Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học sử dụng phương pháp không đánh dấu ứng dụng chuẩn đoán bệnh sớm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI



PHAN HIỂN KIÊN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC SỬ DỤNG
PHƯƠNG PHÁP KHÔNG ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG CHUẨN ĐOÁN
BỆNH SỚM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
VẬT LÝ KỸ THUẬT (KH)

Hà Nội – Năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

PHAN HIỂN KIÊN

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC SỬ DỤNG
PHƯƠNG PHÁP KHƠNG ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG CHUẨN
ĐỐN BỆNH SỚM

Chuyên ngành : VẬT LÝ KỸ THUẬT (KH)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
VẬT LÝ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
TS. TRƯƠNG THỊ NGỌC LIÊN

Hà Nội – Năm 2012


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN
DÒNG ..................................................................................................................4
1.1. Cấu trúc kháng nguyên – kháng thể .....................................................................4
1.1.1. Kháng nguyên.............................................................................................4
1.1.2. Kháng thể ...................................................................................................7
1.2. Phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể ....................................................10
1.2.1. Khái niệm .................................................................................................10
1.2.2. Cơ chế kết hợp ..........................................................................................10
1.3. Ứng dụng của cảm biến sinh học .......................................................................12
1.4. Một số phương pháp phát hiện ung thư hiện nay ...............................................12
1.4.1. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch đánh dấu enzyme (ELISA – Enzyme
linked immunosorbent assay) .............................................................................12
1.4.2. . Phương pháp kháng thể miễn dịch đánh dấu huỳnh quang ( fluorescencelabeled antibody Immunoassay ) ........................................................................13
1.4.3. Phương pháp đánh dấu miễn dịch đồng vị phóng xạ (Radio Immuno
Assay – RIA). .....................................................................................................14
CHƯƠNG 2: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ CHUYỂN ĐỔI NHẠY
KHỐI LƯỢNG VÀ ĐIỆN HÓA .....................................................................16
2.1. Cảm biến sinh học nhạy khối lượng (QCM sensor) ..........................................16
2.1.1. Tinh thể Quartz .........................................................................................16
2.1.1.1. Cấu trúc ..........................................................................................16
2.1.1.2. Tính chất áp điện ............................................................................16
2.1.2. Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM) .............................................18

2.1.3. Một số cấu trúc QCM ...............................................................................21
2.1.4. Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM..21
1


2.2. Cảm biến sinh học điện hóa (Electrochemical sensor) ......................................22
2.2.1. Giới thiệu ..................................................................................................22
2.2.2. Vật liệu .....................................................................................................23
2.2.3. Công nghệ.................................................................................................24
CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO CẢM BIẾN .................28
3.1. Cảm biến QCM ..................................................................................................28
3.1.1. SAM (self-assembled monolayer)............................................................28
3.1.1.1. Màng mỏng đơn lớp theo công nghệ tự lắp ghép (SAM).............29
3.1.1.2. Màng mỏng tự lắp ghép alkanethiols (SAM of alkanethiols) ........30
3.1.2. Quy trình chế tạo cảm biến PSA –QCM ..................................................33
3.1.2.1. Hóa chất..........................................................................................33
3.1.2.2. Thiết bị đo ......................................................................................33
3.1.2.3. Quy trình chế tạo ............................................................................35
3.1.3. Tiến hành thí nghiệm. ..............................................................................37
3.1.3.1. Tiến hành đo độ dịch tần. ...............................................................37
3.2. Cảm biến điện hóa ..............................................................................................38
3.2.1. Polypyrrole (PPy) .....................................................................................38
3.2.1.1. Cấu trúc của monome Pyrrole (Py) ................................................38
3.2.1.2. Polyme polypyrrole (PPy) ..............................................................38
3.2.2. Phương pháp tổng hợp PPy ......................................................................40
3.2.2.1. Phương pháp phân cực vòng (CV – Cyclic Voltammetry) ............41
3.2.2.2. Phương pháp phân cực dòng tĩnh (GS - Galvanostatic).................42
3.2.2.3. Phương pháp phân cực thế tĩnh (PS – Potentiostatic) ....................42
3.2.3. Chế tạo cảm biến PSA-DEP .....................................................................42
2

3.2.3.1. Phương pháp cố định thành phần sinh học lên vật liệu rắn............42
3.2.3.2. Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) .....................................44
3.2.3.3. Hóa chất và thiết bị.........................................................................49
3.2.3.4. Quy trình chế tạo chip cảm biến ....................................................50
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẨO LUẬN .........................................................53
4.1. Khảo sát hoạt động của cảm biến QCM.............................................................53
4.1.1. Màng SAM - kháng thể ............................................................................53
4.1.1.1. Khảo sát cơ chế hình thành màng SAM .........................................53
4.1.1.2. Hiệu suất cố định kháng thể PSA ...................................................54
4.1.2. Khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến hoạt động của cảm biến .........56
4.1.2.1. Kiểm tra độ ổn định của cảm biến .................................................56
4.1.2.2. Tối ưu hóa độ pH của dung dịch đệm ............................................57
4.1.2.3. Tối ưu hóa tốc độ dòng chảy ..........................................................58
4.1.2.4. Khảo sát thời gian phân tích ...........................................................58
4.1.3. Cảm biến PSA-QCM ................................................................................59
4.1.3.1. Xây dựng cảm biến PSA-QCM ......................................................59
4.1.3.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến trên mẫu thực ...........................62
4.2. Khảo sát hoạt động của cảm biến điện hóa ........................................................62
4.2.1. Kết quả tạo hạt nano vàng lên điện cực in cacbon ...................................62
4.2.2. Kết quả của cảm biến total PSA-DEP-CV ...............................................65
4.2.3. Kết quả của cảm biến free PSA-DEP-CV ................................................67
KẾT LUẬN ..............................................................................................................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................71

