẫu (Lựa chọn một số cây dược liệu bản địa ở Việt
Nam cịn ít được nghiên cứu). Đã chọn được hai loài cây thuốc diệp hạ châu
đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diệp hạ châu (Phyllanthus

urinaria L.); thu thập mẫu tại một số vùng ở miền Bắc Việt Nam).

- Xử lý mẫu.

- Chạy điện di, nhuộm theo phương pháp phân tích hệ izozym Superoxide
dismutaza (SOD), Esteraza (EST), peroxidaza (PO), chụp ảnh mẫu.

- Phân tích số liệu.
- Viết báo cáo.

5. Các kết quả đạt được:

Vê mặt khoa học:

- Tổng quan có chọn lọc các nghiên cứu trong và ngoài nước về đối tượng
nghiên cứu và những nghiên cứu về izozym trên một số đối tượng khác.

- Kết quả cho thấy có thể sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST
và PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền và phân loại
nhanh 2 loài Phyỉlanthus amarus và Phyỉỉanthus urinaria ngay từ khi cây 
còn nhỏ (đặc biệt là hệ izozym SOD). Phát hiện quần thể Phyllanthus

urinaria L. Nội Bài - Sóc Sơn có phổ izozym SOD mang 3 băng đặc trưng

của loài Phylỉanthus amarus. Có thể đây là con lai giữa 2 lồi Phylìanthus

amarus và Phỵllơnthus urinaria L.
Sản phẩm:

- Báo cáo tổng kết đề tài

- Một phần kết quả nghiên cứu đã được công bố trong 2 bài báo khoa
học (1 bằng tiếng Việt và 1 bằng tiếng Anh).

Vê mặt đào tạo:

- Đào tạo 1 cử nhân Sinh học: Sinh viên Cao Lệ Quyên lớp Sinh K46A

với đề tài khoá luận liên quan đến nội dung đề tài QT-04-15, bảo vệ
tốt nghiệp đạt 9,5 điểm.

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

- Khả năng ứng dụng

Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học và góp phần phân loại hai loài
cây thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diệp 
hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) thu thập ở miền Bắc Việt Nam.

6. Tình hình kinh phí của đề tài:

Tổng kinh phí của để tài: 16.0Ơ0.000 VNĐ

- Chi phí nghiệp vụ chun mơn như dụng cụ, hố chất... 6,740.000 VNĐ

- Chi phí thuê mướn, thuê lao động 6.000.000 VNĐ

- Quản lý phí, hỗ trợ đào tạo và nghiên cứu khoa học 1.120.000 VNĐ

- Thanh toán điện nước 640.000 VNĐ

- Nghiệm thu để tài, in , mua tài liệu... 1.500.000 VNĐ

Đã thanh quyết toán

SUMMARY

a) The title of subject: Using some isoenzyme systems to assess the
genetic diversity of some Vietnamese native medicinal plants.

b) Numberical code: QT- 04-15

c) The g ran t holder: M.Sc. Hoang Thi Hoa
d) The Participants: Dr. Dinh Doan Long

M.Sc. Pham Thanh Huyen
Tech.. Tran Thi Nhuan

e) Objectives and contents:

* Objectives: The two native medicinal plant species Phyllanthus

amarus Schum. Et. Thonn. and Phyllanthus urinaria L. are colecting

from different areas in the north of Vietnam.

* Contents: In Vietnam, Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and

Phyllanthus urinaria L. are the two most well-known medicinal plants

among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae.
These medicinal plants have been used for centuries in the traditional
medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema, hematometra,
hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite.

Recently, numerous pharmaceutical products derived from these two plant
species, e.g. Livbilnic (Traphaco Co. Ltd), VG-5 (Central pharmaceutical
company N05), Hepaphyl (Central pharmaceutical company 25), Hepamarin,
Livsin-94 (Haphaco) etc. have been commercialized and widely used in
clinical treatment of liver ailments, including the hepatitis B infection.

In order to assess the genetic diversity of these medicinal plants and to
establish a method for rapid identification of these two plant species, we
performed the analysis of some isozyme markers: Izozym Superoxide

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

dismutaza (SOD), Izozym Esteraza (EST), Izozym Peroxidaza (PO). The
study revealed that the SOD, EST, PO isozymes profile of the two species are

obviously distinct. All collected samples of p. amarus accessions were

specified by electrophoretic markers of SOD isozyme at Rfs that are equal to
0.63; 0.71 and 0.75; EST isozyme at Rfs are 0,09; 0,42; PO isozyme at Rfs 
are 0,85; 0,87 .Whereas, these markers were absent from most of p. urinaria 
samples, except for some seemingly interspecific forms.

g) The obtained results:

In conclusion, our study indicated that the analysis of SOD, EST, PO
isozyme markers might be used as a simple and cost-effective technique for
assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two
medicinal plant species - Phyllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and

Phyllanthus urinaria L.

XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa ThS. Hoàng Thị Hoà

XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG

PHÓ HiỆb IRƯÓNB

PŨS.T

s.

dí)ù.L ^ỈẰuiL^Ối.

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

MỤC LỤC

Mở đầu... 5

Nội dung chính của đề tài... 7

TThương 1. Tổng quan tài liệ u ... 7

1. Các nghiên cứu về Phyllanthus L... 7

1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi... 7

1.2. Hình thái học, tế bào học và phân b ố ... 7

1.3. Phân bố và sinh thái ... 8

1.4. Sử dụng Phylỉanthus L. trong y học cổ truyền... 9

1.5/Thành phẩn hoá học của Phyllanthus L... ... 9

1.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Phyllanthus L... 9

1.7. Các dược phẩm được bào chế từ p. amarus và p. urinaria... 10

2. Đại cương về izozym ... ... 11

2.1. Izozym Superoxide dismutaza (SOD. E .c.1.15.1.1)... 13

2.2. Izozym Esteraza (EST. E.C.3.1.1.2) ... 14

2.3. Izozym Peroxidaza (PO. E.c. 1.1.1.17)... 14

Chương 2. Vật liệu và phương pháp... 16

2.1. Vật liệu thực v ậ t... 16

2.2. Phương pháp phân tích đa hình izozym ... 18

2.2.1. Phương pháp thu m ẫ u ... 18

2.2.2. Phương pháp nghiền m ẫ u ... 19

2.2.3. Phương pháp điện d i ... 19

2.2.4. Phương pháp phân tích kết quả nghiên c ứ u ... 19

Chương 3. Kết quả và thảo lu ậ n ... 21

3.1. Phổ điện di hệ izozym SOD c ủ a ... 21

3.2. Phổ điện di hệ izozym E S T ... 25

3.3. Phổ điện di hệ izozym P O ... 27

3.4. Quan hệ di truyền giữa các quần t h ể ... ... 31

Kết L u ậ n ... 32

Tài liệu tham k h ả o ... 33

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

MỞ ĐẨU

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và diộp hạ 
châu (Phyllanthus urinaria L.) ià hai loài cây thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ 
Ẽuphorbiaceae, phân bố tương đối rộng rãi ở Việt Nam. Hai loài cây thuốc 
này đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền ở nước ta cũng như ở 
nhiều nước khác thuộc vùng Đông và Nam Á như An độ, Malaysia, Thái 
Lan, Campuchia, Lào, Trung quốc, Inđônêsia ... Tuy vậy, cho đến nay việc 
sản xuất các dược phẩm từ hai loài p . amarus và p. urinaria L. chủ yếu dựa 
trên các dược liệu thu hái tự nhiên, trong đó phần lớn là các dạng mọc hoang 
dại, bộc lộ một số nhược điểm sau:

- Viêc thu hái khơng có quy hoạch dẫn đến nguy cơ mất đi các nguồn 
tài nguyên di truyền,

- Việc thu hái từ các dạng hoang dại không đáp ứng được yêu cầu của 
công nghiệp dược do nguồn dược liệu ban đầu thường không ổn định và 
khơng kiểm sốt được về mặt hóa học, hoạt tính sinh học.

- Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng vi sinh
vật (nấm, vi khuẩn, virút ...), vì vậy có thể mang theo các nguồn chất độc

ngoài ý muốn.

- Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiễm độc với các nguồn 
hóa chất độc khác nhau, như chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, các chất thải công

nghiệp ... nếu cây được thu hái từ các vùng bị ô nhiễm và thực tế tình hình

này rất khổ kiểm sốt.

Hình 1. Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus L. (A) và

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Ngoài ra, trong thực tế p. amarus và p. urinaria L. là hai lồi cây thuốc 
có đặc điểm hình thái rất giống nhau (xem Hình la,b) và giống với một số
loài Phyllanthus khác hiện đang có ở Việt nam, như p. niruri, p. reticulaĩus

... vốn ít được quan tâm hơn vì mục đích chế biến dược liệu. Việc phân loại

chính xác các lồi phyllanthus hiện nay chỉ có thể thực hiện nhờ các chuyên 
gia phân loại thực vật sau khi cây đã phát triển đến giai đoạn trưởng thành.
Trước thực tế như vậy, việc thu thập dược liệu tự phát từ người dân đứng
trước nhiều nguy cơ nhầm lẫn và khó có thể đảm bảo chất lượng của nguồn
dược liệu sử dụng cho sản xuất dược phẩm ở quy mô công nghiệp.

Trong hồn cảnh đó, báo cáo đề tài này của chúng tơi nhằm góp phần
cung cấp một công cụ phục vụ cho việc phân loại nhanh hai loài cây dược
liệu dẻ nhầm lẫn này. Ngoài ra, kỹ thuật này còn cho phép đánh giá mức độ
đa hình di truyền của các quần thể mẫu được thu thập từ một số địa phương 
khác nhau ở miền Bắc nước ta, là dẫn liệu cơ bản cho việc chọn lọc nguồn
nguyên liệu phục vụ công tác chọn, tạo giống các loài cây thuốc này ở Việt
Nam trong tương lai.

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam cho thấy khả năng ứng dụng các
chỉ thị phân tử (molecular fingerprintings) trong việc phân loại và định danh
nhanh các loài thảo dược ở nước ta, vốn từ trước đến nay chỉ được thực hiện
chủ yếu dựa vào các chỉ thị hình thái (là chỉ thị dễ gây nhầm lẫn trong nhiều
trường hợp) và trong một số ít trường hợp là chỉ thị hóa học.

</div>
(8)<div class='page_container' data-page=8>

NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỂ TÀI

CH Ư Ơ NG 1. T Ổ N G Q U A N T À I LIỆU 
1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỂ PH YLLAN TH U S L.

1.1.1. Phân loại học thực vật và tên gọi

Chi Phyllanthus là một trong những chi lớn nhất của họ Thầu dầu
(Euphorbiaceae), thuộc bộ Euphorbiales, phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp
Hai lá mầm (Dicotyledons). Chi này gồm 11 phân chi: Isocladus, Kirganelia,
Cicca, Emblica, Phyllanthus, Conami, Gomphidium, Phyllanthodendron,
Xylophylỉa, Botryanthus, Eriococcus (ưnander et al., 1990) và có khoảng gần
700 lồi. p. amarus và p. urinaria cùng thuộc phân chi Phyllanthus nhưng p.

amarus thuộc nhánh Phyllanthus còn p. urinaria thuộc nhánh Urinaria; trong

phân chi Phyllanthus còn có 2 nhánh khác là Lysiandra và Pentandra [25].
Trong chi Phyllanthus, nhiều loài cây trong đó có p. amarus và p.

urinaria được sử dụng làm thuốc trong y học dân tộc ở nước ta và một số nước

nhiệt đới khác trên thế giới như Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Peru,
Tanzania,... từ cách đây hàng nghìn năm. Nhưng, phải đến năm 1738 chúng
mới được Linné mô tả và đặt tên (tại Barbados). Mặc dù vậy, những tài liệu cổ
cho thấy từ lâu những loài cây này đã từng được ghi nhận và mô tả [25].

Về tên gọi, do được sử dụng rộng rãi trong nền y học dân tộc của nhiều
quốc gia từ hàng nghìn năm, nên hai loài p. amarus và p. urinaria được gọi bằng 
rất nhiều tên địa phương khác nhau, như: herbe du chagrin, petit tamarin rouge,
surette (Pháp), Chanca piedra (Peru), quebra-pedra, arranca-pedras, erva
pombinha (Braxin), pemilla del pasto (Puerto Rico), Holy Friday (Colombia),
gale of wind (Florida và Caribe thuộc Anh), Hurricane weed (Bahamas), Creole

quinine, arrebentapedra, Paraparaimè (Paraguay), Santa Maria, San Pedro, herb of
San Pablo, sampasampalkan (Philippines), zhen chu cao, ye xia zhu, Hsieh-hsia
Chu (Trung Quốc), Komikansou (Nhật Bản), Pitirishi, Budhatri (An Độ),... Đôi
khi, tại một số địa phương, các tên thường được dùng lẫn lộn để gọi tên cả hai
loài hoặc một số loài khác thuộc chi Phyllanthus [25].

