Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây mãn đình hồng althaea rosea để thu nhận hợp chất flavonoid có hoạt tính sinh học

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................2
1.1 SƠ LƯC VỀ CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHEAE ROSEA L. ................2
1.1.1 Đặc điểm phân loại .....................................................................................2
1.1.2 Đặc điểm hình thái ......................................................................................2
1.1.3 Đặc điểm sinh thái .......................................................................................3
1.1.4 Đặc điểm phân bố .......................................................................................4
1.1.5 Các hợp chất có giá trị trong cây Mãn Đình Hồng.....................................4
1.1.6 Giá trị y dược của cây Mãn Đình Hồng ......................................................4
1.2 TỔNG QUAN VỀ HP CHẤT FLAVONOID..............................................4
1.2.1 Cấu tạo và đặc điểm của hợp chất tự nhiên Flavonoid..............................5
1.2.2 Tác dụng dược lý .........................................................................................6

1.2.2.1 Tác dụng kiểu Vitamine P ........................................................................6
1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa ..........................................................................6
1.2.2.3 Các tác dụng khác ....................................................................................6
1.2.3 Sơ lược về một số hợp chất Flavonoid có trong cây Mãn Đình Hoàng .......7


1.2.3.1 Hợp chất Rutin ..........................................................................................7
a. Đặc điểm hóa lý .................................................................................................7
b. Giá trị y dược .....................................................................................................7
1.2.3.2 Hợp chất Quercetin...................................................................................9

a. Đặc điểm hóa lý ................................................................................................9
b. Giá trị y dược .....................................................................................................9
1.2.3.3 Hợp chất Kaempferol ..............................................................................11
a. Đặc điểm hóa lý ................................................................................................11
b. Giá trị y dược .....................................................................................................11
1.2.3.4 Hợp chất Myricetin..................................................................................12
a. Đặc điểm hóa lý ................................................................................................12
b. Giá trị y dược .....................................................................................................12
1.2.4 Một số đối tượng chứa hợp chất Flavonoid................................................13
1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU HP CHẤT THỨ CẤP.........15
1.3.1 Lịch sử nghiên cứu......................................................................................15
1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo.........................................................................................16

1.3.2.1 Khái niệm về mô sẹo ..............................................................................16
1.3.2.2 Phương pháp tạo mô sẹo ...........................................................................16
1.3.2.3 Đường cong tăng trưởng ............................................................................17
1.3.2.4 Ứng dụng của nuôi cấy mô .......................................................................18
1.3.3 Nuôi cấy huyền phù tế bào và thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học ........18
1.3.4 Các điều kiện nuôi cấy tế bào ảnh hưởng đến sản xuất các chất thứ cấp 20

1.3.4.1 Chất điều hòa sinh trưởng .........................................................................20
1.3.4.2 Nguồn đạm ................................................................................................20


1.3.4.3 Nguồn Carbon............................................................................................21
1.3.4.4 Ánh sáng ....................................................................................................21
1.3.4.5 Các chất khác ............................................................................................21
1.4 SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID
CHROMATOGRAPHY) .....................................................................................21
1.4.1 Lý thuyết cơ bản về sắc ký lỏng cao áp HPLC .........................................21

1.4.2 Cấu tạo và hoạt động của máy sắc ký lỏng cao áp HPLC........................22
CHƯƠNG 2 – MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .............................27
CHƯƠNG 3 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................28
A. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ...........................28
B. TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ................28
C. THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM ..............................................................................29
3.1 THIẾT LẬP QUI TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO, TẠO MÔ SẸO VÀ
DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA

ROSEA L. .................................................................................................29
3.1.1 Vật liệu .......................................................................................................29

3.1.1.1 Nguyên liệu nuôi cấy ..............................................................................29
3.1.1.2 Hóa chất khử trùng .................................................................................29
3.1.1.3 Môi trường nuôi cấy ................................................................................29
3.1.1.4 Điều kiện nuôi cấy ..................................................................................29
3.1.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm .............................................................29

3.1.2.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy ......................................29
a. Mục đích tiến hành ..........................................................................................29
b. Bố trí thí nghiệm ...............................................................................................30


c. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................30
d. Các bước tiến hành ............................................................................................30
3.1.2.2 Thí nghiệm 2: nh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo ..31
a. Mục đích thí nghiệm .........................................................................................31
b. Bố trí thí nghiệm ...............................................................................................31
c. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................32
d. Các bước tiến hành thí nghiệm .......................................................................32