3


MỞ ĐẦU

Với sự phát triển mạnh mẽ của xã hội như hiện nay, nhu cầu về đo đạc, phân tích hóa
chất là rất lớn, chính vì thế sự ra đời của cảm biến sinh học là khá quan trọng. Nó là
một cơng cụ quan trọng trong kiểm tra an tồn thực phẩm, chuẩn đoán y học và kiểm
tra nội khoa, các hệ phát hiện các tác nhân ô nhiễm môi trường. Cảm biến sinh học là
một thiết bị có nhiều ưu điểm: sử dụng đơn giản, có khả năng phát hiện nhanh, độ
nhạy cao cũng như có tính chọn lọc mạnh mẽ trong các hệ hóa học và sinh học.
Giáo sư LelDNA Clark Jnr được biết đến như cha đẻ của cảm biến sinh học. Năm
1956 ông công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá. Những năm tiếp theo ơng tiếp
tục thực hiện rất nhiều thí nghiệm nhằm cố gắng mở rộng khả năng hoạt động của
cảm biến như phát hiện được thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm
biến. Vào năm 1962, tại hội nghị New York Academy of Science, ông đã thuyết trình
một bài về cảm biến sinh học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic,
potentiometric or conductometric) more intelligent by adding enzyme transducers as
membrane enclosed sDNAwiches”. Ơng đưa ra mơ hình đầu tiên về cảm biến sinh học
(xem hình 1). Cảm biến sinh học theo mơ hình của Clark bao gồm điện cực oxy hóa,
trên đó có màng giữ enzyme glucose (glucose oxidase). Khi mật độ glucose trong môi
trường phản ứng giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một
cách tương ứng. Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng
độ glucose trong môi trường cần kiểm tra.


Hình 1. Mơ hình cảm biến sinh học đầu tiên của C Clark [1].
Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo [2] lần đầu tiên công bố chi
tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme đo điện
thế, một cảm biến đo nồng độ urê dựa trên điện cực cố định enzyme urê (urease) bằng
màng chất lỏng chọn lọc amonium.
Năm 1975 Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fibre-optic sensor) gắn
các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO2 và O2. Cũng vào năm 1975, một số vi khuẩn
cũng đã được sử dụng như những thành phần sinh học trên các điện cực vi sinh để đo

nồng độ cồn. Năm 1975 công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần đầu tiên biến ý
tưởng của Clark thành hiện thực thơng qua việc thương mại hóa các cảm biến sinh
học. Sản phẩm đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa trên hydrogen peroxide và đó
cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của các cảm biến sinh học trong đời
sống. Vào năm 1982, Shichiri và các đồng nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm biến
glucose in vivo, là loại cảm biến kim đầu tiên cho các xét nghiệm dưới da.
Cảm biến sinh học có thể hiểu là một thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học như
enzyme, các kháng thể, DNA… để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hóa chất. Vì vậy
một cảm biến sinh học thơng thường gồm có 3 thành phần cơ bản, đó là: (1) thành
phần hóa học; (2) thành phần sinh học và (3) thành phần vật lý.


Với sự phát triển mạnh mẽ của xã hội như hiện nay, nhu cầu về đo đạc, phân tích hóa
chất là rất lớn, chính vì thế sự ra đời của cảm biến sinh học là khá quan trọng. Nó là
một cơng cụ quan trọng trong kiểm tra an tồn thực phẩm, chẩn đoán y học và kiểm
tra nội khoa, phát hiện các tác nhân gây ô nhiễm môi trường. Cảm biến sinh học có
nhiều ưu điểm như sử dụng đơn giản, có khả năng phát hiện nhanh, độ nhạy cao cũng
như có tính chọn lọc mạnh mẽ trong các hệ hóa học và sinh học.
Hiện nay, cảm biến sinh học đã và đang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà
khoa học cũng như các trung tâm nghiên cứu. Tuy nhiên việc chế tạo cảm biến sinh
học vẫn gặp rất nhiều khó khăn như độ ổn định trong chế tạo sản phẩm, phương pháp
đo tín hiệu, thời gian phản ứng, khả năng tái sử dụng, … Do vậy, những nghiên cứu
mới trong tương lai chủ yếu sẽ tập trung vào hai hướng chính:
(1) Khắc phục những khó khăn sẵn có của thế hệ cảm biến cũ: Nâng cao độ ổn
định để có thể chế tạo hàng loạt, cải thiện khả năng tái sử dụng của các cảm biến
sinh học, tìm giải pháp hạ giá thành sản phẩm.
(2) Xây dựng mơ hình lý thuyết giải thích, tìm kiếm vật liệu cũng như khả năng
ứng dụng mới của cảm biến, giảm kích thước cảm biến để tích hợp được nhiều
cảm biến trên một thiết bị, cải tiến thiết bị đo đơn giản và dễ sử dụng, rút ngắn thời
gian đáp ứng .v.v.