ỏ Việt Nam, các cây thuốc p. amarus và p. urinaria cũng được gọi tên 
bằng những tên địa phương khác nhau, chẳng hạn như chó đẻ răng cưa, cam
kiềm, vườn kiềm, diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, rút
đất, khao ham... Và cũng giống như ở một số nước, ở nước ta các tên địa phương
đôi khi cũng được dùng lẫn lộn cho cả hai loài. Nhưng phổ biến nhất p. amarus 
được gọi là diệp hạ châu đắng hay chó đẻ chân chim, chó đẻ thân xanh, phân biệt
với P. urinaria được gọi là diệp hạ châu hay chó đẻ răng cưa [1],

1.1.2. Hình thái học, tê bào học

Các đặc điểm hình thái cơ bản của p. amarus và p. urinaria có thể mô 
tả như sau: là những cây thân thảo, sống một năm hoặc nhiều năm, cao
trung bình 20-30cm, đơi khi có thể cao đến 60-70cm; Thân nhẵn, tròn; lá

</div>
(9)<div class='page_container' data-page=9>

mọc so le, hình bầu dục, xếp sít nhau thành hai dãy, mỗi cành như một lá
kép hình lồng chim, mặt trên xanh lục nhạt, mặt dưới màu xanh mốc;
phiến lá thuôn, dài 5-15mm, rộng 3-6mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép
nguyên; gân - phụ mảnh, có 4-6 cặp; khơng có cuống lá hoặc cuống lá rất
ngắn. Hoa mọc ở nách lá, nhỏ, có cuống ngắn, đơn tính cùng gốc; hoa đực

b đầu cành, hoa cái ở cuối cành, tiểu nhụy 3, chỉ nhị dính nhau; Quả nang,

hình cầu đường kính khoảng 2mm, mọc rủ xuống ở dưới lá nên được gọi là
diêp hạ châu (nghĩa là hạt dưới lá); mỗi quả có 6 hạt hình tam giác, màu nâu

nhạt, có vân ngang. Cây thường ra hoa từ tháng 4 đến tháng 6 và ra quả từ
tháng 7 đến tháng 9 [1,7].

Ngoài những đặc điểm chung trên, hai loài p. amarus và p. urinaria 
cũng có một số điểm khác biệt về hình thái như: p. amarus thường mọc 
thẳng, thân mầu xanh, ít chia nhánh trong khi p. urinaria lại thường phân 
nhánh, thân có mầu xanh xẫm hoặc tím; cây p. amarus thường có quả nhẫn, 
khơng gai cịn quả của cây p. urinaria thường có gai; hoa của p. amarus có 5 
lá đài, cịn hoa của p. urinaria có 6 lá đài (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng 
Hộ, 1999). Tuy vậy, các đặc điểm phân biệt này thường chỉ rõ rệt khi cây đã
đạt đến giai đoạn trưởng thành (ra hoa, kết quả) và được phân loại bởi những
nhà phân loại học có kinh nghiêm. Trong thực tế quá trình thu thập và chế
biến dược liệu hiện nay, những khó khăn trong phân loại như vậy rất dễ dẫn
đến việc thu thập nhầm lẫn giữa hai lồi này [2,5].

Cho đến nay có rất ít những nghiên cứu về tế bào học của Phyllanthus

amarus và p. urinaria. Nghiên cứu của Bancilhon và cộng sự (1971) cho

thấy bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của p. amarus là 2n= 26 hoặc 2n= 52; 
Nghiên cứu của Rossignol và cộng sự (1987) lại cho thấy bộ nhiễm sắc thể
lưỡng bội của p. urinaria là 2n= 50. Một dẫn liệu khác cho rằng bộ nhiễm 
sắc thể lưỡng bội của p. amarus cũng là 2n=26, còn của p. urinaria là 
2n=14, 2n= 52, hoặc 2n= 50 tuỳ theo thứ (Phạm Hoàng Hộ, 1999). Như vậy,
có thể nói, đến nay chưa có nghiên cứu hồn chỉnh về số lượng và đặc điểm
bộ nhiễm sắc thể cơ bản của các loài Phyllanthus [5,11,17],

1.1.3. Phân bố và sinh thái

Ở Việt Nam, chi Phyllanthus L. có khoảng 40 lồi. Trong đó có hai

lồi là Phyllanthus amarus và Phylỉanthus urinaria L. có hình dáng gần 
giống nhau, mọc rải rác ở khắp mọi nơi trừ vùng cao lạnh. Trên thế giới, các
loài này cũng được phân bố rộng rãi ở Campuchia, Lào, Malaysia, Thái lan,
Trung quốc, Ấn độ, Brazil, Florida và Texas (Mỹ). Phylỉanthus L. là cây ưa 
ẩm và ưa sáng hoặc có thể hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bãi cỏ, ở
ruộng cao ( đất trổng màu), nương rẫy, vườn nhà và đôi khi ở vùng đồi. Cây
con mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè và tàn lụi
vào mua thu. Do khả năng ra hoa kết quả, nhiều hạt giống phát tán gần nên
cây mọc thành đám dày đặc, đôi khi lấn át cả cỏ dại và cây trồng khác [1],

</div>
(10)<div class='page_container' data-page=10>

1.1.4. Sử dụng Phyllanthus L. trong y học cổ truyền

Các tác dụng điều tri được biết đến rộng rãi của hai loài Phyllanthus

amarus và Phyllanthus urinaria bao gồm điều trị một số rối loạn đường tiêu

hóa (đặc biột là các bệnh lý về gan), bệnh tiểu đường, một số bệnh về thận,
đường tiết niệu, (Calixto et al., 1998). Gần đây, một số nghiên cứu lâm sàng 
và dược lý đã chứng minh dịch chiết và thành phần của hai lồi cây thuốc này
có tác dụng ức chế quá trình sao chép của virút viêm gan B và nhiều
retrovirút khác (trong đó có HIV) nhờ tác dụng ức chế hoạt động của enzym
sao chép ngược reverse transcriptaza [13,21,22].

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cho thấy các dịch chiết Phyllanthus
có hoạt tính ức chế ACE (angiotensin-converting enzym) liên quan đến một
số biến chứng của bệnh tiểu đường [24,25]

1.1.5. Thành phần hoá học của Phyllanthus L.

Các chất hố học của cây Phylanthus L. tìm thấy ở lá, thân và rễ gồm

một số chất chính như:

Lignan : phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin.

Flavonoid : phyllanthin flavonoid FG-1, phyllanthin flavonoid FG-2.
Tannin : repandusinic acid, geraniin.

Ngồi ra cịn một số thành phần hoá học như: glycoside, alkaloid,
elligitannin, phenylpropanoid, lipid, sterol, flavonol,...[12].

Hypophyllanthin Phyllanthin Niranthin

1.1.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Phyllanthus L.

Từ giữa thập niên 60, Phyỉỉanthus L. đã trở thành đề tài nghiên cứu 
hoá thực vật để xác định các phân tử hoạt động và các hoạt động dược lý của
chúng. Nguổn hoá thực vật chỉ có thể tìm thấy ở giống Phyllanthus. Nhiều
phân tử hoạt động là thuộc tính hoạt động sinh học như lignan, glycoside,
flavonoid, alkaloid, elligitannin, phenylpropanoid tìm thấy ở lá, thân và rễ
cây. Các lipid, sterol, flavonol cũng thấy phổ biến trong cây [12, 17].

Hai chất phyllanthin và hypophyllanthin được xác định là có hoạt tính
chống viêm gan [18,20].

</div>
(11)<div class='page_container' data-page=11>

1.1.7. Các dược phẩm được bào chế từ p . amarus và p . urinaria

Hiện nay, các dược phẩm dưới dạng cao của p . amarus và p. urinaria có 
mặt ở rất nhiều nước trên thế giới (Hình 3). Riêng ở nước ta, trong vài năm 
gần đây, nhiều biột dược có nguồn gốc từ p . amarus và p. urinaria được sử 
dụng rộng rãi. Trong đó, có thể kể đến Iivbilnic® (Công ty cổ phần dược

phẩm Traphaco), VG-5® (Cơng ty dược phẩm TW 5), Hepaphyl® (Cơng ty 
dược phẩm TW25), Hepamarm®, Livsin-94® (Cơng ty cổ phần dược phẩm 
Hà Tây), v.v... Hiện nay, những dược phẩm này đang được sử dụng rộng rãi 
trong việc điều trị một số bệnh lý về gan, đặc biệt là viêm gan siêu vi B 
Trong y học cổ truyền, toàn bộ cây Phylìanthus L. được rửa sạch, dùng tươi 
hay phơi khô. Dùng cây khô bằng cách như pha trà hoặc sắc thuốc uống hàng 
ngày.

Hình 2. Một số biột dược có nguồn gốc từ Phyllanthus amarus (hình A) và p. urinaria

</div>
(12)<div class='page_container' data-page=12>

Hình 3. Một số dược phẩm dang được tiêu thụ tại thị trường trong nước.

VG5® của cơng ty dược TW 5 có thành phần chính là p. amarus (A)
Livbiln® của cơng ty Traphaco có thành phần chính p. urinaria (B)

Mặc dù các loại dược phẩm nêu trên ở nước ta đang được nhiều người sử 
dụng, nhưng phần lớn các công ty dược khơng có vùng trồng ngun liệu ổn 
đinh, mà thường thu mua từ trong dân. Việc thu mua nguyên liêu một cách 
tự phát như vậy biểu lộ một số nhược điểm như sau: (1) Gây nguy cơ làm mất 
nguồn tài nguyên di truyền; (2) Khó kiểm sốt tính ổn đinh về thành phần 
hóa học và hoạt tính sinh học của dược liệu; (3) Dược liệu có mang theo các 
hợp chất hố học khơng mong muốn (chất độc, chất ơ nhiễm,.. .)■

Trong hồn cảnh đó, viộc xây dựng các vùng nguyên liệu để có thể khai 
thác ổn đinh, bển vững là điều cần thiết. Với ý nghĩa như vậy, việc sử dụng 
các chĩ thị phân tử nhằm đánh giá đa dạng các nguồn gen hiên có sẽ cung cấp 
dẫn liêu cần thiết cho việc đinh hướng, quy hoạch cơng tác chọn tạo giống và 
tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu làm thuốc từ thảo mộc.

1.2. ĐẠI CƯƠNG VỂIZOZYM

Bản chất hoá học của enzym là protein, do đó cấu trúc khơng gian của 
tồn bộ phân tử có vai trò quan trọng đối với hoạt tính sinh học xúc tác của 
enzym.

</div>
(13)<div class='page_container' data-page=13>

định. Hay nói cách khác izozym là những dạng enzym có hoạt tính xúc tác
tương tự hoặc giống nhau (cùng phản ứng hố học) nhưng có các đặc tính
hố học (độ pH tối ưu, điểm đẳng điện, chất ức chế, ...) khác nhau. Trên cơ
sở đặc điểm di truyền, có thể chia izozym làm 2 loại:

- Izozym đơn gen: là các izozym chịu sự kiểm soát của một gen, được 
hình thành từ các chuỗi polypeptít đơn, nhưng có các kiểu phân tử khác nhau
(v.d: về thành phần và trật tự các axít amin); vì vậy, có thể phân tách được
bằng điện di.

- Izozym đa gen: là các izozym được mã hoá bởi 2 hay nhiều gen, có thể 
phân biệt được bằng hoá miễn dịch hoặc dựa trên đặc tính enzym.

Các biến dạng tương ứng của izozym là allozym. Allozym là sản phẩm
của những alen khác nhau của cùng một lôcut, nó khác với izozym là sản
phẩm của những lôcut khác nhau.

Các nhà khoa học đã đánh giá được tầm quan trọng của việc nghiên
cứu izozym để phục vụ cho nhiều lĩnh vực khác nhau. Một trong số đó là các
cơng trình nghiên cứu phân loại tiến hóa của các lồi sinh vật.

Với trình độ kỹ thuật tiên tiến và sự phát triển của khoa học, ngày càng
có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình của izozym. Ban đầu là
những phương pháp đơn giản như: phương pháp pha loãng, phương pháp độ
nhớt, phương pháp làm mất hoạt tính bằng kéo dài thời gian ngồi cơ thể đến

những phương pháp sắc kỷ (chromatography), phương pháp điện di
(Electronphoresis) và phương pháp ghi hình (scanning). Trong các phương
pháp này phương pháp nghiên cứu bằng điện di trên gel polyacrylamid được
sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học, bởi nó dễ thực hiện, thời gian
thực hiện nhanh và có hiệu quả kinh tế [19].

Sử dụng phương pháp nghiên cứu phổ izozym esteraza bằng điện di
trên gel polyacrylamid theo gradien nồng độ 8-16% đã thành cơng trong việc
phân loại các lồi và dòng khác nhau của bèo hoa dâu [23].

Trong lĩnh vực di truyền và chọn giống, phương pháp điện di izozym
được coi như là biện pháp cực kỳ hữu hiệu. Đây là phương pháp thành công
để nhận biết các con lai một cách dễ dàng. Đã có nhiều cơng trình trong và
ngồi nước sử dụng một số hệ izozym để phân tích đa hình di truyền, phân
loại và nhận biết con lai ở thực vật.. .Các nhà chọn giống và di truyền học đã
sử dụng phương pháp điện di trên gel tinh bột để nghiên cứu về cấu trúc di
truyền của loài lúa Oryza sativa [' ]. Từ đó phát hiện ra 5 lơcut gen đa hình 
mã hóa cho 8 enzym đã được nghiên cứu trong số 1688 giống lúa truyền
thống ở Châu Á. Phân tích izozym của các enzym trên đã dẫn tới sự nhận
dạng của 6 nhóm lúa [4].

Sử dụng hệ thống izozym người ta đã nghiên cứu di truyền và phân loại
các loại cây an quả như táo, lê, đào, dâu tằm, vải, cam, xoài, chuối, khoai sọ

V.V. [ 1 5 , 1 9 ] .

