Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR

(giáo dục nha khoa, súc miệng bằng dung dịch Fluor,
khám răng, trám bít các hố rãnh) phù hợp với học sinh
THC S. Tuy nhiên, các nội dung chưa đáp ứng được
yêu cầu ca về số lượng và chất lượng do thiếu cơ sở
vật chất và nhân lực.
Triền khai chăm sóc răng miệng, giáo dục cách
phịng chống, xử trí các bệnh răng miệng theo từng
khối !ớp, giáo dục học sinh có học lực trung bình, kém,
đào tạo cho giáo viên và cha/m ẹ học sinh về chương
trình nha học đường là rất cần thiết. Tồ chức các buồl
sinh hoạt ngoại khỏa cho học sinh về chăm sóc RM,
và thực hiện khám bệnh SR, V L định kỳ 2 lần/năm cho
học sinh. Gia đinh và nhà trường cùng chung tay hành
động C SR M cho học sính.
TÀ I LIỆU T H A M KHẢO
1. Nguyễn Mạnh Hà (2010), Sâu răng và các biến
chứng.Nha xuất bản Giáo dục trè-22.
2. Bệnh viện Răng hàm mặt Thành phố Hồ Chí Minh
(2005), "Báo cáo hoạt động chương trình Nha học đường
năm 2005".
3. Khoa RHM Bệnh viện Nhi Đồng li Thành phố Hồ
Chỉ Minh, Cách khám răng cho cộng đồng, Bài giảng về
chăm sóc sức khoẻ răng miệng.

4. Nguyễn Anh Sơn (2010), Thực irạng bệnh sâu

răng, viêm lợi và mộỉ số yểu tố liên quan ở học sinh khối
lớp 6 trường trung học cơ sờ thị trấn Hương Canh, huyện
Bình Xuyên, tỉnh Vĩnh Phúc, Luận văn thạc sỹ y tế công
cộng, Trường đại học Y tế cong cộng, Hà Nội.
5. Trần Văn Trường (2000), "Báo cáo công tác nha

học đường", tr. 1.
6. Trần Văn Trường, Lâm Ngọc Ắn và Trịnh Đinh Hải
(2001), Điều tra sức khỏe răng miệng toàn quốc, NXB Y
học Hà Nội.
7. J.p. and S.G. Damle Bhavsar (1995), Dental caries
and oral hygiene amongst 12-14 years old handicapped
children of Bombay, India. J Indian Soc Pedod Prev Dent,
1-3,13.
8. Poul Erik Petersen và các cộng sự. (2004), "Effect
of a school-based oral health education programme in
Wuhan city, Peoples Republic of China", international
Dental Journal. 54, tr. 33-41.
9. Ronald Patrick và các cộng sự. (2006), "Reducing
Oral Health Disparities: A focus on Social and Cultural
Determinants", BMC Oral Health. 6 Sumptement (S4).
10. W HO (1997), Oral health surey basic method. 4th
Editison, Geneva, pp.25-28.

T hS : Bùi T h ị M inh Phượng

Giảng viên bộ m ơn Hóa Sinh - Trường Đ ại học Y D ược Thái Bình
H ư ớ ng d ẫn k h o a học: G S .T S Tạ T hành V ăn

Trưởng bộ m ỗn Hóa sin h - Trường đ ạ i học Y Hà N ội
T Ó M TẮT

Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X. Người mẹ mang
gen bệnh cố khả năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do vậy chủ yếu bệnh nhân là nam. Với sự tiến bộ
của kỹ thuật sinh học phân từ, hiện nay các nhà khoa học có thể xẩc định chính xác vị trí đột biến gen yểu tố víu
(F8) gây bệnh hemophilia A tăng hiệu quả trong việc phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chắt lượng chăm

sóc súc khỏe trong cộng đồng.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu 60 bệnh nhân đã được chẩn đoán hemophilia A.
Mục tiêu: Xác định một số đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A.
Kểt quả: Kết quả cho thấy đã phát hiện được 90% (54/60) bệnh nhân hemophilia A có đột biến gen F8 bao
gồm: đảo đoạn intron 22 là 35,2%, đột biến sai nghĩa là 20,4%, đột biến mất nucleotid là 11,1 %, đột biến vô nghĩa
là 11,1%, đột biến thêm nucleotid là 11,1%, đột biển vị trí nối exon-intron là 5,55%, đột biến mất đoạn lớn là
5,55%.
Kết luận: Đây là kỹ thuật hữu ích giúp ích cho việc phát hiện sớm cốc gen gây đột biến có hướng tư vấn chẩn
đốn trướcAmng quả trình mang thai.
Từ khóa: Hemophilia A, gen F8.
SUMMARY

_

DETECTION OF DISEASE - CAUSING GENE MUTATIONS IN HEMOPHILIA A BY PCR
Hemophilia A is a recessive sex-linked disease, the gene caused the disease locates in X chromosome. An
affected mother can deliver the disease to 50% o f her sons, thus most o f the patients are male. With the advance
o f molecular biotechnology, scientists can correctly determine the location o f mutation o f Factor VIII (F8) gene
causing Hemophilia A to increase the effect o f disease control and improve community health services.
Subjects and methods: study subjects were 60 patients diagnosed with hemophilia A.
Objective: The objective o f the study was to detect some F8 gene mutations causing hemophilia A.
Results: The result showed that 90% (54/60) o f hemophilia A patients had F8 gene mutation included: 35.2%
o f patients with intron 22 inversion mutation, 20.4% o f patients with missense mutation, 11.1% o f patients with
nucleotid deletion mutation, 11.1% o f patients with nonsense mutation, 11.1 % o f patients with nucieotid insertion

467


mutation, 5.55% o f patients with exon-intron connecting mutation and 5.55% o f patients with large section deletion
mutation.

