Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.26 MB, 7 trang )

(1)<div class='page_container' data-page=1>

(giáo dục nha khoa, súc miệng bằng dung dịch Fluor, 
khám răng, trám bít các hố rãnh) phù hợp với học sinh 
TH C S . Tuy nhiên, các nội dung chưa đáp ứng được 
yêu cầu ca về số lượng và chất lượng do thiếu cơ sở 
vật chất và nhân lực.

Triền khai chăm sóc răng miệng, giáo dục cách 
phòng chống, xử trí các bệnh răng miệng theo từng 
khối !ớp, giáo dục học sinh có học lực trung bình, kém, 
đào tạo cho giáo viên và cha/m ẹ học sinh về chương 
trình nha học đường là rất cần thiết. Tồ chức các buồl 
sinh hoạt ngoại khỏa cho học sinh về chăm sóc RM, 
và thực hiện khám bệnh S R , V L định kỳ 2 lần/năm cho 
học sinh. Gia đinh và nhà trường cùng chung tay hành 
động C S R M cho học sính.

TÀ I LIỆU T H A M K HẢ O

1. Nguyễn Mạnh Hà (2010), Sâu răng và các biến 
chứng.Nha xuất bản Giáo dục trè-22.

2. Bệnh viện Răng hàm mặt Thành phố Hồ Chí Minh 
(2005), "Báo cáo hoạt động chương trình Nha học đường 
năm 2005".

3. Khoa RHM Bệnh viện Nhi Đồng li Thành phố Hồ 
Chỉ Minh, Cách khám răng cho cộng đồng, Bài giảng về 
chăm sóc sức khoẻ răng miệng.

4. Nguyễn Anh Sơn (2010), Thực irạng bệnh sâu 
răng, viêm lợi và mộỉ số yểu tố liên quan ở học sinh khối

lớp 6 trường trung học cơ sờ thị trấn Hương Canh, huyện 
Bình Xuyên, tỉnh Vĩnh Phúc, Luận văn thạc sỹ y tế công 
cộng, Trường đại học Y tế cong cộng, Hà Nội.

5. Trần Văn Trường (2000), "Báo cáo công tác nha 
học đường", tr. 1.

6. Trần Văn Trường, Lâm Ngọc Ắn và Trịnh Đinh Hải 
(2001), Điều tra sức khỏe răng miệng toàn quốc, NXB Y 
học Hà Nội.

7. J.p. and S.G. Damle Bhavsar (1995), Dental caries 
and oral hygiene amongst 12-14 years old handicapped 
children of Bombay, India. J Indian Soc Pedod Prev Dent, 
1 - 3 , 1 3 .

8. Poul Erik Petersen và các cộng sự. (2004), "Effect 
of a school-based oral health education programme in 
Wuhan city, Peoples Republic of China", international 
Dental Journal. 54, tr. 33-41.

9. Ronald Patrick và các cộng sự. (2006), "Reducing 
Oral Health Disparities: A focus on Social and Cultural 
Determinants", BMC Oral Health. 6 Sumptement (S4).

10. W HO (1997), Oral health surey basic method. 4th 
Editison, Geneva, pp.25-28.

T hS : Bùi T h ị M inh Phư ợ ng 
Giảng viên bộ m ơn Hóa Sinh - Trường Đ ại h ọ c Y D ư ợ c Thái Bình

H ư ớ ng d ẫn k h o a học: G S .T S T ạ T hàn h V ăn 
Trưởng bộ m ỗn Hóa s in h - T rường đ ạ i học Y Hà N ội

T Ó M TẮ T

Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X. Người mẹ mang 
gen bệnh cố khả năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do vậy chủ yếu bệnh nhân là nam. Với sự tiến bộ 
của kỹ thuật sinh học phân từ, hiện nay các nhà khoa học có thể xẩc định chính xác vị trí đột biến gen yểu tố

víu

(F8) gây bệnh hemophilia A tăng hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chắt lượng chăm 
sóc súc khỏe trong cộng đồng.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu 60 bệnh nhân đã được chẩn đoán hemophilia A.
Mục tiêu: Xác định một số đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A.

Kểt quả: Kết quả cho thấy đã phát hiện được 90% (54/60) bệnh nhân hemophilia A có đột biến gen F8 bao 
gồm: đảo đoạn intron 22 là 35,2%, đột biến sai nghĩa là 20,4%, đột biến mất nucleotid là 11,1 %, đột biến vô nghĩa 
là 11,1%, đột biến thêm nucleotid là 11,1%, đột biển vị trí nối exon-intron là 5,55%, đột biến mất đoạn lớn là 
5,55%.

Kết luận: Đây là kỹ thuật hữu ích giúp ích cho việc phát hiện sớm cốc gen gây đột biến có hướng tư vấn chẩn 
đốn trướcAmng quả trình mang thai.

Từ khóa: Hemophilia A, gen F8.
S U M M A R Y _

DETECTION OF DISEASE- CAUSING GENE MUTATIONS IN HEMOPHILIA A BY PCR

Hemophilia A is a recessive sex-linked disease, the gene caused the disease locates in X chromosome. An 
affected mother can deliver the disease to 50% o f her sons, thus most o f the patients are male. With the advance

o f molecular biotechnology, scientists can correctly determine the location o f mutation o f Factor VIII (F8) gene 
causing Hemophilia A to increase the effect o f disease control and improve community health services.

