Xác định các Protein có tính kháng nguyên của Streptococcus suis serotype 2 bằng phương pháp Immunoproteomics

XÁC ĐỊNH CÁC PROTEIN CĨ TÍNH KHÁNG NGUN
CỦA STREPTOCOCCUS SUIS SEROTYPE 2
BẰNG PHƯƠNG PHÁP IMMUNOPROTEOMICS
Tác giả: Nguyên Hoàng Bách (Tiến sỹ, Giàng viên Bộ môn Vi Sinh, Đại học YDược Huếj
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Văn An (Giảng viên Bộ môn Vi Sinh, Đại học YDược Huế)
GS. Alberto A lberti (Đại học Sassarí, Cộng hồ Y)
TĨM TẤT
Mở đầu: Nhiễm trùng liên cầu lợn ở người là một bệnh nhiễm trùng cấp tính với biểu hiện lâm sàng đa dạng
bao gồm nhiễm trùng huyết, viêm màng não mủ, viêm nội tâm mạc, viêm khớp... Hiện vẫn chưa có vaccine
phịng bệnh hữu hiệu trên lợn và cà người. Nghiên cứu của chúng tơi cung cấp dữ liệu về các protein có tính
khống nguyên được xốc định bằng phương pháp immunoproteomics. Đối tuựng và phương pháp: Protein hòa
tan tống
số củaSS2 được phân giải bằngđiện di protein 1 chiều trên gelacrylamide và sàng lọc huyết thanh
của các
bệnh nhân nhiễm bệnh bằng western immunoblotting. Các protein có tính kháng ngun được nhận
biết bằng kỹ thuật immunoblottịng trên 2-D acrylamide gel và định danh bằng kỹ thuật nanoLC-ESI-MS/MS.
Kết quả. Định danh 4 protein bằng sắc ký/khối phổ: enoỉãse, 60kDA chaperonin, Chaperone protein DnaK and
elongation factor Tu. Tắt cà 4 protein đã được báo cảo có tính sinh miễn dịch với ở câc vật chủ khác trong trên
câc nghiên cứu gần đây.
Từ khóa: Nhiễm trùng liên cầu lợn, SS2.
SUMMARY
IDENTIFICATION ANTIGENIC PROTEINS OF Streptococcus suis serotype 2 BY IMMUNOPROTEOMICS
APPROACH
Auhtor: Nguyen Hoang Bach (Department o f Microbiology, Hue University o f Medicine and Pharmacy)
Supervisor: Dr. Le Van An (Department o f Microbiology, Hue University o f Medicine and Pharmacy)
Prof. Alberto Alberti (University o f Sassari, Italy)
Introduction: Streptococcus suis infection in humans is an acute infectious disease with diverse clinical
manifestations include septicemia, meningitis, endocarditis, arthritis... There are no effective vaccines against
SS2 for both swine and humans. This study provides data on the antigenic proteins identified by
immunoproteomics method.
Materials and methods: Total soluble protein extracts of SS2 were resolved on 1-D acrylamide gel. Patient sera