Conclusion: This is a useful technique for early detection o f genes causing mutations to give counseling and
diagnostic before and during pregnancy.
Keyw ords: Hemophilia A, F8 gene.
Đ Ặ T V Ấ N ĐỀ
Hemophilia A là bệnh rối ioạn đông máu, bệnh gây
nên do thiếu hụt hay bát thường chức năng củã yếu tố
V III. Đ ây ià một bẹnh di truyền gen iặn íiên kết với
nhiễm sac thể giới tính X. Việt N am là một nước cỏ tỷ
lệ mắc bệnh hemophilia A trong cộng đồng khá cao.
Theo nghiên cứu cua Đ ỗ Trung Phấn năm 1996 tỳ lệ
mắc bệnh hemophilia A khoảng 25 - 60/1.000.000
người. Hiện nay tại Việt Nam có khoảng 6000 bệnh
nhân hemophilia Ả trong đó chỉ có 30% được phát
hiện và điều trị, phương pháp điều trị chủ yếu íả sử
đụng yếu tố V lỉí trong máu toàn phần (truyền trực tiếp
hoặc tách chiết) rất tốn kém mà hiệu qua khơng cao,
đặc biệt có nguy cơ cao đối với các bệnh lây truyền
qua đường máu. Trên thể giới, các nha khoa học đã
phân tích gen của bệnh nhân hemophilia A và rất
nhiều dạng đột biến gen yếu tố VIII (F8) được công bố.
C ác nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau
sẽ gây những kiểu hình đặc trừng khác nhau. Bệnh
nhân hemophilia A thề nặng thường gặp dạng đột biến
đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-5Ò%),bệnh nhân
hemophilia A thề nhẹ và trung bình chủ yeu ià đột biến
điểm (chiếm 90-95% ). ở v ĩệ t Nam, các cơng trình
nghiên cứu về bệnh hemophilia A chủ yểu là nghiên
cứu yề đặc điềm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ
iệ mắc bệnh hoặc đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bằng
các chế phẩm thay thế.T. Với sự tiến bộ của kỹ thuật

sinh học phân tử, các nhà khoa học có thể phân tích
D NA của người bệnh để xác định chính xác các tổn
thương gen gây bệnh hemophilia A, cũng như kiểm
soát bệnh tốt hơn nhờ phát hiện người phụ nữ mang
gen bệnh và tư vấn di truyền trưởc hôn nhân, tăng
hiệu quả trong việc phịng ngừa bệnh tật đơng thời
nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe trong cộng
đồng.
Mục tiêu của đề tài:

1. Xác định mộỉ sổ đột biến trên gen F8 gây bệnh
hemophilia Á.
2. Mối liên quan giữa thể bệnh với một số đột biến
gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam.
ĐỐI TƯ Ợ NG VÀ PHƯ Ơ NG PHÁP
1. ĐỐI tứ ợ ng nghiên cứu
Nhỏm đối chứng: gòm 20 người (10 nam, 10 nữ)
khỏe mạnh, tiền sử gia đình khơng có ngườỉ mắc bệnh
di truyền. Nhóm chứng dùng để chuẩn hóa kỹ thuật và
làm mẫu đối chứng cung với mẫu nghiên cứu để khi
thực hiện các kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích
gen.
Nhóm nghiên cứu: 60 bệnh nhân được chẩn đoán
xác ổịnh hemophillia A tại Viện Nhi Trung ương và
Viện Huyểt học Truyền máu Trung ương.
Tiêu chuẩn lựa chọn:
* Lâm sàng:
+ Chảy máu: Chảy máu khó cầm sau chấn thương,

sau va chạm hay chảy máu một cách íự nhiên.

+ Vị trí: Chảy máu trong khớp, cơ hoặc một sổ vị trí
khác.
+ Tính chất; Thường chảy máu tái phát.
+ Tiền sừ: Có tiền sử chấy máu kéo dài hoặc trong
gia đinh có người thân bị chày máu khó cầm.
* Cận lâm sàng:
+ Định lượng yếu tố FV1II giảm dưới 30%.
- Thể nặng: Hoạt tính yếu tố FVIII < 1%.
- Thể trung bình: Hoạt tính yếu tố F V II11-5%.
- Thể nhẹ: Hoạt tính yếu tố FVIII 5-30% .
+ A P T T kéo dài.
+ Thời gian máu chảy binh thường.

+ Số lượng tiểu cầu và độ tập trung tiểu cầu binh
thường.
2. Trang th iế t bị, dụng cụ nghiên cứu và hóa
chất
3. P hư ơ ng pháp và kỹ th u ậ t nghiên cứu
Đối với bệnh nhân thể nặng: xác định hiện tượng
đảo đoạn intron 22 bằng phừơng pháp Inversion PCR
(l-PCR). Khơng có đột biến đảo đoạn iníron 22, xác
định đao ổoạn intron 1 bằng phương pháp Multiplex
PCR. Nếu vẫn khơng xác định được thì ta khuyếch đại
toàn bộ 26 exon để tim đột biển mất exon. Nếu khơng
có đột biến, phân tích đột biến điềm bằng phương
pháp giải trình tự gen.
Đoi với bệnh nhân thể vừa và nhẹ sử dụng
phương pháp P C R để xác định đột biến mất exon, nếu
khơng đột biến thì giải trinh tự gen trực tiếp để phát
hiện các dạng đột bien điểm.

