Nghiên cứu chẩn đoán nhanh Staphylococci và tính đề kháng Methicillin của chúng bằng kỹ thuật PCR đa mồi

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

<b>NGHIÊN </b>

<b>c ứ u CHẨN ĐOÁN NHANH STAPHYLOCOCCI VÀ TÍNH ĐÈ </b>

<b>KHÁNG METHICILLIN CỦA CHÚNG BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI</b>

<b>Những người thực hiện: Trần Thanh Loan, Trương Đình An Sơn </b>

<i><b>Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Kỹ thuật Y Dược Đà Nắng </b></i>

<b>Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Đình Bỉnh </b>

<i><b>Bộ mơn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Huế</b></i>

<b>ĐẶT VÁN ĐỀ</b>

stảphyỉococci ỉà một tác nhân gây nhiều nhiễm
khuẩn thường gặp, chúng có thể gây nên nhiều bệnh
lý khác nhau như nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn
da, nhiễm khuẳn đường tiết niệu, nhiêm khuẩn vết
thương, vết bỏng, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn
huyểt, viêm tủy xương.,.[2], [3], [4], [5]. Các nhiễm
khuần do staphyiococci thương điều irị khó khăn do vi
khuển kháng íhuốc, rất nhiều cac staphylococci kháng
thuốc, đa kháng thuốc được phân lập từ bệnh nhân.
Các vi khuẩn kháng Methiciliỉn íhường kháng với nhiều
thuốc khác, nên nó được xem như là “siêu vi
khuẩn”[2], [3], [

6

]. Việc chẩn đoản sớm sự nhiễm
khuẩn do staphylococci và tính kháng thuốc của
chúng có vai trị rất quan trọnp trong điều trị. Nhiều
nghiên cứu ứng dụng các yểu to tạo nên độc lực mạnh
cua Staphylococci như các yếu tố xâm nhiêm, sinh độc
íố, sinh các men phân huy protein, chất diệt bạch
cầu...Trong đó, FemA, Coagulase là những chỉ thị

thường dùng để phát hiện các staphylococci có độc

<i><b>lực ờ các phịng thí nghiệm.</b></i>

Tại Việt Nam, các nghiên cửu liên quan đến chần
đoán, phát hiện độc lực của các staphylococci và tính
kháng Methỉciliin bằng các phương pháp truyền thống,
tuy nhiên các nghiên cứu ve kỹ thuạt sinh học phân tư
đe phát hiện gen mã hóa FemA, yếu tố độc iực của
các Staphylococci như Coagulase hoặc gen mecA đề
kháng Methicillin của các staphylococci chưa có nhiều

t2]. ~

Đê tài: “Nghiên cứu chân đoán nhanh
Staphylococci và tính đề kháng Methiciliin của chúng
bằng kỹ thuật PCR đa mồi” nham mục tiêu xây dựng
quy trỉnh chẩn đoán nhanh staphylococci, xác định
gen mã hóa FemA, yếu íố độc !ực Coagulase và tinh
đề kháng kháng sinh Methicillin của chúng bằng kỹ
thuật PCR và so sánh với các phương pháp chẩn
đốn Staphylococci phịng thí nghiệm truyền thống,
phát hiện Coagulase và tính đe kháng kháng sinh
Methicilỉin của chúng.

<b>ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu</b>

1

. Đối tượng nghiên cứu

<b>- 80 chủng VI khuẩn của các staphylococci gồm 45 </b>

chủng S.aureus và 35 chủng staphyococci coaguỉase
âm tính được phân iập bằng phương pháp ntioi cấy
thường quy.

- Cac chủng vi khuẩn làm chứng gồm <b>01 </b>chủng <b>s. </b>

aureus có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+), 01
chủng vi khuẩn Streptococcus pyogenes (chứng âm
Coagulase (-), mecA (-), FemA (-).

