Lên men lactobacillus acidophilus thu nhận sinh khối để ứng dụng trong công nghệ sản xuất probiotic

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

NGUYỄN KIM THANH NHÃ

LÊN MEN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
THU NHẬN SINH KHỐI ðỂ ỨNG DỤNG
TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROBIOTIC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số
: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp. Hồ Chí Minh, 03/2011


ðẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

LÊN MEN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
THU NHẬN SINH KHỐI ðỂ ỨNG DỤNG
TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROBIOTIC

CBHD : PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
TS. NGUYỄN BÍCH HỒNG

HVTH : NGUYỄN KIM THANH NHÃ
MSHV : 09310577

Tp. Hồ Chí Minh, 03/2011


TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA
PHÒNG ðÀO TẠO SðH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ðộc lập - Tự do - Hạnh phúc

Tp. HCM, ngày . .9 . . tháng . .03 . . năm 2011.. .

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Kim Thanh Nhã.

Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 10/08/1982.

Nơi sinh: ðồng Nai

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học.

MSHV: 0 9310577

I- TÊN ðỀ TÀI: Lên men thu nhận sinh khối Lactobacillus acidophilus để ứng dụng
trong cơng nghệ sản xuất probiotic.
II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Xác định đặc tính probiotic của giống Lactobacillus acidophilus.
Tối ưu hóa điều kiện ni cấy theo quy mơ phịng thí nghiệm.
Khảo sát mơi trường nuôi cấy cải biến.
Lên men fed-batch thu sinh khối Lactobacillus acidophilus.
Sấy phun sinh khối Lactobacillus acidophilus.
Khảo sát ñiều kiện bảo quản tối ưu sinh khối Lactobacillus acidophilus sau
khi sấy phun.
III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/01/2010
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/12/2010.
V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS. Nguyễn Thu Hương
TS. Nguyễn Bích Hồng.
Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được hội đồng chun ngành thơng qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
(Họ tên và chữ ký)
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)

KHOA QL CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


CƠNG TRÌNH ðƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA
ðẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
Cán bộ hướng dẫn khoa học :
PGS,.TS. NguyễnThúyHương.
TS.Nguyễn BíchHồng.
Cán bộ chấm nhận xét 1 :
..................................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2 :
..................................................................................
Luận văn thạc sĩ ñược bảo vệ tại Trường ðại học Bách Khoa, ðHQG Tp. HCM
ngày . . . . . tháng . .01 . . năm . . 2011. . .
Thành phần Hội ñồng ñánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. ..............................................................
2. ..............................................................
3. ..............................................................
4. ..............................................................
5. ..............................................................
Xác nhận của Chủ tịch Hội ñồng ñánh giá LV và Bộ môn quản lý chuyên ngành
sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
Chủ tịch Hội ñồng ñánh giá LV

Bộ môn quản lý chuyên ngành


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn đến q Thầy Cơ trường
ðại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là những thầy cơ đã tận
tình dạy bảo cho tơi suốt thời gian học tập tại trường.
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến Phó giáo sư – Tiến sĩ Nguyễn Thúy
Hương và Tiến sĩ Nguyễn Bích Hồng đã dành rất nhiều thời gian và tâm
huyết hướng dẫn em trong thời gian thực hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn q Thầy Cơ bộ mơn Cơng Nghệ Sinh
Học - Khoa Kỹ thuật hóa học đã tạo rất nhiều điều kiện trong suốt khóa học
và thời gian thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin cảm ơn các bạn CNSH cao học khóa 2008 và 2009 ñã
ñộng viên hỗ trợ trong suốt khóa học.
Cuối cùng, con xin cám ơn ba mẹ đã ln ủng hộ, hỗ trợ và động viên

con trong thời gian qua.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 01năm 2011
Học viên
Nguyễn Kim Thanh Nhã


TÓM TẮT LUẬN VĂN
ðề tài luận văn: “ Lên men thu nhận sinh khối Lactobacillus acidophilus để ứng dụng
trong cơng nghệ sản xuất probiotic”.
Học viên thực hiện: Nguyễn Kim Thanh Nhã.
Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Thúy Hương.
TS. Nguyễn Bích Hồng
Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2010 ñến tháng 12/2010.

Nội dung ñề tài
1. Xác ñịnh các ñặc ñiểm giống Lactobacillus acidophilus.
2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch ni cấy.
3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy theo quy mơ phịng thí nghiệm.
4. Khảo sát mơi trường ni cấy cải biến.
5. Lên men fed-batch thu sinh khối Lactobacillus acidophilus.
6. Sấy phun sinh khối Lactobacillus acidophilus.
7. Khảo sát ñiều kiện bảo quản tối ưu sinh khối Lactobacillus acidophilus sau khi sấy
phun.