3.1. QŨy trình lẩ y mẫu
Bệnh nhân đã chẩn đoán hemophilia A được iấy
5ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông EDTA
với hàm lượng 1,5mg/mL. Q uy trinh lấy máu đảm bảo
vơ írùng tuyệt đối.

3.2. Quy trình tách ch iế t DNA từ máu ngoại v i
3.3. Xác định đ ộ t biến gen F8
3.3.1. Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 bằng kỹ
thuật l - P C R '
k ỹ thuật l-PC R gồm 3 bước: (1) c ắ t DNA bằng
enzyme Bell, (2) NỐI bằng T 4 ligate, (3) Khuyếch đại
bằng phản ưng multiplex PCR. Phương pháp I-PCR
có ưu điểm là dễ tiến hành. Enzyme Bell tác dụng rất
đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym e có tính đạc hiệu
cao. San phẩm P C R được khuyếch đại dễ dàng trong
thời gian khoảng 30 phút do các đoạn DNA có kích
thước ngắn (487 và 559pb). Như vậy xét nghiệm phân
tích gen được tiến hành nhanh chóng, kết quả ỉhụ
được có độ tín cậy cao, dễ thực hiện.

468

3.3.2. Phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1 bằng kỹ
ỉhuật multiplex PCR
k ỹ thuật multiplex PCR: Thiết kể hai phản ứng
multiplex P C R cố thể phát hiện được các bệnh nhân bị
đột biến: phản ứng 1 có chưa các cặp mồi đặc hiệu

cho Ĩnt1h1 cộng với một mồi đặc hiệu cho chuỗi Ỉn1h2,
phản ứng 2 chứa cặp mồi đặc hiệu int1h2 cộng với
một mồi đặc hiệu cho intl h1. Dựa vào kích thước khác
nhau của các đoạn D NA sau khi điện di để phát hiện
đột biến.

3.3.3. Phất hiện đột biến mất exon bằng kỹ thuật
PCR
Phản ứng P C R sử dụng cặp mồi đặc hiệu để
khuếch đại từng exon của gen F8, sau đó điện di trên
gel agarose, mẫu bệnh nhân đưực tiến hành song
sọng với mẫu đối chứng. Nếu m âu đối chứng xuất
hiện vạch DNA tương ứng với kích thước của exon
được khuếch đại, ĩrong khi mẫu bệnh nhân không xuấỉ
hiện vạch thỉ bệnh nhân bị đột biến m ất đoạn exort đó.

Thể nhẹ: 4/5 bệnh nhân phát hiện được đột biến
chiếm tỷ lệ 80% , 1/5 bệnh nhân chưa phát hiện được
đột biến chiếm 20% .
3. K ết quả p h á ỉ h iện các d ạng đ ộ t biến gen F8

3.1. K ế t quả xác định đ ộ t biến đảo đoạn
3.1.1. Kết quả xấc định đột biến đảo đoạn íntron 22
bằng kỹ thuật Inversion PCR
45 bệnh nhân hemophillia A chẩn đoán trên lâm
sàng thể nặng được xét nghiệm đột biến đảo đoạn
Intrõn 22 bắng phương pháp Inversion PCR. Kết quả
có 19/45 bệnh nhân có đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ
42,2% .

ĐC HA HA RA BA HA HA HA M
02 33 07 12 2 0 3 3 55

3.3.4. Phát hiện đột biến điểm bằng kỹ thuật giải
trình tự gen
Được thực hiện theo qui trình sử dụng phương
phốp
BigDye
terminator
sequencing
(Applied
Bỉosysíems, Foster city USA). V iệc phân tích kểt quả
dựa vào sự so sánh trình tự geri cua bệnh nhan với
trình tự gen chuẩn của Gen Bank(nạtỉona! center for
biotechnology information, NCBI) bằng phần mềm
CLC. So sánh trinh tự các acid amin của bệnh nhân
với trinh tự chuẩn chùa Genbank bằng phần mềm
Biast của NCBI.
K ÉT QU Ả
1. Đ ặ c đ iểm chung về đ ố i tư ợ n g nghiên cứu
4 5/60 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng thể
nặng chiếm tỷ lệ 75% , 10/60 bệnh nhân thể írung bình
chiếm tỷ lệ 16,67% , 5/60 bệnh nhân thể nhẹ chĩếm tỷ
lệ 8,33% .
2. T ỷ iệ p h át hiện đ ư ợ c đ ộ t biến

2.1. Ty iệ bệnh nhân theó k ế t quả p h á t hiện đột
biến
Nghiên cứu phái hiện được 5 4/60 trường hợp
bệnh nhân có đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A

chiếm tỷ iệ 90% . Số bệnh nhân chưá phát hiện được
là 6/6 0 chiếm tỷ lệ 10%.