Subjects and methods: study subjects were 60 patients diagnosed with hemophilia A.

Objective: The objective o f the study was to detect some F8 gene mutations causing hemophilia A.

</div>
(2)<div class='page_container' data-page=2>

mutation, 5.55% o f patients with exon-intron connecting mutation and 5.55% o f patients with large section deletion 
mutation.

Conclusion: This is a useful technique for early detection o f genes causing mutations to give counseling and 
diagnostic before and during pregnancy.

Keyw ords: Hemophilia A, F8 gene.

Đ Ặ T V Ấ N Đ Ề

Hemophilia A là bệnh rối ioạn đông máu, bệnh gây 
nên do thiếu hụt hay bát thường chức năng củã yếu tố 
V III. Đ â y ià một bẹnh di truyền gen iặn íiên kết với 
nhiễm sac thể giới tính X. Việt N am là một nước cỏ tỷ 
lệ mắc bệnh hemophilia A trong cộng đồng khá cao. 
Theo nghiên cứu cua Đ ỗ Trung Phấn năm 1996 tỳ lệ 
mắc bệnh hemophilia A khoảng 2 5 - 60/1.000.000 
người. Hiện nay tại Việt Nam có khoảng 6000 bệnh 
nhân hemophilia Ả trong đó chỉ có 30% được phát 
hiện và điều trị, phương pháp điều trị chủ yếu íả sử 
đụng yếu tố V lỉí trong máu tồn phần (truyền trực tiếp 
hoặc tách chiết) rất tốn kém mà hiệu qua không cao, 
đặc biệt có nguy cơ cao đối với các bệnh lây truyền

qua đường máu. Trên thể giới, các nha khoa học đã 
phân tích gen của bệnh nhân hemophilia A và rất 
nhiều dạng đột biến gen yếu tố VIII (F8) được công bố. 
C ác nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau 
sẽ gây những kiểu hình đặc trừng khác nhau. Bệnh 
nhân hemophilia A thề nặng thường gặp dạng đột biến 
đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-5Ò%),bệnh nhân 
hemophilia A thề nhẹ và trung bình chủ yeu ià đột biến 
điểm (chiếm 90-95% ). ở v ĩệ t Nam, các cơng trình 
nghiên cứu về bệnh hemophilia A chủ yểu là nghiên 
cứu yề đặc điềm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ 
iệ mắc bệnh hoặc đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bằng 
các chế phẩm thay thế.T. Với sự tiến bộ của kỹ thuật 
sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể phân tích 
D N A của người bệnh để xác định chính xác các tổn 
thương gen gây bệnh hemophilia A, cũng như kiểm 
soát bệnh tốt hơn nhờ phát hiện người phụ nữ mang 
gen bệnh và tư vấn di truyền trưởc hôn nhân, tăng 
hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh tật đông thời 
nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe trong cộng 
đồng.

Mục tiêu của đề tài:

1. Xác định m ộỉ sổ đột biến trên gen F8 gây bệnh 
hemophilia Á.

2. Mối liên quan giữa thể bệnh với một số đột biến 
gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam.

Đ Ố I T Ư Ợ N G V À P H Ư Ơ N G P H Á P
1. ĐỐI tứ ợ n g nghiên cứu

Nhỏm đối chứng: gòm 2 0 người (10 nam, 10 nữ) 
khỏe mạnh, tiền sử gia đình khơng có ngườỉ mắc bệnh 
di truyền. Nhóm chứng dùng để chuẩn hóa kỹ thuật và 
làm mẫu đối chứng cung với mẫu nghiên cứu để khi 
thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích 
gen.

Nhóm nghiên cứu: 6 0 bệnh nhân được chẩn đoán 
xác ổịnh hemophillia A tại Viện Nhi Trung ương và 
Viện Huyểt học Truyền máu Trung ương.

Tiêu chuẩn lựa chọn:
* Lâm sàng:

+ Chảy máu: Chảy máu khó cầm sau chấn thương,

sau va chạm hay chảy máu một cách íự nhiên.

+ Vị trí: Chảy máu trong khớp, cơ hoặc một sổ vị trí 
khác.

+ Tính chất; Thường chảy máu tái phát.

+ Tiền sừ: Có tiền sử chấy máu kéo dài hoặc trong 
gia đinh có người thân bị chày máu khó cầm.

* Cận lâm sàng:

+ Định lượng yếu tố FV1II giảm dưới 30% .
- Thể nặng: Hoạt tính yếu tố FVIII < 1%.
- Thể trung bình: Hoạt tính yếu tố F V II1 1-5%.
- Th ể nhẹ: Hoạt tính yếu tố FVIII 5-30% .
+ A P T T kéo dài.

+ Thời gian máu chảy binh thường.

+ Số lượng tiểu cầu và độ tập trung tiểu cầu binh
thường.

2. Tran g th iế t bị, dụng cụ nghiên cứu và hóa 
chất

3. P hư ơ n g p háp v à kỹ th u ậ t nghiên cứu

Đối với bệnh nhân thể nặng: xác định hiện tượng 
đảo đoạn intron 22 bằng phừơng pháp Inversion PCR 
(l-PCR ). Khơng có đột biến đảo đoạn iníron 22, xác 
định đao ổoạn intron 1 bằng phương pháp Multiplex 
PCR. Nếu vẫn không xác định được thì ta khuyếch đại 
toàn bộ 2 6 exon để tim đột biển mất exon. Nếu khơng 
có đột biến, phân tích đột biến điềm bằng phương 
pháp giải trình tự gen.

Đoi với bệnh nhân thể vừa và nhẹ sử dụng 
phương pháp P C R để xác định đột biến mất exon, nếu 
khơng đột biến thì giải trinh tự gen trực tiếp để phát 
hiện các dạng đột bien điểm.

3.1. QŨy trình lẩ y mẫu

Bệnh nhân đã chẩn đoán hemophilia A được iấy 
5ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông EDTA 
với hàm lượng 1,5mg/mL. Q uy trinh lấy máu đảm bảo 
vơ írùng tuyệt đối.

3.2. Quy trình tách c h iế t DNA từ m áu n goại v i
3.3. Xác đ ịnh đ ộ t biến gen F8

3.3.1. Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹ 
thuật l - P C R '

k ỹ thuật l-PC R gồm 3 bước: (1) c ắ t DNA bằng 
enzyme Bell, (2) NỐI bằng T 4 ligate, (3) Khuyếch đại 
bằng phản ưng multiplex PCR . Phương pháp I-PCR 
có ưu điểm là dễ tiến hành. Enzym e Bell tác dụng rất 
đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym e có tính đạc hiệu 
cao. San phẩm P C R được khuyếch đại dễ dàng trong 
thời gian khoảng 3 0 phút do các đoạn DNA có kích 
thước ngắn (487 và 559pb). Như vậy xét nghiệm phân 
tích gen được tiến hành nhanh chóng, kết quả ỉhụ 
được có độ tín cậy cao, dễ thực hiện.

3.3.2. Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1 bằng kỹ 
ỉhuật multiplex PCR

</div>
(3)<div class='page_container' data-page=3>

cho Ĩnt1h1 cộng với một mồi đặc hiệu cho chuỗi Ỉn1h2, 
phản ứng 2 chứa cặp mồi đặc hiệu int1h2 cộng với

một mồi đặc hiệu cho intl h 1. D ựa vào kích thước khác 
nhau của các đoạn D N A sau khi điện di để phát hiện 
đột biến.

3.3.3. Phất hiện đột biến mất exon bằng kỹ thuật 
PCR

Phản ứng P C R sử dụng cặp mồi đặc hiệu để 
khuếch đại từng exon của gen F8, sau đó điện di trên 
gel agarose, mẫu bệnh nhân đưực tiến hành song 
sọng với mẫu đối chứng. Nếu m âu đối chứng xuất 
hiện vạch DNA tương ứng với kích thước của exon 
được khuếch đại, ĩrong khi mẫu bệnh nhân không xuấỉ 
hiện vạch thỉ bệnh nhân bị đột biến m ất đoạn exort đó.

3.3.4. Phát hiện đột biến điểm bằng kỹ thuật giải 
trình tự gen

Được thực hiện theo qui trình sử dụng phương 
phốp BigDye terminator sequencing (Applied 
Bỉosysíems, Foster city USA ). V iệc phân tích kểt quả 
dựa vào sự so sánh trình tự geri cua bệnh nhan với 
trình tự gen chuẩn của Gen Bank(nạtỉona! center for 
biotechnology information, NCBI) bằng phần mềm 
CLC. So sánh trinh tự các acid amin của bệnh nhân 
với trinh tự chuẩn chùa G enbank bằng phần mềm 
Biast của NCBI.

K É T Q U Ả

1. Đ ặ c đ iểm c h un g v ề đ ố i tư ợ n g nghiên cứu
4 5 /6 0 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng thể 
nặng chiếm tỷ lệ 75% , 10/60 bệnh nhân thể írung bình 
chiếm tỷ lệ 16,67% , 5/60 bệnh nhân thể nhẹ chĩếm tỷ 
lệ 8,33% .

2. T ỷ iệ p h á t hiện đ ư ợ c đ ộ t biến

2.1. Ty iệ bệnh nhân theó k ế t quả p h á t hiện đột 
biến

Nghiên cứu phái hiện được 5 4 /6 0 trường hợp 
bệnh nhân có đột biến gen F 8 gây bệnh hemophilia A 
chiếm tỷ iệ 90% . Số bệnh nhân chưá phát hiện được 
là 6/6 0 chiếm tỷ lệ 10%.

2.2. Tỳ lệ đ ộ t biến theo thề bệnh ở nhóm p h á t
hiên và nhóm khơng p h á t hiện '___________

H P h ố i hiện đ ư ợ c ta C h u a p h àt hiện đ irợ c
100.00%

90.0054 
80.00%
70.00%
60.0054
SO.OOSé
40.00%
-30.0054
20.0 0 %

10.00«
0.00% -1

T ru n g b ìn h Nhẹ

- Thể nhẹ: 4 /5 bệnh nhân phát hiện được đột biến 
chiếm tỷ lệ 80% , 1/5 bệnh nhân chưa phát hiện được 
đột biến chiếm 20% .

3. K ế t quả p h á ỉ h iện c ác d ạ n g đ ộ t biến gen F8
3.1. K ế t quả xác đ ịnh đ ộ t biến đảo đoạn

3.1.1. Kết quả xấc định đột biến đảo đoạn íntron 22 
bằng kỹ thuật Inversion PCR

45 bệnh nhân hemophillia A chẩn đoán trên lâm 
sàng thể nặng được xét nghiệm đột biến đảo đoạn 
Intrõn 2 2 bắng phương pháp Inversion PCR . Kết quả 
có 19/45 bệnh nhân có đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ 
42,2% .

ĐC HA HA RA BA HA HA HA M
02 33 07 12 2 0 3 3 55

SOObp ss%p

4S7fcp

M : (aark e r kich thiròc lOObp
E C : Mầu đui ch ũ sg ( n g u ơ i bìtili tlitrịng)

HA33, HA3S Khơng cò ãăc đoạn {iron 22

HA02, HA07, HA ù , HA20.HAS5: rô d j}*
itroa ĩ ĩ

Hình 1. Hình ảnh điện dĩ sản phẩm PCR xác định đột biến 
đảo đoạn ỉnỉron 22

Nhận xét: D N A người bình thường ở mẫu đối 
chứng dương (+) khi được khuếch đại bang phản ứng 
multiplex P C R có 1 băng kích thước tương ứng 4 87 
bp. Nếu đột biến xảy ra, khi khuếch đại sẽ cho 1 đoạn 
kích thước 559 bp. N hư vậy, ở vị trí các giếng tương 
ứng với các bệnh nhân m ã số HA33, H A38 khơng có 
đảo đoạn intron 22 do cùng có vạch DNA kích thước 
4 8 7 bp. ở giếng mã số H A02, HA07, HA12, HA20, 
HA55 là bệnh nhân hemophiília A có đột biến đảo 
đoạn intron 22 (hình 1) do điện di đều có vạch DNA 
kích thước 559bp.

3.1.2. Xác định đột biến đảo đoạn intron 1 bằng 
phương pháp Multiplex PCR

Có 19/45 bệnh nhân hemophilỉia A thề nặng bị đột 
biến đảo đoạn intron 2 2 , 2 6 /4 5 bệnh nhân hemophillỉa 
A thể nặng còn lại tiếp tục được sàng lọc đột biển đảo 
đoạn intron 1 thẽo phương pháp multiplex P C R Kết 
quả 26 bệnh nhân này không bị đột biến đảo đoạn 
intron 1.

| M | p i M
M PI P2 PI P2 Pi P2 Ỉ T n M

Biễuđơ í: Tỷ lệ đọt biên theo the bẹnh ở nhóm phát hiện 
và nhóm chưa phát hiện được

Nhận xét:

- Thể nặng: 41/45 bệnh nhân phát hiện được đột 
biến chiếm tỷ ịệ 91,1% . 4 /4 5 bệnh nhân chưa phát 
hiện được đột biến chiếm tỳ !ệ 8,9% .

- Thể trung binh: 9/10 bệnh nhân phát hiện được 
đột biến chiếm tỷ iệ 90% . 1/10 bệnh nhản chưa pháỉ 
hiện được đột biến chiếm tỷ lệ 10%.

2kb

—>\

Ikb—

ụ

— 1191bp

M: Maầer kích thước
Pi: Phàn ứng l dặc hiệu cho iníihỉ
P2: Phán úng 2dặc hiệu cho iflt!h2

</div>
(4)<div class='page_container' data-page=4>

Nhận xét: Trong kết quả ở hình 2, các phản ứng 
multiplex P C R khuếch đại đoạn Ỉnt1h1 (P 1) chỉ cho các 
đoạn DNA kích thước 1908bp chứng tỏ cặp mồi 9F và 
9cR thiết kế cho đoạn in tlh l bắt cạp với nhau. Các 
phản ứng khuếch ổại đoạn in t l h i (P 2) ổều cho kích 
thước 1191 bp chứng tỏ chì cỏ cặp mồi int1h-2R và

ÌnMh-21" hiâi I H-yV/ínạr* in H í y ? wAi 1-jh g ii

Như vậy, không có đột biến ỉntron 1. ờ các bệnh nhân 
mã số H A15, HA46, H A45 và HA24.

3.2. K ế t quả p h á t hiện đ ộ t biến m ấ t exon bằng 
phản ứng PCR

Nghiên cứu này có 3 bệnh nhân đột biến mất exon 
bao gồm HA38, HA51, HA55.

- Đột biến mất exon 8 và exon 9 ở bệnh nhân 
H A 51:

Exon7

Exon 8

Exon9

Exon 10

-

Ỷ BN -

+ BN *

+

BN -

+ BN M

M: Marker í GObp

BN: bệnh nhân

4-: đoi chứng dương

- ; đối chứng âm

Hình 3. Kết qua PCR xác định đột biến mắt exon ờ bệnh

nhân HA51

Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ HA51 sau khi được 
khuếch đại toàn bộ 38 cặp mồi cùng với các mẫu đổi 
chứng âm và đối chứng dương phát hiện ở vị trí exon

3.3.2. Đột biến sai nghĩa

C.6545

I

I C A C T C T T C G C A T G G A G T T G .

Người bình thường

8, exon 9 của bệnh nhân khơng có vạch D N A trong khi 
tát cả các exon còn lại đều lên vạch DNA tương ứng 
với mẫu đổi chứng dương. Đ iều này chứng tò bệnh 
nhân bị đột biến mat đoạn exon 8 và exon 9.

3.3. K ế t quả p h á t hiện đ ộ t biến bằng ph ư ơ n g 
pháp g iả i trình tự

Ọ o ỉẤn

o. o . /. L ý Ụ i U Ỉ K s i i /7/ái U U Ờ i i Ỉ Ỉ U U i & U U U

Đ ột biến mất 15 nuclẽtid.

' • f 5 c.43S459doi15Nu

I

p . ttS - ^ S d e lY ty n

GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACAC' GCTGAGGT^ATTAC

Ngtrờibmhthirêng BệnhnfiẵnHA46

135-139

GtaeBaak 125 E.I£gn0ftSy Y r e m ĩL:<mSHPVSLBMGVSraKÃSEI£SYVF3SLCLSVCLH5
L L S y n Q R E V I T U N ® S H ? V S L H f tV G V S r> « A S E IS G m C S L & S V C L a 3
^ 1 LLGPT1QASV...ĨTLKỉmSHPVStHAVGVSríỉ[®SBISCrv'FDSLĨLSVCLHS
Hirih 4. Hinh ẫnti đột biên mẫt đoạrí 15 nucieotid ơ bệnih

nhân HA46

Nhận xét: Bệnh nhân m ã số H A46 thể nặng, không 
phát hiện thấy đảo đoạn intron 22, intron 1. khuếch đại
38 cặp mồi đều lên vạch căng, rõ nét. Tinh sạch DNA 
của các phản ứng khuếch đại này và giải trình tự, sau 
đó so sánh với trình tự người bình thường. Kết quả tại 
exon 4 phát hiện thấy độí biến mất 15 nucleotid tại vị 
trí c.435-450. Khi kiểm tra sự thay đổi acid amin do đột 
biển gây ra, thấy tại vị trí protein từ 135 đến 139 bị mẩt 
5 acid amin Tyrosin, Asparagin, Threonỉn, Valin, Valin 
(p. 135-13 9 d e lí yr-Vai).

C.6545G>A
p.R2182H(Arg 2182 His)

Ỷ

C A C T C T T C A C A T G G A G T T Gj

Bệnh nhân HA59

2182

Q u e r y 2 1 4 4
S b j c t 1

VFFG1WDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNS

219:

VFFGNVDSSGIKHWIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTL MELMGCDLNS

VFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLHMELMGCDLNS

4 9

</div>
(5)<div class='page_container' data-page=5>

Nhận xẻt: Hỉnh ảnh giải trình tự ở bệnh nhân mã số 
HA59 cho thấy: có đột biến thay thế rìũcleotid G thành 
nucleotid A (G>A) trên exon 23 cùa gen F8. So sánh 
với trình tự Genebank thấy trên exon 23 vị trí C.6545 
G>A, dân đến thay đổi acid amin vị trí p.2182 của 
protein gen F8 từ Arginin thành Histidin 
(p.Arg2182His).

3.3.3. Đột biến thêm vô nghĩa

C *H T m mpUUa{UtiíMĩi#tì

. TTCTCĨGGAĨAĨACCTTCAA ĨĨC TC ĨG O A ĨA A A C C ĨĨC A A A

Ĩ Ị 4 Í

CĩMbuk 1W JflUw»}i$£Y^5w«lWttMĨĨwíi3mộ(J
m m s s w M m m m m w w m

Hình 6. Hình ảnh đột biến tạo stop codon 
của bệnh nhân HA33

Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ H A 33 sau khi được 
giải trình tự kiểm tra vị trí đột biến cho thấy: đột biến 
thay thế nucleotid T bằng nucỉeotid A tại vị trí 6425. So 
sánh với trình tự Genebank cho thấy: đột biến này làm 
thay đổi acid amin Leucin tạo thành stop codon gây 
dừng đột ngột quá trình phiên m ã protein 
(p.Leu2142Stop).

3.3.4. Đột biến thêm một nucleotid
Đ ột biến thêm nuđeotid C:

e.2777 e,2777ỉn»c

p.S827iiu{lytỉỉ7lnt)

TTAGGACCCCCAAGTATGCCi TTAGGACCCCCCAAGTATGCC

Ngiròiblnli tỉuròng B ệnh nhản H.AQ3

3.3.5. Đột biến mẩt 1 nucleotìd 
Đ ột biến m ất nudeotid A:

e.3389deU
p.R1130del( Argilỉãđei)

G G AG C C A A A A A A A A TA A C C T T- G G A G C C A A A A A AaVaA C C T T

Ê ấ k ầ m ề ề ì ề ấ

N g trờ i b in h th ư ờ n g Bệnh nhãn HA01

1130

-

_

-B

CíBsbiaỉi m e Q asĩTaTĩ-iọsD3as5s?asfQKKTEHĩFi&11ỉ3aĩ8ĩVarjỉLSJiffiỊJĩBFLS¥iTS 1 H Ỉ
gssiH rĩiBísie

RUI 5 6 i Ỗ55ÌTSTTÌỈ5D5K 1020

Hình 8. Hình ảnh đột biến mất nucleotid A của bệnh nhân 
HA01

Nhận xét: Hinh ảnh giải trình tự cho thấy bệnh 
nhân HA01 có đột biến m at một nucieotid A. So sẩnh 
với trinh tự G enebank thấỵ mất một nucleotid A tại vị 
C.3388, dan đến protein yếu tố V íll bi lệch khung dịch 
mã toàn bộ acid amin từ vị trí p. 1130 (p.Ầrg1130deỉ).
...3 Â 3 .i.-Ề 9 L Ế Ể Đ J Ể .y ịM .ũ Ế ...

c iì o r cil5J«5a»T

TTTCATGAAGGTTAGTGAGTCTT TTTGATGAAGTTTAGĩCAGTCTT;

Ngi^t bình thưửng Bịnh nhin HA4Ỉ

Hình 9. Hình ảnh độỉ biến tại vị trí nối exon/intron của bệnh 
nhân HA45

Nhận xét: Với những thay đỗi bầt thường ở gần 
hoặc tại vị trí đầu hoặc cuối exon là vị írí nối giữa exon 
v à in íro n 1 3 .

4. Mối liên quan giữa thể bệnh và độỉ biến khác 
nhau trên bệnh nhân hemophillia A

4.1. Tỷ lệ các dạng đột biến phát hiện được trên 
bệnh nhân hemophillia A__ __ ____________ ____

8 8 5 'Ã A "S lK K L Ì);K V 3S ĨSỉ;ỉÌI,I3T ĩf5D H L A A ữ T D :ỉT 5S L 5??r^L D F :< V S T A ĨL F ?F M S 3 3 6 '
ĨA A ?S L K K L D íK V S3T 3ìiíỉI.ISĨIP3K -ÍI.M 'Ơ T D !í?SSL G f?

KA03 Ĩ S ì ? Ã n ? S L ^ L 5 H V S SĨ S Í i a ĩ I S Ĩ I P S3 !ilM G T D !l?S S L g??S _ _____ _ 2 3 2
Hình 7. Hình ảnh đột biến ỉhêm nucleotỉd

c

của bệnh nhản

HA03

Nhận xét: Hỉnh ảnh giải trình tự cho thấy bệnh 
nhân mã số HA03 có đột biến thêm một nucleotid

c.

Kiểm tra trên trinh tự G enebank x ác định thay đồi này 
trên exon 14 !à C.2777 insC, đột biến gây lệch khung 
dịch mã toàn bộ acid amin còn lại từ vị trt 
p.927(p.Lys927ĩns).

r * <§>

Bieu đồ 2: Các dạng đột biên pháỉ hiện được ỉrên bệnh 
nhân hemophilia A

Nhận xét: Trong 5 4 bệnh nhân phát hiện được đột 
biến co:

- Đ ộ t biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỷ lệ cao nhất: 
1 9 /5 4 (3 5 ,2 % ).

</div>
(6)<div class='page_container' data-page=6>

thêm nucleoíid đứng íhứ ba, mỗi loại 6/54 (11,1% ).

- Chiếm tỵ lệ thấp nhất là đột biến tại vị trí nối exon- 
intron, đột biến mất đoạn lớn: mỗi loại 3/54 (5,55% ).

4.2. Tỷ lệ các dạng đột biến trông từng thể bệnh

100.00%

o n n tĩỊí
80.00%
70,00%
.60.00%
50.00%
40.00%
30.00%

20,00%

10.00%

0.00%

Intron 22
Thể nặng

đột biến điểm
Thể trung bình

đột biến đỉểm

ĩh ể n h ẹ

Biểu đồ 3: Tỷ lệ các dạng đột biến trong từng thể bệnh
Nhận xét:

- Đ ộ t biến đảo đoạn Intron 22: chỉ gặp ở bệnh nhân 
thể nặng: 1 9 /4 5 (4 2 ,2 % ).

- Đ ột biến điểm gặp chù yếu ở thề trung bỉnh 90% 
(9/10), thể nhẹ 80% (4/5).

4.3. Tỷ lệ đột biến ờ bệnh nhân hemophilia A
thể n ặ n g _____________

3.90%

* Đào đoạn itron 22

B Đội biền điềm
ÍỈS Mất đoạn lớn
B Chưa phát hiện

Biễu đồ 5: Tỷ lệ đột biến ở bệnh nhân hemophillia A thể 
nặng

Nhận xét: Bệnh nhân hemophilia A thề nặng:
- 1 9 / 4 5 (42,2% ) đột biến đảo đoạn Intron 22.
- 1 9 / 4 5 (42,2% ) đột biến điềm. ’

- 3/45 (6,7% ) đột biến mất đoạn lớn.
- 4 /4 5 (8,9% ) chưa phát hiện được đột biến.
B À N LUẬN

Bệnh hemophilia A !à một bệnh di truyền do thiếu 
hụt hoặc bất thường chức năng của yếu tố đông máu 
huyết tương - yếu tố Vill. T ừ năm 1984, nghiên cứu 
của Gitschier đã cho thấy những hiểu biết đầy đủ về 
cấu trúc phân từ gen F8 tổng hợp protein yếu tố VIII,

mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế bệnh học 
phân tử hemophilia A và các dạng đột biến gen F8 gây 
bệnh.

X ác định vị trí các đột biến gen F 8 ử bệnh nhân 
hemophilia A cung cẩp nhiều lợi ích cho khoa học cơ 
bản và ứng dụng lâm sàng. Đổi với những bệnh nhân 
bị bệnh hemophilia A, xác định được vị trí đột biến là 
một tiêu chuẩn vàng để khằng định chính xác chẩn

đốn bệnh, ngồi ra nó cũng hỗ trợ trong việc tiên 
íượng mức độ nghiêm trọng của bệnh và diễn biến lâm

Sàng7 trong dự báo nguy cơ phát triển các kháng íhể

kháng FVIII đẻ từ đó lựa chọn phương pháp điều trị tối 
ưu. Hơn nữa, xác định được vị trí đột biến của bệnh 
nhân ià điều kiện tiên quyểt cho việc chẩn đoán trước 
sinh nhữna phụ nữ mang gen bệnh và tiến hành thiết 
lập bản đo đột biển gen F8 là tiền đ ề hết sức quan 
trọng cho việc áp đụng liệu pháp điều trị gen trong 
tương lai để giải quyết triệt để căn bệnh này.

T y lệ p h á t hiện đ ư ợ c đ ộ t biến

Trong nghiên cứu này, xác định đột biến trên gen 
F8 được thực hiện ở 6 0 bệnh nhân đã được chần 
đoán hemophilia A khơng có quan hệ huyết thống: Có 
54 trường hợp phát hiện được đột biến chiếm 90% , 6 
(10% ) trường hợp chưa phát hiện được đột biến. T ỷ lệ 
chưa phát hiện được đọt biến của chúng tôi cao hơn 
các tác giả khác công bổ là 2-7% , nguyên nhân có thể 
do chúng tôi chưa phối hợp được các phương pháp 
khác để chẩn đoán các vị trí đọt biến ờ trong vùng 
intron, chưa xác định được các đọt biến lặp đoạn DNA 
bằng phương pháp M L P Ầ ... Tuy nhiên so với các tác 
giả chì sử dụng phương pháp giải trinh tự gen đơn 
thuần thì tỷ lệ phảt hiện được đột biến cùa chủng tơi 
íương đối cao, phù hợp. s ố bệnh nhân phát hiện được 
đột biến ở từng thể bệnh là: Thể nặng 9 1 ,i% , thể

trung bình 90% , thể nhẹ 80% . So với tỳ lệ phát hiện 
được đột biến cua tác giả Santacroce và cộng sự thực 
hiện trên 1296 bệnh nhân hemophilia A ở Italia là 874 
(89% ), 146 (84% ), 133 (94% ) tứơng ứng bệnh nhận 
thể nặng, trung bình, nhẹ. [3]. Theo tac gia Bogdanova 
cũng chì sừ dụng phương pháp giải trình tự phát hiện 
đột biến cho kết quả xác định được đột biến từng thể 
là: 100% íhể nặng, 9 6 % thể trung bình và 8 8 % the nhẹ

ư l

x

C ác dạng ỡ ộ ỉ biên g â y b ệnh h em o ph ilia A ờ 
V iệ tN a m

T ỉ !ệ các dạng đột biến khác nhau trong nghiên cứu 
của chúng tôi cho thấy hay gặp nhầt là đảo đoạn intron 
22 (35,2% ). T ỷ íệ này tướng tự với tỷ lệ đột biến đảo 
đoạn intron 2 2 đã được cong bố 4 2 - 50% ở nhóm 
bệnh nhân thể nặng, ở Đ ài Loan tỷ lệ nảy là 45,1% , 
40-5 0 % ở Châu Ấu.

</div>
(7)<div class='page_container' data-page=7>

Hungari. Nghiên cứu trên bệnh nhân hemophilia A ờ 
Ắn Đ ộ thấy ỉỷ ịệ đột biến iníron 1 ià 2,7% , tương tự 
nghiên cứu ờ Nam Phi các đột biến này chỉ tim thầy ở 
bệnh nhân da đen m à khơng tìm ìhấy ở bệnh nhân da 
trắng. Tuy nhiên, đảo đoạn intron 1 là một đột biến 
quan trọng cần sàng lọc, m ặc dù tỷ íệ phát hiện trong 
quần thể người da trắng thấp.

Sau khi thu được D N A có chất lượng tốt chúng tôi

sử dụng kỹ thuật P C R với 38 cặp mối đặc hiệu cho 26 
exon cua gen F8 và phát hiện được 3 bệnh nhân bị đột 
biến mất ẽxon chiếm tỷ íệ 5,55% . Với 23 bệnh nhân 
thể nặng, 10 bệnh nhân thể trung bình và 5 bệnh nhân 
thể nhẹ sừ dụng kỹ thật giải trinh tự gen để xác định 
các loại đột biến điểm cho kết quả: dạng đột biến sai 
nghĩa 20,4% , đột biến m ất /thêm nucieotid và đột biến 
vô nghĩa có cùng tì lệ 11,1% ; đột biến vị trí nối và đột 
biến mẩt đoạn lớn có tì lệ là 5 ,55% trong số bệnh nhân 
phái hiện được đột biến. C ác ioại đột biển được tỉm 
thấy tỉ ỉệ phù hợp với các kết quả báó cáo được cơng 
bố bởi các tác giả R epesse [9], Jochen Graw [5], 
Adoracion Venceia [1], Rosetti [8].

cứu khác trên thế cỊịới
Pháp

[9]
120
BN

Đức
[53
845
BN

Tây
Ban
Nha C1]
267 BN

Argentina
[83
260 BN

Nghiên
cứu này

60 BN
inỉron 22 46,0% 35,7% 43% 44% 35,2%
Sai nghĩa 15,0% 38,2% 34% 12,2% 20,4%
Vị trí nối 7,0% 2,6% 2,6% 3,7% 5,55%
Vơ nghĩa 13,0% 9,3% 3,7% 10,2% 11,1%

Thêm

nucleoíid 7,0% 2,6% 2,0% 1,9% 11,1%
Mát

nucleotid 10,0% 7,5% 7,8% 15,9% 11,1%
Mât đoạn

lớn 2,0% 3,0% 1,0% 10,2% 5,55%

K Ế T LUẬN

Nghiên cứu phát hiện đột biến gen F8 trên 6 0 bệnh 
nhân bằng sử dụng kết hợp 4 phương pháp khác 
nhau, chúng tôi rút ra được kểt luận sau:

1. P h á t hiện đ ộ t bỉến g en F 8 ờ bệnh nhân

hemophilia A của Việt Nam

- Tỷ lệ phát hiện được đột biến là 9 0 % (54/60 bệnh 
nhân), trong đó tỉ íệ phát hiện đột biến ở thể nặng 
91,1% , ờ the trung bình 9 0 % và ở thể nhẹ 80%.

- C ác dạng đột biến được phát hiện bao gồm: đảo 
đoạn iníron 22 là 3 5,2% (1 9 /5 4 bệnh nhân), đột biến 
sai nghĩa ià 2 0,4% (11/54 bệnh nhân), đột biến mất 
nucleotid là 11,1 % (6/54 bệnh nhân), đột biến vô nghĩa 
là 11,1% (6/54 bệnh nhân), đột biến thêm nucleotid là
11,1% (6/54 bệnh nhân), đột biến vị trí nối exon-iníron 
là 5,55% (3/54 bệnh nhân), đột biến m ất đoạn lớn là 
5,55% (3/54 bệnh nhân),

2. T ỷ iệ đ ộ t biến p h á t hiện đ ư ợ c với th ể lâm

sàng

- Thể nặng: phát hiện được đột biến đảo đoạn 
intron 22 lá cao nhất chiếm tỉ lẹ 42,2% , đột bien mất 
đoạn lớn là 6,7% , đột biến điểm ià 42,2% .

- Thể trung bình, thể nhẹ khơng có đột biến đảo

đoạn, chl gặp đột biến điểm 9 0% ở thể trung bình, 
80% ở thể nhẹ.

- Chưa phát hiện được đột biến đảo đoạn in tro n l.

KIẾN NGHỊ

1. Thiết lập và quản lý cơ sờ dữ liệu về bệnh nhân 
và người mang gen bệnh hemophilia A.

2. T ư vấn di truyền trước hơn nhân và chẩn đốn 
trước sinh cho những người mang gen bệnh trước - 
trong quá trinh mang thai.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Adoración Venceslá, Maria Angeles Corral- 
Rodriguez, Manei Baena, Mónica Comet, Montserrat 
Domènech, Montserrat Baiget, Pablo Fuentes-Prior, 
Eduardo F, Tizzano. (2008). identification of 31 novel 
mutations in the F8 gene in Spanish hemophilia A 
patients: structural analysis of 20 sai nghĩa mutations 
suggests new intermoiecular binding sites. Blood, 111(7), 
3468-3478.

2. Brockway W l, Olson ID, Fass DN, Bowie JW, Mann 
KG. (1977). Purification of porcine and human ristocetin- 
Wiilebrand factor. LabClin Med, 89,1278-1294.

3. Castaman G, Margaglione M, Morfini M, Rocino A, 
Santagostino E, Tagarielio G, Mannucci PM. (2008). The 
Italian AICE-Genetics hemophilia A daỉabase:results and 
correlation with clinical phenotype. Haematologica. 93(5),

722-728.

4. Chang SP, Ma GC, Chen M, Kuo SJ, Chang c s , 
Shen MC. (2008). The spectrum of ỉhe factor 8 (F8) 
defects in Taiwanese patients with haemophilia A. 
Haemophiiia, 14,787-795.

5. Hans Hermann, Brackmann, Jochen Graw, 
Johannes Oldenburg. (2005). Heamophilia A: from 
mutation analysis to new therapies. Nature reviews 
Genetics, 6,488-501.

6. Kazazian HH, Jr Lakich D, Antonarakis SE, 
Gitschier J. (1993). Inversions disrupting the factor VIII 
gene are a common cause of severe haemophilia A. Nat 
Genet, 5,236-241

7. Markoff A, Bogdanova N, Poilmann H. (2005). 
Spectrum of molecular defects and mutation detection 
rate in patients with severe hemophilia A. Hum Mutat, 26, 
249-254.

8. Rossetti LC, Szurkalo i, Radio CP. (2013). Factor 
VIII genotype characterization of haemophilia A affected 
patiens with transient and permanent inhibitors: a 
comprehensive Argentine study of inhibitor risks. 
Haematoiogica, 19,115-118.

9. Repesse Y, Slaoui M, Ferrandis M, Gautier p, 
Costa c , Lavergne JM, Derlon AB. (2007). Factor Vlli

(FVIil) gene mutations in 120 patients with hemophilia A: 
detection of 26 novel mutations and correlation with FVIII
inhibitor development. Thrombosis and Haemostasis, 5, 
1469-1476.

10. Schwaab R, Becker J, Moiler-Taube A, Schwaab
u, Schmidt w , Brackmann HH, Gn'mm T, Oiek K, 
Oldenburg J. (1996). Characterization of the factor VIII 
defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: family 
studies indicate a mutation type-ependent sex ratio of 
mutation frequencie. Am J Hum Genet, 58(4), 657-670.

</div>