Kết quả đề tài
1. Chủng Lactobacilus acidophilus có những đặc tính của probiotic cao: Chịu được pH
thấp, muối mật, loại bỏ cholesterol, sinh L-acid lactic, kháng khuẩn và phân giải
protein.
2. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy quy mơ phịng thí nghiệm: Mơi trường MRS với 13g

sucrose và 14.55g peptone là môi trường tối ưu cho sự phát triển tạo sinh khối của vi
khuẩn Lactobacillus acidophilus.
3. Lên men fed-batch
Sucrose là cơ chất lên men giới hạn trong fed-batch.
Kết quả lên men fed-batch với cơ chất giới hạn là sucrose ở ba chế ñộ 3 g/l.h, 5
g/l.h, 7 g/l.h. Chế ñộ sucrose 5 g/l.h sinh khối cực ñại ñạt cao nhất ñạt 2.784
CDW (g/l)


4. Khảo sát một số môi trường cải biến ba mơi trường được tiến hành thử nghiệm để
ni cấy L. acidophilus bao gồm môi trường A( cà chua), B ( giá ñỗ), C (cải xanh).
Các kết quả cho thấy trên mơi trường C có khả năng tạo sinh khối cao nhất so với 2
môi trường A và B.
5. Khảo sát ñiều kiện nhiệt ñộ bảo quản sinh khối L. acidophilus sau khi sấy phun: Hai
chế ñộ nhiệt ñộ ñược khảo sát là 4oC và 15oC. Sau gần 1 tháng bảo quản thì ở nhiệt độ
4oC mật độ tế bào vi khuẩn L. acidophilus vẫn duy trì ở mức cao ≈ 108 cfu/g.


i

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
CHƯƠNG 1: MỞ ðẦU

Trang

1.1. ðặt vấn ñề ............................................................................................................. 1
1.2. Nội dung ............................................................................................................... 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ðại cương về probiotic .......................................................................................... 3
2.2. Phương pháp nuôi cấy batch, fed-batch ............................................................... 25
2.3. Các nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................................... 29
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................ 37
3.2. Nguyên vật liệu ................................................................................................... 37
3.2.1. Chủng vi sinh vật .......................................................................................... 37
3.2.2.Môi trường nuôi cấy ...................................................................................... 37
3.3. Phương pháp phân tích ........................................................................................ 38
3.3.1. Xác ñịnh mật ñộ tế bào bằng phương pháp ño mật ñộ quang ......................... 38
3.3.2. Xác ñịnh lượng sinh khối khô ....................................................................... 38
3.3.3. Xác ñịnh khả năng chịu pH thấp ................................................................... 39
3.3.4. Xác ñịnh khả năng chịu muối mật ................................................................. 39
3.3.5. Khả năng chịu cholesterol ............................................................................. 39
3.3.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn .................................................................... 39


ii

3.3.7. ðịnh tính acid lactic ...................................................................................... 40
3.3.8. Phương pháp định lượng acid lactic .............................................................. 40
3.3.9. Xác ñịnh ñồng phân dạng D, L acid lactic ..................................................... 41
3.3.10. Hoạt tính phân giải protein .......................................................................... 42
3.3.11. Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm yếu tố toàn phần ............................... 42
3.3.12. Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm đường dốc nhất ................................. 44
3.3.13. Phương pháp tiến hành thí nghiệm .............................................................. 45
3.3.14. Những nghiên cứu làm tiền ñề cho lên men fed-batch thu nhận sinh khối
probiotic ..................................................................................................................... 45
3.3.15. Lên men trong fermenter ............................................................................. 50

3.3.16. Sấy phun sinh khối probiotic ....................................................................... 53
3.3.17. Bảo quản sinh khối probiotic ....................................................................... 53
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Những nghiên cứu làm tiền ñề cho lên men thu nhận sinh khối probiotic ............ 54
4.2. Lên men trong fermenter ...................................................................................... 69

4.3. Sấy phun thu sinh khối L. acidophilus và theo dõi thời gian bảo quản sinh khối L.
acidophilus ................................................................................................................ 75
4.4. Khảo sát khả năng lên men tạo sinh khối của vi khuẩn L. acidophilus trên một số
môi trường cải biến ................................................................................................... 76

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
5.1. Kết luận ............................................................................................................... 78
5.2. ðề nghị................................................................................................................ 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
PTN : Phịng thí nghiệm
QHTT: Quy hoạch tuyến tính
LAB: Lactic acid bacteria ( Vi khuẩn sinh acid lactic)
CDW: Sinh khối khô


iv

DANH MỤC BẢNG VÀ ðỒ THỊ

Trang
Bảng 3.1: Thông số tối ưu thành phần môi trường .................................................... 47
Bảng 3.2: Số liệu thí nghiệm leo dốc với sucrose và peptone ................................... 48
Bảng 3.3 : Thơng số tối ưu điều kiện ni cấy .......................................................... 48
Bảng 4.1: Ảnh hưởng của pH 2 lên L. acidophilus ................................................... 56
Bảng 4.2: Khả năng sống sót của L. acidophilus ở pH 2, bổ sung 0,3% mật bò ....... 57
Bảng 4.3: Khả năng sinh acid lactic của L. acidophilus ........................................... 58
Bảng 4.4: Hoạt tính kháng khuẩn thể hiện theo pH ................................................... 59
Bảng 4.5: Phổ kháng khuẩn của dịch nuôi cấy .......................................................... 60
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ ñến khả năng tạo sinh khối và
hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus acidophilus. .................................................... 61
Bảng 4.7: Kết quả tối ưu hóa theo điều kiện ni cấy theo quy hoạch thực nghiệm .. 62
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát % giống ........................................................................ 64
Bảng 4.9: Kết quả khảo sát nhiệt độ ni cấy ............................................................ 64