</div>
(14)<div class='page_container' data-page=14>

Để xác định đặc điểm di truyền và hoạt tính của hệ enzym esteraza là
các enzym có liên quan đến tính kháng thuốc, người ta đã tiến hành phân tích
các izozym này để góp phần phân loại và phịng trừ muỗi, sâu tơ .. .[9].

Theo nhận xét của tác giả Trịnh Đình Đạt, người đã nghiên cứu về các
hệ izozym trong nhiều năm thì có thể phân loại muỗi, tằm, mối, sâu tơ, cá rô
phi, lươn .. .bằng phân tích hệ izozym esteraza ở các mơ và trong máu [3].

Đã có nhiều tác giả nghiên cứu về tính đa hình của izozym peroxidaza
ở thực vật và cho thấy hình thái izozym peroxidaza có nhiều biến đổi trong
quá trình sinh trưởng của sinh vật., ở các giống lúa chịu hạn tốt, hoạt tính
peroxidaza cao hơn rõ rệt so với các giống lúa không chịu hạn [6, 10].

Những nghiên cứu về izozym trong lĩnh vực y học cũng đạt được
những kết quả rất có triển vọng. Hiện nay đã xuất hiện hàng loạt các công
trình hóa sinh lâm sàng mà theo đó thì những biến đổi vể phương diện
izozym của huyết thanh bệnh nhân có thể có ỷ nghĩa trong chẩn đoán phân
biệt. Ngoài ra phương pháp nghiên cứu izozym còn được dùng để xác định
thành phần nhân chủng của một số tộc người ở Việt nam. Điểu đó góp phần
vào việc nghiên cứu các đặc trưng huyết học phục vụ cho nghiên cứu các
thông số sinh học của người Việt Nam [8].

1.2.1. Izozym Superoxide dismutaza (SOD. E .c .l.15.1.1)

Superoxide dismutaza (SOD) là enzym có mặt ở hầu hết các cơ thể
sống hiếu khí và các bào quan có sự hình thành dạng oxi hoạt động. SOD lần
đầu tiên được tách bởi Mann và Kellis vào năm 1938 và lúc bấy giờ các tác
giả này cho rằng đó là một protein có chứa kim loại đồng (Cu2+). Sau đó
người ta gọi enzym này với một số tên như: erythrocuprein,
indophenoloxidaza hay tetrazolium oxidaza. Đến năm 1969 Me Cord và
Fridovich đã phát hiện ra chức nâng xúc tác đặc biệt của enzym này và đặt
tên là superoxide dismutaza (SOD) xúc tác cho phản ứng biến đổi superoxide
(0*‘2) thành peroxide hydro (H20 2) và oxi ( 0 2) theo các phản ứng sau:

SOD-Cu + 0*2 — ► SOD-Cu1+ + 0 2
SOD-Cu1+ + 2H+— ► SOD-Cu2+ + H20 2
Phương trình tổng quát là:

SOD

0*2 + 0*2 + 2H+ --- * 0 2 + H20 2

Như vậy SOD có vai trị là trung tâm trong việc triệt tiêu gốc
superoxide được tạo ra bởi q trình oxi hố.

Về mặt di truyền thì tất cả các enzym SOD đều được mã hoá trong
nhân và chuyển đến cơ quan đích nhờ trình tự tín hiệu dân đường .

</div>
(15)<div class='page_container' data-page=15>

v ề mặt phân loại các enzym SOD đều cẩn có các ion kim loại cho hoạt

động xúc tác của chúng và dựa trên thành phần cofactor kim loại mà người ta
chia SOD thành các dạng khác nhau bao gồm:

- Các SOD chứa Mangan (MnSOD)

MnSOD là một nhóm enzym được tách ra từ ty thể hệ thống oxi hoá
photphoryl hoá của tế bào nhân chuẩn (eukaryote) hay từ các tê bào nhân sơ
(procaryote) và ở tế bào chất của Staphylococcus xỵlosus.

MnSOD ơ các sinh vật nhân sơ hầu hết có dang dimer với mỗi
monomer có chứa 1 ion Mn2+. Các hợp chất hữu cơ đóng vai trị làm khung
bao lấy ion Mn2+ ở giữa .

- Các SOD chứa sắt (FeSOD)

Martin và cộng sự cho thấy rằng FeSOD ở tế bào vi khuẩn s. mutans 
OMZ176 là một holoenzym có khối lượng vào khoảng 43000 Da và mỗi
phẩn dưới đơn vị có khối lượng 20700 Da. Và cũng theo các tác giả này thì
trật tự axit amin của enzym này có đặc điểm giống với trật tự axit amin của
MnSOD cùng tìm thấy trong vi khuẩn đó.

- Các SOD chứa đồng và kẽm (Cu/ZnSOD)

Cu/ZnSOD lần đầu tiên được phát hiện ở Photobacter và sau đó được 
phát hiện ra ở hầu hết các vi khuẩn nhân sơ như Brucella abortus, Legionella

sp, E. coli, Neisseria meningitidis và một số đại diện của chi Haemophilus, 
Actinobaccilus và Pasteureỉìa, Salmonella. Gen mã hoá và cấu trúc của

enzym này đã được xác định.

Cu/ZnSOD là một enzym có cấu trúc đặc biệt điển hình, dạng dimer có
khối lượng phân tử khoảng 32 kDa [19].

1.2.2. Izozym Esteraza (EST. E.c.3.1.1.2)

Esteraza (EST) là một nhóm các izozym khơng cùng nguồn gốc, ít
biểu hiện chuyên hóa chất, song tất cả esteraza có một đặc tính chung nhất là
phá hủy liên kết este của axit cacbonic trong các chất phát sinh từ naphthol,
indoxil và methylum billphrin. Izozym esteraza thuộc lớp hydrolaza xúc tác
cho phản ứng phân giải và tổ hợp các este theo sơ đổ sau:

ROORj + HOH * * RCOOH + R,OH.

Năm 1957- 1961 ủy ban về enzym của Hội Hóa sinh quốc tế đã soạn
thảo sự phân loại thống nhất và danh pháp của các enzym. Qua đó các enzym
được phân ra làm 6 nhóm , mỗi nhóm chia thành các phân nhóm , dưới phân
nhóm và tiểu phân nhóm. Esteraza được xếp vào nhóm 3, phân nhóm thứ 1 và
tiểu phàn nhóm thứ 1.

Ở thực vật đã được chứng minh là có 3 nhóm esteraza: Arylesteraza
(A), Aliesteraza (B) và Cholinesteraza (C). Các A.esteraza thủy phân este
thơm nhanh hơn mạch thẳng, trong khi đó B.esteraza thủy phân những este

</div>
(16)<div class='page_container' data-page=16>

mạch thẳng nhanh hơn nhóm A.esteraza . c.esteraza có tác dụng mạnh nhất
đối với cholineste và cũng có thể thủy phân este mạch thẳng và este thơm
nhưng không dẽ dàng bằng 2 nhóm kia [19].

ị.2.3. Izozym Peroxidaza (PO. E .c .l. 1.1.17)

Izozym peroxidaza thuộc lớp enzym oxi hóa khử , chúng có khả năng
oxi hóa các hợp chất thơm khi có mặt H20 2. Peroxidaza có thể giết chết các
vi sinh vật và phá hủy các chất hóa học khi có mặt H20 2, phenol, alcohol.
Đây là loại izozym độc cho các tế bào động vật và thực vật. Các izozym
peroxidaza khác nhau được tìm thấy trong các mơ khác nhau. Các peroxidaza
thực vật có tính đặc hiệu cơ chất rộng rãi. Trong nghiên cứu peroxidaza cây
cải ngựa (HRP) ( Maehly, 1960) cho thấy cơ chế tác dụng peroxidaza gồm
có 3 giai đoạn:

Izozym peroxidaza được chia làm hai nhóm chính: nhóm axit và nhóm
kiềm. Bằng phương pháp điện di và sắc ký trên đối tượng lúa mạch người ta
thấy phần lớn các dạng peroxidaza nằm trong nhóm kiềm, cịn các dạng
thuộc nhóm axit chiếm một tỷ lệ rất thấp [19].

HRP + H2Oz

Complex I + AH
Complex II + AH
Phương trình tổng quát là:

H20 2

Complex I
Complex II + A

HRP + A + 2H ,0

</div>
(17)<div class='page_container' data-page=17>

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU THỰC VẬT

Hai loài cây thuốc diộp hạ châu đắng (Phylỉanthus amarus Schum. et. 
Thơnn.) và diệp hạ châu 0Phyllanthus urinaria L.) điển hình là đối tượng sử 
dụng trong nghiên cứu của chúng tôi.

n

Phyỉlanthus amaru 
Phyỉlanthus urinaria L.

</div>
(18)<div class='page_container' data-page=18>

Bảng 1. Danh sách và địa điểm thu thập các mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus và p. urinaria

STT Ký hiệu

mẫu

Địa điểm thu mẫu Thời gian 
thu mẫu'
Loài

Xã, huyện Tỉnh/Thành
phố
1

Ahk Phyllanthus

amarus Hoàn Kiếm

Đợt 1

2 U-rx P. urinaria Thanh Xuân Đơt 1

3 UTO P. urinaria Trâu Ọuỳ, Gia Lâm Đơt 1

4

a nt Phyllanthus

amarus

Ngọc Trục, Từ
Liêm

Đợt 1

5

Abđ Phyllanthus

amarus Ba Đình

Đợt 4

6 Urb P. urinaria Đơt 1

7

a nb

Phyllanthus

amarus Nơi Bài, Sóc Sơn

Đợt 3

8 _ Unb P. urinaria Đơt 3

9

Ađa Phyỉlanthus

amarus Thị trấn Đông Anh

Đợt 3

10 UữA p. urinơria Đơt 3

11

Acl Phyllanthus

amarus Cổ Loa, Đông Anh

Hà Nội Đợt 3

12 UcL P. urinaria Đơt 3

13

^HB Phyllanthusamarus Hải Bối, Đông Anh Đợt 3

14 Uh b P. urinaria Đơt 3

15

Apj Phylỉanthus

amarus Phú Thị, Gia Lâm

Đợt 3

16 UpT P. urinaria Đơt 1

17 UpL P. urinaria Phủ Lỗ, Sóc Son Đơt 3

18

Ath Phyỉlanthus

amarus Tây Hồ

Đợt 4
19

^ĐD Phyllanthusamarus Đống Đa Đợt 4

20

^NH Phyỉlanthusamarus Ngũ Hiêp, Thanh Trì Đợt 4

21 Phyỉlanthus

amarus Mao Điền, cẩm

Đợt 2

22 U\1Đ P. urinaria Đơt 2

23

^HD Phyllanthusamarus Thành phố Hải
Dương

Hải Dương Đợt 2

24 Uhd P. urinaria Đợt 2

25 U rK P. urinaria Tứ K ỳ Đ ợt 2

1 Đợt 1: ngày 7-8/12/2004; Đợt 2: ngày 2-3/3/2005; Đợt 3: ngày 7-8/3/2005; Đợt 4: ngày
24-29/3/2005.

</div>
(19)<div class='page_container' data-page=19>

Ký hiệu 
mẫu

Đia điểm thu mẫu Thời gian 
thu mẩu'

STT Loài

Xã, huyện Tỉnh/Thành
phố
26

Avy

Phyllanthus

amarus Viêt Yên

Đợt 2

27 Uvv P. urinaria Đơt 2

28

Aln

Phyllanthus

amarus Lục Ngạn

Bắc Giang Đợt 2

29

Asđ Phyllanthus

amarus Sơn Đông

Đợt 2

30 Uyr P. urinaria Thuân Thành Bắc Ninh Đợt 3

31

UvL P. urinaria Nghĩa Trai, Văn Lâm Hưng Yên Đợt 4

32 UphL P. urinaria Phú Lãm, Hà Đông

Hà Tây Đợt 1

33 Ujijf P. urinaria Thường Tín Đợt 4

34 Uls P. urinaria Lương Sơn Hồ Bình Đợt 4

35

Ayđ Phyllanthus

amarus n Định Thanh Hóa

Đợt 4

36 UTĐ P. urinaria Tam Đảo Vĩnh Phúc Đợt 4

Để thu thập nguyên liệu, chúng tôi tiến hành bốn đợt điều tra xác định
vị trí phân bố tự nhiên của các quần thể hai loài p. amarus và p. urinaria à 
một SỐ địa phương thuộc miền Bắc. Cụ thể, đợt 1 được tiến hành trong các
ngày 7-8/12/2004, tại Hà Nội, Hà Tây, đợt 2 trong các ngày 2-3/3/2005, tại
Bắc Giang, Hải Dương, đợt 3 trong các ngày 7-8/3/2005 tại ngoại thành Hà
Nội và đợt 4 từ ngày 24/3 đến ngày 29/3/2005 tại Hà Nội, Hưng Yên, Hà tây,
Hồ Bình và Vĩnh Phúc. Từ các mẫu thu được, dựa vào khố phân loại hình
thái, chúng tơi chọn ra 36 mẫu có các đặc điểm hình thái tương đối điển hình
của hai lồi cây thuốc được quan tâm nghiên cứu, trong đó 17 mâu thuộc loài

Phyllanthus amarus (được ký hiệu là A) và 19 mẫu thuộc loài Phyllanthus 
urinaria (được ký hiệu là U).Danh sách, địa điểm và thời gian thu thập các

mẫu được nêu chi tiết trên Hình 4 và Bảng 1.