Do dó, nội dung của bản luận văn chỉ tập trung vào những vấn đề sau: sử dụng linh
kiện QCM (Quartz Crystal Microbalance) và điện cực in các bon (Screen-printed
carbon ink electrode SPCEs) trong nghiên cứu chế tạo cảm biến chẩn đoán sớm bệnh
ung thư tiền liệt tuyến.
Đồ án gồm có 4 chương:
Chương 1: Cảm biến sinh học ứng dụng kháng thể đơn dòng.


Chương 2: Cảm biến sinh học ứng dụng bộ chuyển đổi nhạy khối lượng và điện
hóa
Chương 3: Quy trình cơng nghệ chế tạo cảm biến.
Chương 4: Kết quả đo và thảo luận


CHƯƠNG 1: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG
KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG

1.1.

Cấu trúc kháng ngun – kháng thể

1.1.1. Kháng ngun
• Khái niệm
Kháng nguyên (antigen) là những vật chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo cơ thể,
khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức là một quá
trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp những phân tử đặc biệt gọi là kháng thể
(dịch thể hay kháng thể tế bào). Tóm lại, kháng nguyên là chất gây ra đáp ứng miễn
dịch đặc hiệu và phản ứng với các sản phẩm của đáp ứng đó.
• Phân loại kháng ngun
* Kháng ngun hồn tồn (antigen)

Là loại kháng ngun có đầy đủ hai khả năng là tính kích thích cơ thể sinh kháng
thể và sự kết hợp đặc hiệu với kháng thể đó đo chính kháng nguyên ấy kích thích
sinh ra. Hầu hết các kháng ngun hồn tồn có bản chất là protein như các cấu
phần của cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật, các chất độc thực vật, các nọc độc
động vật...
* Kháng ngun khơng hồn tồn (haptoll)
Cịn gọi là bán kháng nguyên, là những chất tự bản thân nó khơng có khả năng kích
thích cơ thể sinh kháng thể, nhưng có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể
tương ứng.Ví dụ: kháng nguyên thân (O) của vi khuẩn Pneumococcus là chất đa
đường polysaccarit, một mình nó khơng làm sản sinh ra kháng thể, để trở thành một
kháng nguyên hoàn toàn trong thân vi khuẩn, bán kháng nguyên polysaccarit kết
hợp với protein (hoặc nucleoproteit), trong đó thành phần đa đường sinh ra phản
ứng đặc hiệu, còn thành phần protein làm sinh ra kháng thể đặc hiệu.
Căn cứ vào bản chất, cấu trúc
4


* Kháng nguyên là protein
+ Kháng nguyên là protein động vật: Kháng ngun là protein động vật là loại có
tính kháng nguyên mạnh nhất như huyết thanh của loài này là kháng nguyên mạnh
đối với loài khác.
+ Kháng nguyên là protein thực vật: Kháng nguyên là protein thực vật là các loại
protein chiết xuất từ thực vật cũng có biểu hiện tính kháng ngun, đặc biệt là
protein có trong phấn hoa của một số loài thực vật.
+ Kháng nguyên là protein vi khuẩn: các độc tố vi khuẩn là protein, vì vậy nó có
tính kháng ngun cao, kháng ngun lơng của vi khuẩn cũng có bản chất là
protein.
+ Kháng nguyên là protein capxit của virut: Đây là loại kháng nguyên mạnh, có thể
chiết xuất thành kháng ngun hồ tan. Có virut ngun vẹn cũng là kháng ngun
hồ tan và có thể kích thích cơ thể sinh miễn dịch cao.

* Kháng nguyên là gluxit, polysaccrit: Đại đa số gluxit, polysaccarit có tính kháng
ngun yếu, riêng của vi khuẩn thì có tính kháng nguyên mạnh. Các nhóm máu
được biểu thị theo các kháng nguyên có trên bề mặt của hồng cầu, chúng là
polysaccarit có nhóm A, B, AB và O.
* Kháng nguyên lipit: Kháng ngun lipit tự bản thân khơng có tính kháng nguyên,
chúng chỉ biểu thị tính kháng nguyên khi nằm trong phức hợp lipoproteit.
* Kháng nguyên là axit nucleic: Các axit nucleic (ADN, ARN) tự bản thân có tính
kháng ngun rất yếu và cũng chỉ sau khi liên kết với protein trong phức hợp
nucleoproteit mới biểu thị tính kháng ngun.
• Tính đặc hiệu của kháng nguyên
Người ta gọi khả năng kết hợp của kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu tương ứng
là tính đặc hiệu của kháng nguyên. Trong trường hợp đáp ứng miễn dịch dịch thể thì
kháng nguyên kết hợp với globulin miễn dịch (kháng thể), còn trong trường hợp đáp
ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thì kháng nguyên liên kết với những receptor
xuất hiện ngay trên bề mặt những tế bào lympho T hay gọi là kháng thể tế bào.