2.2. Tỳ lệ độ t biến theo thề bệnh ở nhóm phát
hiên và nhóm khơng p h á t hiện
'___________
H Phối hiện đ ư ợ c

ta

C h u a phàt hiện đirợ c

ss%p
4S7fcp

SOObp

M : (aark er kich thiròc lOObp
E C : Mầu đui ch ũ sg ( n g u ơ i bìtili tlitrịng)

HA33, HA3S Khơng cị ãăc đoạn {iron 22
HA02, HA07, HA ù , HA20.HAS5: rô d j< b ú n aio *>}*
itroa ĩ ĩ

Hình 1. Hình ảnh điện dĩ sản phẩm PCR xác định đột biến
đảo đoạn ỉnỉron 22
Nhận xét: D NA người bình thường ở mẫu đối
chứng dương (+) khi được khuếch đại bang phản ứng
multiplex P C R có 1 băng kích thước tương ứng 487
bp. Nếu đột biến xảy ra, khi khuếch đại sẽ cho 1 đoạn

kích thước 559 bp. N hư vậy, ở vị trí các giếng tương
ứng với các bệnh nhân m ã số HA33, HA38 khơng có
đảo đoạn intron 22 do cùng có vạch DNA kích thước
4 8 7 bp. ở giếng mã số HA02, HA07, HA12, HA20,
HA55 là bệnh nhân hemophiília A có đột biến đảo
đoạn intron 22 (hình 1) do điện di đều có vạch DNA
kích thước 559bp.

3.1.2.
Xác định đột biến đảo đoạn intron 1 bằng
phương pháp Multiplex PCR
Có 19/45 bệnh nhân hemophilỉia A thề nặng bị đột
biến đảo đoạn intron 22, 2 6/45 bệnh nhân hemophillỉa
A thể nặng còn lại tiếp tục được sàng lọc đột biển đảo
đoạn intron 1 thẽo phương pháp multiplex P C R Kết
quả 26 bệnh nhân này không bị đột biến đảo đoạn
intron 1.

100 .00 %

90.0054
80.00%
70.00%
60.0054

SO.OOSé
40.00% -

|M |

30.0054
20.0 0 %

M

10.00«
0.00% -1
T ru n g b ìn h

p i

PI P2 PI P2 Pi

M

P2 Ỉ T n

M

Nhẹ

Biễuđơ í: Tỷ lệ đọt biên theo the bẹnh ở nhóm phát hiện
và nhóm chưa phát hiện được
Nhận xét:
- Thể nặng: 41/45 bệnh nhân phát hiện được đột
biến chiếm tỷ ịệ 91,1% . 4 /4 5 bệnh nhân chưa phát
hiện được đột biến chiếm tỳ !ệ 8,9% .
- Thể trung binh: 9/10 bệnh nhân phát hiện được
đột biến chiếm tỷ iệ 90% . 1/10 bệnh nhản chưa pháỉ
hiện được đột biến chiếm tỷ lệ 10%.

—>\

2kb

ụ— 1191bp

Ikb—
M: Maầer kích thước

Pi: Phànứng l dặc hiệuchoiníihỉ
P2: Phánúng 2dặc hiệuchoiflt!h2
Hình 2. Hỉnh ảnh điện di sản phẩm PCR xác định đảo đoạn
intron 1

469


Nhận xét: Trong kết quả ở hình 2, các phản ứng
multiplex P C R khuếch đại đoạn Ỉnt1h1 (P 1) chỉ cho các
đoạn DNA kích thước 1908bp chứng tỏ cặp mồi 9F và
9cR thiết kế cho đoạn in tlh l bắt cạp với nhau. Các
phản ứng khuếch ổại đoạn in t lh i (P 2) ổều cho kích
thước 1191 bp chứng tỏ chì cỏ cặp mồi int1h-2R và
ÌnMh-21"

hiâi I H-yV/ínạr* in H íy ?

wAi 1-jh g ii

8, exon 9 của bệnh nhân khơng có vạch D NA trong khi
tát cả các exon còn lại đều lên vạch DNA tương ứng
với mẫu đổi chứng dương. Đ iều này chứng tò bệnh
nhân bị đột biến mat đoạn exon 8 và exon 9.

3.3.
K ết quả p h á t hiện đ ộ t biến bằng phư ơ ng
pháp g iả i trình tự
Ọ oo. /. L ý Ụ i U Ỉ KỉẤ
n
o.
s i i /7/ái U U Ờ i i Ỉ Ỉ U U i & U U U

Như vậy, khơng có đột biến ỉntron 1. ờ các bệnh nhân
mã số HA15, HA46, HA45 và HA24.

Đ ột biến mất 15 nuclẽtid.
'• f 5

3.2.
K ế t quả p h á t hiện đ ộ t biến m ất exon bằng
phản ứng PCR

c.43S459doi15Nu

I

p . ttS - ^ S d e lY ty n

GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACAC' GCTGAGGT^ATTAC

Nghiên cứu này có 3 bệnh nhân đột biến mất exon
bao gồm HA38, HA51, HA55.
Đột biến mất exon 8 và exon 9 ở bệnh nhân
H A 51:
Ngtrờibmhthirêng
BệnhnfiẵnHA46

Exon7
-

Exon 8

Ỷ BN -

Exon9

+ BN *

+

Exon 10
BN -

135-139

+ BN M

GtaeBaak 125
^

1

E.I£gn0ftSy Y r e m ĩL:LL SynQ R EV
IT U N ® S H ? V S L H f tV G V S r> « A S E IS G m C S L & S V C L a 3
LLGPT1QASV..........ĨTLKỉmSHPVStHAVGVSríỉ[®SBISCrv'FDSLĨLSVCLHS

Hirih 4. Hinh ẫnti đột biên mẫt đoạrí 15 nucieotid ơ bệnih
nhân HA46

M: Marker í GObp
4-: đoi chứng dương

BN: bệnh nhân
- ; đối chứng âm

Hình 3. Kết qua PCR xác định đột biến mắt exon ờ bệnh
nhân HA51
Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ HA51 sau khi được
khuếch đại toàn bộ 38 cặp mồi cùng với các mẫu đổi
chứng âm và đối chứng dương phát hiện ở vị trí exon

3.3.2.