were tested by western blot. Immunogenic protein were identified by immunoblotting techniques on 2-D acrylamide
gels and identified by nanoLC-ESI-MS/MS. Results: 4 proteins have been identified by the data obtained from
nanoLC-ESI-MS/MS: enolase, 60kDA chaperonins, Chaperone proteins and elongation factor Tu DnaK. In recent
studies, all o f 4 proteinsare involved in binding antigens and presenting them to the immune system.
Keywords: Streptococcus suis infection, SS2.
Đ Ặ Ĩ VẮN ĐỀ
Nhiễm trùng liên cầu lợn ở người là một bệnh
nhiễm trùng cấp tính với biểu hiện lâm sàng đa dạng
bao gịm nhiễm trùng huyết, viêm màng não mủ, viêm
nội tâm mạc, viêm khớp. Nhiễm liên cau lợn ở người
được phát hiện đầu tiên vào năm 1960 và số lượng
bệnh nhân nhiễm ngày càng tăng. Bằng các kỹ thuật
phân lập và nuôi cấy thông thường, S.suis gây bệnh
(chủ yếu là serotype 2 ) được phân lập từ các bệnh
phẩm lâm sàng hoặc tiến hành lảm xét nghiệm huyết
íhanh học hoặc bằng phương pháp re-time PCR.
Kháng ngun vỏ liên cầu lợn có cấu trúc
polysaccharide đặc hiệu, đóng vai trị quan trọng trong
khả năng gây bệnh cùa vi khuẩn, người ta chia liên
cầu lợn thành 35 íỵpe huyết thanh khác nhau dựa vào
cấu trúc kháng ngun polysaccharides, trong đó các
íype 1/2 và 2 thường được phân lập trên lợn bệnh và
có khả năng lây sang người [9], [10].
Xác định tính protein có tính kháng ngun vi
khuẩn gây bệnh cho người và động vật có vai trò quan
trọng trong sinh học và y học, nhằm xác định tính chất
độc iực trong gây bệnh của chúng, quan trọng hơn là
sư dụng các protein này vào làm vaccine, chế tạo các
bộ sinh phẩm chần đoán huyểt thanh học như ELiSA,
western blot, sắc ký miễn dịch. Các nghiên cứu gần

đây ở các nước phát triển người ta sử dụng kỹ thuật
immunoproteomics. Phương pháp này đã áp dụng
trong nghiên cứu để tạo ra vaccine và sinh phẩm chẩn
đoán với các vi khuẩn Mycoplasma mycoides,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus equi ssp.
Zooepidemicus, Bordetella bronchisepíicav Vibrio
parahaemolyticus, Bruceiia meíitensis [4], [15], [16],
[19], [21] [25]
Nghiên cứu này chúng tơi sử dụng kỹ thuật
immunoproteomics đề phân tích và xác định tính
kháng nguyên của các protein sinh miễn dịch ờ liên
cầu !ợn type 2. Kết quả của nghiên cứu này sẽ làm cơ
sở đế có thề đưa các protein kháng ngun này iàm
mơ hình vaccine hay tạo ra các bộ sinh phẩm để chẩn
đoán nhiễm trùng liên cầu type 2 ở người vả động vật.
ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯỚNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
1. Đối tứợng nghiên cứu
Chùng Vi khuan: 3 chủng Streptococcus suis
serotype 2 phân lập từ dịch não tủy bệnh nhân viêm
màng não mũ đã được định danh bằngcảc phương
pháp định danh vi sinh vật thường quy và phương
pháp real-time PCR, cung cấp bởi khoa Vi sinh, Bệnh
viện Trung ương Huế [20].
Huyết thanh’ Huyết thanh được tách từ máu íồn
phần của bệnh nhân ổã có chẩn đoốn viêm màng não

500

do liên cầu lợn sau 1-4 tuần từ khi bị bệnh.
2.
Phương pháp nghiên cứu
Tách protein hòa tan tổng số của SS2
Sinh khối SS2 sau 2 ngày nuôi cấy trong thang BHI
(Brain-Heart Infusion broth) được thu nhận bằng ly
tâm, dung địch tế bào vi khuẩn đồng nhất được xư lý
bằng nhiệt và siêu âm để thu hoạch protein tồn phần
hịa tan ở íế bàọ bi khuẩn.
Phân tách bằng điện di 1 chiều SDS-PAGE
5-15 ụg protein tổng số được cho vào acrylamide
gelvà quá trình điện di được tiến hành trên hệ thống
điện di đứng. Gel được nhuộm bằng coomassie blue
với kit SimpiyBlue™ SafeStain (Life Technologies, Hoa
Kỳ). Hình ảnh gel đượcsố hóa trên hệ thống
ImageScanner™ ill (GE, Hoa Kỳ) hay được dùng thực
hiện Western blot.
Sàng iọc huyết thanh tích hợp bằng Western Biot
Protein toàn phần của mỗi chùng được phân tách
bằng kỹ thuật SDS-PAGE trên 1 lược 1mm và chuyển
lên màng nitrocellulose. Để sàng lọc các huyết thanh
bệnh nhân, mỗi loại huyết thanh sẽ được ủ với màng
ở độ pha loãng từ 1:500-1:1500 trong PBS-T có 2%
(w/v) sữa tách béo bằng bộ sàng lọc Mini-PROTEAN II
Multiscreen Apparatus (Bio-RacCcẢ, Hoa Kỳ), ừ màng
với kháng the 2 có gắn enzyme là Goat Anti-Human
!gG-HRP-conjugated (SouthernBiotech, Alabama, Hoa
Kỳ) ở độ pha loang 1:50.000 trong PBS-T có 5% (w/v)
sữa tách béo. Màng được làm hiện màu bằng cơ chất
huỳnh quang Luminata™ Forte Western HRP