3.1.2.3 Thí nghiệm 3 Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào cây Mãn
Đình Hồng............................................................................................................32
a. Mục đích thí nghiệm .........................................................................................32
b. Bố trí nghiệm thức ...........................................................................................32
c. Chỉ tiêu theo dõi ..............................................................................................32
d. Các bước tiến hành thí nghiệm .......................................................................33
3.1.2.4 Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu
được lượng sinh khối cao nhất .............................................................................33
a. Mục đích thí nghiệm .........................................................................................33
b. Bố trí nghiệm thức ............................................................................................33
c. Chỉ tiêu theo dõi ...............................................................................................33
d. Các bước tiến hành thí nghiệm ........................................................................34
3.2 ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯNG FLAVONOID CÓ TRONG MÔ SẸO
DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA

ROSEA L. ..................................................................................................35
3.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavonoid có trong cây Mãn Đình Hồng Althaea

Rosea L. ...............................................................................................................35


3.2.1.1 Mục tiêu tiến hành thí nghiệm ................................................................35
3.2.1.2 Nguyên liệu .............................................................................................35
3.2.1.3 Hóa chất_Thiết bị ...................................................................................35
3.2.1.2 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................35
3.2.1.5 Phương pháp tiến hành ............................................................................36
a. Xử lý nguyên liệu .............................................................................................36
b. Các bước tiến hành thí nghiệm .........................................................................36
3.2.2 Thí nghiệm 6: Định lượng Flavone ...........................................................37

3.2.2.1 Mục tiêu thí nghiệm ................................................................................37
3.2.2.2 Nguyên vật liệu .......................................................................................37
3.2.2.3 Hóa chất ..................................................................................................37
3.2.2.4 Điều kiện chạy HPLC .............................................................................38
3.2.2.5 Phương pháp tiến hành ............................................................................38
a. Bố trí nghiệm thức ............................................................................................38
b. Các bước tiến hành thí nghiệm .........................................................................38
CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.......................................................40
4.1 THIẾT LẬP QUI TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO, TẠO MÔ SẸO VÀ
DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA

ROSEA L. ..................................................................................................40
4.1.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy .........................................40
4.1.2 Thí nghiệm 2: nh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo .....41
4.1.3 Thí nghiệm 3: Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào Mãn Đình
Hồng Althase Rosea L ........................................................................................47


4.1.4 Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu được
lượng sinh khối cao nhất......................................................................................48
4.2 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH ĐỊNH LƯNG HP CHẤT FLAVONE ..............51
4.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavone có trong cây Mãn Đình Hồng Althaea Rose L.51
4.2.2 Thí nghiệm 6: Định lượng Flavone bằng phương pháp HPLC......................... 51
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................53
5.1 KẾT LUẬN ...................................................................................................53
5.1.1 Thiết lập qui trình nuôi cấy in vitro, tạo mô sẹo và dịch huyền phù tế
bào cây Mãn Đình Hồng .....................................................................................53

5.1.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy .............................................................53
5.1.1.2 nh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo .........................53

5.1.1.3 Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào cây Mãn Đình Hồng ......53
5.1.1.4 Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu được lượng sinh
khối cao nhất .......................................................................................................53
5.1.2 Kết quả định tính định lượng Flavone .......................................................54

5.1.2.1 Kết quả định tính Flavone .......................................................................54
5.1.2.2 Kết quả định lượng Flavone ....................................................................54
5.2 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................54
5.2.1 Nuôi cấy in vitro .........................................................................................54
5.2.2 Định tính và định lượng các Flavonoid .....................................................54
5.2.3 Nghiên cứu ứng dụng ................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

• NAA :

Naphthalenacetic acid.

• BA

:

6–Benzyl–aminopurine.

• MS

:

Murashine & Skoog, 1962.

• HPLC :

Hight Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng cao áp).