5


Kháng nguyên nào thì kháng thể ấy, kháng nguyên gắn với kháng thể như chìa khố
ấn vào ổ khố, như âm bản với dương bản.
Tính đặc hiệu của kháng nguyên khơng phải do tồn bộ cấu trúc của cả phân tử
kháng nguyên quyết định mà do “nhóm quyết định” của kháng nguyên, đó là những
đoạn nhỏ hoặc một bộ phận nhỏ nằm trên bề mặt phân tử kháng nguyên quyết định.
Nhóm quyết định kháng ngun khơng những quyết định tính đặc hiệu sinh kháng
thể tương ứng mà còn là vị trí để kháng thể đó hoặc lympho bào mẫn cảm có thể
gắn với kháng nguyên một cách đặc hiệu. Nếu kháng ngun chỉ có một nhóm
quyết định thì sẽ kích thích cơ thể sinh ra một loại kháng thể tương ứng và kháng
nguyên đó chỉ kết hợp đặc hiệu và duy nhất với kháng thể đó mà thơi. Nếu kháng
ngun có nhiều nhóm quyết định thì có nhiều kháng thể tương ứng được sinh ra,

nhưng nhóm quyết định nào thì kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng với nhóm
đó mà thơi. Có bao nhiêu nhóm quyết định kháng ngun thì có bấy nhiêu loại
kháng thể và kết hợp đặc hiệu độc lập với nhau.
• Quyết định kháng nguyên
Bất kỳ một polypeptide hay protein phức hợp nào có hoạt tính sinh học cao đều có
cấu trúc phức tạp, thơng thường chúng có cấu trúc gấp khúc, mà người ta thường gọi
là cấu trúc không gian ba chiều (threedimensional protein = 3-D protein).
Những vùng lồi lõm nằm trên protein chịu trách nhiệm về tính kháng nguyên,
được gọi là điểm quyết định kháng nguyên (antigendeterminant) hay còn gọi là
epitope. Mỗi một protein kháng nguyên có thể có 1 epitope hoặc nhiều epitope
khác nhau.
Thông thường các protein được coi là kháng nguyên đều có khả năng kích thích
sinh kháng thể. Chúng ta cần phân biệt 2 khái niệm về loại kháng thể: kháng thể đa
dòng và kháng thể đơn dòng.
Kháng thể đa dịng: Là kháng thể do nhiều epitope kháng ngun kích thích sinh ra,
do vậy chúng có khả năng kết hợp với nhiều epitope trong phản ứng kết hợp kháng
nguyên - kháng thể.

6


Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody = Mab): là do duy nhất một epitope kích
thích sinh ra và chỉ kết hợp duy nhất với epitope đó.

(a)

(b)

Hình 1.7: (a) Kháng thể đa dịng,(b) Kháng thể đơn dịng.
1.1.2. Kháng thể

•

Khái niệm

Globulin miễn dịch hay kháng thể là các protein có trong huyết thanh hoặc dịch sinh
học của cơ thể (nước tiểu, sữa...) có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã
kích thích sinh ra nó. Kháng thể theo định nghĩa trên đây được gọi là kháng thể
miễn dịch hay kháng thể đặc hiệu.
Bản chất của kháng thể là protein, nên các tác nhân hóa, lý như axít, kiềm nhiệt độ
đều có thể phá huỷ kháng thể. Hoạt tính của kháng thể phụ thuộc vào pH của môi
trường và nhiều yếu tố khác. Amone sulfat, natri sulfat, cồn ở 4°C có thể làm kết
tủa kháng thể nhưng không làm mất hoạt tính của chúng, do đó người ta lợi dụng
tính chất này để tinh chế kháng thể.
Hai đặc tính sinh học quan trọng của kháng thể là khả năng phản ứng đặc hiệu với
kháng nguyên và khả năng biểu hiện như một kháng nguyên, tức là kích thích sinh
kháng thể chống laị chính nó. Kháng thể chống lại kháng thể gọi là kháng kháng
thể. Có thể tạo kháng thể chống từng loại Ig hoặc chống từng phần cấu trúc của
phân tử Ig (mảnh Fab hoặc Fc).
•

Đặc tính của kháng thể
7


Có tính đặc hiệu với kháng ngun rất cao, mỗi loại kháng thể chỉ kết hợp đặc hiệu
duy nhất với loại kháng nguyên đã sinh ra chúng, ví dụ: kháng thể chống độc tố uốn
ván chỉ kết hợp với độc tố uốn ván, không kết hợp với độc tố bạch hầu.
Phần đặc hiệu có khả năng liên kết với kháng nguyên được gọi là “trung tâm hoạt
động” của kháng thể. Kháng thể có bao nhiêu “trung tâm hoạt động” thì có bấy
nhiêu hố trị, thơng thường cỏ hai hố trị như phân tử lớn, nhưng cũng có thể kháng

thể có đa hố trị.