substrate (Merck Miilipore Corp., Darmsíadỉ, Đức) và
tín hiệu trên màng được thu nhận bởi hệ thống
ChemỈDoc™ XRS+.
Phân tách protein bằng điện di hai chiều (2-D
PAGE)
300 ụg protein hòa tan tổng số SS2 được hòa tan
trong đệm thủy hóa (6 M Urea; 2 M Thiourea; 4%
CHAPS; 1 M DTT) bổ sung 1% SERVALYT™ Carrier
Ampholytes pH 3-10 (SERVA Electrophoresis GmbH,
Đức). Thủy hóa thụ đọng mẫu vào thanh gel 11 cm pH
3-10 Non-linear SẺRVA IPG BlueStrips (Serva
Electrophoresis GmbH, CA, Hoa Kỳ). Protein được tập
trung theo chiều đẵng điện trên hệ thống Ettan
iPGphor 3 (GE Heathcare, Hoa Kỳ) đến khi đạt 38,000
Vh.Các protein được phân tách chiều thứ hai trên
bằng điện di 1 chiều SDS-PAGE. Mãu được chạy trên
2 thanh gel đồng thời, một thanh gel được nhuộm
bằng thuốc nhuộm SimpiyBlue™ SafeStain (Life
Technologies, Grand Island, NY, Hoa Kỳ). Thanh gel
cịn lại sẽ dùng để phân tích western blot theo mô tả ờ
trên với những thay đổi để phù hợp với gel điện di 2
chiều.
Định danh protein bằng sắc ký lỏng kết nối khối
phổ (nanoLC-ESI-MS/MS)
Xác định các protein kháng nguyên trên gel điện di
2 chiều bằng cách chồng lấp hình ảnh các íín hiệu
írong gel phân tích western blot lên hinh ảnh gel từ
điện dỉ 2 chiều. Các proíeinđược đánh dấu và cắỉ ra
khỏi gel. Sau đó các thành phần được loại màu thuốc
nhuộm và tiến hành cắt các protein thành các chuỗi

poíypeptide bằng enzyme trypsin.

Quá trinh thực hiện khối phổ liên tiếp được tiến
hành trên hệ thống khối phổ XCT Ultra 6340 bắt ion
íheo mơ tả của Bossa và cs. (2014). Dữ liệu khối phổ
đưực phân tích bằng mềm Proíeome Discoverer
(version 1.4; Thermo Scientific, Bremen, Germany) sử
dụng server nội bộ Mascot (version 2.3; Matrix
Science) để định danh các protein, dựa theo các điều
kiện: cơ sở dữ liệu UniProtKB/Swiss-Prot (phiên bản
05-2015), enzyme: trypsin, taxonomy: Streptococcus.
KẾT QUẢ VÀ BAN LUẬN
1.
SDS-PAGE, western ỉm m unoblotting và lựa
chọn huyết thanh bệnh nhân
Theo hình 1, một lượng lớn các băng protein hoà
ỉan tổng số của SS2 sau khi phân tách có khối iượng
ỉập trung chủ yếu trong khoảng 10-100 kDa. số lượng
và vị trí các băng protein của 3 chủng SS2 tương đồng
nhau.
..2 6 . 2 , .