Bảng 4.10: Kết quả khảo sát pH môi trường nuôi cấy .............................................. 65
Bảng 4.11: Kết quả tối ưu thành phần môi trường nuôi cấy ...................................... 66
Bảng 4.12 : Kết quả thí nghiệm leo dốc.................................................................... 69
Bảng 4.13 : Kết quả khảo sát cơ chất giới hạn .......................................................... 72
Bảng 4.14: Tóm tắt các chế độ và kết quả ................................................................ 74
Bảng 4.15: Nhiệt độ và thời gian bảo quản hoạt tính của sinh khối L. acidophilus
sau sấy phun. ........................................................................................................... 75
Bảng 4.16: Khả năng sinh acid lactic của L. acidophilus trên môi trường cải biến.... 76
Bảng 4.17: Khả năng ức chế vi khuẩn kiểm định trên các mơi trường cải biến
của L. acidophilus .................................................................................................... 77
ðồ thị 4.1: ðường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus ......................... 55
ðồ thị 4.2: ðộng học lên men theo mẻ khơng điều khiển pH .................................... 70
ðồ thị 4.3: ðộng học lên men theo mẻ ñiều khiển pH 6.0 ........................................ 71
ðồ thị 4.4: ðộng học lên men fed-batch 3g/l.h sucrose, pH 6.0 ................................ 72
ðồ thị 4.5: ðộng học lên men fed-batch 5g/l.h sucrose, pH 6.0 ................................ 73

ðồ thị 4.6: ðộng học lên men fed-batch 5g/l.h sucrose, pH 6.0 ................................ 73


v

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Hệ thống phát sinh lồi biểu diễn dưới dạng cây thể hiện mối quan hệ giữa các
lồi trong họ Lacto-bacillaceae (L-Lactobacillus) ..................................................... 12
Hình 2.2: Lactobacillus acidophilus dưới kính hiển vi ............................................. 12
Hình 2.3: Lactate dehydrogenase và Racemase ....................................................... 14
Hình 2.4: Acid L-lactic và acid D-lactic .......................................................................... 15
Hình 3.1: Sơ đồ tổng qt q trình nghiên cứu ....................................................... 45
Hình 3.2: Sơ đồ lên men theo mẻ trong fermenter .................................................... 50
Hình 3.3 : Lên men L. acidophilus bằng fermenter tự động. ..................................... 52
Hình 3.4: Sơ đồ lên men fed-batch ........................................................................... 52
Hình 4.1: Khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus ........................................................ 54
Hình 4.2: Tế bào Lactobacillus acidophilus quan sát dưới kính hiển vi .................... 54
Hình 4.3: Lactobacillus acidophilus phân giải casein trong mơi trường

thạch MRS bổ sung 1% casein. ................................................................................. 58
Hình 4.4: Vịng kháng khuẩn ở pH 3. ....................................................................... 59
Hình 4.5: Sinh khối L. acidophilus sau khi sấy phun. ............................................... 75


vi


CHƯƠNG 1
MỞ ðẦU

1

1.1 ðặt vấn ñề
Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe được bổ sung vào chế ñộ
ăn uống của cơ thể vật chủ. Theo ñịnh nghĩa của tổ chức y tế thế giới và tổ chức lương
nông thế giới (WHO/FAO, 2001) “ Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi tiêu thụ
vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng” [54]. Qua
nhiều thử nghiệm nghiên cứu về các chủng vi khuẩn có lợi thường được sử dụng bao
gồm: Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic như Lactobacillus (L.acidophilus, L.casein),
Bifidobacterium; các chủng E.coli không gây bệnh; Clostridium butyricum;
Streptococcus salvarius; các chủng Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus breve,
Bacillus infantis, Bacillus longum và Saccharomyces boulardii (nấm men). Hầu hết các
chủng probiotic ñược sử dụng sản xuất thực phẩm là những lồi thuộc nhóm vi khuẩn
acid lactic như là Lactobacillus và Bifidobacteria.
Probiotic có thể đem đến cho cơ thể những lợi ích sau đây: Ngăn chặn sự xâm
nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản trở chúng bám vào thành ruột. Giúp cho
việc tiêu hóa thức ăn hữu hiệu hơn. ðối với những người thường bị chứng bất dung nạp
đường lactose thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa chất ñường này dễ dàng hơn. Giảm nguy
cơ tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh (Antibiotic Associated Diarrhea hay
AAD). ðiều hòa hệ miễn dịch. Ngừa ung thư ruột. Giảm cholesterol trong máu. Giảm
thiểu hiện tượng dị ứng. Ngăn chặn và xử lý nhiễm khuẩn Helicobacter pylori gây viêm
loét dạ dày.
Sản phẩm probiotic trên thị trường rất đa dạng, ngồi dạng probiotic thường gặp
trong yogurt, kefir, phomai tươi cottage… Probiotic cịn được bán ra dưới nhiều hình
thức khác như: Probiotic cô lạnh, viên nang (capsule), viên nén, bột, yogurt trị liệu, men
bia Saccharomyces bolardii.
Tuy nhiên, không phải cứ bổ sung probiotic vào thực phẩm hay sữa thì được gọi
là probiotic. Probiotic có thể bị tiêu diệt bởi các men và acid đường ruột. Do đó, để