Hình 1.8: Cấu trúc của kháng thể.
Kháng thể có bản chất là protein, nên kháng thể nhiệt độ hố chất, axit, kiềm, các
loại men phá huỷ.
•

Chức năng của kháng thể

Sự kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên là một trong những chức năng chính của
kháng thể. Chức năng của kháng thể liên quan chặt chẽ với cấu trúc, do cấu trúc quy
định.
-

Đoạn Fab: Có chức năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, làm bất hoạt
nó, mà các kết quả lý hóa đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều kỹ
thuật miễn dịch.

-

Đoạn Fc: Nối 2 đoạn Fab với nhau, có chức năng kết hợp với các thụ thể trên
bề mặt tế bào (hoặc phân tử), khởi động các cơ chế hoạt hóa: Bạch cầu, bổ
thể. Như vậy kháng thể có chức năng hoạt hóa hệ miễn dịch không đặc hiệu.

8


-

Fab và Fc khơng hoạt động riêng rẽ, mà có sự quan hệ phối hợp rất chặt chẽ.

Ví dụ: Khi Fab tách khỏi Fc bằng enzyme thì nó vẫn kết hợp được với kháng
nguyên, nhưng sẽ không gây được kết tủa, ngưng kết.

Tóm lại, các kháng thể có chức năng bất hoạt một cách đặc hiệu kháng nguyên,
đồng thời hoạt hóa các cơ chế miễn dịch khơng đặc hiệu của cơ thể, kết hợp chặt
chẽ miễn dịch đặc hiệu và khơng đặc hiệu.
• Kháng thể đơn dịng (Monoclonal Antibody)
Kháng thể đơn “clon” hay kháng thể đơn dịng mới được nói đến trong những năm
gần đây, nhưng thực sự nó có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu và ứng dụng.
Khi đưa một hỗn hợp gồm n loại kháng nguyên vào cơ thể thì sẽ có n loại kháng thể
được sinh ra. Để có được kháng thể đơn đặc hiệu (tức là kháng thể chỉ chống lại
một loại kháng nguyên) người ta phải dùng phương pháp hấp thu, tách chiết kháng
thể không cần thiết hoặc làm tinh khiết kháng nguyên để gây miễn dịch. Kháng thể
này tuy nói là đơn đặc hiệu nhưng thực chất đó vẫn là một hợp chất gồm nhiều
kháng thể hợp lại, mà mỗi một kháng thể chống lại một loại quyết định kháng
nguyên có trong phân tử kháng nguyên. Phương pháp sản xuất này tốn kém, phức
tạp và thường dùng động vật để chế huyết thanh miễn dịch.
Theo thuyết chọn lọc “clon” thì mỗi lympho bào trong cơ thể có khả năng nhận diện
một loại “quyết định kháng nguyên” và mỗi một loại “quyết định kháng ngun”
sau khi nhận diện đều có thẩm quyền kích thích lympho bào này tăng sinh và biệt
hố thành một đơn lympho bào có khả năng sinh ra kháng thể chống lại quyết định
kháng nguyên tương ứng (hay kháng thể đơn đặc hiệu tương ứng). Như vậy kháng
thể đơn dòng là một loại kháng thể do một “clon” lympho bào sản xuất và tiết ra để
chống lại một loại quyết định kháng nguyên nhất định. Kỹ thuật này được Milstein
và Kohler đưa ra 1975 và được ứng dụng để sản xuất các kháng thể đơn dịng ở
ngồi cơ thể bằng kỹ thuật liên hợp tế bào myeloma với tế bào lympho B hoạt hoá
của chuột.

9

1.2.

Phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể

1.2.1. Khái niệm
Khi cho tiếp xúc giữa kháng thể đặc hiệu (kháng thể dịch thể hoặc kháng thể tế bào)
với kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng thì phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu. Phản ứng kết hợp này có thể xảy ra
“invivo”(trong cơ thể sống) hoặc “invitro”(trong ống nghiệm).
1.2.2. Cơ chế kết hợp
Sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các lực liên kết lý
hóa sau:
-

Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Wander-Wals:
do sự chuyển động của các điện tử làm cho phân tử trở thành có cực, và hút
phân tử bên cạnh nếu tiếp cận với lực khác dấu của phân tử này.

-

Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau. Ví dụ giữa nhóm amin và
nhóm carboxyl.

-

Lực liên kết nhẹ giữa các cầu nối hydro với nhau : tạo ra giữa nguyên tử H+
(trên phân tử kháng nguyên hoặc kháng thể) với O-, hoặc N-, thực chất đây
cũng là lực hút tĩnh điện.

-

Lực kỵ nước: khi 2 nhóm kỵ nước nằm đủ gần, thì chúng sẽ liên kết với nhau
sau khi loại trừ các phân tử nước giữa chúng. Lực này chi phối 50% lực liên
kết kháng nguyên-kháng thể nói chung.

Phản ứng kết hợp giữa kháng ngun kháng thể khơng phải là một phản ứng hóa
học khơng hồn tồn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên
và kháng thể.