301

KD

2SO -

Hỉnh 1: Phổ điện di SDS-PAGE của 3 chùng SS2 (iD 262,
286,301). MW: Precision Plus Protein™ All Blue Pre­

stained Protein Standards; Đường 1,3,5: 3 Ịjg protein hoà
tan tổng sổ. Đường 2,4,6:15 pg protein hoà tan tổng số.
Nhằm xác định huyết thanh bệnh nhân có lượnp
kháng thể cao với các protein tồn phần hồ tan, mơi
chùng SS2 sẽ được sang lọc bằng kỹ thuật Western
biot cùng với huyết thanh từ cácbệnh nhân nhiễm liên
cầu lợn. Huyết thanh lấy ở các thời điểm khác nhau
(từ 1-4 tuần từ khí bị bệnh) íừ 4 bệnh nhân viêm màng
não do SS2 và 2 bệnh nhân nhiễm N. meningitidis, H.
influenza !àm huyết thanh đối chứng âm. Kết quả sàng
lọc huyếỉ thanh bằng western blot ơ hình 2 , đừờng so
10 và 11 (huỵết thanh đối chứng âm) khơng có tín hiệu
nào.Hai huyết íhanh với ID 286, 4 tuần; !D 301, 3 tuần
có nhiều băng tín hiệu hơn so với các huyết thanh
khác.Các huyết thanh được trộn lại và đùng như
kháng thể 1 đặc hiệu trong phân tích western biot trên
diện di 2 chiều 2-D PAGE.

* / t

*

19 íl

Hỉnh 2: Hình ảnh western bloỉcùa protein hoà tan tổng số
của SS2 với 11 huyết thanh bệnh nhân viêm màng não.
Đường số 1-9: HTbệnh nhân nhiễm SS2 được lấy sau 1-3
ỉuần; 10: HT bệnh nhân nhiễm N. meningitidis sau 1 tuần;
11: HT bệnh nhân nhiễm H. influenza sau 1 tuần.

501


2.
Điện di 2 chiều, western immunoblotting và protein được phân tích sắc ký/khồi phổ cho thấy 4
sắc ký/khốỉ phổ
trong 5 protein được định danh lần lượí là: elongation
Protein ìồn phần hòa tan của 3 chủng SS2 là 262,
factor Tu, enolase, 60 kDa chaperonin, chaperone
286 và 301 được trộn lại và phân tách trong điện di 2
protein DnaK.
chiều 2-D PAGE ở 2 thanh gel đồng thời. Hình ảnh
Các thơng sổ về trọng lượng phân tử (MW), điểm
điện di 2 chiều cho tháy phổ điện di protein được phân
định danh (identification score), sổ peptide trùng khớp
..í
í . . . _____ ì : _ j _ I_____ Á . _____________ i i _ £
2 . 1 . 2 ___ J
tách theo điểm đẵng điện (pl) ơ chiếu ổlện di thử nhất
nằm trong khoảng pH 4-7 (hình 3A). ở thanh gel thứ
hai, kết quả phân tích bằng western blot với kháng thể
và điểm định danh từ 463-758.4 protein này đều khớp
1 là hỗn hợp cùa 2 huyết thanh ỈD 286,4 tuần; ỈD 301,
với protein của Streptococcus suis chùng 98HAH33. 1
3 tuần (hình 3B). Theo hỉnh 3B cho thầy có 5 protein
protein được định danh lè 60 kDa chaperonin của
cóphức hợp kháng ngun-kháng thể íừ bệnh nhân
Streptococcus anginosus nhưng có các thơng số pl,
nhiễm SS2. Các proteĩncó trọng lượng được tính theo
trong lượng phân tử (WM) tương đương với s. suis 60

thực nghiệm lần lượt là 36, 46,48, 52 và 67 kDa. Năm
kĐa chaperonin.
pH 3

=3

pH 3

KDa

.o o iiiiiliiS lllil

Hình 3. Phổ điện di 2 chiều protein toàn phần của s. suis (130 mm IPG strip, pH 3-10) và kết quả phân tích western
immunoblotting. A. Gel được nhuộm bằng coomassie blue tương tích khối phơ. Chuẩn trọng lữợngphân tử ờ bên ỉrái
được tính bằng kiỉodaỊton. B. Gel thực hiện song song được sử dụng để phân tích western blot (nồng độ pha lỗng
huyết thanh 1:1,500). Các cấu từ đánh dấu được định danh bằng nanoLC-ESI-MS/MS.