được gọi là probiotic, một trong những ñiều kiện ñầu tiên là chủng probiotic mạnh, ñược
chứng nhận lâm sàng và có số lượng lớn.
Việc sản xuất probiotic địi hỏi chi phí và cơng nghệ cao nên Việt Nam vẫn
chưa có nhiều sản phẩm chứa probiotic hay sản phẩm bổ sung probiotic thật sự ñược
kiểm nghiệm và chứng nhận lâm sàng, nguồn probiotic trong nước chủ yếu được nhập
khẩu, chưa được sản xuất theo quy mơ công nghiệp.


2

Trong những năm gần ñây, vi khuẩn lactic ñược sử dụng nhiều trong lên men
thực phẩm do có đặc tính sinh học của probiotic như khả năng chịu muối mật, acid, có
hoạt tính kháng khuẩn, loại bỏ cholesterol... Sinh khối của vi khuẩn lactic cũng là nguồn
protein bổ sung cho con người và gia súc (Blanch và Clark, 1996). Bên cạnh đó, các sản
phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic cũng được ứng dụng trong cơng nghiệp dược
phẩm và thực phẩm, ví dụ như bacteriocin có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, khả
năng chịu ñược ñiều kiện cực đoan của mơi trường dạ dày và ức chế sự tăng trưởng của
vi khuẩn gây ôi thiu thức ăn (Desmazeaud, 1996). Trong đó, Lactobacillus acidophilus
được sử dụng như men vi sinh bổ sung vào thực phẩm cũng như trong dược phẩm do có
nhiều ưu điểm đã được nghiên cứu và chứng minh Lactobacillus acidophilus có lợi cho
sức khỏe ( Alvarez-Olmos và Oberhelman, 2001; Shanahan, 2002; Guarner Malagelada,
2003)
Trong kỹ thuật lên men có ba phương pháp chính: Lên men theo mẻ, fed-batch
và lên men liên tục. Trong đó, lên men theo mẻ ñơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên hiệu
suất khơng cao do sự tích lũy cơ chất, độc chất. Phương pháp lên men fed-batch là
phương pháp lên men rút ngắn thời gian lên men và làm tăng hiệu suất của q trình lên
men, tuy nhiên sự tự động hóa khơng cao. Lên men fed-batch sẽ làm giảm chi phí sản
xuất vì chỉ cần bổ sung một lượng cơ chất vừa đủ trong suốt q trình lên men. Lên men
liên tục tự động hóa cao nhưng kỹ thuật phức tạp, phải tiệt trùng liên tục.
Vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu lên men

fed-batch ñể thu sinh khối Lactobacillus acidophilus và tìm ñiều kiện tốt nhất để bảo
quản hoạt tính probiotic của Lactobacillus acidophilus.

1.2 Nội dung
Xác ñịnh các ñặc ñiểm giống Lactobacillus acidophilus.
Xác ñịnh hoạt tính kháng khuẩn của dịch ni cấy.
Tối ưu hóa điều kiện ni cấy theo quy mơ phịng thí nghiệm.
Khảo sát môi trường nuôi cấy cải biến.
Lên men fed-batch thu sinh khối Lactobacillus acidophilus.
Sấy phun sinh khối Lactobacillus acidophilus.
Khảo sát ñiều kiện bảo quản tối ưu sinh khối Lactobacillus acidophilus sau
khi sấy phun.


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


3

2.1. ðại cương về probiotic
2.1.1. Lịch sử probiotic
Probiotic, có nghĩa là “cho cuộc sống”, ñã ñược sử dụng trong nhiều thế kỷ
như là những thành phần tự nhiên trong thực phẩm có lợi cho sức khỏe. Vào đầu thế
kỷ 20 nhà khoa học người Nga Eli Metchnikoff giáo sư viện Pasteur Paris (ñoạt giải
thưởng Nobel) là người ñầu tiên bằng những quan sát ban đầu đã tìm ra một số vi
khuẩn có lợi có thể thay đổi các hệ thực vật đường ruột và thay thế vi khuẩn có hại
bởi các vi khuẩn có ích. Metchnikoff đã đưa ra khái niệm kết quả của q trình lão
hóa là do sự phân giải protein của vi khuẩn sản sinh chất ñộc hại trong ruột già. Sự
phân giải protein của vi khuẩn như Clostridia có trong hệ tiêu hóa của hệ thực vật