2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH IZOZYM

Phương pháp phân tích đa hình izozym được thực hiện theo qui trình
của Tanksley s. D. và Orton T. J. (1983)[19] kết hợp với Zimmerman w . J.

(1989)[ 23] có cải tiến, với các bước thực hiện chính như sau:

2.2.1. Phương pháp thu mẫu

Để việc thu mẫu tương đối đổng nhất, tại mỗi địa điểm chúng tồi đều
chọn những cây có kích thước vừa phải, sinh trưởng và phát triển tốt. Sau đó
chung tôi đào cây lấy cả phần đất, cho vào túi ni lơng có sẵn giấy báo thấm
nước buộc êtiket vào cây, bảo quản và đưa vào về phòng thí nghiệm sao cho
cây vẫn tươi.

</div>
(20)<div class='page_container' data-page=20>

2.2.2. Phương pháp nghiền mẫu

Chúng tôi chọn và cắt những cành lá non, rửa sạch bằng nước cất, thấm
khô, cân 500 mg mẫu và chuyển vào cối sứ,bổ sung 500|il đệm và nghiền
cho đến khi thu được dung dịch huyền phù đồng nhất (quá trình nghiền được
giữ trong đá lạnh). Thu lấy dịch đổng nhất và chuyển vào ống eppendorf Ly
tâm lạnh (4°C) ở 14000 vòng/phút trong vòng 15 phút. Thu phần dịch phía
trên để tiến hành phân tích điện di các hệ izozym.

2.2.3. Phương pháp điện di

Bản chất hoá học của enzym là protein, do các alen khác nhau qui
định, nên cấu trúc bậc một của các protein enzym là khác nhau, vì thế hình
thành nên các enzym khác nhau về trọng lượng và kích thước phân tử.

Enzym là chất đa điện ly, vì vậy ở trạng thái dung dịch nó phân cực vẻ
điện tích. Trong điện trường của dòng điện một chiều, các phân tử trong hỗn
hợp protein sẽ chuyển động về phía catot (-) hoặc anot (+) theo tốc độ khác
nhau. Do vậy trên bản gel, các phân tử protein có kích thước khác nhau sẽ
nằm ở vị trí khác nhau sau khi chạy điện di.

Sự khác nhau giữa các băng điện di của các izozym được dùng để so
sánh, đánh giá sự khác nhau về bản chất di truyền của các loài. Sự khác nhau
càng ít thì quan hệ họ giữa chúng càng gần và ngược lại.

Sử dụng gel polyacrylamid 2 lớp cho việc nghiên cứu: gel cơ có nồng
độ 4% polyacrylamid và gel tách có nồng độ 12% polyacrylamid .

Chúng tôi tiến hành điện di trên máy điện di Mini - ProteanR3(Biorad,
Mỹ). Kích thước bản gel 10 X 10 cm, cường độ dòng điện 120vol, hiệu điện
thế 40mA, nhiệt độ 5nc , thời gian 2h->3h cho đến khi vạch mầu chuẩn cách
đáy bản gel khoảng lcm. Sau khi điện di xong, gel được lấy ra khỏi khuôn và
tiến hành nhuộm.

Sau khi điện di đại đa số protein là khơng có mầu (trừ Hemoglobin), vì
vây ta phải tiến hành nhuộm để biết vị trí của protein sau khi chạy điện di,
đoi với mỗi loại prôtein có cơ chất chất xúc tác và thuốc nhuộm khác nhau.
Phương pháp phân tích hệ izozym SOD bằng phản ứng nhuộm màu với NBT
và Riboflavin. Phân tích hệ izozym esteraza bằng phản ứng nhuộm màu với
hỗn hợp 2 cơ chất oc-Naphthyl acetat, p-Naphthyl acetat với thuốc nhuộm
Fast Garnet và Fast blue RR salt. Phân tích hệ izozym PO bằng phản ứng
nhuộm màu của. bcnzidin trong A.accticl0% va được xac định tren đọ nhạy
earn với H 2o j[ 19,23].

2.2.4. Phương pháp phân tích kết quả nghiên cứu

Phương pháp tính Rf: Tính đa hình hệ izozym của các mẫu quần thể thuộc

hai loai p amarus và p. urinaria biểu hiện thông qua sự khác biệt về thành 
phần và tốc độ di chuyển tương đối (Rf) của các băng điện di trên bản gel

phan tích. Để phân biẹt các băng đa hình, độ di chuyển tương đối Rf được

</div>
(21)<div class='page_container' data-page=21>

xác định bằng tỷ lộ khoảng cách từ đầu gel tách đến vị trí báng điện di so với
chiều dài gel tách [16].

R f = -

x: Khoảng cách từ đầu gel tách đến vị trí băng điện di
1: Khoảng cách từ đầu gel tách đến vạch kết thúc điện di.

Phương pháp tính khoảng cách di truyền dựa trên dấu chuẩn izozym:

Các băng đa hình được ghi nhận dựa trên sự có mặt hoặc vắng mặt của
chúng. Các số liệu được thu thập và xử lý bằng chương trình NTSYSpc 2.02h
(Rohlf F.J, 1993) để xác định hệ số tương đồng di truyền và xây dựng sơ đồ
hình cây quan hộ di truyền giữa các mẫu quần thể thu được.

</div>
(22)<div class='page_container' data-page=22>

C H Ư Ơ N G III. K Ế T Q UẢ VÀ T H Ả O LU ẬN

3.1. Phổ điện di hệ izozym SOD của các mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria thu thập ở một số địa điểm

tại miền Bắc Việt Nam.

Kết quả phân tích các băng điện di hệ izozym SOD của các mẫu quần thể

p. amarus và p. urinaria được thu thập ở các địa điểm khác nhau trong cả 4

đợt thu mẫu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về kiểu hình hệ izozym SOD giữa
hai lồi cây thuốc này. Mặc dù câc mẫu của hai loài được thu thập từ các địa
phương cách biệt về mặt địa lý và vào các thời điểm khác nhau (từ tháng
12/2004 đến tháng 3/2005), nhưng nhìn chung phổ điện di của các quần thể
trong phạm vi lồi'có tính đổng hình cao, đặc biột là đối với các quần thể của
loài p. amarus. Trong nghiên cứu này tất cả các mẫu quấn thể của loài p.

amarus (ký hiệu là A) đều cho phổ điện di phổ izozym SOD rõ nét, trong khi

các mẫu quần thể của loài p. urinaria (ký hiệu là U) chỉ cho các băng mờ 
hoặc không phát hiện thấy băng điện di.

Rf

0,22
0,40
0,43
0,52
0,60
0,63
0,67
0,71
0,75

Hình 5: Phổ điện di hệ izozym SOD cùa các mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu

là A) và Phylỉanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ờ một số địa điểm tại miền Băc Việt Nam

Khi phân tích 17 mẫu của lồi p. amarus ( Hình 5,6,7,8) chúng tôi thu 
đươc tổng cộng 9 băng đa hình khác nhau tương ứng với các giá trị Rf là

0 22; 0,40; 0,43; 0,52; 0,60; 0,63; 0,67; 0,71; và 0,75. Trong số đó, đáng chu
y hơn cả là có ba băng đồng hình rõ nét xuất hiện ở tất cả 17 mẫu quần thể
cua loài p. amarus (Rf= 0?63; Rf= 0,71 và Rf= 0,75). Trong khi đó, việc

</div>
(23)<div class='page_container' data-page=23>

phân tích 19 mẫu quẩn thể của loài p. urinaria chỉ thấy xuất hiện băng điên 
di ở 4/19 mẫu (chiếm « 20%) đó là các mẫu UVY (Hình 6), lim (Hình 7),

U ThT> và ƯL5 (Hình 8) vói tổng sổ 5 băng đa hình (Rf = 0,45; Rf = 0,48- Rf =

0,63; Rf = 0;71 và Rf = 0,75). Đối với 15/19 mẫu p. urinaria cịn lại khơng 
quan sát thấy băng điện di. Một điểm dáng chú ý nữa là trong số 4 mẫu kể 
trên ( đặc biệt rõ đối với hai mẫu UVY và UNB), băng điện di chỉ xuất hiên ở 
cac VỊ tn Rf là 0,63; 0,71 và 0,75, như vậy giống với các băng đổng hình rõ 
nét của các quần thể loài p. amarus. Nhưng có một sự khác biệt la đối với 
các mẫu P. urinaria này, các băng điện di chỉ biểu hiện mờ với cường độ ánh 
sang băng 1/2 so với các mâu p. amarus. Ngoài ra, khi quan sát rhực tế 
chúng tôi thấy hại mẫu UVY và UNB được thu thập từ các khu vực có sự phân 
bố của cả hai loài p . amarus và p. urinaria trong phạm vi hẹp. Điều đó dần 
chụng tơi đến một giả thiết rằng: có thể các mẫu Uvy và UNB là “con lai” giữa 
hại loài p. amạrus và p . urinaria, mặc dù về hình thái chúng mang đặc điểm 
giống với lồi p. urianaria (vì vậy được xếp vào nhóm U). đây la một hiện 
tượng đáng quan tâm, chưa từng được ghi nhận trong các nghiên cứu phân 
loại các loài Phyllanthus. Mặc dù trước đây đã có một số báo cáo cho thây có 
sự tồn tại của các dạng trung gian về hình thái giữa các loài thuộc chi 
Phyllanthus (Taylor, 2003) [20].

Rf

0,40
0,43

0.52
0,63
0,67
0,71
0,75

Hình 6: Phổ điện di hệ izozym SOD của các mẫu quần thể hai loài phylỉanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một sô địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

</div>
(24)<div class='page_container' data-page=24>

^illì ^Cl ^I)A ^\B ^NB ^ r r UphL ƯĐA UCL ƯI1B

Rf

0,60

0,63

0 71

075

Hình 7: Phổ điện di hệ izozym SOD của các mảu quẩn thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phyỉỉanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

0,63
0,67
0 71
0 7 5

Hình 8 ' Phổ điện di hệ izozym SOD của các mâu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

</div>
(25)<div class='page_container' data-page=25>

R f ^liK ^Vt ^CL ^ĐA ^NB ^TH A BĐ ANH

0,22

•
0,40

0,60
0,63
0,71
0,75

H ình 9: Phổ điện di hê izozym SOD cùa các mẫu quần thể loài Phyllanthus 
A) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

amarus (ký hiệu là

R f ư p L Ư TQ U NB U M U nA U HB ư c, u r r ư-nc M

0,63
0,71

0,75

Hình lơ: Phổ điện di hẹ izozym SOD của các mẫu quần thể loài Phyllanthus urinaria (ký hiệu
là U) thu thập ở một sô' địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

</div>
(26)<div class='page_container' data-page=26>

3.2. Phổ điện di hệ izozym EST của các mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria thu thập ở một sô địa điểm

tại miền Bắc Việt Nam.

Trên hình 11, 12, 13, 14 là phổ điện di izozym EST của các mẫu quần thể

hai loài Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria thu thập ở một số địa 
điểm tại miền Bắc Việt Nam (36 mẫu).Tương tự như phổ điện di izozym

SOD, ở đây chúng tôi cũng thấy sự khác biệt rõ rệt về kiểu hình hộ izozym
EST giữa hai loài cây thuốc này. Trong số 17 mẫu của loài p. amarus, khi 
phân tích chúng tơi nhận được phổ điện di đều cho các băng đa hình. Chúng
tơi đã thu được 6 băng đa hình khác nhau với các giá trị Rf= 0,09; 0,24; 0,27;
0,42; 0,58 và 0,71. Trong số đó có 2 băng đồng hình xuất hiện ở tất cả 17
mẫu quẩn thể của loài p. amarus (Rf= 0,09; 0,42; xem hình). Trong khi đó 
thì 16/19 mẫu của quần thể lồi p. urinaria không thấy xuất hiện băng điện 
di. Chỉ có 3/19 mẫu có thấy xuất hiện băng, đó là các mẫu U-ThT , ƯLS và UNB
với tống số 5 băng đa hình (Rf= 0,09; 0,38; 0,42; 0,63 và Rf= 0,71) [Xem
hình 12, 13].

R f Á NT AHK Apt u pr U„hL U BD U TQ Urx

0,09 K g l

0,27 l U f l f
0,42 |||||i

0,58 111111
0,71 lm s m

Hình 11: Phổ điện di hệ izozym EST của các mảu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu

ià A) và Phyỉlanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một sô' địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

</div>
(27)<div class='page_container' data-page=27>

I IB ^ C L ^ Đ A N B N B ^ T T U p h L ^ Đ A ^ C L ^ H B

R f

0,09
0,24

0,42

0,58 
0,71

Hình 12: Phổ điên di hê izozym EST của các mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

R f

0,09
0,24

0,42
0,58
0,71

M A

bđ

A

th

A

nh

A

đa

A

yđ

U

tđ

UThT ƯLS u v

0,38

0,63

Hình 13: Phổ điện di hệ izozym EST của các mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu
là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bấc Việt Nam

</div>
(28)<div class='page_container' data-page=28>

^ ^Mũ ^HD ^VY ^LN -^SĐ U yy UyK U HD U MD

R f
0,09
0,24
0,42
0,58

0,71

H ình 14: Phổ điện di hê izozym EST của các mẫu quần thể hai Loài Phyllanthus amarus (ký hiệu 
là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ỏ một sô' địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

Trong đó hai quần thể ư-rh-r , ULS (Hình 13) chỉ có 2 băng điện di có Rf=
0,38; Rf= 0,63 (không trùng với Rf của các quần thể p.amarus). Riêng quần 
thể P. urinaria Nội Bài UNB (Hình 12) băng điện di chỉ xuất hiện ở các vị trí 
Rf= 0,09; 0,42; 0,71 giống như vị trí các băng chung của các quần thể p.

amarus nhưng mờ và mảnh hơn . Kết quả này cũng phù hợp với kết quả

phân tích hệ izozym SOD ở phần (3.1.), càng củng cố thêm về giả thiết “con
lai” giữa hai loài p.amarus và p. urinaria mà chúng tôi đã để cập ở trên.