Peptide đơn nhất

Số peptide

18

18

22 607 64,8 4,75

Q8KJ20

3

16

24

502

7 58,17

30,74

13

Số amino acid

# Prot,

4

Chaperone protein ĐnaK OS=Streptococcus suis
(strain 98HAH33) GN=dnaK PÈ=3 sv=1 - .
[DNAK_STRS2]
60 kDa chaperonin OS=Streptococcus anginosus
GN=groL PE=3 s v =1 - [CH60_STRAP]

Độ bao phủ

596,39 28,34 20

Điểm định đan

5 A4VZB5

Trọng ỉượng [kĐa]

Chúng tôi ước tính khối lượng phân tử và điểm đẵng điện pl dựa theo hình ảnh trên gel điện đi 2 chiều và so
sánh với kết quả phân tích từ dữ liẹu khối phổ. Có một số khác biẹt giữa aiá trị thực nghiệm va iý thuvết khi khảo
sát khối lượng phân tử protein. Trong khi đó, giá trị pỉ khơng khác biệt nhiều, trong khoảng pH 4-5. Điếu khác biệt
có thể do quá trình sau khi phân giai và hậu dịch mã đã cat vùng alkaline và quá trinh phosphorin hóa của các
gốc amino acid [ 12 ].
3. Định danh protein
Từ dữ liệu phân tích khổi phổ chúng tơi đã xác định được 4 protein kháng nguyên được nhận biết bằng huyết
thanh của bệnh nhân bị nhiễm trùng S.suis, gồm enoiase, 60kDA chaperonin, Chaperone protein DnaK and
elongation factor Tu (Bảng 1). Tất cá 4 protein này đã được các nghiên cứu gần đây xác định là có tính sinh miễn
dịch ơ các động vật nghiên cứu [6], [8], [27].
Bảng 1. k ế t quả định danh các 5 thành phần protein cùa s. suis serotype 2 được nhận diện bằng huyết thanh
của bệnh nhân nhiễm bệnh tự nhiên
sơ Mã số
Mơ tả
TT
ít
TI
ơì
■£L

540 56,9 4,73


3 A4W2T1

Enoiase OS=Streptococcus suis (strain 98HAH33)
GN=eno PE=3 s v =1 - [ENO_STRS2]

526,26 26,90

14

11

11

16

2 A4VZZ3

Elongation factor Tu OS=Streptococcus suis (strain
98HAH33) GN=tuf PE=3 sv=2 - [EFTU_STRS2]

463,06 38,94

15

14

14

22 398 44,0 4,98

A4W2T1

Enoiase OS=Streptococcus suis (strain 98HAH33)
GN=eno PE=3 sv=1 - [ENO_STRS2]

16

2

2

2

Enoiase là enzyme chịu trách nhiệm cho quá trinh
tách nước của 2-phosphoglycerate (2-PGE) đe chuyển
thành phosphoenoipyruvate (PEP). Gần đay, enoláse
được thừa nhận la protein ỉiên kết với plasminogen
(piasminogen-binding protein) và. là kháng nguyên nổi
,bậì liên quan đến độc lực của rhột số loài vi khuẩn
giống Streptococcus.Enolase nằrntrên bề mặt ỉế bào
và góp phấn vào bám dính niêm mạc của các vi khuẩn
gây bệnh và hỗ trợ xâm nhập vào tế bào vật chủ [6],
[7], [13], (22].
Dinis vàcs. (2009) đã phát triển một vaccine an
toàn và hiệu qua nhằm phòng bệnh sâu răng gây bởi
Streptococcus sobrinus trên chuột bằng cách dùng
enolase tái tổ hợp. Trong nghiên cứu của chúng tôi,
protein số 1 trùng khớp vơi enolaseS. suis serotype 2.
Enolase của SS2 đã được nhận biết bằnghuyết thanh
bệnh nhân mắc bệnh sau 1-3 tuần trong phân tích
western immunoblotting trên 1-D và 2-D gel. Feng và
cs.(2009), Lu và cs.(2012)đã xác định gene mã hóa