đường ruột bình thường sản sinh ra chất độc hại bao gồm phenol, indol và ammonia
từ sự phân giải protein. Theo Metchnikoff các hợp chất này chịu trách nhiệm cho
những gì ơng gọi là “ruột tự nhiễm độc” gây ra những biến ñổi vật lý liên quan ñến
tuổi già. Vào thời gian đó đã biết được sữa lên men bởi các vi khuẩn lactic ức chế sự
phát triển của vi khuẩn phân giải protein do sự lên men của lactose làm giảm pH. Ông
cũng quan sát thấy rằng một số người dân vùng nông thôn ở Châu Âu như Bungari và
vùng thảo nguyên ở Nga sống chủ yếu vào sữa lên men bằng vi khuẩn lactic sống lâu
hơn. Dựa trên những dữ kiện, Metchnikoff ñưa ra việc tiêu thụ sữa lên men với vi
khuẩn lactic vô hại, làm giảm pH của ruột và ñiều này sẽ ngăn chặn sự phát triển của
vi khuẩn phân giải protein. Metchnikoff ñã tự giới thiệu chế độ ăn uống của Ơng với
sữa chua lên men bởi vi khuẩn Ông gọi là “trực khuẩn Bungari” và đã thấy được lợi
ích của chúng đối với sức khỏe của Ông. Những người bạn ở Paris của Ông nhanh
chóng theo gương và các bác sĩ cũng bắt đầu chỉ ñịnh chế ñộ ăn uống sữa chua cho
các bệnh nhân của họ.
Henry Tissier, cũng từ viện Pasteur, là người ñầu tiên phân lập ñược
Bifidobacterium. Ông ñã phân lập vi khuẩn từ hệ thực vật ñường ruột của một trẻ sơ
sinh bú sữa mẹ và ñặt tên là Bacillus bifidus communis, sau đó được đổi tên thành
Bifidobacterium bifidum. Tissier chỉ ra rằng Bifidobacteria chiếm ưu thế trong hệ
thực vật ñường ruột của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và Ông ñề nghị sử dụng Bifidobacteria
ñiều trị cho trẻ bị tiêu chảy. Cơ chế hoạt ñộng là Bifidobacteria sẽ thay thế vi khuẩn
phân giải protein gây bệnh.


4

Vào năm 1917, giáo sư người ðức Alfred Nissle ñã phân lập ñược chủng
Escherichia coli từ phân của những người lính trong chiến tranh thế giới thứ nhất, họ
bị viêm ruột non kết trong thời gian bùng nổ bệnh lỵ trực khuẩn (shigellosis). Ở thời
điểm đó, thuốc kháng sinh chưa ñược phát hiện và Nissle sử dụng chủng này và thành
cơng đáng kể trong trường hợp viêm nhiễm đường ruột cấp tính (salmonellosis và

shigellosis). Escherichia coli Nissle 1917 vẫn cịn ñược sử dụng và là một trong vài ví
dụ về probiotic không phải là vi khuẩn lactic.
Vào năm 1920, Rettger chứng minh rằng “trực khuẩn Bungari” của
Metchnikoff, sau đó gọi là Lactobacillus bulgaricus không thể sống trong ruột người
và hiện tượng thực phẩm lên men biến mất ở bên ngoài. Lý thuyết của Metchnikoff
ñược bàn cãi ở giai ñoạn này và có những nghi ngờ lý thuyết về sự sống lâu của ông.
Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt ñộng của trung tâm ñược
chuyển tới Mỹ. Có luận ñiểm cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn trong ñường ruột có
nhiều khả năng cho việc sản xuất hiệu quả mong muốn trong ñường ruột và vào năm
1935 một số chủng Lactobacillus acidophilus được tìm thấy có tác dụng tích cực cho
đường tiêu hóa của con người. Các thử nghiệm đã ñược thực hiện trên chủng vi sinh
vật này, kết quả thu ñược rất khả quan ñặc biệt trong việc ñiều trị táo bón mãn tính.
Thuật ngữ “probiotic” lần đầu tiên ñược Kollath ñưa ra vào năm 1953. Trái
ngược với thuốc kháng sinh, probiotic ñược xác ñịnh là yếu tố bắt nguồn từ vi khuẩn
kích thích sự tăng trưởng của vi sinh vật khác. Năm 1989 Roy Fuller ñưa ra một ñịnh
nghĩa của probiotic ñã ñược sử dụng rộng rãi : “ Vi sinh vật sống có lợi cho vật chủ
được bổ sung vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng hệ vi khuẩn ñường ruột của vật
chủ”. ðịnh nghĩa của Fuller nhấn mạnh các yêu cầu của tính khả thi cho probiotic và
giới thiệu một số khía cạnh của một số tách dụng có ích trên cơ thể vật chủ.
Trong những thập niên tiếp theo loài Lactobacillus bao gồm Lactobacillus
rhamnosus, Lactobacillus casein, và Lactobacillus johnsonii chúng là những loài vi
khuẩn có ích cho đường ruột [54].

2.1.2. Một số định nghĩa probiotic
Probiotic là những thực phẩm chức năng khi ăn vào sẽ có ảnh hưởng rõ ràng
trong sự điều chỉnh các quá trình chức phận cơ thể (Lyon, 2005).


5

Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe ñược ăn vào qua
ñường miệng cùng với các chất dinh dưỡng truyền thống trong thức ăn (Zayed &
Roos, 2003).
Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe ñược bổ sung vào chế
ñộ ăn uống của cơ thể vật chủ. Theo tổ chức y tế thế giới: ‘‘Probiotic là các vi sinh vật
sống mà khi tiêu thụ vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi về sức khỏe cho người sử
dụng” [54].