2. V ậỉ liệu nghiên cứu

<i><b>2.1. Hóâ Chat, sinh phẩm</b></i>

- Các loại môi trường nuôi cáy và thực hiện kháng
sinh đồ: Môi trường ni cấy: íhạch máu, thạch
thưởng, Chapman, BHI, Muelíer HỈnton Agar, mơi
ỉrường sinh vậí hóa học...

- Các loại vật iíệu khác: Thuốc nhuộm Gram, Huyết
tương thỏ, H

2

0

2

3%, Nước muối sinh lý vô khuẩn, các
loại đĩa kháng sinh Oxacillin và Cefocitin.

- Các loại hóa chất để thực hiện PCR: Agarose,
duncj dịch điện di, Ethidium Bromide, thang DNA
chuan.

<i><b>2.2. Thiết bị, dụng cụ</b></i>

- Các loại thiết bị: Tu ấm 350C và 370C, máy iắc

rung (Vortex), tủ lạnh, các loại máy ly tâm, tủ an íồn
sinh học, máy ln nhiệt, buồng điện di, bàn đèn đọc
kết quả điện di...

- Các loại dụng cụ: Đèn cồn, kẹp đĩa kháng sinh,
thước đo đường kính vỏng ức chế, khuyên cấy, tăm
bông vô khuẩn, các loại vật iỉệu đề thực hiện PCR...

<b>3. </b> <b>Phương pháp nghiên cứu</b>

<i><b>3.1. Kỹ thuật nuôĩ cắy và định danh vi khuẩn </b></i>
<i><b>Staphylococci</b></i>

Các bệnh phẩm được cấy trên các môi trường đặc,
lỏng tùy theo yêu cầu kỹ thuật của từng loại mẫu
ngNệm. Khi có khuẩn lạc nghi ngờ (màu vàng trên
Chapman, tan máu B trên thạch máu...), làm phiến
phếí nhuộm Gram kiểm tra hình thải. Tiến hành phân
lập và định danh theo quy trình truỵền thống chẩn
đoán các Staphylococci là: cầ u khuan Gram dương
đứng đám, catalase dương tính, xác định
Staphylococci khi có các tiêu chuẩn sau: sắc íố vàng,
lên men đường mannit, có coagulase dương tính. Các
Síaphyiococci coagulase âm tính khi có hay khơng lên
men đường mannit, coaguỉase âm

<i><b>[2J,[33-3.2. Kỹ thuật phát hiện vi khuẩn staphylococci </b></i>
<i><b>kháng Methicillin qua trung gian mecA bằng kỹ </b></i>
<i><b>thuật s ử dụng đĩa Cefoxitin (Theo CLSl 2011): Với </b></i>

khoanh giấy cefoxitin 30ụg tren môi trường Mueiler
Hinton Agar, trong Điều kiện nuôi cấy: 33-35

<b>°c/16 </b>

-
18 giờ. Đọc kết quả: ắ 21 mm = mecA diPơng tính; ằ
22 mm = mecA âm tính. [1]

<i><b>3.3. S ử dụng kỹ thuật PCR tìm gen mã hóa </b></i>
<i><b>FemA, Coagulase và gen mecA</b></i>

- Tách chiết DNA từ khuẩn lạc staphylococci:
Tách chiết DNA bằng phương pháp nhiệt. DNA
của vi khuẩn sẽ được chuẩn b ĩ bằng cách lấy

1

khuẩn lạc cho vào ống eppendorf có chứa 250 MÍ
nước cẩt. Huyền dịch vi khuẩn này sẽ được chưng
cách thủy ở nhiệt độ 990C trong 10 phút. Sau đo
quay ly íam 10.000 vổng/phút trorìg 10 phút. Bỏ phần
cặn lắng, lấy phần dịch noi đề sử dụng cho phản ứng
<i>PCR [2], ự ], [</i>

8

].