protein enolase của SS2 và đã xây dựng hệ thổng biểu
hiện protein enolase để sản xuất protein tái tổ hợp.
Nghiên cứu đã cho thấy enolase của SS2 có tính sinh
mỉễn dịch mạnh cũng như có vai trò xâm nhiễm vàò tế
bào cơ thể vật chủ [8], [18],
60kDA chaperonin (còn được biết ià Cpn60,
HSP60 hay GroEL) có ở hầu hết các serotype của s.
suis và thường đứợc tiét ra môi trường nuôi cấy [ 1 j.
60kĐA chaperonin thuộc nhóm stress protein hay
proteins chịu nhiệt (hsps). Dữ liệu khối phổ cho thấy
protein số 4 írùng khớp với 60 KDa chaperonin của
SS2. Trong những năm gần đây, hsps được xem như
là một kháng nguyên mạnh và nó liên quan đến khả
năng sống sóí của vi khuẩn trong cơ thể vật chủ, hay
cơ chế gây bệnh của vi khuẩn. Cainelli Gebara và cs.
(2007) đã nghiên cửu thành phần hsps hòa tan của
Bordetella pertussis và bổ sung thành phần hsps
kháng nguyên với bệnh ho gà trong hỗn hợp vaccine
bạch hầu-ho gà-uốn ván (DPT). Vaccine này tạo được
hàm lượng kháng thể cao, đã giúp 78% chuột thí
nghiệm phìong được nhiễm trùng khi gây nhiễm trùng
thực nghiệm với B. pertussis sổng [2].
Chaperone protein DnaK là một thành viên của họ
protein chịu nhiệt (hsps). Nó ià một kháng nguyên phổ
biến của các vi khuẩn gây bệnh. Protein này đứợc bảo
tồn về mặt di truyền.đóríg vai trị quan trọng sự gấp
cuộn cùa cấu trúc protein, tương tác giữa proteinprotein và trong cơ chế xuyên màng của protein...[14],
[24], [26]. Chúng tôi đã xác định protein số 5 Eà
chaperone protein DnaK của SS2. Nghiên cứu gần

78,69

5,98

435 47,1 4,77

435 47,1 4,77

đây của Chen và cs. (2011) báo cáo rằng DnaK có thể
liên quan đến bám dínhcủá SS2 lên tế bào HEp-2 [3],
[31]. Takaya và cs. (2004) nhận thấy rằng cơ chể hoạt
động của DnaK/DnaJ chaperone la giúp cho
Salmonella enterica serovar Typhimurium xâm nhiễm
vào tế bào biểu mô và sống sót dưới cơ chế miễn dịch
cùa đại thực bào [23], DnaK có thể là một ứng viên tốt
để tạo ra vaccine phịng SS2, dựa írên các kết quả
nghiên cứu ỜS. pneumoniae [11], Mycobacterium
tuberculosis [17], và s. suis [30].
Các yếu tố kéo dài (EF) đóng vai trị quan trọng
trong viẹc tổng hợp protein ở ribosome. Elongation
factor-Tu (EF-Tu) gián tiếp tham gia vào viẹcđưa
aminoacyl ỈRNA vào vị trí trống của ribosome trong
quá trình dịch mã. Thành phần protein số 2 phù hợp
với SS2 EF-Tu. EF-Tu, nó được xác định là một
protein có tính sinh miễn dịch ở Bacillus cereus [5] and
SS2 [28], [29].
KẾT LUẬN
Nghiên cứu của chúng tôi đã cung cấp dữ liệu về
các protein cố tính kháng nguyên của SS2,-được nhận
biết bằng huyết thanh của bệnh nhân nhiễm liên cầu