10


Hình 1.9: Liên kết kháng ngun- kháng thể.
• Phản ứng ngưng kết (Agglutination test)

Hình 1.10: Phản ứng ngưng kết.
A - Khơng xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một
xác vi khuẩn.
B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi khuẩn.
C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM.
Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi khuẩn). Khi găp
kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt
thường có thể quan sát được. Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp.
Khi cho kháng nguyên hữu hình trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì các vi
khuẩn sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu. Do mỗi cầu nối với các
kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết
biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc những cụm
bông lơ lửng.
11

• Phản ứng kết tủa (Precipitation test)
Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong phản ứng
này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể tương ứng, cũng là
chất hòa tan trong huyết thanh.
Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra, sự kết tủa
biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được. Phản ứng kết tủa cũng
cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH, các ion môi trường điện giải…
1.3.

Ứng dụng của cảm biến sinh học

Các kỹ thuật dùng trong chẩn đoán vi sinh vật hiện nay hầu hết thuộc các phản ứng
kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. Trong chẩn đoán trực tiếp, sau khi vi sinh
vật đã dược nuôi cấy phân lập, người ta dùng kháng huyết thanh mẫu (huyết thanh
chứa loại kháng thể đã biết) để xác định loại vi sinh vật gây bệnh. Trong chẩn đoán
gián tiếp, người ta xác định kháng thể đặc hiệu có trong dịch thể của động vật nghi
mắc bệnh. Thường kháng thể có trong huyết thanh nhờ các kháng nguyên mẫu (là vi
sinh vật đã biết được nuôi cấy thuần khiết).
1.4.

Một số phương pháp phát hiện ung thư hiện nay

1.4.1. Phương pháp xét nghiệm miễn dịch đánh dấu enzyme (ELISA – Enzyme
linked immunosorbent assay)
Đây là một kỹ thuật được sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự có
mặt của kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu. Phương pháp này dược sử dụng
thông dụng trong các chuẩn đoán y học phát hiện các bệnh, đặc biệt trong việc
chuẩn đoán sớm các bệnh ung thư nhờ việc xác định sự có mặt của chất chỉ điểm.
Phương pháp này cho phép xác chính xác sự có mặt của kháng nguyên hoặc kháng

thể trong dung dịch. Nhưng phương pháp này có một số nhược điểm là enzyme hoạt
động phụ thuộc vào nhiết độ, tốn kém hóa chất và thời gian.

12


Hình: Các bước hoạt động của phương pháp đánh dấu enzyme.
1: Kháng thể được cố định trên một bề mặt.
2: Tương tác kháng nguyên - kháng thể.
3: Kháng thể phát hiện được đưa vào và gắn kết với kháng nguyên thứ cấp.
4: Kháng thể trung gian kết thêm với enzyme và được liên kết với kháng thể
phát hiện
5: Các chất nền thay đổi màu sắc bởi enzyme.
Nồng độ PSA có thể được xác định theo phương pháp này (xem hình 1.2). Enzyme
được sử dụng là peroxidase lấy từ củ cải trắng (Horse radish peroxidase, HRPO).
Hợp chất tạo màu cho HRPO là TMB (5,tetramethyl benzidine). HRPO sẽ chuyển
TMB thành hợp chất hịa tan màu vàng do được kích thích bởi bước sóng 450 nm.
Theo nhiều nghiên cứu, phương pháp này xác định được nồng độ PSA tối thiểu là 2
(mIU/mL) tối đa là 150 (mIU/mL).
1.4.2. Phương pháp kháng thể miễn dịch đánh dấu huỳnh quang (
fluorescence-labeled antibody Immunoassay )
Chất phát huỳnh quang được gắn vào kháng thể. Khi có tương tác xảy ra, phức hợp
kháng thể huỳnh quang sẽ gắn chặt vào kháng nguyên sẽ tạo lên một phức hợp bền
vững. Khơng một kháng thể nào bị mất trong q trình rửa, và kết quả được quan
sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kính hiển vi này chứa nguồn ánh sáng có cường
độ lớn kích thích kính lọc để tạo ra bước sóng có khả năng gây hoạt hố huỳnh
quang. Tấm chắn của kính lọc có tác dụng loại bỏ các bước sóng gây nhiễu của ánh
sáng. Khi quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang phải quan sát dưới với nền tối.
Kháng nguyên tương tác đặc hiệu với phức hợp kháng thể huỳnh quang. Tương tác
13

này xảy ra thì quan sát được màu xanh lục sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Tồn bộ q trình trên là nguyên lý hoạt động của phương pháp này (xem hình 1.3).
Việc xác định PSA cũng tuân theo nguyên lý này với chất phát huỳnh quang được
gắn

vào

kháng

thể

PSA

là

tetramethylrhodamin

(TMR)

hoặc

là

tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). Hợp chất này tạo ra màu đỏ và được
quan sát dưới kính hiển vi khi tương tác kháng nguyên kháng thể xảy ra. Phương
pháp này nhược điểm là khó phân biệt giữa sự phát màu đặc hiệu và không đặc
hiệu, mất nhiều thời gian và tốn kém.

Hình: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp.
1.4.3. Phương pháp đánh dấu miễn dịch đồng vị phóng xạ (Radio Immuno
Assay – RIA).
Mỗi loại ung thư lại có một loại kháng nguyên đặc hiệu. Kháng nguyên này sẽ kết
hợp với kháng thể đặc hiệu với nó. Nếu dùng các kháng thể đặc hiệu (kháng thể đơn
dòng: monoclonal anbibody) đã được đánh dấu bằng một đồng vị thích hợp phát tia
gamma thì kháng thể này sẽ kết hợp với kháng nguyên tương ứng và tạo thành phức
hợp kháng nguyên - kháng thể đánh dấu phóng xạ. Để tìm và phát hiện khối u nào
đó, người ta thường sử dụng một số đồng vị phóng xạ như

123

I,

111

In,

99m

Tc,

131

I.