3.3. Phổ điện di hệ izozym PO của các mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria thu thập ở một số địa điểm

tại miền Bắc Việt Nam

Dựa vào kết quả phổ điện di izozym PO từ hình 15 đến hình 18 chúng tơi
cũng thấy 17 mẫu của loài p. amarus đều xuất hiện băng. Chúng tôi cũng thu 
được tổng cộng 6 băng đa hình khác nhau với các giá trị Rf= 0,29; Rf= 0,60;
Rf= 0 64; Rf= 0,69 ; Rf= 0,85 và Rf= 0,87. Trong số đó, có 2 băng đổng hình
xuất hiện ở tất cả 17 mẫu quần thể của loài p. amarus (Rf= 0,85 và Rf= 0,87). 
Trong khi đó, kết quả phân tích 19 mẫu quần thể của loài p. urinaria chỉ thấy 
xuất hiên băng điện di ở 6 quần thể, đó là các quần thê ƯĐA,UHe , UphL (Hình
15), UXĐ ,ƯLS và U-n,T (Hình 16), vói tổng số 3 băng đa hình (Rf= 0,68; 0,74 và
0 79). Cả 6 quần thể p. urinaria này đều có 1 băng chung ở vị trí Rf= 0,74. 
Cịn lại 13/19 mẫu p. urinaria không quan sát thấy băng điện di.

</div>
(29)<div class='page_container' data-page=29>

R f

0 ,6 0
0 ,6 4
0,6 9

0,85
0,8 7

Hình 15: Phổ điện di hẹ izozym PO của các mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu 
là A) và Phylỉanthus urinaria (ký hiệu là ư) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

0,85
0,87

H ình 16: Phổ điện di hệ izozym PO của các mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu

là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ở một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

</div>
(30)<div class='page_container' data-page=30>

Hình 17: Phổ điện di hệ izozym PO của các mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu

là A) và Phyllanthus urinaria (ký hiệu là U) thu thập ờ một số địa điểm tại miền Bắc Việt Nam

Để kiểm tra lại, chúng tôi tiến hành điện di lại cả 17 mẫu của loài p.

amarus và 19 mẫu của loài p. urinaria ở cả 4 đợt thu mẫu và nhuộm với cả 3

hệ izozym SOD, EST và PO thì kết quả thu được vẫn khơng thay đổi (xem
hình 9, 10).

3.4. Quan hệ di truyền giữa các quần thể hai loài Phyllanthus amarus và

Phyllanthus urinaria dựa trên các dấu chuẩn izozym SOD, EST và PO

Trong 3 hệ izozym SOD, EST và PO trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận
thấy hệ izozym SOD cho độ đa dạng hơn.

Dựa trên các băng đồng hình và đa hình khi phân tích hệ izozym SOD từ
17 mẫu quần thể của loài p. amarus và 19 mẫu quần thể của loài loài p.

urianarỉa, chúng tôi đã xác đinh đợc hệ số đồng dạng di truyền và xây dựng

đợc cây quan hệ di truyền giữa các quần thể thập đợc của hai loài p. amarus 
vắ P. urinaria bằng việc sử dụng phần mềm NTSys 2.02h. Kết quả được 
trình bày trên hình 18.

Từ kết quả phân tích, có thể chia các quần thể hai loài p. amarus và p.

urinaria được sử dụng trong nghiên cứu này làm 3 nhóm chính. Nhóm thứ

nhất bao gổm toàn bộ 17 quần thẽ p. ứtìĩãrus VỚI hộ sô tơng đong di truyen 
dao động trong khoảng từ 0,63 đến 1,00. Nhóm thứ hai gồm 14 quần thể p.

</div>
(31)<div class='page_container' data-page=31>

UMĐ> UHD, Ujk, UVL, U-JT, UpL) có hệ số tương đồng di truyền là 1,00 (do hồn
tồn khơng xuất hiện các băng điện di hệ izozym SOD). Nhóm cịn lại có thể
là hệ trung gian của hai nhóm trên gồm các quần thể UVY, ƯNB, U^T, và ULS.

H h

- 5

I I I I I 1 11 » I » I--- Ị ~

0,25 0,50 0,75

Hệ số tương đồng di truyền

Am
A«K
Apt
A*tĐ
Ahd
Avy
Aln
Asđ
AtìĐ
Ath

Ađđ
A*H
Ayđ
A+hb
Acl
Aoa
Anb
■ U N0

I UĩhT

IịỊls

■ UvY 
U p t
UphL

Ubđ
UvL

U t q
U t x
U t k

Uhd
Umđ

U t t
U p l
U đ a

Ucl
Uhb
Utđ
"“ I
1,00
1—
0,00

Hình 2. Sơ đồ quan hệ df truyèn cùa 36 quần thẻ m ẫu thuộc hai loài p. am arus và p. urinaria được xác 
bằng kỹ thuật phân tích chì thị izozym SOD (địa điềm thu thập các mẫu được nêu trên Bảng 1)

đính

</div>
(32)<div class='page_container' data-page=32>

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ các kết nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD, EST và PO để góp phần
phân loại hai loài cây thuốc Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.và

Phyllanthus urinaria L. ngay từ khi cây còn nhỏ (đặc biệt là hệ izozym

SOD).

2. Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng của các quần thể loài p.

amarus trong nghiên cứu này có Rf= 0,63; Rf= 0,71 và Rf= 0,75.

3. Các băng điện di phổ izozym EST đặc trưng riêng của các quần thể lồi p.

amarus có Rf=0,09 và Rf=0,42.

ằ . Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng của các quần thể loài p. 
amarus có Rf= 0,85 và Rf= 0,87.

j C Phát hiện quần thể p.urinaria Nội Bài ,Sóc Sơn (UNB) có phổ điện di 
izozym SOD, EST mang các băng đặc trưng của lồi p. amarus. Có thể đây 
là con lai giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria.

ế . Có thể sử dụng các hệ izozym SOD, EST và PO để đánh giá mức độ đa

dạng và khoảng cách di truyền giữa 2 loài p. amarus và p. urinaria thu thập 
ở miền Bắc Việt Nam, trong đó hệ izozym SOD cho độ đa dạng hơn.

ĐỀ NGHỊ

1. Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên
cứu đa dạng di truyền các loài Phyllanthus spp. và các đối tượng khác, nhằm
góp phần vào việc phân loại và kiểm định dược liệu.

2. Có những nghiên cứu sâu hơn vể quần thể Phyllanthus urinaria L. Nội 
Bài, Sóc Sơn để khẳng định xem đây có đúng là con lai giữa 2 lồi hay
khơng?

</div>
(33)<div class='page_container' data-page=33>

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đỗ Huy Bích và cs.(1999), Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam,

tập II, Tr. 438, Nxb Khoa học kỹ thuật; Hà Nội.

2. Võ Vãn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội.
3. Trịnh Đình Đạt và cs. (1999), “Một số hệ isozym của các dịng cá rơ phi -
oreochromis niloticus nuôi ở Việt Nam”, Tạp chí sinh học, (23,3a),tr 167-

169.

4. Hoàng Thị Hoà, Đinh Đoàn Long, Nguyễn Thị Biên, Trần Thị Nhuận
(2004), “Xác định các dòng lúa lai bằng việc sử dụng hệ izozym esteraza”,

Tạp chí khoa học ĐHQGHN, T. XX, số 2PT.

5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Thành phố Hổ Chí 
Minh.

6. Nguyễn Như Khanh, Võ Minh Thứ (1995), “Tính đa hình izozym
peroxidaza và esteraza của một số giống lúa chịu hạn và mặn”. Di Truyền

Học và ứng dụng, số 3. tr 27-32.

7. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nơm, Nxb Y học, Hà 
Nội.

8. Chu Văn Mẫn, Trịnh Đình Đạt (1992), “ Tính đa dạng của các hệ isozyme
ở người Việt Nam ”, Di Truyền Học và ứng dụng, số 1, tr. 11-14.

9. Đỗ Lê Thăng, Trịnh Đình Đạt (2001), “Hệ isozyme esterase của sâu tơ
(plutella xylo Stella) kháng thuốc diệt”, Di Truyền Học và ứng dụng, số 4, tr. 
27-30.

10. Allbert L. and Andrew u . s (1968), “Isoenzyme in biology and
medicine”, Academic press, London.

11. Bancilhon, L. (1971) “Contribution a' rétude taxonomique de genre

Phyllanthus (Euphorbiacees).” Boissiera 18, 9-81; 22 plates.

12. Calixto J.B., Santos A.R., Cechinel F.V., Yunes R.A. (1998), A review of
the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and
therapeutic potential. M ed Res Rev, 18(4): 225 - 258.

13. Chan H.L., Sung J.J., Fong W.F., Chim A.M., Yung p.p., Hui A.Y., Fung
K.p. Leung p .c. (2003), Double-blinded placebo-controlled study of p.

urinaris for the treatment of chronic hepatitis B. Ailment Pharmacol. Ther.

18: 339 - 345.

14. Glaszmann J. c (1987), “Isozyme and classification of Asian rice
varieties”, Theor Appl. Genet, 74, pp. 21-30.

</div>
(34)<div class='page_container' data-page=34>

15. Nguyen V. X, Yoshino H., Tahara M. (1998), “Genetic control of four 
enzymes indiphoid Tarro, colocasis eskulenta (L.) schott”, Breeding Science 
48, pp. 273-280.

16. Rohlf F.J.(1993), NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable

analysis system version 1.80. Exeter software. Applied Biostatistics Ins.,

New York.

17. Rossignol L., Rossignol M., Haicour R. (1987), “A systematic revision
and Phyllanthus Subsection Urinaria (Euphorbiaceae).” American journal

and Botany, 74, 12, December, 1853-1862.

18. Syamasundar, K.V., Singh, B., Thakur, R.S., Husain, A., Kiso, Y., and
Hikino, H. (1985), “Antihepatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs.”

Journal o f Ethnopharmacology 14, 41-44.

19. Tanksley S.D. and Orton T.J. (1983), Isozymes in plant genetics and

breeding. Elsevier Science Publ., Amsterdam.

20. Taylor L. (2003), Chanca piedra “stone breaker" (Phyllanthus niruri). 
Sage Press Inc.

21. Thyagarajan S.P., Subramanian s., Thirunalasundari T., Venkateswaran
P.S., Blumberg B.s. (1988), Effect of Phyllanthus amarus on chronic carriers 
of hepatitis B virus. Lancet, 2 (8614): 764 -766.

22. Venkateswaran P.S., Millman I., and Blumberg B.s. (1987), Effects of an
extract from p. niruri on hepatitis and woodchuck hepatitis viruses: invivo 
and invitro studies. Proceedings o f National Academy o f Science USA, 84: 
2 7 4 -2 7 8 .

23. Zimmerman W.S., Lumpkin T.A., Watanable I. (1989), Isozyme
differentiation of Azolla. Euphytica 42: 163 - 170.

24.ưeno H. and et al (1988), “ Chemical and pharmaceutical studies on
medicinal plants in Paraguay. Geraniin, an angiotensin-converting enzyme
inhibitor from ‘paraparai m i,’ Phyllanthus mruri.”, J. Nat. Prod, 51(2), pp. 
357-59.

25. Unander W.D., Webster L. G., Blumberg s. B., (1990), “Records of
usage or assays in Phyllanthus (Euphorbiaceae) I. Subgenus Jsocladus,

Kirganelia, Cicca and E m b lica Jo u rn a l o f Ethopharmacology 30, 233-246.