Nhận xét: Bệnh nhân m ã số HA46 thể nặng, không
phát hiện thấy đảo đoạn intron 22, intron 1. khuếch đại
38 cặp mồi đều lên vạch căng, rõ nét. Tinh sạch DNA
của các phản ứng khuếch đại này và giải trình tự, sau
đó so sánh với trình tự người bình thường. Kết quả tại
exon 4 phát hiện thấy độí biến mất 15 nucleotid tại vị

trí c.435-450. Khi kiểm tra sự thay đổi acid amin do đột
biển gây ra, thấy tại vị trí protein từ 135 đến 139 bị mẩt
5 acid amin Tyrosin, Asparagin, Threonỉn, Valin, Valin
(p. 135-13 9 d e lí yr-Vai).

Đột biến sai nghĩa
C.6545

C.6545G>A
p.R2182H(Arg 2182 His)

I

Ỷ

IC A C T C T T C G C A T G G A G T T G .

CACTCTTCACATGGAGTTG

Người bình thường

j

Bệnh nhân HA59
2182

Q u e ry

2144

S b jc t

1

VFFG1WDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNS
VFFGNVDSSGIKHWIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTL MELMGCDLNS
VFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLHMELMGCDLNS

Hinh 5. Hình ảnh đột biến ờ bệnh nhân mã số HA59

470

219:
49


Nhận xẻt: Hỉnh ảnh giải trình tự ở bệnh nhân mã số
HA59 cho thấy: có đột biến thay thế rìũcleotid G thành
nucleotid A (G>A) trên exon 23 cùa gen F8. So sánh
với trình tự Genebank thấy trên exon 23 vị trí C.6545
G>A, dân đến thay đổi acid amin vị trí p.2182 của
protein
gen
F8
từ
Arginin
thành
Histidin
(p.Arg2182His).
3.3.3. Đột biến thêm vô nghĩa

3.3.5. Đột biến mẩt 1 nucleotìd
Đột biến m ất nudeotid A:
e.3389deU
p.R1130del(Argilỉãđei)
G G AGC CA AA A A AA A TAA C CTT-

G G AG C C A A AA A A aV

A C C TT

Ê ấ k ầ m ề ề ìề ấ
Bệnh nhãn HA01

N g trờ i b in h th ư ờ n g

mm
C *H T

a

-

1130

B

pUUa{UtiíMĩi#tì

CíBsbiaỉi

_-

I
m e

QasĩTaTĩ-iọsD3as5s?asfQKKTEHĩFi& 11ỉ3aĩ8ĩVarjỉLSJiffiỊJĩBFLS¥iTS

56i

Ỗ55ÌTSTTÌỈ5D5K

1H Ỉ

gssiHrĩiBísie
RUI

. TTCTCĨGGAĨAĨACCTTCAA

ĨĨCTCĨG O A ĨAA A CCĨĨCA AA

Hình 8. Hình ảnh đột biến mất nucleotid A của bệnh nhân
HA01
Nhận xét: Hinh ảnh giải trình tự cho thấy bệnh
nhân HA01 có đột biến m at một nucieotid A. So sẩnh
với trinh tự G enebank thấỵ mất một nucleotid A tại vị
C.3388, dan đến protein yếu tố V íll bi lệch khung dịch
mã tồn bộ acid amin từ vị trí p. 1130 (p.Ầrg1130deỉ).

Ĩ Ị4 Í

CĩMbuk

1W JflUw»}i$£Y^5w«lWttMĨĨwíi3mộ(J
m m ssw M m m m m w w m

.........3 Â

3.3.4. Đột biến thêm một nucleotid
Đ ột biến thêm nuđeotid C:

Ngirịiblnli tỉurịng

885
KA03

ĨS ì

.-iỀ

9 L Ế

Ể

Đ

J Ể

.y M
ị

.ũ

Ế

.................................................................................................

cil5J«5a»T

TTTCATGAAGGTTAGTGAGTCTT TTTGATGAAGTTTAGĩCAGTCTT;

Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ H A 33 sau khi được
giải trình tự kiểm tra vị trí đột biến cho thấy: đột biến
thay thế nucleotid T bằng nucỉeotid A tại vị trí 6425. So
sánh với trình tự Genebank cho thấy: đột biến này làm
thay đổi acid amin Leucin tạo thành stop codon gây
dừng đột ngột quá trình phiên m ã protein
(p.Leu2142Stop).

TTAGGACCCCCAAGTATGCCi

3

c iì o r

Hình 6. Hình ảnh đột biến tạo stop codon
của bệnh nhân HA33

e.2777

1020

Ngi^t bình thưửng

Bịnh nhin HA4Ỉ

Hình 9. Hình ảnh độỉ biến tại vị trí nối exon/intron của bệnh
nhân HA45
Nhận xét: Với những thay đỗi bầt thường ở gần
hoặc tại vị trí đầu hoặc cuối exon là vị írí nối giữa exon
v à in íro n 1 3 .

4.
Mối liên quan giữa thể bệnh và độỉ biến khác
nhau trên bệnh nhân hemophillia A
4.1. Tỷ lệ các dạng đột biến phát hiện được trên
bệnh nhân hemophillia A__ __ ____________ ____

e,2777ỉn»c
p.S827iiu{lytỉỉ7lnt)

TTAGGACCCCCCAAGTATGCC

B ệnh nhản H.AQ3

r

'Ã A "SlK K L Ì);K V 3SĨSỉ;ỉÌI,I3Tĩf5D H L A A ữT D :ỉT 5SL 5??r^L D F:ĨA A ?SLK KLD íK VS3T3ìiíỉI.ISĨIP3K-ÍI.M 'Ơ TD!í?SSLGf?
? Ã n ? S L ^ L 5 H V S SĨ S Í i a ĩ I S Ĩ I P S3 !ilM G T D !l?S S L g??S

_
_____ _ 2 3 2

*

<§>

Hình 7. Hình ảnh đột biến ỉhêm nucleotỉd c của bệnh nhản
HA03

Bieu đồ 2: Các dạng đột biên pháỉ hiện được ỉrên bệnh
nhân hemophilia A

Nhận xét: Hỉnh ảnh giải trình tự cho thấy bệnh
nhân mã số HA03 có đột biến thêm một nucleotid c.
Kiểm tra trên trinh tự G enebank xác định thay đồi này
trên exon 14 !à C.2777 insC, đột biến gây lệch khung
dịch mã tồn bộ acid amin cịn lại từ vị trt
p.927(p.Lys927ĩns).

Nhận xét: Trong 54 bệnh nhân phát hiện được đột
biến co:
- Đ ột biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỷ lệ cao nhất:
1 9 /5 4 (3 5 ,2 % ).
- Đột biến sai nghĩa đứng thứ 2 :1 1 /5 4 (20,4% ).
- Đột biến m ất nucleotid, đột biến vô nghĩa, đột biến

471

thêm nucleoíid đứng íhứ ba, mỗi loại 6/54 (11,1% ).
mở đường cho các nghiên cứu về cơ chế bệnh học
Chiếm tỵ lệ thấp nhất là đột biến tại vị trí nối exon- phân tử hemophilia A và các dạng đột biến gen F8 gây
intron, đột biến mất đoạn lớn: mỗi loại 3/54 (5,55% ).
bệnh.
4.2. Tỷ lệ các dạng đột biến trơng từng thể bệnh
X ác định vị trí các đột biến gen F8 ử bệnh nhân
hemophilia A cung cẩp nhiều lợi ích cho khoa học cơ
bản và ứng dụng lâm sàng. Đổi với những bệnh nhân
100. 00 %
bị bệnh hemophilia A, xác định được vị trí đột biến là
on n tĩỊí
một tiêu chuẩn vàng để khằng định chính xác chẩn
80.00%
đốn bệnh, ngồi ra nó cũng hỗ trợ trong việc tiên
70,00%
íượng mức độ nghiêm trọng của bệnh và diễn biến lâm
.60.00%
Sàng7 trong dự báo nguy cơ phát triển các kháng íhể
kháng FVIII đẻ từ đó lựa chọn phương pháp điều trị tối
50.00%
ưu. Hơn nữa, xác định được vị trí đột biến của bệnh
40.00%
nhân ià điều kiện tiên quyểt cho việc chẩn đoán trước
30.00%
sinh nhữna phụ nữ mang gen bệnh và tiến hành thiết
20 ,00 %
lập bản đo đột biển gen F8 là tiền đề hết sức quan
10.00%
trọng cho việc áp đụng liệu pháp điều trị gen trong

0 .00%
tương lai để giải quyết triệt để căn bệnh này.
Intron 22
đột biến điểm
đột biến đỉểm
T y lệ p h á t hiện đ ư ợ c đ ộ t biến
Trong nghiên cứu này, xác định đột biến trên gen
Thể trung bình
Thể nặng
ĩh ể n h ẹ
F8 được thực hiện ở 60 bệnh nhân đã được chần
đốn hemophilia A khơng có quan hệ huyết thống: Có
Biểu đồ 3: Tỷ lệ các dạng đột biến trong từng thể bệnh
54 trường hợp phát hiện được đột biến chiếm 90%, 6
(10% ) trường hợp chưa phát hiện được đột biến. Tỷ lệ
Nhận xét:
chưa phát hiện được đọt biến của chúng tôi cao hơn
- Đ ột biến đảo đoạn Intron 22: chỉ gặp ở bệnh nhân
các tác giả khác cơng bổ là 2-7% , ngun nhân có thể
thể nặng: 1 9 /4 5 (4 2 ,2 % ).
do chúng tôi chưa phối hợp được các phương pháp
- Đ ột biến điểm gặp chù yếu ở thề trung bỉnh 90%
khác để chẩn đốn các vị trí đọt biến ờ trong vùng
(9/10), thể nhẹ 80% (4/5).
intron, chưa xác định được các đọt biến lặp đoạn DNA
4.3.
Tỷ lệ đột biến ờ bệnh nhân hemophilia A bằng phương pháp M LPẦ... Tuy nhiên so với các tác
thể n ặ n g _____________
giả chì sử dụng phương pháp giải trinh tự gen đơn
thuần thì tỷ lệ phảt hiện được đột biến cùa chủng tơi

íương đối cao, phù hợp. s ố bệnh nhân phát hiện được
3.90%
đột biến ở từng thể bệnh là: Thể nặng 9 1 ,i% , thể
trung bình 90% , thể nhẹ 80% . So với tỳ lệ phát hiện
được đột biến cua tác giả Santacroce và cộng sự thực
* Đào đoạn itron 22
hiện trên 1296 bệnh nhân hemophilia A ở Italia là 874
B Đội biền điềm
(89% ), 146 (84% ), 133 (94% ) tứơng ứng bệnh nhận
ÍỈSMất đoạn lớn
thể nặng, trung bình, nhẹ. [3]. Theo tac gia Bogdanova
B Chưa phát hiện
cũng chì sừ dụng phương pháp giải trình tự phát hiện
đột biến cho kết quả xác định được đột biến từng thể
là: 100% íhể nặng, 96% thể trung bình và 8 8% the nhẹ

ưl

Biễu đồ 5: Tỷ lệ đột biến ở bệnh nhân hemophillia A thể
nặng
Nhận xét: Bệnh nhân hemophilia A thề nặng:
- 1 9 / 4 5 (42,2% ) đột biến đảo đoạn Intron 22.
- 1 9 / 4 5 (42,2% ) đột biến điềm. ’
- 3/45 (6,7% ) đột biến mất đoạn lớn.
- 4 /4 5 (8,9% ) chưa phát hiện được đột biến.
B ÀN LUẬN
Bệnh hemophilia A !à một bệnh di truyền do thiếu
hụt hoặc bất thường chức năng của yếu tố đông máu
huyết tương - yếu tố Vill. T ừ năm 1984, nghiên cứu
của Gitschier đã cho thấy những hiểu biết đầy đủ về

cấu trúc phân từ gen F8 tổng hợp protein yếu tố VIII,

x

C ác dạng ỡ ộ ỉ biên g ây bệnh h em o ph ilia A ờ
V iệ tN a m
T ỉ !ệ các dạng đột biến khác nhau trong nghiên cứu
của chúng tôi cho thấy hay gặp nhầt là đảo đoạn intron
22 (35,2% ). Tỷ íệ này tướng tự với tỷ lệ đột biến đảo
đoạn intron 22 đã được cong bố 42 - 50% ở nhóm
bệnh nhân thể nặng, ở Đài Loan tỷ lệ nảy là 45,1% ,
40-50% ở Châu Ấu.
Trong nghiên cửu của chủng tôi 26 bệnh nhân
không cố đột biến đảo đoạn intron 22 được kiểm tra
xác định đột biến đảo đoạn intron 1 bằng kỹ thuật
multiplex P C R cho thấy khong có bệnh nhân nào có
đảo đoạn intron 1. Chúng tơi cho rằng với kểt luận âm
tính có thể cỡ mẫu của chúng tôi chưa đủ lớn để phát
hiện đột biển này. Trong nghiên cứu của Andrikòvỉcs
cũng cho thấy kết quả âm tính với loại đột biển này khi
nghiên cứu írên 104 bệnh nhân hemophilia A ở

472


Hungari. Nghiên cứu trên bệnh nhân hemophilia A ờ
Ắn Đ ộ thấy ỉỷ ịệ đột biến iníron 1 ià 2,7% , tương tự
nghiên cứu ờ Nam Phi các đột biến này chỉ tim thầy ở
bệnh nhân da đen m à khơng tìm ìhấy ở bệnh nhân da
trắng. Tuy nhiên, đảo đoạn intron 1 là một đột biến

quan trọng cần sàng lọc, m ặc dù tỷ íệ phát hiện trong
quần thể người da trắng thấp.
Sau khi thu được D N A có chất lượng tốt chúng tơi
sử dụng kỹ thuật P C R với 38 cặp mối đặc hiệu cho 26
exon cua gen F8 và phát hiện được 3 bệnh nhân bị đột
biến mất ẽxon chiếm tỷ íệ 5,55% . Với 23 bệnh nhân
thể nặng, 10 bệnh nhân thể trung bình và 5 bệnh nhân
thể nhẹ sừ dụng kỹ thật giải trinh tự gen để xác định
các loại đột biến điểm cho kết quả: dạng đột biến sai
nghĩa 20,4% , đột biến m ất /thêm nucieotid và đột biến
vơ nghĩa có cùng tì lệ 11,1% ; đột biến vị trí nối và đột
biến mẩt đoạn lớn có tì lệ là 5,55% trong số bệnh nhân
phái hiện được đột biến. C ác ioại đột biển được tỉm
thấy tỉ ỉệ phù hợp với các kết quả báó cáo được cơng
bố bởi các tác giả R epesse [9], Jochen Graw [5],
Adoracion Venceia [1], Rosetti [8].

cứu khác trên thế cỊịới
Pháp
Đức
Tây
Argentina
Ban
[53
[9]
[83
120
845
Nha C1]
260 BN

BN
BN
267 BN
inỉron 22 46,0% 35,7%
43%
44%
Sai nghĩa 15,0% 38,2%
34%
12,2%
Vị trí nối
7,0% 2,6%
3,7%
2,6%
Vơ nghĩa 13,0% 9,3%
3,7%
10,2%
Thêm
7,0% 2,6%
2,0%
1,9%
nucleoíid
Mát
10,0% 7,5%
7,8%
15,9%
nucleotid
Mât đoạn
2,0% 3,0%
1,0%
10,2%

lớn

Nghiên
cứu này
60 BN
35,2%
20,4%
5,55%
11,1%
11,1%
11,1%
5,55%

K Ế T LUẬN
Nghiên cứu phát hiện đột biến gen F8 trên 60 bệnh
nhân bằng sử dụng kết hợp 4 phương pháp khác
nhau, chúng tôi rút ra được kểt luận sau:
1. P hát hiện đ ộ t bỉến g en F8 ờ bệnh nhân

hemophilia A của Việt Nam
- Tỷ lệ phát hiện được đột biến là 9 0% (54/60 bệnh
nhân), trong đó tỉ íệ phát hiện đột biến ở thể nặng
91,1% , ờ the trung bình 9 0% và ở thể nhẹ 80%.
- Các dạng đột biến được phát hiện bao gồm: đảo
đoạn iníron 22 là 35,2% (1 9/54 bệnh nhân), đột biến
sai nghĩa ià 20,4% (11/54 bệnh nhân), đột biến mất
nucleotid là 11,1 % (6/54 bệnh nhân), đột biến vô nghĩa
là 11,1% (6/54 bệnh nhân), đột biến thêm nucleotid là
11,1% (6/54 bệnh nhân), đột biến vị trí nối exon-iníron
là 5,55% (3/54 bệnh nhân), đột biến m ất đoạn lớn là

5,55% (3/54 bệnh nhân),
2. Tỷ iệ đột biến p h á t hiện đ ư ợ c với th ể lâm

sàng
- Thể nặng: phát hiện được đột biến đảo đoạn
intron 22 lá cao nhất chiếm tỉ lẹ 42,2% , đột bien mất
đoạn lớn là 6,7% , đột biến điểm ià 42,2% .
- Thể trung bình, thể nhẹ khơng có đột biến đảo

đoạn, chl gặp đột biến điểm 90% ở thể trung bình,
80% ở thể nhẹ.
Chưa phát hiện được đột biến đảo đoạn in tro n l.

KIẾN NGHỊ
1. Thiết lập và quản lý cơ sờ dữ liệu về bệnh nhân
và người mang gen bệnh hemophilia A.
2. T ư vấn di truyền trước hôn nhân và chẩn đoán
trước sinh cho những người mang gen bệnh trước trong quá trinh mang thai.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Adoración Venceslá, Maria Angeles CorralRodriguez, Manei Baena, Mónica Comet, Montserrat
Domènech, Montserrat Baiget, Pablo Fuentes-Prior,
Eduardo F, Tizzano. (2008). identification of 31 novel
mutations in the F8 gene in Spanish hemophilia A
patients: structural analysis of 20 sai nghĩa mutations
suggests new intermoiecular binding sites. Blood, 111(7),
3468-3478.
2. Brockway W l, Olson ID, Fass DN, Bowie JW, Mann
KG. (1977). Purification of porcine and human ristocetinWiilebrand factor. LabClin Med, 89,1278-1294.
3. Castaman G, Margaglione M, Morfini M, Rocino A,

Santagostino E, Tagarielio G, Mannucci PM. (2008). The
Italian AICE-Genetics hemophilia A daỉabase:results and
correlation with clinical phenotype. Haematologica. 93(5),
722-728.
4. Chang SP, Ma GC, Chen M, Kuo SJ, Chang c s ,
Shen MC. (2008). The spectrum of ỉhe factor 8 (F8)
defects in Taiwanese patients with haemophilia A.
Haemophiiia, 14,787-795.
5. Hans Hermann, Brackmann, Jochen Graw,
Johannes Oldenburg. (2005). Heamophilia A: from
mutation analysis to new therapies. Nature reviews
Genetics, 6,488-501.
6. Kazazian HH, Jr Lakich D, Antonarakis SE,
Gitschier J. (1993). Inversions disrupting the factor VIII
gene are a common cause of severe haemophilia A. Nat
Genet, 5,236-241
7. Markoff A, Bogdanova N, Poilmann H. (2005).
Spectrum of molecular defects and mutation detection
rate in patients with severe hemophilia A. Hum Mutat, 26,
249-254.
8. Rossetti LC, Szurkalo i, Radio CP. (2013). Factor
VIII genotype characterization of haemophilia A affected
patiens with transient and permanent inhibitors: a
comprehensive Argentine study of inhibitor risks.
Haematoiogica, 19,115-118.
9. Repesse Y, Slaoui M, Ferrandis M, Gautier p,
Costa c , Lavergne JM, Derlon AB. (2007). Factor Vlli
(FVIil) gene mutations in 120 patients with hemophilia A:

detection of 26 novel mutations and correlation with FVIII

inhibitor development. Thrombosis and Haemostasis, 5,
1469-1476.
10. Schwaab R, Becker J, Moiler-Taube A, Schwaab
u, Schmidt w , Brackmann HH, Gn'mm T, Oiek K,
Oldenburg J. (1996). Characterization of the factor VIII
defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: family
studies indicate a mutation type-ependent sex ratio of
mutation frequencie. Am J Hum Genet, 58(4), 657-670.
11. Yang T, Liu w , Zhao w , Chase GA. (2007).
Accounting for Genotyping Errors in Tagging SNP
Selection. Annals of Human Genetics, 71(4), 467-479.

473