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

- Cặp mồi (Primers): Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tt Primers sân phấm Chức nănq Tham khảo từ

Coagulase 5'-ATAGAGATGCTGGTACAGG-3’

5'-GCTTCCGAĨTGTTCGATGC-3 603-872 Coaguíase Hookey eí ai. (1998) [3]

2

mecA 5-CCTAGTAAATGCTCCGGAA-3’ _{5’-CTAGTCCATTCGGTCCA-3} 314 MRSA Nizami Duran (2012) [

6

]
3 FemA 5'-AAAAAAGCACATAACAAGCG-3‘

5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3' 132 S.aureus Nizami Duran (2012) [

6

]
* Thực hiện phẫn ứng PCR

Một phản ứng PCR y=25|il gồm: 1.5mM MgC!2,
200ịjM mỗi loại dNTP, 0,625 unit Taq DNA
polymerase, 0,5ụM mỗi mồi, Taq buffer, nưởc cất 2
iần*

Các bước tiến hành: Đối với mỗi mẫu, thực hiện
<i>như sau: 20|il mix PCR pha ở trên + 5ịi\ dịch DNA tách </i>
chiết, cho vao eppendorf 0,2mi. Đặt chường trình cho
máy iuân nhiệt hoạt động:________________________

Bước 1: 95°c 5 phút

1

chu kỳ
Bước 2:

95°c 30 giây

40 chu kỳ

51°c 30 giâv

72°c 30 giây

Bước 3: 72°c

₆

phút

1

chu kỳ

Điện di để phát hiện sản phẩm PCR: sản phẩm tạo
<i>thành được điện di ờ điện thế 80V, trên thạch agarose </i>

1

% nhuộm với chất màu huỳnh quang tự nhiên và đọc
kết quả ở buồng đọc huỳnh quang. Sự hiện diện cua
sản phẩm sẽ được so sánh với thang mẫu ĐNA ladder

100

bp.

4. X ử lý số liệu: Xử lý các số liệu thu thập đưực
bằng phương pháp thống kê y học. Độ nhạy và độ đạc
hiệu của các thử nghiệm tính theo công thức của bảng
2x2 ià: Độ nhạy = a/a+c; Độ đặc hiệu = d/b+d [9].

<b>KẾT QUẢ NGHIỀN cứ u</b>

<b>1. Tính chất sỉnh vật học của các staphylococci phân lập được</b>

Bảng 1. Tính chất sinh vật học của các staphylococci
Tính chất

Vi khuẩn ' Câu khuấn Gram (+)n % Catalase (+)n % Mannit (+)n % Coagulase (+)n % Tan máu {+)n % sẳc íố vànqn %
S. aureus 45

100,0

45

100,0

45

100,0

45

100,0

39 86,7 45

100,0

Staphylococci coagulase

âm tính 35

100,0

35

100,0

14 40,0

0

0

28 80,0 29 82,9

Các Staphylococci được định danh và xác định độc
lực bằng phướng pháp truyền thống dựa vào tiêu bẩn
nhuộm Gram, tính chất Caíalase dương tính, làm đơng
huyết tương, lên men đường Mannit, tính chất tan máu
và khuẩn íạc có sắc tố màu vàng.

<b>2. </b> <b>Đặc điểm kiểu hình và kĩểu gen về độc iực và </b>
<b>kháng Methiciliin của hai nhóm staphylococci </b>
<b>khảo sát</b>

Bảng 2. Tính kháng thuốc Methiucillin của các

Các chùng vi
khuẩn

Số
chủng

thừ

Tính kháng Methiciilin bằng test
Cefoxitin qua trung gian mecA

Khánq Nhạy

N % n %

S.aureus 45 40 88,9 5

_11,1

sta coa (-) 35 15 42,9

20

57,1
Tống cộng 80 55

68,8

25 31,2
trung gian mecA qua test Cefoxitin kết quà cho thấy
các chùng S.aureus kháng Cefoxitin đếrì 88,9%, các
chùng staphylococci coaguiase âm tính kháng
Cefoxitin chi CO 42,9%. Tỳ !ẹ đề kháng chung của các
chủng Staphylococci là

68

,

8

%.