</div>
(35)<div class='page_container' data-page=35>

Bộ Khoa h ọc và Công nghệ 
HỘI ĐỔNG KHOA HỌC T ự NHIÊN

N gành Khoa học Sự sống

NHữNG VẤN ĐỂ

NGHIÊN CỨU c ơ BẢN

TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG

BÁO CÁO KHOA HỌC,

HỘI NGHỊ TOÀN QUỐC 2005

NGHIÊN CỨU Cơ BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG

Trường Đ ại h ọc Y Hà Nội, 03 tháng 11 năm 2005

</div>
(36)<div class='page_container' data-page=36>

NỌI DUNG

■

N h ữ n g v ấn đ ề n g h iê n cứ u cơ b ản tro n g K hoa học S ự sống n ăm 2004-2005
v à đ ề x u ất n h ữ n g đ ịn h h ư ớ n g tiế p theo

GS.TS. N g u y ễn Bá

M ột số h o ạ t đ ộ n g và k ế t q u ả n g h iê n cứu chủ yếu về kh o a học và công nghệ
của Trường Đại học Y Hà Nội

GS.TS. N g u y ễn Lân Việt

M ột số tax o n m ớ i v à/h ay b ổ su n g cho h ệ thự c v ật V iệt N am và vấn để bảo tồ n chúng

P han Kê'Lộc, N guyễn Tiến Hiệp, N guyễn Thị Thanh H ương, Đỗ Tiến Đoàn,
N g u y ễn Q u an g H iếu, Tô Văn Thảo, N guyễn Tiến Vinh, N guyễn Sinh Khang,
P hạm Văn Thế, D ươ ng Thị H oàn, J. R egalado Jr., L.v. A veryanov, A.L. Averyanova
D.D. Soejarto, K.D. Hill, S.K. Wu, J. Wen, A. Farjon, s. Swan, N. Furey,

N guyễn M ạnh C ường, Vũ Ngọc Long

T ổ n g q u a n các đặc điểm sin h học chủ yếu gặp ở b ệ n h n h â n ung th ư vòm m ũi họng
V iệt N am . M ột số ứ n g d ụ n g lâm sàng

Phan Thị Phi Phi

N h ữ n g k ế t q u ả nổ i b ậ t của Đ ê tài n g h iê n cứu cơ b ản vê áp d ụ n g kỹ th u ật sin h học
p h ầ n tử tại V iện C ông n g h ệ S in h học, v iệ n KH& CNVN

Lê T rần Bình, N ông V ăn Hải, Phan Văn Chi, Lê Q uang H uấn,

Trương Nam Hải, Đinh Duy Kháng

P a d ạ n g đ ộ n g vật và b ảo tồn n g u ồ n g en tại V ư ờ n Q uoc gia X uân Sơn - P hu Thọ

T rần M inh Hợi, N guyễn Xuân Đặng, Lê Đ ình Thuỷ, N guyễn Văn Sáng, Lê Xuân H uệ

I

D A DẠNG SINH HỌC

■ •

V À BẢO TỒN NGUỒN GEN

K ết q u ả đ iề u tra bước đ ầu về sự p h â n b ố của k h u h ệ bò sát ở k h u bảo tồn
th iê n n h iê n Bà N à - N úi C húa, th à n h p h ố Đà N ang

</div>
(37)<div class='page_container' data-page=37>

331. S ử d ụ n g h ệ izo zy m su p ero x id e d ism u ta za (SOD) tro n g n g h iê n cứ u đa h ìn h di tru y ền
và góp phần phân loại hai loài cây thuốc Phyllattthus amarus vả Phyllanthus urinaria

à V iệt N a m

.H o à n g Thị H ịa, Đ inh Đ ồn Long, Cao Lệ Quyên, Trần Thị N huận, Phạm T hanh H uyền

332. N g h iê n cử u h a i k ỉế u tái sin h in vitro cây k h o ai lan g Ipom oea b atatas L.

N guyễn H ữ u Hổ, N guyễn V ăn U yển

333. N g h iê n cứ u tạo p h â n tử 2 chức n ă n g đ ế ứ n g d ụ n g tro n g y học

Lê Q uang H uân, Vũ Thị Bích H ườ ng

334. Đ á n h giá đ a d ạ n g n g u ồ n g e n xoài V iệt N am (M angifera) sử d ụ n g kỹ th u ậ t RAPD

N guyễn Thị N gọc H uệ, T rần D anh Sửu, Trịnh H ồng Kiên

335. T ách dòng, xác đ ịn h và so sá n h trìn h tự gen m ã hóa p ro tein N ib của b ố n dòng virus
gây b ệ n h đ ố m v ò n g trê n cây đ u đ ủ ở V iệt N am

N guyễn M inh H ùng, C hu H oàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, Lê Duy Thành

336. P h ân tích đ a h ìn h d i tru y ề n của tập đ o àn giố n g n ấm L inh C hi (G anoderm a) ở m ức độ
p h â n tử n h ằ m p h ụ c v ụ công tác tu y ể n chọn và p h â n loại giống nấm

T rần M ạnh H ùng, Đ ặng T rọng Lương, Bùi M ạnh Cường, N guyễn H uỳnh M inh Quyên

337 N g h iê n cứ u công n g h ệ lê n m e n p h y tase từ vi k h u ẩ n Bacillus subtilis

Đỗ Thị N gọc H uyền, Lê Thiên Minh, N guyễn Thuỳ Châu, Trương Nam Hài

338 Biểu hiện gen mã hóa protein vỗ virus gây bệnh viêm túi truyền nhiễm trong trứng gà

T rần Thị T hanh H uyền, Lê T hanh Hòa, Lê Q uang H uân

339. M ột số k h ác b iệ t về h o ạt độ enzym , p h ổ b ăn g p ro tein và A D N của mối

M arcrotertnes carbonarius, M . g ilvu s th u th ập ờ M ã Đà và Cát Tiên, tin h Đ ông Nai

Đ ặng Q u an g H ư ng, Phạm Thị T hanh Vân, Trần Thị H uyẽn Nga,
N g u y ễn Q u an g H uy, Phan T uân N ghĩa

340. H aem ophilus influenzae T yp b: Đ ặc điểm sin h học p h â n tử, y ếu tố n g u ổ n lây 
m an g tín h gia đ ìn h

P han Lê T hanh H ương, Đ ặng Đức Anh, Vũ Thị Thu H ư ờ n g , Lê N hật Minh,

N gô Thị Thi, T rần Q uang C ảnh, Tsuguo Sasaki

341. K hảo sát tác đ ộ n g của m ột số tác n h â n gây ức ch ế m iễn dịch lên h ệ m iễn dịch
ch u ộ t n h ắ t trắ n g M us m usculus var. A lbino

P han M inh Liêm, Phạm Văn Phúc, N guyễn Thị Thúy Anh,
Phan Kim Ngọc, N gô Kê'Sương

1238

1242

1246

1250

1254

1258

1262

1266

1270

1274

</div>
(38)<div class='page_container' data-page=38>

1238

S IN H H Ọ C P H Ả N TỬ, T Ế BẢO VÀ CÁC Đ ỈN H HƯ ỞNG ỨNG DỤNG

Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) trong

nghiên cứu đa hình di truyền và góp phần phân loại hai

lồĩ cây thuốc Phyllanthus amarus va Phyỉianthus

urinaria ở Viêt Nam

■

Hoàng Thị Hịa, Đinh Đồn Long*, Cao Lệ Qun, Trần Thị Nhuận

Trưởng Đại học KHTN, Đại học Quốc giá Hà Nội
Phạm Thanh Huyền
Khoa Tài nguyên Dược Liệu, Viện Dược Liệu, Bộ Y tế

MỞ ĐẦU

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et. Thonn.) và Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) lả 
hai loài cây thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ Euphobiaceae, phân bố tương đối rộng rãi ở nước ta Hai loài 
cây thuốc này được sử dụng từ lâu đời trong y học cỗ truyền của Việt Nam và nhiều nước Châu Á như 
Án độ, Malaysia, Thái lan, Campuchia, Lào, Trung Quốc, Indonesia. Các tác dụng điều trị được biết đến 
rộng rãi của chúng bao gồm điếu trị rối loạn đường tiêu hóa (đặc biệt là các bệnh lý về gan), bệnh tieu 
đường, một số bệnh về thận, đường tiết niệu (Calixto et al., 1998). Gần đây. mpt số nghiên cưu dược lý 
đã chứng minh các dịch chiết của Phyllanthus có tác dụng ức chế quá trình sao chép của virus viêm gan 
siêu vi B và các loại retrovirus khác (bao gồm cà HIV) nhờ cơ chế ức chế enzym sao chép ngược reverse 
transcriptaza (Thyagarajan et al„ 1988; Venkateswaran et ai., 1987; Chan et al„ 2003).

Riêng ờ nước ta, trong vài năm gần đây, nhiều biệt dược có nguồn gốc từ Phyllanthus amarus và p. 
urinaria đã được sản xuất và sử dụng rộng rãi. Trong đó, có thẻ kề đến Livbilnic®(Cơng ty cổ phần Dược 
phẩm Traphaco), VG-5® (Cơng ty Dược phẩm TW5), Hepaphyl® (Cơng ty Dược phẩm TW25), 
Hepamarin®, Livsin-94® (Công ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây), ...

Tuy vậy, việc sản xuất các dược phẩm từ hai loài p. amarus và p. urinaria dựa trên các dược liệu thu hải 
tự nhiên bộc lộ một số nhược điểm như sau: (1) Việc thu hái khơng có quy hoạch dễ dẫn đến nguy cơ mắt 
đi các nguồn tài nguyên di truyền; (2) Việc thu hái từ các dạng hoanq dại không đáp ứng được yêu cầu 
của công nghiệp dược do nguồn nguyên liệu ban đầu thường kém on định và khó kiểm soát về thành 
phẩn hóa học, hoạt chất sinh học; (3) Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng vi sinh 
vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các tác nhân gây bệnh khác, vi vậy có thể mang theo các nguồn chất độc 
ngoài ý muốn; (4) Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiêm độc với các nguồn chất độc khác 
nhau, chẳng hạn như chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, các chất thải cõng nghiệp ... nếu được Ihu hái từ các 
vùng bị ô nhiễm; (5) Trong thực tế, p. amarus và p. urinaria lả hai lồi cây thuốc có đặc điểm hình thái rất 
giống nhau và giống với một số loài Phyllanthus khác hiện đang cò ờ Việt Nam, như p. niruri, p. 
reticũlatus vốn ít được quan tâm hơn vi mục đích chế biến dược liệu. Trước thực tế đó, việc thu hái dược 
liệu đứng trước nguy Cữ nhầm lẫn và khó có thẻ đảm bảo chất lượng cho quá trinh sản xuát dược phẩm.
Nhằm góp phần cung cấp một cõng cụ phục vụ cho công tác bảo tồn, định hướng chọn tạo giống và phân 
loại hai loài cây dược liệu dễ nhầm lẫn này, chúng tôi tiến hành đề tài “Sử dụng hệ izozym superoxide 
dismutaza (SOD) trong nghiên cứu đa hinh di truyền và góp phằn phân loại h lồi cây thuốc p. amarus 
và P. urinaria ờ Việt Nam".

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu thự c vật

Đẻ thu thập nguyên liệu sử dụng trong nghiên cửu, chủng tôi tiến hành bốn đợt điều tra xác định vị trí 
phân bổ tự nhien cua cac quằn thể hai Toài p. amarus và p. urinaria ờ một số địa phương thuộc miền Bắc. 
Cụ thể đợt 1 được tiến hành trong các ngày 7-8/12/2004, tại Hà Nội và Hà Tây; đợt 2 trong các ngày 2 - 
3/3/2005 tại Bắc Giang và Hải Dương; đợt 3 trong các ngày 7 - 8/3/2005 tại ngoại thành Hà nội; và đợt 4 
từ ngày 24/3 đến ngày 29/3/2005 tại Hà nội, Hưng n, Hà Tây, Hịa Bình và Vĩnh Phúc. Từ các mẫu thu 
được dựa vào khós phân loặi hình thái, chúng tỏi chpn ra 36 mâu có đặc điem hình thai tương đoi đi6n

hình CÙ3 hai lồi cây thuốc được qusn tâm nghiên cứu, trong đó có 17 mâu thuộc loai p. amarus (được ky

</div>
(39)<div class='page_container' data-page=39>

NHỮNG VẤN ĐỂ N G H IÊN cứu c ơ B Ả N TRONG KHOA HỌC sự SỐNG 1239

hiệu lả A) và 19 mẫu thuộc loải p. urinaria (được kỷ hiệu là U). Danh sách, đja điểm và thời gian thu thập 
các mẫu được nêu chi tiết trên Bảng 1.

Phân tích đa hình izozym

Phương pháp phân tích đa hỉnh izozym được thực hiện theo qui trinh của Tansklẹy và Orton (1983) kết 
hợp với Zimmerman (1989) cỏ cài tiến, với các bước cơ bản như sau: (1) Chọn, cắt lấy phần lá non. rừa 
sạch fcẳng nước cắt, thắm

khô; (2) Cân 500 mg mẫu và 
chuyển vào cối sứ, bổ sung 
500 111 dung dịch đệm và 
nghiền cho đến khi thu được 
dung dịch huyền phù đồng 
nhất (quá trình nghiền được 
giữ trong đá lạnh); (3) Thu 
láy dịch đồng nhất và 
chuyển vào ống eppendorf, 
ly tâm lạnh (4°C) ờ 14.000 
vòng/phủt, trong vòng 5 
phút; (4) Thu phần dịch phía 
trên để tiến hảnh phân tích 
hệ izozym SOD trên gel điện 
di polyacrylamid; (5) Điện di 
được tiến hành trên gel 
polyacrylamid gồm hai lớp 
(gel cô: 4% acrylamid, gel 
tách: 12% acrylamid); (6)

Kết thúc quá trinh điện di, 
gel được tách khỏi khuôn và 
tiến hành nhuộm phân tích 
hệ izozym SOD.

Phân tích kết quả nghiên 
cứu

Tính đa hình hệ izozym 
SOD của các mẫu quần thể 
thuộc hai loài Phyllanthus 
amarus và p. urinaria biểu 
hiện thông qua sự khác biệt 
về thành phần và tốc độ di 
chuyển tương đối (Rf) của 
các bảng điện di trẽn bản 
gel phân tích. Để phân biệt 
các băng đa hình, độ di 
chuyển tượng đối Rf được 
xác định bằng tỳ lệ khọảng

cách từ đầu gel tách đên vị

B ả n g 1. D a n h s á c h v à đ ịa đ iể m t h u th ậ p c á c m ẫ u q u ầ n

P h y lla n th u s a m a ru s v à p . u r in a ria

Ký hiệu Loài Địa điểm thu mẫu

t h ể h a i lo à i

Thời gian
Ahk Phyllanthus amarus Hoàn Kiếm, Hà Nội Đợt1
Utx P. urinaria Thanh Xuân, Hà Nội Đ ọi 1

Uto P. urinaria Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Đợt 1

Ant Phyllanthus amarus Ngọc Trực, Từ Liêm, Hà Nội Đ ọi 1

Abđ Phyllarìthus amarus Ba Đinh, Hà Nội Đợt 4

Ubo P. urinaria Đợt 1

Anb Phyllanthus amarus Nội Bài, Sóc Sơn, Hà Mội Đợt 3

Unb P. urinaria Đợt 3

Ada Phyllanthus amarus Thị trấn Đông Anh, Hà Nội Đợt 3

Uđa P. urinaria Đợt 3

Acl Phyllanthus amarus Cổ Loa, Đỏng Anh, Hà Nội Đ ợ t3

UcL P. urinaria Đợt 3

Ahb Phyllanthus amarus Hài Bối, Đông Anh, Hà Nội Đợt 3

UhB P. urinaria Đ ợ t3

Apt Phyllanthus amarus Phú Thị, Đông Anh, Hà Nội Đợt 3

Upt P. urinaria Đợt 1

Upl P. urinaria Phú Lỗ, Sóc Sơn, Hà Nội Đợt 3

Ath Phyllanthus amarus Tây Hồ, Hà Nội Đ ọi 4

Aođ Phyllanthus amarus Đống Đa, Hà Nội Đợt 4

Anh Phyllanthus amarus Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội Đợt 4

Amd Phyllanthus amarus Mao Điền, cẩm Giàng, Đợi 2

Umo P. urinaria Hải Dương Đ ợ t2

Ahd Phyllanthus amarus Thành pho Hải Dương, Đ ợ t2

Uho P. urinaria Hải Dương Đợt 2

Utk P. urinaria Tứ Kỳ, Hải Dương Đợt 2

Avy Phyllanthus amarus Việt Yên, Bắc Giang Đợt 2

UvY P. urinaria Đợt 2

Aln Phyllanthus amarus Lục Ngạn, Bầc Giang Đợt 2

Asđ Phyllanthus amarus Sơn Đông, Bắc Giang Đợt 2

Utt P. urinaria Thuận Thành, Băc Ninh Đợt 3

Uw P. urinaria Nghĩa Trai, Văn Lãm, Hưng Yên Đợt 4

UphL P. urinaria Phú Lãm, Hà Đông, Hà Tây Đợt 1
UlhT P. urinaria Thường Tín, Hà Tây Đợt 4
Ùls P. urinaria Lương Sơn, Hịa Bình Đợt 4

Ayđ Phyllanthus amarus Yên Định, Thanh Hóa Đọt 4

Urn P. urinaria Tam Đảo, Vĩnh Phúc Đợt 4

Đợt 1: ngày 7-8/12/2004; Đợt 2: ngày 2-3/3/2005; Đợt 3: ngáy 7-8/3/2005;
Đợt 4: ngày 24-29/3/2005

0,63
p7
0 71
0 75
í
' K
ĩẹ.

‘# 1 •

i t - ị

f 1

</div>
(40)<div class='page_container' data-page=40>

1240

S IN H H Ọ C P H Â N TỬ, T Ế BÀO VÀ CÁC Đ ỈN H HƯ Ớ NG ỨNG DỤNG
trí băng điện di so với chiều dải gel tách.

Các băng đa hinh được ghi nhận dựa trên sự có 
mặt hoặc vắng mặt cua chúng. Các số liệu được

- _ . dựng sơ đõ hinh cây quan hệ di
truyền giữa các mẫu quần thẻ thu được.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phổ izozym SOD của hai loài cây thuốc 
Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria
Kết quả phận tích các băng điện di hệ izozym 
SOD CÙ3 các quằn thể p. amarus và p. urinaria 
được thu thập ơ các địa điểm khác nhau trong ca
4 đợt thu mẫu cho thấy có sự khác biệt rõ rẹt va 
kiểu hinh hệ izozym SOD giữa hai loài cây thuoc 
này. Mặc dù các mâu của hai loài được thu thập từ 
các địa phương cách biệt về mặt đja lý và vào các 
thời điểm khác nhau (từ tháng 12/2004 đến tháng 
3/2005), nhưng nhìn chung phổ điện đi cùa các 
quằn thể trong phạm vi một loài có tính đồng hình
r a n r t à r h i õ t l à rĩAi \ir>í\ m l Ằ n 1UẲ ì : r \

urinaria (ký hiệu U) chĩ cho ra 
các băng mờ hoặc không phát hiện thấy bảng điện 
đi (Hình 1),

Khi phân tích 17 mẫu của loài p. amarus, chủng

tôi thu được tổng cộng 9 băng đa hình khác nhau 
tương ứng với các giá trị Rf là 0,22; 0,40; 0,43; 
0,52; 0,60; 0,63; 0,67; 0,71 và 0,75. Trong số đó 
đáng chú ý hợn cả là có 3 băng đồng hinh rõ nét 
xuất hiện ở tât cả 17 mẫu quần thẻ của loài p. 
amarus (Rf = 0,63; Rf = 0,71 vá Rf = 0,75, xem 
Hinh 1). Trong khi đó, việc phân tích 19 mẫu quần 
thẻ cùa loài P. urinaria chỉ thấy xuát hiện băng 
điện di ở 4/19 mẫu (chiếm ss 20%). Đó là các mẫu

Uvy, Unb, Utht, và Uls với tồng sổ 5 băng đa hình

(Rf = 0,45; Rf = 0,48; Rf = 0,63; Rf = 0;71 và Rf =
0,75). Đối với 15/19 mẫu p. urinaria còn lại không 
quan sát thấy băng điện di. Một điềm đáng chú ý

' «■ l i _ l í A __ V . X . » L . X , _ + 1 . . . .

Hệ số tư ơ n g đ ò n g di tru yền

Hinh 2. Sơ đồ quan hệ di truyền của 36 quần 
thể mâu thuộc hại loài p. amarus và p, urinaria 
được xác định bằng kỹ thuật phân tích chi thị 
izozym SOD (địa điem thu thập các mẫu được 
nêu trên bảng 1)

g a i II i a j r u a i i y u i y i I U I . i v i y i U I W I I I u a n y V * I I U y

lữa lả trong số 4 mẫu kẻ trên (đặc biết rõ đối với hai mẫu Uvy và Unb), băng điện di chỉ xuát hiện ờ các vị 
:ri Rf là 0,63; 0,71 và 0,75, như vậ^ giống với các băng đồng hình rõ nét của các quần thể lồi p. amarus

^hưng, có một sự khác biệt là đoi với các mẫu p, urinaria nảy, các băng điện di chì biểu hiện mờ với 
:ường độ sáng bằng Ví so với các mẫu p. amarus. Ngoài ra, khi quan sát thực tế, chúng tỏi thấy hai mẫu 
Jvy va Unb được thu thập từ các khu vực có sự phân bổ cùa cà hai loài p. amarus và p. urinaria trong

>hạm vi hẹp. Điều đó dẫn chúng tôi đến một giả thiêt răng: có thể các mẫu Uvy và Unb lã “con lai” giữa hai

aài p . a m a ru s và p . urin a ria , m ặ c dù về hìn h thá i chúng m ang đ ặ c điểm giống với lồi p . uríanaría (vì vậy

fược xếp vào nhóm U). Đây là một hiện tượng đáng quan tâm, chưa từng được ghi nhận trong các 
ighiên cứu phân loại các loài Phyllanthus. Mặc dù trước đây đã có một số báo cáo cho thấy có sự ton tại

ủa các d ạ n g tru n g g ia n về h in h thá i giữ a các loài th u ộ c chi P hylla nthus (Taylor, 2003).

'iệ c tấ t cà c á c m ẫu qu ần th ể của lồi p. am a rus ln biểu hiện 3 băng đồ ng hinh rõ nét ờ vị trí R f bang 
,63; 0,71 vá 0 ,7 5 tro n g khi c á c bả ng này hầu như khống xuất hiện trong phằn lớn các m ẵu của loài p.

rin aria , h o ặ c ch ì x u ả t hiện m ờ tro n g m ột s ố m âu quần thể đư ợ c nghi ngờ lả c á c dạng trung gian, cho

lấ y có th ể sử dụ ng c h ỉ thị S O D đ ẻ ph ân loại nhanh hai loài p. am a ru s và p. urinaria.

'ựa trẽn các bảng đồng hinh và đa hình khi phân tích hệ izozym SOD từ 17 mẫu quần thể của loái p. 
marus và 19 mẫu quần thể của lồi p. urianaria, chúng tơi đã xác định được hệ số đông dạng di truyền

</div>
(41)<div class='page_container' data-page=41>

n h ữ n g v ấ nđ ển g h i ê nc ứ u c ơb ả n t r o n gk h o a h ọ c s ự s ố n g 1241

urinaria bằng việc sử dụng phần mềm NTSys 2.02h. Kết quả được trình bày trên Hình 2. Từ kết quả phân 
tích, có thẻ chia các quần thể hai loài p. amarus vả p. urinaria được sử dụng trong nghiên cứu này làm 3 
nhỏm chính. Nhóm thứ nhắt bao gồm toàn bộ 17 quần thẻ p. amarus với hệ số tương đồng di truyền giao 
động trong khoảng từ 0,63 đến 1,00. Nhóm thứ hai gồm 14 quần thể p. urinaria (bao gồm các quần thẻ 
Ubđ. Utx, Uđa, Ucli Uhb, Upt. Utq, Uphi, Umđ, Uhdi Utk. Uvl, U tt, Upl) có hệ số tương đồng đi truyền là

1,00 (do hoàn toàn khỏnạ xuất hiện các băng điện di hệ izozym SOD). Nhóm cịn lại có thẻ là dạng trung 
gian <Jũa hai nhóm trên gom các mẫu quần thể Uw. Unb, ƯThT, và

Uls-KẾT LUẬN

Có thẻ sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD đẻ góp phần phân loại hai lồi cây thuốc Phyllarìthus 
amarus Schum. Et. Thonn. vả Phyllarỉthus urinaria L., Trong đó các băng điện di đặc trưng của các quẩn

thẻ p. amarus được thu trong nghiên cứu này có Rf bằng 0,63; 0,71 và 0,75. Phát hiện thay một số quần

thể có kiểu hỉnh của loài p. urinaria, nhưng băng điện di hệ izozym SOD cho thấy chúng có thể là dạng 
trung gian của hai loài p. amarus và p. urinaria. Rất có thể xảy ra hiện tượng lai giữa hai loài cây thuốc 
nảy trong tự nhiên. Tuy vậy, để khăng định cần phải có các nghiên cứu tiếp theo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Calixto JB, Santos AR, Cechinel FV, Yunes RA, 1998. A review of the plants of the genus Phyllanthus: their
chemistry, pharmacology, and therapeutic potential. Med Res Rev, 18(4): 225 - 258.

2. Chan HL, Sung JJ, Fong WF, Chim AM, Yung pp, Hui AY, Fung KP, Leung PC, 2003. Double-blinded placebo-
controlled study of P. urinaris for the treatment of chronic hepatitis B. Ailment Pharmacol. Ther. 18: 339 - 345.
3. Rohlf FJ. 1993. NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable analysis system version 1.80. Exeter software.

Applied Biostatistics Ins., New York.

4. Tanksles SD and Orton TJ, 1983. Isozymes in plant genetics and breeding. Elsevier Science Publ., Amsterdam.
5. Taylor L, 2003. Chanca piedra “stone breaker” (Phyllanthus (liruri). Sage Press Inc.

6. Thyagarajan SP, Subramanian s, Thirunalasundari T, Venkateswaran PS, Blumberg BS, 1988. Effect of

Phyllanthus amarus on chronic carriers of hepatitis B virus. Lancet, 2 (8614): 764 -766.

7. Venkateswaran PS, Millman I, and Blumberg BS, 1987 Effects of an extract from p. niruri on hepatitis and 
woodchuck hepatitis viruses: invivo and invitro studies. Proceedings o f National Academy o f Science USA, 84: 274 
-2 7 8 .

8. Zimmerman w s , Lumpkin TA, Watanable I, 1989. Isozyme differentiation of Azolla. Euphytica 42: 163 - 170.
‘ Cơng trình được sự tài trợ cùa Đại hpc Quốc gia Hà nội Các tác giả xin chân thánh cảm ơn PGS.TS. Trịnh Đinh
Đạt đã độc và góp ỷ cho bản thào.

SUMMARY

Assessment of genetic polymorphism and rapid

identification of the two medicinal plant species -

Phyllanthus amarus and p. urinaria - by using

superoxide dismutase (SOD) isozyme markers

Hoang Thi Hoa, Dinh Doan Long, Cao Le Quyen, Tran Thi Nhuan

University of Science, VNU. Hanoi

Pham Thanh Huyen

Department of Medicinal Plants Resource, National Institute of Medicinal Materials
In Vietnam Phvllanthus amarus Schum. Et. Thonn. and Phyllanthus urinaria L. are the two most well-known 
medicinal plants among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae. These medicinal plants
have been used for centuries in the traditional medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema,

hematometra, hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite.

In o rd e r to a s s e s s th e g e n e tic d iv e rs ity o f th e s e m e d icin a l p la n ts and to e s ta b lis h a m e th o d fo r rapid id e n tifica tio n of

these two plant species, we performed the analysis of SOD isozyme markers The study revealed that the SOD isozyme
orofifes of the two specks are obviously distinct. All collected samples of p. amarus accessions were specified by 
e S ro p h o re tfc markers of SOD isozym eat R f^ h a ta r e e q u a l 1 0 ^ 6 3 :0 71 and 0.75 Whereas, these markers were
absent from most of p. urinaria samples, except for some seemingly interspecific forms.

In conclusion our study indicated that the analysis of SOD isozyme markers might be used as a simple and cost-
effective technique for assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two medicinal plant species -

Phyllanthusamarus Schum Et. Thonn. and Phyllanthus urinaria L.

</div>
(42)<div class='page_container' data-page=42>

DANH SÁCH BÁO CÁO CÔNG Bố TẠI PHỤ TRƯƠNG 
TẠP CHÍ KHOA HỌC THÁNG 11-2005

Doan Huong Mai, Nguyen Xuan Huan, Pham Thi Lan

ESTABLISHING THE STATUS MAP OF ECOSYSTEMS IN KIM BOI DISTRICT HOA BINH PROVINCE

Nguyen Due Hong, Phung Thi Ngoc, Nguyen Huu Nhan

ENVIRONMENTAL AND LABOR CONDITIONS OF SEVERAL CRAFT VILLAGES IN HATAY AND NAMDINH

Nguyen Huu Nhan, Nguyen Due Hong

SOME ANTHROPOMETRICAL SIZES IN FACE, HEAD REGION AND THEIR APPLICATIONS IN DESIGNING 
MEANS OF PERSONAL PROTECTION

Nguyen Huy Chien, Nguyen Xuan Quynh

PRIMARY INVESTIGATING RESULT OF MACROINVERTEBRATE RESOURCE A T CA ESTUARY

Nguyen Nghia Thin, Ho Thi Tuyet Suong, Nguyen Manh Cuong

DIVERSITY OF LIANAS A T THE c u c PHUONG NATIONAL PARK

Nguyen Thi Kim Thanh, Nguyen Nghia Thin

MEDICINAL PLANTS OF CUC PHUONG NATIONAL PARK, VIETNAM

Nguyen Thuy Lien, Dang Thi Sy

GENUS COSMARIUM A T BA HAO LAKE, MA DA FORESTATION, DONG NAI PROVINCE

Nguyen Van Quang

BIODIVERSITY OF TERMITE (ISOPTERA) AND THEIR DISTRIBUTION IN HUONG SON DISTRICT, HATINH 
PROVINCE

Nguyen Van Vinh, Bae Yeon Jae

TWO NEW RECORDS OF HEPTAGENIIDAE (EPHEMEROPTERA, INSECTA) IN VIETNAM

Nguyen Xuan Huan, Doan Huong Mai

THE ORIENTATION OF ECOLOGICAL PLANNING IN KIM BOI DISTRICT TO THE YEAR 2010 SERVING 
SUSTAINABLE DEVELOPMENT

Thach Mai Hoang, Nguyen Manh Ha, Nguyen Thanh Tra

SURVEY ON WILD BOVINES (BOVIDAE SPP.) IN BU GIA MAP NATIONAL PARK (BINH PHUOC PROVINCE) 
AND NAM NUNG NATURE RESERVES (DAK NONG PROVINCE) IN 2005

Trinh Van Hanh, Dinh Xuan Tuan, Nguyen Minh Due, Nguyen Thi My, Nguyen Van Quang

TESTING RESULTS OF METARHIZIUM OUTPUT USING FOR CONTROLLING ODONTOTERMES 
HAINANESIS ON THE DIKES

Truong Quang Hoc, Pham Binh Quyen, Hoang Van Thang

BIODIVERSITY OF THE TYPICAL ECOLOGICAL REGION, QUANG BINH & QUANG TRI

Vu Trung Tsng, Chu Tien Vinh, Chea Phala

AGE AND GROWTH OF GREATER LIZARDFISH (SAURIDA TUMBIL, BLOCH 1785) IN THE GULF OF 
TONKIN OF VIETNAM

Bui Thi Viet Ha, Pham Van Ty, Tu Minh Koong, Le Gia Hy

NEW I SOLA TED STRAIN OF STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS TC54 AND THE USE ITS CULTURAL 
BROTH AS C R U D E ANTIBIOTIC FOR CONTROL OF PHYTOPHATHOGENIC FUNGI

Ha Thi Thanh Binh, Nguyen Quoc Khang _______ _____________ ___

ANTI-OXIDATION OF FLAVONOIDS FROM CAMELLIA SINENSIS (CAMELLIA SINENSIS LINDL o. KUNTZE)

Hoana Thi Hoa, Dinh Doan Long, Le Duy Thanh

DISCRIMINATION OF THE TWO MEDICINAL PLANTS - PHYLLANTHUS AMARUS AND PHYLLANTHUS 
URINARIA - REVEALED BY ISOZYME MARKERS

</div>
(43)<div class='page_container' data-page=43>

Ngo Giang Lien, Pham Due Ngoc, Truong Dinh Co, Ngo Thi Huong.

USE OF THE SINGLE COCKTAIL POLYMERASE CHAIN REACTION TO IDENTIFY MEMBERS OF

a n o p h e l e sm in im u s g r o u pb e l o n g in g t o THEMYZOMYIA s e r ie s in VIETNAM

Nguyen Quoc Khang, Yves Engelborghs, Johan Hoebeke

KINETIC AND EQUILIBRIUM STUDIES ON THE INTERACTION OF ARTOCARPUS INTEGRIFOLIA LECTIN 
WITH GALACTOSE AND GALACTOSE ANALOGUES

Nguyen Thi Van Anh, Nguyen Thi Thao, Nguyen Mong Hung, Phan Tuan Nghia

EARLY INDENTIFICATION OF SEX IN CHICKEN EMBRYO USING MULTIPLEX PCR OF CHD GENE

Nguyen Trung Thanh, Niranjana H. Murthy, Yu Kee Won, Hahn Eun Jun, Paek Kee Yoeup

LARGE-SCALE CULTIVATION OF PANAX GINSENG c. A. MEYER CELL SUSPENSION FOR GINSENOSIDES 
PRODUCTION: EFFECT OF INOCULUM SIZE

Pham Thi Kim Trang, Nguyen Van Mui, Phạm Hung Viet, Michael Berg, Shinsuke Tanabe

APPLICATION OF BIOMARKERS FOR ASSESSMENT OF ARSENIC EXPOSURE FROM GROUNDWATER IN 
VIETNAM

Trinh Dinh Dat, Hoang Kim Phuc, Dinh Nho Thai, Nguyen Van Quang, Dinh Doan Long

</div>
(44)<div class='page_container' data-page=44>

ĐẠI HỌC Q UỐC GIA HÀ NỘI

TRUỒNG Đ Ạ I HỌC KHOA HỌC T ự N H IÊ N
K H O A SINH HỌC

Cao Lệ Q uyên

s ử DỤNG MỘT SÔ HỆ IZOZYM TRONG NGHIÊN

CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỂN v à g ó p p h ầ n p h â n

LOẠI HAI LOÀI CÂY THUỐC PHYLLANTHUS

AMARUS VÀ PHYLLANTHUS URINARIA L.

THU THẬP Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY
Ngành: Sinh học

C án bộ hướng d ẫn : Th.s. Hoàng Thị Hoà
TS. Đinh Đoàn Long

</div>
(45)<div class='page_container' data-page=45>

PHIẾU ĐÃNG KÝ

KẾT QUẢ NGHIÊN c ú u KH-CN

T ên đề tà i : Sử dụng một số hệ izozym để nghiên cứu đa dạng di truyền ở
một sơ lồi cây dược liệu bản địa ở Việt nam.

Mã số: QT-04-15______

Cơ quan chủ trì đề t à i : Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên
Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Tel: 8584287

Tổng kinh phí thực thỉ: 16.000.000 VNĐ

Trong đó: - Từ kinh phí nhà nước: khơng

- Kinh phí của trường: : 16.000.000 VNĐ
- Vay tín dụng: khơng

- Vốn tự có: khơng
- Thu hồi: khồng
Thời gian nghiên cứu: 2 năm

Thời gian bắt đầu: 4/2004
Thời gian kết thức: 12/2005

Tên các cán bộ phối hợp nghiên cứu:

TS. Đinh Đoàn Long
KTV. Trần Thị Nhuận
ThS. Phạm Thanh Huyền

Số đăng ký đề tài:

Ngày:

Số chứng nhận đăng ký kết
quả nghiên cứu:

Bảo mật:

</div>
(46)<div class='page_container' data-page=46>

Tom tăt kêt quả nghiên cứu:

Vj ,Kêt quả cho thấy có thể sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST và PO

P // giá mức đa dạng, khoảng cách di truyền và phân loại nhanh 2 loài

m tjtyuanthus amarus và Phylỉanthus urinaria ngay từ khi cây còn nhỏ (đăc biêt là

hệ izozym SOD).

- Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng của các quần thể loài p.

amarus trong nghiên cứu này có Rf= 0,63; Rf= 0,71 va Rf= 0,75. Các băng điện

di phổ izozym EST đặc trưng riêng của các quần thể loài p. amarus có Rf=0 09 
và Rf=0,42. Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng của các quần thể
loài p. amarus có Rf= 0,85 và Rf= 0,87.

Phát hiện quẩn thể Phyllanthus urinaria L. Nội Bài, Sóc Sơn có phổ izozym 
SOD mang 3 băng đặc trưng của lồi Phyllanthus amarus. Có thể đây là con lai 
giữa 2 loài Phyllanthus amarus và Phyllanthus urinaria L.

- Đã đăng được 2 bài báo khoa học (1 bằng tiếng Việt và 1 bằng tiếng Anh).
- Đào tạo 1 cử nhân Sinh học: Sinh viên Cao Lệ Quyên lớp Sinh K46A

Kiến nghị về quy mô và đối tượng áp dụng nghiên cứu:

1. Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa
dạng di truyền các loài Phyllanthus spp. và các đối tượng khác, nhằm góp phần vào
việc phân loại và kiểm định dược liệu.

2. Có những nghiên cứu sâu hơn về quần thể Phyllanthus urinaria L. Nội Bài, Sóc Sơn 
để khẳng định xem đây có đúng là con lai giữa 2 lồi hay khơng?

Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng cơ

quan chủ trì để tài

Chủ tịch Hội đồng

đánh giá chính

thức

T h ủ trư ở n g cơ q u a n
q u ả n lý đề tài

Họ tên Hoàng Thị Hoà $U) h ù ị. C dfy UỉUh TitảítyẹL

T Ị .

Học hàm

Học vị ThS. GVC

ụ

PCrí

r<

K á n n m

U ẸM ..y/

: ■ :.?H

. .L i ,ti\ ^ỗ4Ì&

Ký tên

Đóng
dấu

' Á y / .

l
\ - \

V V

5
'■
cX

b

/
^

ụ

■r? 
■

/

- J

)

ị

s. *

</div>

Sử dụng một số hệ IZOZYM để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam

SỬ

DỤNG M ỘT SỐ HỆ IZOZYM B Ê NGHIÊM

cứu

ĐA DẠNG D I TRUYỂM

s ố LO À I CÂY DƯỢC U Ệ U

BẢN B ỊA Ỏ V IỆ T MAM

<i>PŨS.T</i>

s.

<i>dí)ù.L ^ỈẰuiL^Ối.</i>

<b>MỞ ĐẨU</b>

<i><b>1.1.7. Các dược phẩm được bào chế từ p . amarus và p . urinaria</b></i>

<b>Rf</b>

<b>Rf</b>

0,60

0,63

0 71

075

<b>R f</b>

<b>R f</b>

<b>M A</b>

<b> A</b>

<b> A</b>

<b> A</b>

<b> A</b>

<b> U</b>

<b> UThT ƯLS u v</b>

<b>R f</b>

<b>NHữNG VẤN ĐỂ </b>

<b>NGHIÊN CỨU c ơ BẢN </b>

<b>TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG</b>

NỌI DUNG

I

<b>D A DẠNG SINH HỌC </b>

<b>V À BẢO TỒN NGUỒN GEN</b>

<b>Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) trong </b>

<b>nghiên cứu đa hình di truyền và góp phần phân loại hai </b>

<i><b>lồĩ cây thuốc Phyllanthus amarus va Phyỉianthus </b></i>

<i><b>urinaria ở Viêt Nam</b></i>

<b>Assessment of genetic polymorphism and rapid </b>

<b>identification of the two medicinal plant species - </b>

<i><b>Phyllanthus amarus and p. urinaria - by using </b></i>

<b>superoxide dismutase (SOD) isozyme markers</b>

<b>s ử DỤNG MỘT SÔ HỆ IZOZYM TRONG NGHIÊN </b>

<b>CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỂN v à g ó p p h ầ n p h â n </b>

<i><b>LOẠI HAI LOÀI CÂY THUỐC PHYLLANTHUS </b></i>

<i><b>AMARUS VÀ PHYLLANTHUS URINARIA L. </b></i>

<b>THU THẬP Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM</b>

<b>PHIẾU ĐÃNG KÝ </b>

<b>KẾT QUẢ NGHIÊN c ú u KH-CN</b>

<i>PCrí </i>

<i>K á n n m</i>

b

<i>ụ</i>

<i><sub>- J</sub></i>

<i><sub>) </sub></i>

<i><sub>ị</sub></i>

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về