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1 Khảo sát hàm lượng Javel dùng để khử trùng ............................................. 30
Bảng 3.2 Nghiệm thức được bố trí ở giai đoạn 1......................................................... 31
Bảng 3.3 Nghiệm thức được bố trí ở giai đoạn 2......................................................... 31
Bảng 3.4 Nghiệm thức khảo sát đường cong tăng trưởng của tế bào mô sẹo ........... 32
Bảng 3.5 Bố trí nghiệm thức khảo sát điều kiện tối ưu hóa về ảnh hưởng của chất
điều hòa sinh trưởng để thu được lượng sinh khối cao nhất ........................................ 33
Bảng 3.6 Bố trí nghiệm thức định tính Flavone ........................................................... 35
Bảng 3.7 Màu của của Flavonoid dưới ánh đèn tử ngoại có và không có xử lý với
kiềm ............................................................................................................................... 37
Bảng 3.8 Các nghiệm thức định lượng Rutin bằng phương pháp HPLC..................... 38
Bảng 4.1 Kết quả khử trùng hạt Mãn Đình Hồng ...................................................... 40
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát ở phạm vi rộng ................................................................. 41
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA ở phạm vi hẹp .................... 44
Bảng 4.4 Kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng .................................................. 47
Bảng 4.5 Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu hóa chất điều hòa sinh trưởng .............. 48
Bảng 4.6 Kết quả theo dõi màu định tính Flavone...................................................... 51
Bảng 4.7 Kết quả định lượng hàm lượng hợp chất Rutin trên mẫu cây thiên nhiên,
mô sẹo khô và dịch huyền phù ..................................................................................... 51

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang
Hình 1.1: Hoa Mãn Đình Hồng mãu đỏ và màu trắng. ................................................ 3
Hình 1.2 Cây hoa Mãn Đình Hồng đang được trồng tại vườn. .................................... 3
Hình 1.3 Cấu trúc C6-C3-C6 ............................................................................................ 5
Hình 1.4 Cầu trúc Benzo-dihypyran.............................................................................. 5
Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Rutin. ......................................................................... 7
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Quercetin. .................................................................. 9
Hình 1.7 Dạng glucoside của Quercitin. ....................................................................... 9
Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Kaempferol............................................................... 11
Hình 1.9 Dạng glycoside của Kaempferol..................................................................... 11
Hình 1.10 Công thức cấu tạo của chất Myricetin ........................................................ 12
Hình 1.11 Dạng glycoside của Myricetin..................................................................... 12
Hình 1.12 Biểu đồ biểu diễn đường cong tăng trưởng. ............................................... 17
Hình 1.13 a Cấu tạo tổng quá một máy HPLC ............................................................ 24
Hình 1.13 b Sơ đồ khối một máy HPLC...................................................................... 25
Hình 1.13 c Các loại máy HPLC thông dụng trong các phòng thí nghiệm hiện nay . 26
Hình 4.1 Mẫu cây Mãn Đình Hồng Khử trùng in vitro................................................ 41
Hình 4.2 (a,b)Mẫu mô sẹo hình thành ở giai đoạn 1, khảo sát phạm vi rộng ............ 43
Hình 4.3 (a, b) Mẫu mô sẹo khảo sát giai đoạn 2 ở phạm vi hẹp ............................... 46
Hình 4.4 Mẫu nuôi cấy huyền phù tế bào.................................................................... 50
Hình 4.5 Mẫu tế bào cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L...................................... 50


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

Trang
Sơ đồ 3.1 Xử lý mẫu định tính ...................................................................................... 36

Biểu đồ 4.1 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát điều kiện khử trùng .......................... 40
Biểu đồ 4.2 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA trên
phạm vi rộng.................................................................................................................. 43
Biểu đồ 4.3 Biểu diễn kết quả khảo sát điều kiện tạo mô sẹo ................................. 46
Biểu đồ 4.4 Biểu diễn đường c4ông tăng trưởng của dịch nuôi cấy huyền phù tế bào...48
Biểu đồ 4.5 Biểu diễn kết quả theo dõi tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ..................... 49


Lời mở đầu

Cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L. đã du nhập vào Việt Nam trong
những năm qua và được trưng bày để làm đẹp trong nhà vào các dịp lễ, tết với giá
trị thẳm mỹ. Tuy nhiên theo các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước thì cây
Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L. còn có các tác dụng dược lý khác như điều trị
viêm, viêm cuống phổi, trị ho, đau ruột… [3] và có chứa các hợp chất có giá trị như
Rutin (73,28 Đôla/25g), Quercetin (82,82 Đôla/25g), Kaempferol (82,82 Đôla/10
mg)… [3], [12], [34]
Ngoài ra, do hiện trạng diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày càng bị hạn
chế như hạn hán, lũ lụt, tăng diện tích đất thổ cư… nên diện tích đất canh tất nông
nghiệp nói chung, hay diện tích đất trồng cây dược liệu ngày càng bị thu hẹp. Để
khắc phục được vấn đề đó và đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng, việc ứng dụng
các phương pháp nuôi cấy mô và dịch huyền phù tế bào cũng đang được quan tâm
để sản xuất và thu nhận các hợp chất ý dược có giá trị.
Với tình hình được nêu trên, mục tiêu của đề tài nghiên cứu đề ra là “khảo
sát các điều kiện nuôi cấy mô nhằm tăng sinh sinh khối tế bào cây Mãn Đình
Hồng Althaea Rosea L. và định lượng hợp chất Flavone có trong cây”. Các nghiên
cứu của đề tài là bước đầu nghiên cứu các điều kiện khử trùng nguồn nguyên liệu
thiên nhiên, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo và
tối ưu hóa điều kiện chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy huyền phù để thu
sinh khối cao nhất, và từ đó xác định hàm lượng hợp chất Flavone có giá trị trong

cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L. Đề tài mang tính khoa học, thiết thực và cấp
thiết để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc thu nhận các hợp chất có
giá trị y dược từ cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L.

Trần Chấn Đại

Trang 1


Chương 1.Tổng quan tài liệu

1.1 SƠ LƯC VỀ CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L.
1.1.1 Đặc điểm phân loại
-

Giới: Plantae

-

Ngành: Magnoliophyta

-

Lớp: Magnolioopisda

-

Bộ: Malvales

-

Họ: Malvaceae

-

Loài :Alcea

-

Tên khoa học là: Althaea Rosea (L.) Cav (Alcea rosea L.)[24]

-

Tên thông dụng tiếng Anh: Hollyhock, Rose Trémière

-

Tên thông thường: Mãn Đình Hồng hay Thục Quỳ. Tên gọi Mãn Đình Hồng
xuất phát từ đặc điểm của cây có màu hồng đỏ rực rỡ. [3]

1.1.2 Đặc điểm hình thái
Cây cỏ thân to, cao đến 2-3,5m, thân đầy lông đứng. Lá có phiến có thùy rộng
đến 30cm, bẹ lá đáy rộng. Hoa ở phần chót thân, to, rộng 10-12cm, trắng, hường,
đỏ, thường đôi; là đài phụ 5-8 lông trắng; đài 2-3cm; ống tiểu nhụy ngắn; noãn sào
25-45 buồng 1 noãn. Trái trong đài đậy; phần quả không khai. [3]
Cây hoa ít phân cành, khi ra hoa ngọn vươn cao thành bông dài. Hoa đơn, mỗi
nách lá cho 1 chùm 2 đến 3 hoa, hoa nở từ dưới lên trên, hoa ở dưới nở to hơn và
càng lên ngọn càng nhỏ dần đến khi chỉ thấy thành 1 chùm hoa nhỏ. Hoa Mãn
Đình Hồng nở quanh năm, nhưng thường được trồng và để trưng và vào dịp tết.
Hạt thường có màu nâu đất, hình hạt đậu, dẹp và các hạt sếp song song với

nhau tạo thành trái.

Trần Chấn Đại

Trang 2


Chương 1.Tổng quan tài liệu

Hình 1.1 Hoa Mãn Đình Hồng màu đỏ và màu trắng
1.1.3 Đặc điểm sinh thái
Cây hoa dễ dàng thích hợp với nhiều loại đất, chịu nóng ẩm và nắng, đất ẩm
vừa. Từ khi trồng đến khi ra hoa khoảng từ 90 đến 100 ngày. Hoa nở liên tục và
kéo dài hàng tháng.
Hạt thường có lượng dầu cao nên khó bảo quản nên thường được hái khi hạt
ngã sang màu vàng và phơi khô bảo quản.

Hình 1.2 Cây hoa Mãn Đình Hồng đang được trồng tại vườn.

Trần Chấn Đại

Trang 3


Chương 1.Tổng quan tài liệu

1.1.4 Đặc điểm phân bố:
-

Cây được trồng trồng phổ biến từ Châu Âu đến Trung Quốc từ những thế kỹ thứ

16. Theo William Turner, nó được liệt vào danh sách các cây thuốc từ thời điểm
này và có tên tiếng Anh là holyoke.
-

Thường được trồng ở Châu Âu, Tây Nam và Trung Á.

-

Tại Việt Nam: cây thường được trồng vào dịp tết tập trung tại Sài Gòn và Đà
Lạt.[24]

1.1.5 Các hợp chất có giá trị trong cây Mãn Đình Hồng
Những nghiên cứu gần đây nhất cho thấy các hợp chất chính trong cây Mãn
Đình Hồng gồm lượng lớn các polysaccharide, flavonoid mà thành phần chính là
Kaeempferol, quercetin, luteolin và myricetin, anthocyanhdin, delphindin và một
vài hormone estrogen có hoạt tính chưa được biết đến. [3], [12],[14],[16],[17]
Theo phân tích của Marlena Dudek và cộng sự [15] thì thành phần tách chiết
của cao khô Mãn đình Hồng dịch Metanol goàm: syringic (47.10 mg), phydroxybenzoic (18.27 mg), p-coumaric (14.06 mg) và acid ferulic (2.35 mg).
1.1.6 Giá trị y dược của cây Mãn Đình Hồng
Rễ hoạt nhuận, giúp nhẹ đau khi đau cổ, đau nướu, nhọt, sưng vết thương, tê
thấp, đau ruột. Lá, hoa trị ho; hoa chứa rutin, crinin, kaemferol, phloretin…, chống
viêm, trị viêm cuống phổi, là tăng sự tuần hoàn, cầm máu, trị kinh ngêt đau.
Chức altein, hoạt động giống oestron, chống viêm khuẩn trái rạ, thủy bào chẩn.
(Fortin) [3]
1.2 TỔNG QUAN VỀ HP CHẤT FLAVONOID [4]
Flavonol là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn và rất phổ biến. Chúng là một
nhóm các hợp chất dị vòng có oxy và là thành phần chính tạo nên sự đa dạng về
màu sắc của các loài hoa lá cây cỏ.
Vào năm 1952, Flavonol được Geissman và Hinreiner sử dụng lần đầu tiên có

cấu trúc cơ bản là flavon (2 –phenylchromone), về sau khái niệm này được mở
rộng cho cả các cấu trúc cho khung cơ bản là 1.3 – diphenylpropan (C6-C3-C6).

Trần Chấn Đại

Trang 4


Chương 1.Tổng quan tài liệu

1.2.1 Cấu tạo và đặc điểm của hợp chất tự nhiên Flavonoid
Khung cơ bản của Flavonoid gồm có 2 vòng (vòng A và vòng B) nối với nhau
qua một mạch carbon (cấu trúc 1.3 – diphenylpropan C6-C3-C6).

Hình 1.3 Cấu trúc C6-C3-C6.
Mạch 3 carbon thường ngưng tụ với vòng A qua cầu nói oxy tạo nên một dị vòng
C thường là 6 cạnh. Cấu trúc ngưng tụ của vòng A và C có tên là nhân Chroman
(benzo-dihypyran).

Hình 1.4 Cấu trúc benzo-dihypyran.
Các cấu trúc của flavonoid khác nhau bởi:
- Vị trí của nhân phenyl gắn lên dị vòng C.
- Mức độ oxy hóa của dị vòng C.
- Bản chất, số lượng và vị trí của các nhóm thế gắn trên khung cơ bản.
Người ta chia flavonoid thành 3 nhóm chính là Euflavonoid, Isoflavonoid và
Neoflavonoid.
Trong nhóm Euflavonoid là những hợp chất có cấu trúc cơ bản là 2
phenylchroman, dựa vào mức độ oxy hóa chia làm sáu phân nhóm: Flavone (gồm
Apigenin, Luteolin) và Flavonol (gồm Rutin, kaempferol, quercetin, Myricetin);

Trần Chấn Đại

Trang 5


Chương 1.Tổng quan tài liệu

Flavonon (gồm Maringenin, Eriodictol) và Flavanonol (gồm Aromadendrin, Fustin,
Taxifolin); Anthocyanindin; Chalocon và dihydrochalcon; Auron (gồm Sulfurcetin,
Bracreatin); Catechin và leucoanthocyanidin.
Nhóm Isoflavonoid là những hợp chất có cấu trúc cơ bản là isoflavan, gồm nhiều
phân nhóm: Isoflavon (gồm Igrigenin, Daizein, Genistein); Isoflavanon, Rotenoid,
nhóm

các

cấu

trúc

khác

:

Coumaranocoumarin,

Coumaranochroman,

Coumaroflavone.
Nhóm Neoflavonoid là những hợp chất có cấu tạo cơ bản là neoflavan (4phenyl-chroman.

1.2.2 Tác dụng dược lý

1.2.2.1 Tác dụng kiểu Vitamin P
Các hợp chất flavonoid có tác dụng làm bền, tăng sức chịu đựng của thành
mạch máu và hồng cầu; làm giải tính thấm của thành mạch. Có tác dụng hỗ trợ
vitamin C trong điều trị bệnh Sacorbut.
Các nhóm flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, catechin leycoanthocyanidin,
anthocyanidin mang tính chất này và được sử dụng nhiều trong biệt dược.

1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa
Các flavonoid do có nhiều nhóm OH phenol nên có tác dụng chống oxy hóa in
vitro, chúng được dùng làm chất chống oxy hóa chất béo, dược phẩm, mỹ phẩm.
Invivo, chúng ức chế Enzyme Catechin-O-methyl transferase làm bền vững chất
adrenalin, chống sự oxy hóa của Vitamin C và một só chất khác do ức chế
cytochrom oxydase của chu trình hô hấp của tế bào.

1.2.2.3 Các tác dụng khác
Ngoài ra chúng còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, dị ứng, tác dụng
chống co thắt làm giảm đau và có tác dụng giãn mạch.
Ngoài ra một số hợp chất flavonoid có nhiều nhóm OH có tác dụng lợi tiểu, hạ
ure huyết nên được dùng trong điều trị bệnh thận, bí tiểu như quercetin,
sacoparosid. Một số hợp chất flavonoid có tác dụng lợi mật và điều hòa chức năng

Trần Chấn Đại

Trang 6


Chương 1.Tổng quan tài liệu

gan, kích thích nhẹ tim và có tác dụng chống ung thư như eupatin, eupatorin. Các
rotenoid có tác dụng độc với cá và côn trùng, được dùng làm thuốc trừ sâu trong
nông nghiệp.
1.2.3 Sơ lược về một số hợp chất Flavonoid có trong cây Mãn Đình Hồng

1.2.3.1 Hợp chất Rutin
a. Đặc điểm hóa lý

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Rutin
-

Công thức phân tư:û là C27H30O16 có trọng lượng phân tử là 610.52 dalton
(g/mol)

-

Tên hóa học: 3, 3’, 4’, 5, 7-pentahydroxyflavon 3-rutinosid, hay 2-(3,4dihydroxyphenyl)-4,5-dihydroxy-3-[3,4,5-trihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxy6-ethyl-oxan-2-yl)oxymethyl]oxan-2-yl]oxy-chromen-7-one

-

Đặc tính: Bột màu vàng nhạt, không mùi. Nó chuyển thành màu vàng khi
tiếp xúc với ánh sáng. Hòa tan trong pyridine, trong methanol và dung
dịch gazo yếu, hòa tan trong glycerin, ít tan trong ethanol và chloroform,
dầu ete, benzen, benzene và carbodisulfide.

-

Điểm nóng chảy: 2100C [27]

b. Giá trị y dược

Rutin có tác dụng làm giảm sự dễ vỡ của các vi mạnh và giảm độ thẩm thấu của
mạnh máu, gia tăng sự bền chắc của mạnh máu do đó có tác động bảo vệ ngăn ngừa
huyết áp cao, cầm máu. Một số nghiên cứu khoa học cho thấy rutin có tác dụng bảo

Trần Chấn Đại

Trang 7


Chương 1.Tổng quan tài liệu

vệ cơ thể chống lại tác hại của asbestos, giúp cơ thể chống tác dụng gây hại cho tế
bào của LDL đã bị oxy hóa, bảo vệ bao tử chống tác động của ethanol. Khi dùng
thêm trong chế độ ăn uống, Rutin cho thấy có tác dụng bảo vệ DNA chống lại các
hư hại gây bởi các hóa chất gây ung thư gan. Ngoài ra rutin còn được dùng chung với
trysin và bromelain để trị sưng xương khớp (osteoarthritis), bệnh nhân bị sưng và đau
đầu gối loạn osteoarthritis.
Các hợp chất rutin, hesperidinm quercitrin và naringin có tác dụng lâm sàng rõ
rệt trong điều trị, tăng tính thấm thành mạch, dễ bị vết thăm bằm dưới da, tró và các
trường hợp giãn mạch. Dịch trích hoa hòe có chứa thành phần rutin có tác dụng hạ
triglycerid trong máu [20]
Ngoài ra hợp chất Rutin còn có tác dụng làm bền và giảm tính thấm của mao
mạch, tăng sự bền vững của hồng cầu, hạ thấp trương lực cơ và chống co thắt.
Trong điều trị bệnh, hợp chất rutin được chỉ định để tăng sức bền và giảm tính
thấm của mao mạch. Điều trị hội chứng chảy máu, xơ cứng, tăng huyết áp, ban
xuất huyết, chứng giãn tónh mạnh (phù, đau, nặng chân, bệnh tró…).
Rutin đươc xem là một chất chống oxy hóa, một chất thu nhặt các gốc tự do và là
một chất phức hóa sắt (Iron chelator). Khi thủy giảm Rutin thì được một genin là
Quercetin và phần tử glucose và một phần tử fhamnose. Quercetin cá tác dụng làm
chậm nhịp tim, gây giãn nỡ động mạnh vành và tăng thể tích tâm thu. Quercetin còn

có hoạt tính chống ung thư bằng cách ức chế sự tăng trưởng của một số dòng tế bào
ung thư như ung thư bao tử, ung thư máu. Liều tác động của Quercetin được ghi nhận
là 1-50mM. [27]

Trần Chấn Đại

Trang 8


Chương 1.Tổng quan tài liệu

1.2.3.2 Hợp chất Quercetin
a. Đặc điểm hóa lý [25]

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Quercetin.
-

Công thức phân tử : C15H10O7.

-

Trọng lượng phân tử: 302.236 g/mol.

-

Tỉ trọng: 1.799g/cm3

-

Nhiệt độ nóng chảy: 3160C.

Hình 1.7 Dạng glucoside của Quercitin.

b. Giá trị y dược
Quercetin thường có các tính chất đặc trưng của nhóm flavonoid. Nhiều cây
thuốc thường có hàm lượng quercetin rất cao. Quercetin được chứng minh là có khả
năng kháng viêm do có thể ức chế trực tiếp phản ứng viêm. Nó hạn chế cả hai quá

Trần Chấn Ñaïi

Trang 9


Chương 1.Tổng quan tài liệu

trình sản xuất và phát tán của histamine cũng như các chất gây viêm khác. Ngoài
ra, nó còn có tính chống oxy hóa và bảo vệ Vitamine không bị phân hủy.
Quercetin cũng cho thấy có tác dụng kháng tế bào ung thư. Trong nghiêm cứu
tại viện nghiêm cứu ung thư British Joural, khi điều trị tổng hợp lượng quercetin và
xử lý sóng âm 20kHz trong vòng 1 phút, tế bào ung thư da và tuyến tiền liệt chết
90% trong vòng 48h mà không có tác dụng gây chết đối với tế bào bình thường.
Trong những nghiên cứu gần đây, chất quercetin giúp đàn ông cảm thấy dể chịu
hơn trong các căn bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt, do nó ức chế các đại thực
bào. Quercetin có khả năng ngăn ngừa ung thư, tiến tiền liệt, bệnh tim, bệnh đục
nhãn mắt, dị ứng, viêm và các căn bệnh liên quan đế hô hấp như viêm cuống phổi
và hen suyễn.
Thức ăn giàu Quercetin gồm có cây Bạch Hoa (1800mg/Kg), Lovage
(1700mg/Kg) táo (440mg/kg), trà…Ngoài ra Quercetin còn được tiềm thấy trong
mật ong mà được lấy từ hoa cây Khuyên diệp và hoa trà. [9],[11]
Ngoài ra, quercetin còn có tính kháng sinh, tác dung hợp trợ với các chất

fluoroquinolone, quercetin gắn vào enzyme DNA gyrase của vi khuẩn vì thế ngăn
chặn khả năng phát triển của vi khuẩn.
Do Quercetin có khả năng chống oxy hóa Vitamin C, do nó tác dụng ức chế men
aldose reductase rất mạnh, mà chất này có tác dụng chuyển glucose thành sorbitol
- một chất có liên quan chặt chẽ với tiến triển của bệnh đái tháo đường và các biến
chứng của bệnh đái tháo đường (đục thủy tinh thể, thương tổn thần kinh, bệnh võng
mạc...)[17],[18],[21],[ 30]

Trần Chấn Đại

Trang 10


Chương 1.Tổng quan tài liệu

1.2.3.3 Hợp chất Kaempferol
a. Đặc điểm hóa lý[24]

Hình 1.8 công thức cấu tạo của Kaempferol
-

Tên khoa học: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one

-

Công thức phân tử : C15H10O6

-

Trọng lượng phân tử: 286.23 g/mol.

-

Tỉ trọng: 1.799g/cm3

-

Nhiệt độ nóng chảy: 276-2780C

Hình 1.9 Dạng glycoside của Kaempferol.

b. Giá trị y dược
Kaempferol là một flavonoid tự nhiên được cô lập từ trà, vi khuẩn Broccoli,

Delphinium, nước ép nho. Kaempferol có màu vàng khi ở nhiệt độ nóng chảy. Ít
tan trong nước nhưng tan nhiều trong ethanol nóng và diethyl ether.
Dạng glucoside của Kaempferol có ở 2 dạng kaemferitrin và astragalin .

Trần Chấn Đại

Trang 11


Chương 1.Tổng quan tài liệu

Kaempferol trong trà được chứng mình là có khả năng giảm thiểu các nguy cơ
tim mạch.
Kaempferol thường có nhiều trong hoa của cây Acacia decurrens và Acacia

longifolia [13].

1.2.3.4 Hợp chất Myricetin
a. Đặc điểm hóa lý [26]

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của chất Myricetin
-

Tên khoa học: 3,5,7-Trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4-chromenone

-

Tên gọi khác: Cannabiscetin, Myricetol, Myricitin.

-

Công thức phân tử : C15H10O8

-

Trọng lượng phân tử: 318.2351 g/mol.

Hình 1.11 Dạng glycoside của Myricetin.

b. Giá trị y dược
Myricetin là một lại flavonoid tự nhiên được tìm thấy trong nho, dâu, trái cây,
rau, các loài cỏ và trong các loại cây khác. Quả cây óc chó là nguồn cung cấp

Trần Chấn Đại

Trang 12

Chương 1.Tổng quan tài liệu

giàu Myricetin. Chất Myricetin được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa.
Nó thường được tìm thấy trong dạng glycoside như Myricitrin.
Trong các nhiên cứu in vitro, cho thấy Myrcicetin ở nồng độ cao có khả năng hỗ
trợ LDL cholesterol do làm tăng lượng tế bào bạch cầu. Và các nghiên cứu gần
đây cho thấy lượng Myricerin ở nồng độ cao có khả năng tiêu diệt các tế bào ung
thư tuyến tiền liệt. [16]
1.2.4 Một số đối tượng chứa hợp chất Flavonoid
- Dâm Dương Hoắc, tên khoa học là Epimedium brevicorum., E. Koreapum,.

E.sagitatum. Cây Dâm Dương Hoắc có chứa các hoạt chất glucoside, icariin,
noricariin, dầu thơm và một số acid béo, flavonol… Cây được sử dụng để điều trị
thiểu năng vành, viêm phế quản mãn, suy nhược thần kinh, cây có tác dụng sinh
học trên hệ tim mạch làm giãn mạch nên có tác dụng làm tăng cường lưu lượng
máu vành , giảm huyết áo. Cây có thể dùng dưới dạng chè thuốc và dùng lâu dài.
Ngoài ra, còn có tác dụng giảm ho, long đồm và kháng khuẩn.[28]
-

Bạch quả: còn có tên là Ngân hạnh. Lá Bạch quả có chức nhiều flavonoid

công hiệu đặc biệt là bisflavon và các heterrozit của flavon và flavonol. Hai chất
này có tính chất chống oxy hóa, do bắt các gốc tự do của võng mạc và não làm
chạm quá trình lão hóa của võng mạc, não và làm giảm các rối loạn liên quan đến
sự lão hóa, có tác dụng điều hoà tính thấm mao mạch, làm giãn mạch và làm giảm
tính nhớt của máu. Bạch quả được dùng để điều trị bệnh lão hóa não, cải thiện trí
nhớ và điều trị các rