Sử dụng kỹ thuật Real time PCR định lượng DNA phôi thai trong huyết tương thai phụ

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

KÉT LUẬN

Nghiên cứu khả năng gắn của phức hợp
nimotuzumab'131! với tế bào A549 invitro và nghiên cứu
tác dụng kháng ung thư phồi không tế bào nhỏ trên mơ
hình chuột nude đữợc ghép tế bao A549 (UTPKTBN),
chúng tơi rúí ra được một sổ kết luận sau:

Ty lệ gắn: Nimotuzumab-1311 gắn bão hòa vào thụ ihể
EGFR của tế bào ung thu' phổi người A549 là43-47 %, ở
mật độ tế bào 0,3 x10 7TB.

Kểí quả phân bố trên chụp SPECT: Nimotuzumab-
131! tập trung nhiều nhất ở trong máu, gan, thận, phổi
trong 24- 48h đầu, sau 72h phức hợp nimotuzumab-
<i>1311 tập írung ở mơ ung thư nhiều hơn các cơ quan </i>
trong cơ thể.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Boland w ., Bebb G. (2010). The emerging role of
nimotuzumab in the treatment of non-small cell iung
cancer. Biologies, 4, 289-98.

2. Rolando Perez, Moreno E., Garrido G. eỉ ai. (2011).
EGFR-Targeting as a Biological Therapy: Understanding
Nimotuzumab’s Clinical Effects. Cancer, 3(2)..r. Biologies,

<b>s ử DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG </b>

<b>DNA PHÔI THAI TRONG HUYÉT TƯƠNG THAI PHỤ</b>

<i>Tên tác giả: Nguyễn T hị Phương Lan (Thạc sĩ, B ộ m ôn Y h ọ c c ơ s ở J r ư ờ n g Đ H D ược Hà Nội)</i>
Giáo vièn hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thanh Thuy
<i>(Bộ m ôn Sinh lý bệnh - Miễn dịch, T rường Đ ại học Y Hà Nội) </i>
PGS.TS. Nguyễn Đức Hinh, TS. Nguyễn Duy Ánh
<i>(Bộ m ôn s á n p h ụ khoa, T rường Đ ạ i họ c Y Hà Nội)</i>
TĨM TẮT

<i>Việc phắt hiện ra DNA phơi thai tự do trong huyết tương mẹ năm 1997 đă mờ ra khả năng m ới cho chần đoốn </i>
<i>trước sinh không xâm lấn. Nghiên cứu của các tác giả cho thấy nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyểt tương </i>
<i>thai phụ tăng tương ứng với tuổi thai và được tăng lên một cách có ý nghĩa trịng thai ky có liên quan đến: sinh </i>
<i>non, tiền sản giật, trisomy 21, /3-thalasemie, ... rồi được xóa nhanh chơng sau sinh. Hiện tại, chưa có bậc thang </i>
<i>nồng độ thương mại của DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ được xây dựng để s ù dụng trong kỹ </i>
<i>thuật Realtime PCR, mục tiêu:i. Xây dựng được đường chuẩn sử dụng trong kỹ thuật Realtime PCR định lượng </i>
<i>DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ. 2. ĐĨnh lượng được nồng độ DNA phôi thai tự do trvng huyet </i>
<i>tương thai phụ bình thường. 3. Định lượng được nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai phụ tiền sản </i>
<i>giậtC hất liệu nghiên cứu: 5ml mâu cửa thai phụ bình thường (30 thai phụ/lần tại cốc thời điểm tuần: 12-14; 16-25; </i>
<i>31-35 và 30 thai phụ tiền sản giật). Phương pháp nghiên cứu: Tàch chiết DNA từ huyết tương thai phụ bình </i>
<i>thường và thai phụ tiền sản giật, tạo minigene nồng độ 1012, thiết kế primer và probe trên đoạn gen chuẩn bị cho </i>
<i>real time PCR, chạy PCR để kiểm tra DNA chiết tâch và định lượng đường chuẩn, chạy real time PCR. Kết quả:1. </i>
<i>Đã xây dựng và hoàn chỉnh được đường chuẩn đinh lượng DNA phôi thai tự do lưu hành trong tuần hoàn thai </i>
<i>phụ. 2. Đã định lượng DNA phơi thai tmng huyết tương thai phụ bình thường 3. Đã định lượng DNA phôi thai </i>
<i>trong huyết tương thai phụ tiến sản giật. Nong độ DNA phôi thài tầng dần theo tuồi thai có ý nghĩa thống kê. Bước </i>
<i>đầu thấy nồng độ DNA phơi thai tăng có ý nghĩa d ự đốn tiền sản giật.</i>

<i>Từ khóa: DNẠ phơi thai tự do, Realtime PCR, huyết tương thai phụ, tiền sản giật.</i>
SUMMARY

<i>USAGE OF REALTIME PCR IN QUANTIFYING CELL-FREE FETAL DNAIN PLASMA OF PREGNANT </i>
<i>WOMEN</i>

<i>Nguyen Thi Phuong Lan (Hanoi Pharmacy University) </i>
<i>Nguyen Thanh Thuy, Nguyen Due Hinh, Nguyen DuyAnh</i>

<i>(Hanoi Medical University)</i>
<i>Qualification o f the cell-free fetal DNA in maternal plasma has potential value fo r prenatal diagnosis and </i>
<i>monitoring a number o f maternal and fetal pathology via the noninvasive prenatal diagnosis. Currently, there is no </i>
<i>commercial concentration scale o f free-cell DNA in maternal serum, which is built to use in Realtime PCR </i>
<i>techniques. The objective o f the research: 1. To set up a baseline fo r using Realtime PCR to quantify the cell-free </i>
<i>fetal DNA in plasma o f pregnant women. 2. Quantify the cell-free fetal DNA in plasma o f healthy pregnant. 3.</i>

4,289-98.

3. Babu K. G., Prabhash K., Vaid A. K. et al. (2014).
Nimotuzumab plus chemotherapy versus chemotherapy
alone in advanced non-smali-cell lung cancer: a
multicenter. Onco Targets Ther, vol 7; 2014. PMC406386.

4. Qu Y-y, Hu S-l, Xu X-y, et at. (2013) Nimotuzumab
Enhances the Radiosensitivity of Cancer Cells In Vitro by
Inhibiting Radiation-induced DNA Damage Repair. PLoS
ONE 8(8): e70727. doi:10.1371/journal.pone.0070727
Randomized, open-label Phase II study. Onco Targets
Ther, 7, 1051-1060.

5. Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Lĩnh Toàn, Hồ Anh Sơn
và cs (2014). Nghiên cứiTđiều chế phức hợp kháng thể
đơn đòng Nimotuzumab gắn đồng vị phỏng xạ 1-131 dùng
trong điều trị ung thư. Y học thưc hành, 914(4), 121-125.

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

<i>Quantify the cell-free fetal DNA in pregnant women with pre-eclampsia. Subjects o f the research: 30 healthy </i>

<i>pregnant women whose blood was taken at the time o f 12‘ 14th week, 16-25th week, 31-35th week and blood </i>
<i>sample from 30 pregnant women with pre-eclampsia. Each blood sample is 5ml. Research methodology: DNA </i>
<i>extraction, creating minigen level 12, primer and probe designing on the gene fragment prepared for Realtime </i>
<i>PCR, using PCR fo r DNA extraction and checking the quantification o f the baseline, and operating the real time </i>
<i>PCR, combination between cross-sectional description and study. Results: the baseline fo r the cell-free fetal DNA</i>

<i>r ir n t ila f in o in r ir n n lẠ tịn n o f n r ọ r tn ạ n t H /n m 0 n h o c hesctn h f iilt a n / i n n rn n la fa H tn s o o f i ' in n a a n tify /in n o</i> <i>fc iffil</i>

<i><b>i / i i u U r u i i i i ^ t i t WM </b></i> <b>v » f / i </b> <b>f i v i i f v i i M M V w w u i i V U f i i U f i U W</b> <i><b>i M p i v i v y U i w S X f J f S t f </b></i> <i><b>i i i V fC lC if i i i l j r i i ì ỳ V V M f i w</b></i> <b> ( V i u i</b>

<i>DNA in maternal plasma in pathological cases.the concentration o f the cell-free fetal DNA in plasma o f normal </i>
<i>pregnant women at the 11-12th week, 13-24th week, 25-38th week gradually increase with p <0.05. In pregnant </i>
<i>women with pre-eclampsia, this concentration is much higher than that in healthy pregnant women at the same </i>
<i>period o f pregnancy with p <0.05. Conclusion: the concentration o f the cell-free fetal DNA which increases upon </i>
<i>gestational age has statistical significance. Initially, increase o f the cell-free fetal concentration predict the pre­</i>
<i>eclampsia.</i>

<i>Keyw ords: Cel!-ữee fetal DNA, real time PCR, plasma o f pregnant women, pre-eclampsia.</i>
ĐẶT VÁN ĐỀ

DNA phôi thai tự do lưu hành trong tuần hoàn thai
phụ ià một dấu ấn sinh học phân tử, được phát hiện
đầu tiên nhờ nghiên cứu của Lo và c s 1997, việc phát
hiện được DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai
phụ đã mở ra kha năng mới cho chan đoán trước sinh
khổng xâm ỉẩn. Nghiên cứu của các tác giả cho tháy
nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai
phụ tăng tương ứng với tuổỉ thai và nịng độ DNA phơi
thai tăng cao bat thường íiên quan đến các biển chứng
của thai kỳ như: sinh non, tiền sản giật, trisomy 21, p-

ỉhalasemie,... rồi được xóa nhanh chóng sau sinh [4],
[9]. Kỹ thuật Realtime PCR khuyếch đại DNA đích mà
có bản saò được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của
phản ứng PCR nó cho phép định lượng chính xấc
nồng độ của DNA thai, viẹc xử lỷ dữ liệu và tính tốn
phụ thuộc vào đường biểu diễn chuẩn (Standard
curve). Hiện tại, chưa có bậc thang nồng độ thương
mại của DNA phôi thai tự do trong huyết tương thai
phụ được xây đựng để sừ dụng trong kỹ thuật
Realtime PCR, vì vậyT chúng tôi tiến hành nghiên cứu
này nhằm mục tiêu:

<i>1. Xây- dựng đường chuẩn s ử dụng trong kỹ thuật </i>
<i>Realtime PCR định luụng DNA phôi thai trong huyết </i>
<i>tương thai phụ</i>

<i>2. Định luựng được nồng độ DNA phôi thai tự do </i>
<i>trong hủyểt tương thai phụ bĩnh thường</i>

<i>3. ĐÍnh lượng được nồng độ DNA phôi thai tự do </i>
<i>trong huyết tương thai phụ tiền sản giật.</i>

ĐỐI TƯỢNG V À PHƯƠNG PHAP NGHIÊN c ứ u
<b>1. Đối từợng nghiên cứu</b>

- Chất liệù nghiên cứu: 5ml máu của thai phụ được
lấy vào ống EDTA, ly tâm tách huyết tương và bao
quản ở -800C đến khi sử dụng.

Nhóm chứng: 02 mẫu máu của thai phụ mang thai

phụ khi chuyển dạ đẻ và sau đẻ biết giới tính của con:
chọn 01 thai phụ mang thai nam và 01 thai phụ mang
thai nữ.

<i>Nhóm thai phụ bình thường: 30 mẫu máu ở tuần:</i>
12-14; 30 mẫu ở 16-25 và 30 mẫu ở tuần 31- 35. Tiêu
chuẩn: có thai lần đầu, tuổi 25 - 35, khơng có các triệu
chứng về nhiễm độc thai nghén hay tiền sử về các
bênh tật khác, không có tiền sử xảy thai liên tiếp hay
thai iưu., không có ý định phá thai, có thề theo dõi

được sản phụ cho đến khi sinh con để biểt được tình
trạng của con, đồng ý và tự nguyện tham gia nghiên
cứu.

Nhóm thai phụ tiền sản giật: Mẫu máu của 30 thai
phụ được chẩn đoán tiền sản giật có 2 trong 4 các
triệu chứng sau trờ lên: siêu âm. S/D = 2.6; RI = 0.6;
vết khuyết tiền tâm trương, phức hợp tâm trương <
35% đính tâm thu; có iăng huyểt áp HATT ằ
140mmHg, HATTr > 90mmHg; có phù ờ các mức độ
khác nhau; protein niệu £ 0.5 g/l ờ mẫu nước tiểu ngẫu
nhiên hoặc 0.3 g/l ở mẫu nước tiểu trong 24h. Tiêu
chuẩn loại trừ: đa thai, đa ối, thai dị dạng, bệnh mắc
kèm: bệnh tim, bệnh thận, tăng huyết áp, đái tháo
đường, basedow, bệnh gan.

Thời gian tiến hành: Từ tháng 1/2013-6/2015
Nơi tiến hành: Bộ môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch
Trường Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện Phụ sản Hà Nội,

Bệnh viện Phụ sản TW, Phòng Viêm gan Virus Viện
VSDTTW.

2. Phương pháp nghiên cửu
- Mơ tả cắt ngang có kết hợp tiến cứu.

» Tiến hành tạo minigene nồng độ 1012, thiết kế
primer và probe, tiển hành chạy PCR để kiểm tra DNA
chiết tách và định lượng đường chuẩn, tiến hành chạy
Realtime PCR định lượng DNA phôi thai.

- Kỹ thuật sử dụng: kỹ thuật chiết tách DNA phôi
thai (theo quy trình của I Randen và c s (2003)), kỹ
thuật PCR lông, kỹ thuật Realtime PCR.

Kỹ thuật Realtime PCR: Nguyên liệu: Standard
cuve đã ổược pha loãng theo các nồng độ từ 1012
đến 100, chứng ấm, chứng dương, DNA phôi thai
trong huyết tương thai phụ cần định lượng. Thành
phần phan ứng:Mtx 2X, SRY-F, SRY-R, Probe, H20.
Real time PCR: 3, 40 chu kỳ mỗi chu kỳ:
940C-1 \ 550C-940C-1 \ 720C-940C-1 720C-6’, 40C-a.

3. X ử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần
mềm chuyến dụng của máy chạy Realtime PCR đã
tích hợp sẵn và các thuật toán thống kê trên phần
mềm SPSS 16.0.

KẾT QUẢ

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

1. Kết quả xây dựng đường chuẩn cho kỹ thuật Realtime PCR cho nghiên cứu
- Tiến hành tạo minigene nồng độ 1012

<b>Hình 1. Trình tự gen của đoạn gen cần quan Ảnh 1. Ecoli trong có chứa plasmid TOPO tâm lấy từ ngân hàng gen</b>
Kiềm tra iạị mồi và mỉnigene: chạy PCR mục đích

kiểm íra xem đã có DNA quan tâm và minigene có phù
hợp khơng, kết quả là thu được: đoạn píasmid có
mang đoạn gen cần quan tâm (rãnh 1 ~

Sau đó xác định bậc thang tương đương. Tiến hành
PCR lồng để kiểm tra primer và nồng độ chuẩn Sau
thiết kế, sau đó điên di để kiểm íra DNA.

<b>Ảnh 2. PCR kiềm tra xem đã co DNA plasmid</b>
Chú thích: M - Marker, Rãnh 1. Nước cất, Rãnh
2,4. Chứng nữ, Rãnh 3. Chứng nam, Rãnh 5, 6, 9,10.
DNA thai phụ mang thai nữ, Rãnh 7,1 1 . DNA thai phụ
mang thai nam, Rãnh 8. DNA có trong plasmid với cặp
mồi Y17, Y18 của mẫu chuẩn D N A 101.

Kiểm tra đường chuẩn: ỉiến hành đo OD mẫu
chuẩn, tính tốn nồng độ 1011 theo định luật Avogadro
từ đó tính độ pha loãng, xây dựng đường chuan và
chạy thử trên máy Realtime.

Độ pha loãng đường chuẩn như sau: pha 1011: íấy
8,5ụl minigen gốc + 341,5 ụl H20 , pha 1010: ỉấy 30ụi
1011 + 270 Ml H20 , Pha 109: lấy 30|JỈ 1010 + 270 Ml
H20 , cứ íàm tiếp tục như vậy và pha ỉoãng tởi 100.

<b>Ảnh 3. PCR kiểm tra DNA trong mẫu chứng nam, chứng </b>
<b>nữ và trong các mẫu theo bậc ỉhang nồng độ.</b>
Chú thích: M - Marker, Giếng 1 - Chứng DNA nữ,
Giếng 2 - Nước cất, Giếng 3 - Chứng DNA nam,
Giếng 4 - Chứng DNA của thai phụ mang thai nam,
Giếng 5 -1 4 - mẫu chuẩn nồng độ từ 101 -108

Nhận xét: sử dụng PCR để bán định lượng đường
chuẩn sử dụng cặp moi Y15, Y16 và Ỷ17, Y18 để kiểm
tra, cho sản pham 198bp và đường chuẩn lên sản
phẩm phụ thuộc vào nồng độ DNA. Sau đó kiểm tra lại
bằng cặp mồi SRY-F và SRỶ-R.

Tiến hành chạy Realtime PCR: Kết quả sau khi
chạy đường chuẩn cùa gen SRY trong mẫu chuẩn pha
loãng ở các nồng độ 101, 102,103,104, 105,106,107,
108.

<b>Hỉnh 2. Hình ảnh phân tích đương chuẩn của gen SRY</b>
Định lượng nồng độ DNA phôi thai trong huyểt

tương thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR từ đường
chuẩn đã xây dựng được.

DNA phối thai sau khi được chiết íách từ huyết
tương thai phụ binh thường và thai phụ tiền sản giật,
chúng tôi tiến hành chạy PCR lồng với cặp mồi cua
gen SRY để kiểm tra sấn phẩm sau chiết tách, sau đó
tiến hành định lượng DNA.

Bảng 1. Nồng độ DNA phơi thai trung bình ờ các
quý của nhóm thai phụ binh thường

Nồng độ DNA
phôi thai trung
binh (copy/m!)

Nồng độ DNA
phôi thai dao

động (mín -
max)

p2-1 p3-1 p
3-2
Quý

1(1) 574,79

60,5
5-1698,52
Quý

2(2) 1587,11

248,31 -

4838,92 <0,05 <0,05 <0,05
Quý

3(3) 2196,62

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

Nhận xét: Nồng độ DNA trung bình của nhóm thai
phụ bình thường tăng dần theo các quý của thai kỳ với
p<0,05.

Bảng 2. Nồng độ DNA phôi thai trung bình ờ các
quý của nhóm thai phụ tiền sản giật__________ „

Nồng độ DNA phơi
thai truna bình

(copy/mi)

- Nồng độ DNA phơi
thai dao độna (min -

max)

p2-1
Quý

2(1) 4882,79 1591,45-7677,00
0,05
Quý

3(2) 28701,26 5678,57-61666,14

Nhận xét: Nong độ DNA trung bình cùa nhóm thai

phụ tỉền sản giật tăng cao theo các quý của thai kỳ với
p<0,05.

Bảng 3. So sánh nồng độ DNA phôi thai giữa nhóm
thai phụ bình thường và thaỉ phụ tiền sản giật ở quý 3
của thai kỳ______

Tuầ

<i>Nơng độ DNA ờ nhóm </i>
thai phụ bình thường

(copy/ml) (1)

<i>Nông độ DNA ở nhổm </i>
thai phụ tiền sản giật

(copy/ml) (2)
n

thai

n X

Dao
động

(min-max)

n X

Dao động
(min-
max)

p2-1

Quý
3 30

2196,6
2

742,98-6397,98 27

28701,2
6

5678,57 -
61666,14

<
0,05
Nhận xét: Nồng độ DNA phơi thai ở nhóm thai phụ
tiền sản giật cao hơn nhóm thai phụ bình thường có
cùng tuổi thai tương ứng vởi p<0,05.

BÀN LUẬN

Gen đặc hiệu nhiễm sắc thể Y, SRY (Sex
determining region Y) íà vùng quy định giới tính nam,
gen này có vị trí ở vùng đầu mút trển cánh ngắn của
NST Y (Yp11.3). Chúng tôi sử dụng sự khác biệt này
để xác định các DNA phôi thai tróng huyết tương của
thai phụ mang thai nam, do vậy chúng tôi đã nhân bản,
trình tự từ ngân hàng gen sau đó sử dụng các trinh tự
này để kiểm tra việc thiết kế mồi và probe. Khi thư
PCR lần 1 với các cặp mồi X1X3 và PCR lồng với cặp
mồi X2X3 để kiểm tra các gen của NST X trên các
mẫu chứng và DNA chiết tách từ huyết tương thai phụ
thì tầt cả các mẫu đều có sản phẩm PCR 261bp,
chứng íỏ DNA chiết tách từ huyết tương thai phụ đảm
bảo chất lượng cho việc phát hiện SRY. Dùng tiểp các
mẫu DNA này cho chạy PCR để kiểm tra gen nằm trên
NST Y thì cho kết quả PCR iần 1 với cặp mồi Y1.5
Y1.6 là 300bp và PCR lồng với cặp mồi Y1.7 Y1.8 là
198bp. Các mẫu DNA chiết tách từ chửng nam binh
thường và từ huyết tương thai phụ sinh con trai đều có
sản phẩm với đơi mồi nảy, còn các mẫu huyết ìương
lấy từ huyết tương thai phụ sinh con gái và DNA
chứng nữ bình thường thì khơng. Kết quả PCR đã
chứng minh rang trong huyết tương thai phụ có mặt
DNA của NST Y của thai. Từ kết quả này chúng tồi
kiểm tra iại đoạn gen bằng các primer và probe với
minigene (standard curve), chủng tơi pha lỗng và tính
tốn đỗi từ ng/ml sang số copies/ml theo định íuật
Avogadro.Kết quả thực hiện phản ứng Realtime PCR
của gen SRY trong nghiên cứu cho tín hiệu tốt với:
R*2 - 0,991 và hiệu quả khuyếch đại E= 96,3%, thòa

mãn các tiêu chuẩn như Bio-Rad (2006) (R*2 >0,98),

hiệu quả khuyếch đại đạt cao (90 - 105%) và mức độ
đồng nhất qua các íần phản ứng lặp iại [2], Vì vậy, có
thể ứng dụng phương pháp này trong cac nghiên cứu
tiểp theo.

Chúng tôi tiến hành định lượng DNA phôi thai trong
huyết tương thai phụ bình thường bằng kỹ thuật

P a o l f i m a D P D A> <i>'X</i> + ^Ạ ?ị 4 A H K Ị A
i x w C i u i i i i w i <i>\ J o</i> ì í i v i U i w i f i u u d iíi c á i f r y , ĩ i U ĩ i y U y u i N n

trung bình ờ quý 1: 574,79 copy/m! (60,55-1698,52
copy/ml), ờ quy 2: 1587,11 copy/ml (248,31-4838,92
copy/ml) và ở quý 3: 2196,62 copy/ml (742,98-6397’98
copy/ml). Đối vơi nhóm thai phụ tiền san giật, nồng ổộ
DNA trúng b)nh ở quý 2: 4882,79 copy/mi
<i>(1591,45-7677,00 copy/ml) và ờ quý 3: 28701,26 copy/mí </i>
(5678,57-61666,14 copy/mi). Điều này chứng tỏ có
DNA phơi thai tự do lưu hành trona tuần hồn thai phụ
và có xu hướng tăng dần theo tuổi thai, đồng thời sự
thay đổi nồng độ DNA phôi thai tự do tăng cao trong
huyết tương thai phụ tiền sản giật so với thai phụ bình
thường có cùng tuổi thai tương ứng với p<0,05.

Theo Lo và c s (1999), DNA phôi thai xuất hiện
trong huyết tương, huyết thanh mẹ từ 3 tháng đầu và
nồng độ tăng cùng với tuổi thai (có thể được giải thích
bời sự iăng diện tfch của rau thài) và tăng đột ngột vào

gần cuối thai kỳ, đặc biệt ià sau tuần thai thứ 32 (đó có
thể ià kết quả của quá trình chuẩn bị sinh nở) và nồng
độ trung bình của DNA phơi thai írong huyết tương mẹ
trong 3 tháng giữa và 3 ỉháng cuối tương ứng là 3,4%
và 6,2% DNA tổng số trong huyết tương mẹ [7], Nhĩeu
nghiên cứu trước đó (Smid và c s 1997, Lo và cs c s ,
1998; Honda và c s , 2002) cũng thấy tồn tại mối liên
quan giữa số lượng DNA phôi thai tự do trong tuần
hoàn mẹ với tuổi thai. Nghiên cứu của Invernizzi và
c s (2002) ở 685 thai phụ bình thường mang thai nam
kết quả: nồng độ DNA phơi thai trung bình dao động
21,6-9,3 copy/mi ở quý 1; 36,9-19,3 copy/ml ở quý 2
và 79,8-54,1 copy/mí ơ quý 3 của thai ky [5]. Nghiên
cứu của Aí Nakib M. và c s (2009) định lượng nồng độ
<i>DNA phôi thai ở 28 thai phụ bình thường^ kểt qua: tư </i>
tuần 19 - 28 là 579 copy/mi (169-1203 copy/ml) và từ
> tuần 28 là 728,5 copy/ml (185 - 1831 copy /ml),
nồng độ DNA tăng dần theo tuằi thai [1 ]

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

nhóm thai phụ bình thường và thai phụ tiền sản giật
cao hơn nghiên cứu của các tác giả trên điều đó có
<i>thể do thai phụ ở các khu vực địa lý khác, quy trình Ịỵ </i>
tâm mẫu máu khác nhau bao gồm cả thể tích huyết
tương của thai phụ và lượng DNA chiết tách và lượng
DNA khuếch đại va phần lớn phụ nữ mang thai ờ Viẹí
Nam đều có tỉnh trạng thiếu máu dẫn tới bánh rau bị
phá hủy làm có lẽ nó cũng góp phần !àm tăng nồng độ
DNA phôi thai tự do trong huyết tương của thai phụ
binh thường và thai phụ tỉền sản giật đặc biệt íà tăng
<i>cao ở nhóm thai phụ tiền sản giật. Nồng độ DNA phôi </i>

thai của chúng tôi phù hựp với nghiên cứu cùa tác giả
Zhong và c s (2001) điếu này có thể do kích íhLPỚc
bánh rau, tình trạng thiếu máu, dinh dưỡng, chế độ ăn
liên quan đến chủng tộc làm cho nồng độ DNA phôi
thai ơ người Châu Á cao hơn ở người Châù Âu.

Tiền sản giật là một bệnh lý phức tạp írong thai kỳ
được đặc trưng bởi tinh trạng tăng huỹết áp và xuất
hiện protein niệu từ tuần 20 cua thai kỳ trở đi ở người
phụ nữ trước đây có huyết áp bình thường. Levine RJ
và c s (2004) đã nghiến cứu ở 120 thai phụ bình
thường và 120 thai phụ tiền sản giật thấy rằng nống độ
của DNA phôi thai tự do tăng leri gấp 2-5 ỉan ở thai
phụ tiền san giật và tăng trươc khi khơi phát các triệu
chứng lâm sàng của tiền sản giật ờ hai thời điểm tuần
thứ 17 và tuần 28 của thai kỳ [6]. Hong Yu và c s
(2013) khi định lượng nồng đọ DNA phôi thai tự do
trong huyết tương 20 thai phụ ờ giai đoạn sớm của
tiền sản giật và 20 thai phụ bình thường, các thai phụ
đều mang thai nam được phát hiện bởi gen SRY, kết
quả cho thấy nồng độ DNA phôi thai ở thai phụ giai
đoạn sớm cua tiền sản giật (logged) (trung vị 3,08; dao
động 2,93-3,68) cao hơn so với nhóm chứng (1,79;
dao động 1,46-2,53) [3]. Năm 2014, Martin A và CS
nghiên cứu tồng quan cho thấy ở 13 nghiên cứu thì 11
nẹhiên cứu đã chứng minh rằng ở nhưng íhai phụ cổ
nong độ DNA phơi ìhai tự do tăng cao, thai phụ sau đó
đã phát triển tiền sản giật, ngoài ra, kết quả của bốn
nghiên cứu đã chứng minh thấy nồng độ DNA phôi
thai tăng cao đáng kể trước khi khởi phát tiền sản giật

[8]. Một số yếu tố nguy cơ ổược cho là làm tăng nguy
cơ phát triển tiền sản giật: bệnh mạch máu của người
mẹ, rối loạn tự miễn dịch, nguyên nhân di truyền, đái
tháo đường, mang thai đôi,... Mặc dù nguyên nhân
chính xác van chưa rõ ràng nhưng tất cả các nguyên
nhân đều dẫn tới rồi ioạn chức nang kết quả: suy lá
nuôi do ỉhay đổi cấu trúc của động mạch xoần và giảm
tưới máu nhau thai hậu quả là tình trạng thiếu oxy qua
nhau thai và nhồi máu đồng thời giải phóng các
cytokin tiền viêm. Theo nghiên cứu của Lo và CS, hầu
hết những phụ nữ đã được nghiên cứu (7 trong số 8
phụ nữ) không phát hiện được nồng độ DNA phơi thai
iuấn hồn sau sinh 2 giờ [7]. Như vậy, nồng độ DNA
phôi thai tự do là một marker sinh học nhiều tiềm năog
và sự tăng nồng độ cùa nó có liên quan đến các giai
đoạn của quá trình thai nghén và tăng cao trước khi có
triệu chứng lâm sàng của tiền sản giật và với tốc độ
giải phóng và thải trừ nhanh chóng, số lượng DNA
phôi thai đã cung cấp một bức tranh toàn cảnh và chi
tiết theo thời gian về sự sản xuất và thải trừ DNA phôi

thai, và vì vậy sẽ có ích cho giám sáì những ỉrường
hợp thai nghén bệnh lý.

KẾT LUẬN

1. Đã xây dựng và hoàn chỉnh được đường chuẩn
định lượng DNẦ phôi thai tự do ÍIPU hành trong tuần
hoàn thai phụ.

2. Nồng độ DNA trung bỉnh ờ nhóm ìhai phụ binh
thường

Quý 1: 574,79 copy/mi (dao động trong khoảng
60,55-1698,52 copy/mi)

Quý 2: 1587,11 copy/mi (dao động trong khoảng
248,31 - 4838,92 copy/m!)

Quý 3: 2196,62 copy/m! (dao động trong khoảng
742,98 - 6397,98 copy/mi).

3. Nồng độ DNA trung binh ở nhóm thai phụ tiền
sản giật

Quy 2: 4882,79 copy/ml (dao động trong khoảng
1591,45 - 7677,00 copy/ml)

Quý 3: 28701,26 copy/ml (dao động írong khoảng
5678,57 - 61666,14 copy/ml)

Nồng độ DNA phôi thai ở nhóm thai phụ tiền sản
giật cao hơn so với nhóm thai phụ bình thường có
cùng tuổi ỉhai tương ứng với p<0,05.

KIẾN NGHỊ

Nếu trên iâm sàng và siêu âm Doppler, thai phụ có
các dấu hiệu nguy cơ của tiền sản giật từ tuần ỉhư 12
nên kết hợp định lượng nồng độ DNÀ phôi thai trong

huyết tương thai phụ giúp theo dõi và phát hiện sớm
tiền sản giật.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ai Nakid M, Desbrièrs R, Boneilo N, et a! (2009),
Total and fetal cell free DNA analysis in maternal blood as
as markers of placenta! insufficiency in intrauterine growth
restriction, Fetal diagnosis and therapy, 26(1), pp.24-8.

2. BioRad Laboratories (2006), Realtime PCR
Application Guide.

3. Hong Yu, Yanting Shen, Qinyu Ge, et al (2013),
Quantification of Maternal Serum cel! free fetal DNA in
early onset preeciampsia,_International Journal of
Molecular Siences, 14(4), pp.7571-7582.

4. Howard Cuckie (2014), Pretanal Screening using
maternal markers, Journal of clinical medicine, 3, pp.504-

520. _ _

5. invernizzi p, Biondi ML, Battezzati PM, et al (2002),
Presence of fetal DNA in maternal plasma decades after
pregnancy, Human genetics, 110(6), pp.587-91.

6. Levine RJ, Maynard S.E., Qian c., et a!. (2004),
Circulating angiogenic factor and the rick of pre-
eclampsia, N. Eng!. J. Med, 340, pp.672-683.

7. Lo YM, Leung IN , Tein MS, et al. (1999),
Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum
in preeclampsia, Clin Chem, 45, pp.184-8.

8. Martin A, Krishna i, Badeii M and Sạmuaei A
(2014), Can the quantity of celi-free fetal DNA predict
preeclampsia: a systematic review, Prenatal diagnosis,
34(7), pp.685-91. _

9. Sifakis s, Koukou z and Spadidos D.A (2015), Cell
free fetal DNA and pregnancy related complication
(Review), Molecular Medicine Report, 11, pp.2367-72.

</div>

<!--links-->