Với việc phát hiện một số loại ung thư: ung thư vú, ung thư nhau thai…, người ta
dùng kháng thể đơn dòng PSA được đánh dấu

125

I, theo nhiều kết quả nghiên cứu

thì giới hạn phát hiện của phương pháp này là 1(ng/mL). RIA là một phương pháp
có khả năng phát hiện các chất chỉ điểm ung thư trong huyết thanh. Phương pháp
này phụ thuộc vào thời gian, có khả năng gây nguy hiểm và chuẩn bị mẫu phức tạp.
14


Một yêu cầu được đặt ra là cần có một phương pháp xét nghiệm chính xác và nhanh
chóng mà khơng bị hạn chế so với các phương pháp trên. Các cơng nghệ mới được
phát triển phải có khả năng đáp ứng chuẩn đoán tốt hơn. Một phương pháp thay thế
cho các phương pháp trên đó là phát hiện định lượng kháng nguyên nhờ một cảm
biến sinh học dựa vào việc cố định kháng thể trên bề mặt cảm biến. Sự kết hợp của
bộ chuyển đổi vật lý với các hoạt động miễn dịch mang lại một hướng đi mới cho
các xét nghiệm miễn dịch. Theo đó các xét nghiệm miễn dịch có thể cho kết quả
nhanh chóng và tự động. Dựa vào tính chất áp điện của tinh thể thạch anh, lợi thế
của tính chất này là có thể đo trực tiếp sự tương tác miễn dịch. Thiết bị của phương
pháp xét nghiệm này gồm miếng tinh thể thạch anh kẹp giữa hai điên cực vàng
được kết nối với thiết bị cho một mạch dao động. Các tinh thể thạch anh dao động ở
tần số công hưởng với mạch dao động. Sự thay đôi nhỏ khối lương trên bề mặt điện
cực dẫn đến sự thay đổi tần số cộng hưởng ở đầu ra. Phương pháp này đáp ưng đầy
đủ các yêu cầu: thời gian phân tích nhanh, chuẩn bị mẫu đơn giản, độ nhạy cao và
rất rẻ.Với những ưu điểm vượt trội như vậy cảm biến sinh học dựa trên cơ sở linh
kiện QCM sẽ hứa hẹn mở ra một phương pháp xét nghiệm miễn dịch không đánh
dấu đầy tiềm năng cho các phịng thí nghiệm trên thế giới trong việc chuẩn đoán
sớm bệnh ung thư.

15

CHƯƠNG 2: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ
CHUYỂN ĐỔI NHẠY KHỐI LƯỢNG VÀ ĐIỆN HÓA
2.1.

Cảm biến sinh học nhạy khối lượng (QCM sensor)

2.1.1. Tinh thể Quartz
2.1.1.1. Cấu trúc
Tinh thể Quartz được cấu thành từ hai nguyên tố : Silic và Oxy. Trong điều kiện
nhiệt độ phòng, tinh thể Quartz có cấu trúc trigonal ( - Quartz) và có hiệu ứng áp
điện rất mạnh. Các ô đơn vị lặp lại tuần hồn trong khơng gian. Tinh thể Quartz có
nhiệt độ chuyển pha là 5730C. Khi nhiệt độ lớn hơn 5730C, tinh thể chuyển sang cấu
trúc hexagonal (-Quartz) và mất đi tính áp điện. Mạng tinh thể có các ion Si+ và
O- , chúng được sắp xếp như trình bày trên hình 1.8.

Hình 1.8: Cấu trúc của tinh thể α - Quartz trong khơng gian (a)
và trong mặt phẳng (b).
2.1.1.2. Tính chất áp điện
Nguồn gốc của hiện tượng áp điện xảy ra trong tinh thể α-Quartz là do sự dịch
chuyển của các ion Si+ và O- trong mạng tinh thể khi có biến dạng. Khi chưa có
ứng suất bên ngồi thì trọng tâm điện tích âm và điện tích dương trùng nhau nên
tinh thể có tính trung hịa về điện. Khi có ứng suất bên ngồi, ứng suất này sẽ làm
cho trọng tâm các điện tích dương và điện tích âm lệch nhau dẫn đến hình thành

16


một momen phân cực điện. Sự xuất hiện của moment phân cực điện này sẽ tạo ra
điện tích trái dấu giữa 2 mặt tinh thể.

Hình 1.9: Cơ chế gây hiện tượng áp điện trong tinh thể α - Quartz.
Khi đặt điện áp xoay chiều có tần số thích hợp lên hai mặt tinh thể, tinh thể sẽ dao
động với tần số của điện áp và sinh ra một tín hiệu điều hòa, gọi là mode dao động
của tinh thể Quartz. Mode dao động này phụ thuộc vào cách cắt tinh thể. Đối với
tinh thể loại AT - cut, dao động tinh thể theo mode trượt (xem hình 1.10). Cịn đối
với tinh thể X - cut có mode dao động co dãn tinh thể dọc theo hướng đặt điện áp
(xem hình 1.11).

Hình 1.10: Mơ tả mode dao động trượt theo bề dày của linh kiện QCM.

Hình 1.11: Mơ tả một số mode dao động trượt bề dày, mode trượt bề mặt
và mode co giãn.
17


Ngồi ra, tinh thể Quartz cịn có mode dao động tổng hợp. Loại mode này bao gồm
cả các dao động tuần hồn (cơ bản), các dao động khơng tuần hồn và các họa âm.
Các mode dao động khơng tuần hồn là các mode khơng mong muốn vì chúng gây ra
hiện tượng dịch tần số khỏi điểm cộng hưởng một khoảng gọi là bước nhảy tần số.
2.1.2. Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM)
Năm 1959, Sauerbrey đã phát hiện ra mối liên hệ giữa sự dịch chuyển tần số cộng
hưởng của tinh thể Quartz với sự thay đổi khối lượng trên một đơn vị diện tích bề
mặt của nó. Cơng trình này đã đặt nền móng cho việc chế tạo và sử dụng tinh thể
Quartz như linh kiện một vi cân (Quartz Crystal Microbalance - QCM). Để biểu
diễn mối liên hệ giữa độ dịch tần số cộng hưởng và biến thiên khối lượng trên bề
mặt, Sauerbrey đã đưa ra phương trình [20]:

F0 = −cF m

(1-2)

Trong đó, cF là hệ số tỉ lệ. Δm biểu diễn sự biến thiên khối lượng trên một đơn vị bề
mặt diện tích của tinh thể. ΔF0 là độ dịch tần số tương ứng với biến thiên khối
lượng. Như vậy, dựa vào phương trình này chúng ta có thể xác định được độ tăng
khối lượng hấp phụ trên bề mặt của linh kiện QCM.
Ngoài ra, trong chất lỏng, độ dịch tần số tỉ lệ với căn bậc 2 của tích mật độ và độ
nhớt dung dịch theo phương trình:

F0 = −F03/2

L  L
q q

(1-3)

Trong đó, ηL, ρL lần lượt là độ nhớt và mật độ chất lỏng; ηq, µqlần lượt là độ nhớt và
modun trượt của tinh thể Quartz. Đây chính là cơ sở cho các ứng dụng của QCM
trong việc xác định mật độ cũng như độ nhớt của môi trường.
Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu tập trung vào ứng dụng QCM đo nồng độ
khí trong mơi trường, làm các cảm biến sinh học hoặc sử dụng nghiên cứu tương tác
giữa các phân tử bề mặt. Ngồi ra, tinh thể Quartz cịn nhạy đối với một số thay đổi
khác trên bề mặt tinh thể như áp suất, nhiệt độ và độ nhám bề mặt. Lấy gần đúng

18


bậc nhất coi độ dịch tần số bằng tổng độ dịch thành phần do các tác nhân khác nhau,
ta có:

F0 = Fmass + Fdensity/viscosity + Fcompres si on + Froughness + Ftemprature (1-4)
Ảnh hưởng của các thành phần khối lượng, độ nhớt của dung môi, nhiệt độ cũng
như độ nhám bề mặt của tinh thể Quartz lên độ dịch tần số cộng hưởng được đánh
giá như sau:
(1)

Ảnh hưởng của khối lượng chất hấp phụ

Khi một lượng chất hấp phụ lên bề mặt tinh thể Quartz thì lượng chất đó có thể coi
như khối lượng cộng thêm vào tinh thể Quartz đồng thời làm tăng chiều dày tinh thể
lên Δd, dẫn tới làm thay đổi tần số cộng hưởng của QCM một khoảng ΔF0 theo
phương trình (1-2).
(2)

Ảnh hưởng của độ nhớt dung môi

Khi tiếp xúc với chất lỏng, tần số của hộp cộng hưởng giảm do độ nhớt và mật độ
chất lỏng gây ra sự tiêu tán năng lượng. Tần số cộng hưởng của QCM tỷ lệ nghịch
với tích độ nhớt và mật độ chất lỏng tiếp xúc với điện cực:
3

F0 = − F0 2 2

(1-5)

L  L
q q

Trong đó:
ηL , ρL : Độ nhớt và mật độ chất lỏng tiếp xúc.

ρq , μq : Mật độ và modun trượt tinh thể Quartz.
ρq = 2.648 g.cm-3, μq = 2.947×1011 g.cm-1.s-2 .
(3)

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Tần số dao động của tinh thể Quartz cũng phụ thuộc nhiệt độ như trình bày trên
hình 1.12. Tuy nhiên, sự phụ thuộc này đối với tinh thể Quart loại AT - cut là tương
đối nhỏ. Trong thực tế, tinh thể loại AT - cut thường có hệ số nhiệt gần như bằng
khơng ở nhiệt độ phịng. Trong khoảng nhiệt độ từ 0 ÷ 60 oC, sự phụ thuộc F(T) là
rất nhỏ, cỡ 1 - 3Hz/ oC và có thể coi như tuyến tính:
19