Bảng 3. Kiểu gen mã hóa chủng vi khuẩn, độc lực
và kháng Methiucillin cùa các chủng staphylococci
khảo sát

Các chủng

vi khuẩn Số chủng thử

FemA mecA Coagulase
í+ì í-ì (+) {-) í+ì (-)

S.aureus 45 45

0

•40 5 45

0

sta coa (-) 35 3 32 15

10

3 32
Tổng cộng 80 48 32 55 25 48 32

100,0% chủng có S.aureus có Coagulase dương
tính với thử nghiệm Coagulase trên phiến kính đều có
gen mã hóa Coagulase, các staphylococci Coaguiase
âm tỉnh (thử nghiệm Coagulase trơn phiến kính và
trong ống nghiệm) có

8

,

6

% (3 chủng) có gen mã hóa
Coagulase.

100,0% chủng có

<b>s.</b>

aureus có Coaguiase dương
tính với thử nghiệm Coagulase trên phien kính đều có
gen mã hóa FemA, các staphylococci Coagulase âm
tính (thử nghiệm Coagulase tren phiến kính và trong
ống nghiệm) có

8

,

6

% (3 chùng) có gen mã hóa FemA.

88,9% chủng có S.aureus có gen mã hóa mecA,
các Staphylococci Coagulase âm tính có 42,9% (15
chủng) có gen mã hóa mecA.

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1314 15

Lane 7: DNA ladder.

Lane 14 chủng

<b>s.</b>

aureus kháng Methiciilin (chứng
dương có Coagulase (+), mecA (+), FemA (+).

Lane 15: Chung V! khuẩn Streptococcus pyogenes
(chứng âm có Coagulase (-), mecA (-), FemA (-),

Lanes 2, 3, 9: chủng vi khuẩn có Coagulase (+),
mecA (+), FemA (+).

Lanes 1,2, 3, 5,

6

,

8

, 9 ,1 1 ,1 2 , 13: chùng vi khuẩn
có FemA (+).

Lanes 4, 10: chủng vi khuẩn chứng Ps.
aeruginosa, E.coli CÓ FemA (-).

Bảng 4. Đánh giá giá trị của các kỹ thuật xác định
Coaguíase của các chủng S.aureus

"■\i$ếí quả PCR
Test Coagầse^,

Có gen mã
hóa
Coagulase

Khơng có gen
mã hóa

Coagulase

Tổng
cộng
S.aureus

Coagulase (+) 45

0

45

Staphylococci

Cốgúlase (-) 3 32 35

Tổng cộng 48 32 80

Độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định
Coagulase cùa staphylococci là 93,8%, kỹ thuật
truyền thống cũng đã bỏ sót 3 chủng staphylococci
có gen mã hóa Coagulase. Độ đặc hiẹu cua kỹ thuật
truyen thống xác định Coagulase của các chủng
Staphylococci là

100

,

0

%.

Bảng 5. So sánh các kỹ thuật xác định tính kháng
Methiciliin của S.aureus

Kỹ thuật PCR Tồng

MecA (+) MecA {-)

Cefoxitin (+) 40

0

40

Cefoxitin (-)

0

5 5

Tống 40 5 45

Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện
tính kháng Methicillín ờ

<b>s.</b>

aureus !à 100,0%, độ đặc
hiệu là

100

,

0

%.

Bảng

6

. So sánh các kỹ thuật xác định íính kháng
Methicillỉn của staphylococci coagulase âm tính

Kỹ thuật PCR Tồng

MecA (+) MecA (-)

Cefoxitin (+) 15

0

15

Cefoxitin (-)

0

20

20

Tống 15

20

35

Độ nhạy của kỹ thuật dùng dĩa Cefoxitin phát hiện
tính kháng Methiciilin ở staphylococci coagulase âm
tính là

100

,

0

%, độ đặc hiệu là

100

,

0

%.

BÀN LUẬN

Nghiên cứu 80 chùng của các staphylococci
được định danh và xác định độc lực bằng phương
pháp truyền thống dựa vào tiêu bản nhuộm Gram,

tính chất Catalase dương tính, làm đơng huyết
tương, lên men đường Manrtit, tính chất tan máu và
khuẩn lạc có sắc tố màu vàng. Dựa vào các tính chất
này, chúng ta đã có thể định danh khá chính xác
S.aureus và các staphylococci coagulase âm tính.
Thời gian để định danh hết 40-48 giờ.

Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi để xác định gen mã
hóa FemA, ịoaguiase và gen mecA đề kháng
Meíhicĩllin của các chủng vi khuẩn cùa hai nhóm
Staphylococci, kết quả có 48 chủng vi khuẩn của các
Staphylococci có gen mã hóa Coaguiase, chiếm
60,0%, trong đó

100

,

0

% chủng

<b>s.</b>

aureus có
Coagulase dương tính với thử nghiệm Coaguiase
trên phiến kính đều có gen mã hóa FemA,
Coaguiase, tuy nhiên với các chủng staphylococci
Coagulase âm tính (cả với thử nghiệm ịoagulase

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

trên phiến kính và trong ống nghiệm) lại có đến

8

,

6

%
(3 chủng) có gen ma hóa ồoagúlase đồng thời
chúng cũng có gen mã hóa FemA. Qua so sánh íhẩy
độ nhạy của kỹ thuật truyền thống xác định
Coagulase cho thấy với cả 2 nhóm staphylococci là
93,8%, trong đó đối với S.aureus thì độ nhạy đến

100

,

0

% và độ đặc hiệu thì với nhóm staphylococci
coagulase âm tính là

100

,

0

%, tuy nhiên, kỹ thuật này
không xác định được gen coagulase nên khi dùng
PCR thi có 3 chùng có gen Coaguỉase.

Sử dụng kỹ thuật kháng sinh đồ khuếch tán trên

thạch theo phương phập Kirby-Bauer để xác định
tính kháng Methicillin bằng đĩa kháng sinh Cefoxitin
1qua ỉrung gian MecA, kết quả là các chủng s.aureus
có 88,9% kháng Coxiỉin, cịn các chủng
Staphylococci coaguíase âm tính kháng Cefoxitin !ai
đến 42,9%.

Kết quà PCR xác định gen mecA, chúng tôi nhận
thấy 88,9% các chủng s.aureus có gen mecA và
42,9% các Staphylococci coaguiase âm tính có gen
mecA. Qua so sánh thấy độ nhạy cùa kỹ thuật dùng
dĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin ở
S.aureus và staphylococci coagulase âm tính là
100,0%, độ đặc hiệu íà 100,0%. Tác giả
Venkatakrỉshna Rao (2011) đã đánh giá hiệu quả của
phương pháp khoanh giấy khuếch tán với đĩa
Cefoxitin 30 jjg, kết quả ghi nhận độ nhạy và độ đặc
hiệu của đĩa Cefoxitin phát hiện tính kháng Methicillin
qua trung gian mecA cỏ cả độ nhạy và độ đặc hiệu íà
100% [7].

Chúng tôi đã xây dựng được quy trình PCR đa
mồi để xác định gen mã hóa FemA, Coagulase và
gen mecA của các staphylococci bằng kỹ thuật đa
mồi. Chúng tôi lựa chọn thiết kế 3 cặp mồi để xác
định gen mã hóa FemA, Coaguiase và mecA có kích
thước sản phẩm khá khác biệt, chúng sẽ tách xa
nhau trong quá trinh điện di, tạo ra những băng cách
biệt nên dễ dàng nhận xét kết quả, tăng cao độ tin
cậy khi đánh giá kết quả. Các tác giả khác cũng có

gợi ý tương tự [2],[3],[43,C5],[8]. Quy trình tương đối
đơn giản, dễ thực hiện ờ tất cả các phịng thí nghiệm
hay phịng xét nghiệm có phương tiện cho PCR. Kết
quả nhanh chóng và chính xác, rát hữu ích cho lâm
sàng để kịp thời điều trị các nhiễm khuẩn do
Staphylococci. Nếu so sánh với quy trình chẩn đốn
Staphylococci và xác định tính kháng Methiciiiin theo
phương pháp truyền thống, chúng tôi nhận thấy:

- Phương pháp truyền thống: cho kết quả sớm
nhất là 40-48 giờ kể từ khi lấy mẫu nghiệm (nhuộm,
nuôi cấy, xác định coagulase, kỹ thuật đĩa kháng
sinh).

- Kỹ thuật PCR: cho kết quả sớm nhất là 20“24
giờ (nhuộm, nuôi cấy, PCR).

Với kỹ thuật 3 cặp mồi (triplex PCR) xác định gen
mã hóa FemA, Coaguiase và gen mecA cùa chúng

<b>tơi, kết quả hồn tồn đáng </b>tin <b>cậy, kỹ thuật thực hiện </b>

khơng quá phức tạp, các phòng thí nghiệm ở các
bệnh viện tuyến tỉnh đều có thể tiến hành được nhằm
chẩn đốn sởm, chính xác các nhiễm staphyiococci
và tính kháng thuốc của chúng để có hướng điều trị
kịp thời.

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu 80 chủng staphylococci bằng các
phương pháp xét nghiệm vi sinh truyền thống và sử
dụng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã xây dựng được quy
trỉnh PCR 3 cặp mồi (tripiex PCR) để xác định gen
FemA, gen mã hóa độc lực Coagulase và gen mecA.
<i>Quy trình có thể thực hiện được ở các bệnh viện </i>
tuyến tỉnh để chần đốn sớm, chính xác cấc nhiễm
khuẩn do staphyiococci và tính kháng thuốc của
chúng để điều trị hiệu quả.

TA! LIỆU THAM KHẢO

1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSi)
(2011), Performance Standards for Antimicrobial
Susceptibility Testing; Twenty-First Informational
Supplement, M 100-S21.JISSBN 1-56238-742-1)

2. Trần Thu Hoa, Đỗ Thị Lan Hương, Nguyễn Thị
Ngọc Loan, Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009),
"Nghiên cứu chế tạo bộ thử nghiệm multiplex PCR phái
hiện Staphylococci đề kháng Methỉciilin”, Y học TP Hồ
Chí Minh, Tập 13, Phụ bản số 2, tr. 176-180.

3. Hookey J.v, Richardson J.F and Cookson B.D
(1998), “Molecular typing of staphylococci Based on
PCR Restriction Fragment Length Poiymorphis and DNA
Sequence Analysis of the Coagulase gene”. J. of Clin.
Microbiol, Voi 36 (4), pp 1083-1089.

4. Kalhor H, Shariati L, Validi M et al (2012),

“Comparison of Agar screen and duplex PCR methods
in determination of MRSA strains isolated from nasal
carriage”. African J of Microbiology Research, Vol 6(16),
pp 3722-3726.

5. Motiagh Mohammad Reza Safari, Maesumeh
Anvari (2010), “Rapid detection of meỉhicillỉn-resistaní
Staphylococci by multiplex PCR", African Journal of
Biotechnology, Vol. 9(45), pp 7629-7631.

6

. Nizami D, Burcin o , Gu!ay G.D et al. (2012),
Antibiotic resistance genes & susceptibility patterns in
Staphylococci, Indian J Med Res, 135, pp 389-396.

7. Rao Venkatakrishna, Bhat Kishore, Kugaji
Manohar, Pai Vidya, Shantaram Manjula (2011),
“Detection of Methiciliin Resistance in staphylococci:
Comparison of Disc diffusion and MIC with mecA gene
detection by PCR”, international Journal of Pharmacy
and Biological Sciences, Voi. 1, Issue 4, pp 518-521.

8

. Thean Y Tan (2002), “A Comparison of PCR
detection of mecA with two standard methods of oxacillin
disk susceptibility testing for coagulase- negative
Staphylococci”, Journal of Medical Microbiology, Vol(51),
pp 83-85.

9. Phạm Hùng Vân (2006), Kỹ thuật xét nghiêm vi
sinh lâm sàng. Nhà xuất bản Y học.

</div>

<!--links-->