2.1.3. Vai trò của probiotic
Qua nhiều thử nghiệm nghiên cứu về các chủng vi khuẩn có lợi thường được
sử dụng bao gồm: Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic như Lactobacillus
(L.acidophilus, L. casein), Bifidobacterium; các chủng E.coli không gây bệnh;
Clostridium butyricum; Streptococcus salvarius; các chủng Bacillus như Bacillus
subtilis, Bacillus breve, Bacillus infantis, Bacillus longum và Saccharomyces
boulardii (nấm men). Trong đó vi khuẩn sinh acid lactic hiện nay ñược sử dụng phổ
biến nhất trong cơng nghiệp sản suất probiotic. Probiotic có thể đem đến cho cơ thể
những lợi ích sau đây:
Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản trở chúng
bám vào thành ruột.
Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn hữu hiệu hơn. ðối với những người thường bị
chứng bất dung nạp đường lactose thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa chất đường này dễ
dàng hơn. Hầu hết dân số trên thế giới không dung nạp lactose sau khi cai sữa là do sự
giảm khoảng 90 – 95% lượng enzyme lactase sinh ra. Lactase là enzyme thuỷ phân
lactose thành glucose và galactose. Sự hiện diện của lactose làm thay ñổi sự cân bằng
thẩm thấu trong khoang ruột kết. Vì vậy xuất hiện những triệu chứng như trương bụng
trương phồng lên, co thắt, ñầy hơi và kéo theo là tiêu chảy. ðể giảm sự không dung
nạp lactose người ta chứng minh ñược rằng nên tiêu thụ sản phẩm probiotic. Và trên
những kiểm nghiệm lâm sàng gần ñây người ta khuyên nên dùng LAB. Giảm nguy cơ
tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh (Antibiotic Associated Diarrhea hay AAD).
ðiều hòa hệ miễn dịch. Ngừa ung thư ruột. Những tác nhân gây ung thư có thể được

đưa vào hay được tạo thành bởi hoạt động chuyển hố của vi sinh vật cư trú trong


6

ñường ruột. Những cơ chế hoạt ñộng của probiotic chống lại khối u có thể tóm tắt như
sau: Khử độc những chất gây ung thư ñược ñưa vào. Thay ñổi mơi trường của ruột và
hoạt động chuyển hố của vi khuẩn có thể tạo thành những chất gây ung thư. Tạo
thành những sản phẩm chuyển hoá (butyrate) mà những sản phẩm này thay ñổi khả
năng của tế bào chết khi nó chết. Sản sinh ra những chất ức chế sự phát triển của
những tế bào tạo khối u. Kích thích hệ thống miễn dịch. Giảm cholesterol trong máu
[39].
Có hai cơ chế khi tiêu thụ LAB làm giảm cholesterol. Cơ chế thứ nhất cho
rằng, cholesterol ñược sử dụng trong sản xuất những acid mật, tăng sự dị hoá và bài
tiết của những acid mật có thể làm giảm cholesterol. Những acid mật chủ yếu ñược
tạo thành bởi gan là acid chenodeoxycholic. Những acid này thường kết hợp với
glycine hay taurine tạo thành acid glycocholic và acid taurocholic, nhưng có thể được
tách ra bởi enzyme vi sinh vật là BSH (bile salt hydrolase). Sự tách những muối mật
này ngăn sự gia tăng cholesterol. ðiều này chứng tỏ rằng vi sinh vật trực tiếp hấp thụ
cholesterol [26].
Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy vì vậy rất khó khăn cho việc
đánh giá ảnh hưởng của probiotic trên bệnh tiêu chảy. Trên toàn thế giới, bệnh tiêu
chảy ñã giết chết phần lớn trẻ em và rotavirus là nguyên nhân chính. Sự phát triển của
Bifidobacteria trong ñường ruột tạo nên pH thấp trong ruột già bằng cách sản sinh ra
acid lactic và acid acetic, vì vậy chúng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram âm kỵ
khí tuỳ ý gây ra bệnh tiêu chảy.
Khu hệ sinh thái đường ruột ổn định, nó hoạt ñộng như một hàng rào vật lý và
sinh lý chống lại vi khuẩn gây bệnh và những kháng nguyên từ khoang ruột. Những
nghiên cứu cho thấy rằng, những trẻ em bị tiêu chảy do rotavirus thì phục hồi nhanh
hay giảm những triệu chứng tiêu chảy khi sử dụng probiotic. Nghiên cứu ở những ñứa

trẻ (1 - 36 tháng tuổi) sử dụng Lactobacillus casei GG liều lượng 1x 1011 CFU trong 5
ngày bệnh tiêu chảy rút ngắn từ 3.8 ngày còn 2.7 ngày .
Nhiều nghiên cứu cho rằng các chế phẩm probiotic có chứa L.rhamnosus GG
giúp hạn chế hội chứng dị ứng thực phẩm. Những ñứa trẻ bị dị ứng với protein thịt bị
và bị nổi vết chàm khi được cho ăn váng sữa đã thuỷ phân có bổ sung L.rhamnosus
GG cho thấy sự cải thiện ñáng kể những vết chàm dị ứng trên da, ñồng thời giảm tiết


7

α1- kháng trypsin và interferon – α, so với những ñứa trẻ chỉ ñược cho ăn sữa ñã thuỷ
phân.
Trong một cuộc thử nghiệm tại bệnh viện công nương Magarett (Úc), việc
cho trẻ dùng các chế phẩm probiotic có chứa Lactobacillus trong chế ñộ ăn uống vời
liều dùng 2 lần/ngày trong sáu tháng ñầu ñời cho thấy khả năng tăng cường sự miễn
nhiễm, làm giảm một nửa số trẻ mắc bệnh viêm da .
Probiotic ngăn chặn và xử lý nhiễm khuẩn Helicobacter pylori gây viêm loét
dạ dày. H. pylori là một trong số một vài vi khuẩn có khả năng sống ñược trong niêm
mạc dạ dày. Trong một số trường hợp chúng gây viêm loét hoặc ung thư dạ dày. Sử
dụng probiotic là liệu pháp thường ñược kết hợp với liệu pháp kháng sinh truyền
thống trong ñiều trị nhiễm khuẩn H. pylori. Các thử nghiệm in vitro và in vivo cho
thấy các chủng L. acidophilus LB tiết ra các chất kháng H.pylori. Chúng cũng làm
giảm sự kết bám, và số lượng của H. felis trong chuột và của H.pylori trên dòng tế bào
ruột người HT29-MTX (Coconier và ctv.,1995). Khi nghiên cứu trên những người
tình nguyện nhiễm H.pylori được ăn loại sữa lên men LC1 chứa L. jonhsonii La1,
thấy rằng có sự giảm mật ñộ H. pylori và giảm các triệu chứng viêm loét dạ dày
(Felley và ctv.,2001) [50].

2.1.4. Các chế phẩm probiotic thơng dụng
Tại Canada và Mỹ, probiotic chỉ được xếp vào loại thực phẩm bổ sung. Ở

dạng viên hoặc dạng bột probiotic phải chịu sự chi phối của cơ quan FDA thông qua
luật Dietary Supplement Health and Education Act Standards… Trường hợp dùng để
lên men yogurt, kefir thì probiotic được xem nằm trong thành phần bình thường của
sản phẩm. Trong kỹ nghệ muốn sử dụng một vi khuẩn nào đó như một probiotic ñể
thêm vào sản phẩm, vi khuẩn này phải được FDA xét duyệt và nằm trong nhóm vi
khuẩn an toàn gọi là GRAS (Generally Recognized as Safe).
Ngoài các probiotic thường gặp trong yogurt, kefir, bơ, pho mai, nước trái
cây… Probiotic có thể thấy bán ra dưới nhiều hình thức khác nhau như:
Probiotic cơ lạnh: Khi hạ nhiệt độ xuống thật thấp vi khuẩn sẽ trở lên khô như
bột nhưng không bị hủy diệt. Chúng sẽ sống lại khi ñược uống vào.


8

Viên nang (Capsule): Mỗi viên chứa từ 2 - 6 tỉ vi khuẩn. Thường có 2 hay 4
loại vi khuẩn phối hợp lại với nhau. Các vi khuẩn thường ñược sử dụng là
Lactobacillus

casein,

Lactobacillus

Lactobacillus

rhamnosus,

acidophilus,

Streptococcus

Lactobacillus

thermophilus,

bulgaricus,

Lactobacillus

lactis,

Bifidobaterium longum.
Bột: Dạng bột ñể pha trong nước. Nhờ lưu lại bao tử trong thời gian ngắn nên
khi ñến ruột một lượng lớn vi khuẩn vẫn còn sống.
Yogurt trị liệu: Nên uống trước khi ăn. Có thể chứa một tỷ lệ probiotic rất cao
(50 tỉ cho một liều).
Men bia, có 2 loại: Men bia Saccharomyces boulardii, cịn gọi là men sống
hay men có hoạt tính. ðược sấy khơ ở nhiệt độ khơng q 40 0C. Có tính năng trị liệu
rất tốt. Men khơng có hoạt tính thường là phế phẩm của kỹ nghệ bia, giá rẻ. Probiotic
khơng có hoạt tính vì đã bị sấy khơ ở nhiệt độ cao [43].

2.1.5. Những yêu cầu về an toàn thực phẩm của probiotic
-

Probiotic phải đảm bảo an tồn cho cơ thể vật chủ.

-

Khơng gây bệnh trong đường ruột của người khỏe mạnh.

-

Có thể sống và hoạt động trao đổi chất trong đường tiêu hóa vật chủ.

-

Phải cịn sống và ổn định trên mỗi vị trí của đường tiêu hóa.

-

Khơng có ảnh hưởng ngược lại trên thuộc tính cảm thụ cơ thể (receptor).

-

Khơng gây dị ứng cho cơ thể.
Những năm gần đây, việc sử dụng sinh vật probiotic và các acid hữu cơ như

chất thay thế kháng sinh trong thực phẩm ñang rất được quan tâm. Sự thích nghi tự
nhiên của nhiều vi khuẩn lactic (LAB) đối với mơi trường ruột và những chất kháng
khuẩn ñược chúng tạo ra (acid hữu cơ và bacteriocin) ñã cho LAB một thuận lợi cạnh
tranh so với những vi sinh vật khác khi ñược dùng làm probiotic.
Tiêu chuẩn lựa chọn vi khuẩn lactic là probiotic bao gồm : có trong cơ thể
người, độ an tồn, khả năng sống sót/ độ acid trong phương tiện vận chuyển, tính chịu
acid và mật, bám vào biểu mơ ruột, khả năng nhân rộng trong ñường ruột, sản xuất L-


9

lactic acid, sản xuất những cơ chất kháng vi trùng, khả năng kích thích hệ thống miễn
dịch của vật chủ và khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như là sản xuất
vitamin, đồng hố cholesterol và lactose.

Theo Salminen và Ouwehand khả năng của các chủng probiotic ảnh hưởng tới
sức khoẻ có thể bao gồm những cơ chế sau :
-

Bám chặt vào màng nhầy ruột và vi sinh vật.

-

Sản sinh những cơ chất kháng sinh vi sinh vật.

-

Chống lại những nhân tố gây bệnh và chất gây ung thư.

-

Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh.

-

Tương tác với tổ chức lympho đường tiêu hố (thay đổi khả năng miễn
dịch).

-

Những thành phần có hại trong đường ruột (liên kết với những ñộc tố và

quy ñịnh hoạt ñộng chuyển hố của vi sinh vật đường ruột) [43].

2.1.6. Khái quát vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria – LAB) đóng một vai trị quan trọng,
chúng được sử dụng nhiều trong cơng nghiệp. Về mặt hình thái chúng có nhiều dạng
khác nhau : hình cầu, hình que, hình oval. Về mặt sinh lý, LAB thuộc nhóm vi khuẩn
gram dương, khơng di động, khơng tạo bào tử, hiếu khí tuỳ ý, khơng gây bệnh và
khơng sản sinh các chất có ñộc và ñộc tố. LAB chủ yếu là loài ưa ấm, nhưng một số
ưa lạnh và một số thì ưa nhiệt. Chúng có thể kháng được với acid yếu (pH 3.5 – 6.5).
Nhận năng lượng nhờ sự phân giải carbohydrate và sản sinh acid lactic chiếm sản
lượng khoảng 90%. LAB là lồi lên men bắt buộc khơng chứa cytochrom và catalase
[43].
LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, phụ thuộc vào những yếu tố mơi
trường như pH, nhiệt độ và sự tích luỹ các sản phẩm chuyển hố cuối. Chúng ñòi hỏi
các vitamin như: thiamine, biotin, acid pantotemic, acid nicotinic và các acid amin. Vì
vậy, mơi trường ni cấy thường bổ sung thêm: nước chiết cà chua, nước chiết giá,
cao nấm men, cao thịt… LAB có mặt ở khắp mọi nơi và phổ biến là ở ñường ruột


10

người và động vật. Vai trị quan trọng nhất của LAB là chống lại vi khuẩn gây bệnh,
làm tăng hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chữa các bệnh tiêu chảy, táo bón.
Dựa vào khả năng lên men người ta chia làm hai nhóm là LAB đồng hình và
LAB dị hình.
Vi khuẩn len men lactic đồng hình tạo acid lactic là sản phẩm chính của q
trình lên men glucose, các sản phẩm phụ là ethanol, acid acetic, CO2, acetone. Lên
men ñồng hình phân giải glucose theo con đường Embden-Mayerhoff. Các vi khuẩn
thuộc nhóm này : L.delbrueckii, L.acidophilus, L.casei, L. bulgaricus, Enterococcus…
Vi khuẩn lên men lactic dị hình thì ngồi sản phẩm acid lactic cịn có một
lượng lớn acid acetic, CO2, ethanol… Sự lên men nhóm này khá phức tạp. Các lồi vi
khuẩn tiêu biểu nhóm này là : Leuconostoc, L. brevis, L. lycopessici, S. cumoris, S.
lactic, S. thermophilus [11].

Theo khoá phân loại Bergey (1986) LAB ñược xếp vào :
Họ : Lactobacteriaceae.
Họ phụ : Streptococaeae.
Giống : Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Giống Streptococcus
lại ñược chia ra các giống Enterococcus, Lactococcus và Streptococcus.
Họ phụ : Lactobacillaceae.
Giống : Lactobacillus.
Giống Lactobacillus
Giống Lactobacillus là giống lớn nhất trong 13 giống vi khuẩn sinh acid lactic
với hơn 100 loài được mơ tả bởi Hugenholtz (1998) [43].
Tế bào Lactobacillus có kích thước 0.5 - 1.2 x 1.0 - 10.0 µm, hình que. Tế
bào thường dạng dài và mảnh hay dạng ngắn trực cầu khuẩn Coccobacilli. Vi khuẩn
Gram dương khi tế bào còn trẻ và Gram âm khi tế bào già, khơng tạo bào tử, khơng
di động. Di động khi có sự hiện diện của tiêm mao. Trên môi trường agar,
Lactobacillus tạo khuẩn lạc lồi, đục, mép trơn, đường kính 2 – 5 mm.