lợn tự nhiên bằng kỹ thuật western immunobiotting.
Các protein đã được phân tách bằng kỹ thuật điện di
protein 2 chiều và định danh bằng kỹ thuật sắc ký khối
phổ (nanoLC-ESI-MS/MS). Các protein này đếu đã
được xác nhận có tính sinh miễn dịch trên các cơ íhể
vật chủ khác nhau. Một số protein như enolase,
chaperone protein DnaK, 60kDA chaperonin đã được
phát triển thành các vaccine tái íổ hợp mơ hình giúp
chống lại sự xâm nhiễm và gây bệnh do s. suis và mọt
số vi khuẩn khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Benkirane R., Gottschalk M. G.Dubreuiỉ J. D.
(1997), identification of a Streptococcus suis 60-kDa heatshock protein using western blotting. FEMS Microbiol Lett,
153(2), 379-385.
2. Cainelii Gebara V. c., Risoleo L., Lopes A. p. et al.
(2007), Adjuvant and immunogenic activities of the 73kDa
N-terminal alpha-domain of BrkA autotransporter and
Cpn60/60kDa chaperonin
of Bordetella
pertussis.
Vaccine,
25(4),
621-629.
doi:
10.1016/j.vaccine.2006.08.033
3. Chen B., Zhang A., Xuz. et ai. (2011), Large-scale
identification of bacteria-host crosstalk
by affinity
chromatography:
capturing

the
interactions
of
Streptococcus suis proteins with host cells. J Proteome
Res, 10(11), 5163-5174. doi: 10.1021/pr200758q
4. Corona L., Cillara G.Tola s. (2013), Proteomic
approach for identification of immunogenic proteins of

503


Mycoplasma mycoides subsp.
capri. Veterinary
Microbiology,
167(3-4),
434-439.
doi:
/>5. Delvecchio V. G., Connolly J. p., Alefantis T. G. et
ai. (2006), Proteomic profiling and identification of
immunodominant spore antigens of Bacillus anthracis,
Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis. Appi Environ
Microbiol, 72(9), 6355-6363. doi: 10.1128/aem.00455-06
6. Dinis M„ Tavares D., Veiga-Maiìa I. et al. (2009),
Oral therapeutic vaccination with Streptococcus sobrinus
recombinant enolase confers protection against dental
caries in rats. J Infect Dis, 199(1), 116-123. doi:
10.1086/594372
7. Esgieas M., Li Y-, Hancock M. A. et af. (2008),
isolation and characterization of alpha-enoỉase, a novel
fibronectin-binding protein from Streptococcus suis.

Microbiology,
154(Pt
9),
2668-2679.
doi:
10.1099/mic.0.2008/017145-0
8. Feng Y., Pan X., Sun w. et al. (2009),
Streptococcus suis enoiase functions as a protective
antigen displayed on the bacterial cell surface. J Infect
Dis, 200(10), 1583-1592.
9. Gottschalk M., Segura M.Xu J. (2007),
Streptococcus suis infections in humans: the Chinese
experience and the situation in North America. Anim
Health Res Rev, 8(1), 29-45.
10. Haleis A., A!fa M., Gottschalk M. et al. (2009),
Meningitis caused by Streptococcus suis serotype 14,
North America. Emerg Infect Dis, 15(2), 350-352.
11. Hamel J., Martin D.Brodeur B. B. (1997), Heat
shock response of
Streptococcus
pneumoniae:
identification of immunoreactive stress proteins. Microb
Pathog, 23(1), 11-21. doi: 10.1006/mpat.1996.0124
12. Jing H. B., Yuan J., Wang J. et ai. (2008),
Proteome analysis of Streptococcus suis serotype 2.
Proteomics, 8(2), 333-349. dot: 10.1002/pmic.200600930
13. Kolberg J., Aase A., Bergmarm s. et al. (2006),
Streptococcus pneumoniae enolase is important for
piasminogen binding despite low abundance of enolase
protein on the bacterial ceil surface. Microbiology, 152(Pt

5), 1307-1317. dot: 10.1099/mic.0.28747-0
14. Krska J., Elthon T.Bium p. (1993), Monoclonal
antibody recognition and function of a DnaK (HSP70)
epitope found in gram-negative bacteria. J Bacteriol,
175(20), 6433-6440;
15. Li c., YeZ., Wen L. et al. (2014), Identification of a
novel vaccine candidate by immunogenic screening of
Vibrio parahaemolyticus outer membrane proteins.
Vaccine,
32(46),
6115-6121.
doi:
/>16. Liu Y., Qin F.-y., Bao G.-l. et al. (2014),
Immunoproteomic Analysis of Bordetella bronchiseptica
Outer Membrane Proteins and Identification of New
Immunogenic Proteins. Journal of integrative Agriculture,
13(9), 2010-2018. doi: />17. Lowrie D. B., Silva c. L , Colston M. J. et ai.
(1997), Protection against tuberculosis by a plasmid DNA
vaccine. Vaccine, 15(8), 834-838.
18. Lu Q., Lu H., Qi J. et ai. (2012), An octamer of

enoiase from Streptococcus suis. Protein & Ceil, 3(10),
769-780. doi: 10.1007/S13238-012-2040-7
19. Mao Y.t Fan H.-j., Zhou Y.-h. et ai. (2011),
immunoproteomic Assay of Antigenic Surface Proteins in
Streptococcus equi ssp. zooepidetnicus. Agricultural
Sciences
in
China,
10(7),

1096-1105.
doi:
/>20. Nguyen B. H., Phan D. H., Nguyen H. X. et ai.
(2015), Molecular diagnostics and ITS-based phylogenic
analysis of Streptococcus suis serotype 2 in central
Vietnam. J Infect Dev ctries, 9(6), 624-630. doi:
10.3855/jidc.7027
21. Olaya-Abril A., Prados-Rosales R., McConnell M.
J. et al. (2014), Characterization of protective extracellular
membrane-derived vesicles produced by Streptococcus
pneumoniae. Journal of Proteomics, 106, 46-60. doi:
/>22. Pancholi V. (2001), Multifunctional aipha-enolase:
its roie in diseases. Ceil Mol Life Sci, 58(7), 902-920.
23. Takaya A., Tomoyasu T., Matsui H. et al. (2004),
The DnaK/DnaJ chaperone machinery of Salmonella
enterica serovar Typhimurium is essential for invasion of
epithelial cells and survival within macrophages, leading
to systemic infection. Infect immun, 72(3), 1364-1373.
24. Vanghele M G. E. (2010), The roie of bacterial
molecular chaperones in pathogen survival within the
host. Rom.J.Biochem., 47(1), 15.
25. Yang Y., Wang L., Yin J. et al. (2011),
immunoproteomic analysis of Brucelia meiitensis and
identification of a new immunogenic candidate protein for
the development of bruceilosis subunit vaccine. Molecular
Immunology,
49(1-2),
175-184.
doi:
/>26. Young D., Roman E., Moreno c. et ai. (1993),

Molecular Chaperones and the immune Response [and
Discussion]. Philosophical Transactions:
Biological
Sciences, 339(1289), 363-368. doi: 10.2307/55833
27. Zhang A., Chen B., Mu X et al (2009),
identification and characterization of a novel protective
antigen, Enoiase of Streptococcus suis serotype 2.
Vaccine,
27(9),
1348-1353.
doi:
10.1016/j.vaccine,2008.12.047
28. Zhang A., Xie C-, Chen H. et al. (2008),
Identification of immunogenic cell wall-associated proteins
of Streptococcus suis serotype 2. Proteomics, 8(17),
3506-3515. doi: 10.1002/pmic.200800007
29. Zhang W.Lu c. p. (2007), immunoproteomic
assay of membrane-associated proteins of Streptococcus
suis iype 2 China vaccine strain HA9801. Zoonoses
Public Health, 54(6-7), 253-259. doi: 10.1111/J.18632378.2007.01056.x.
30. Zhang W.Lu c. p. (2007), Immunoproteomics of
extracellular proteins of Chinese virulent strains of
Streptococcus suis type 2. Proteomics, 7(24), 4468-4476.
doi: 10.1002/pmic.200700294
31. Zhang X., Jiang X., Yang L. et al. (2015), DnaJ of
Streptococcus suis Type 2 Contributes to Cell Adhesion
and Thermotolerance. J Microbiol Biotechnol, 25(6), 771781.

504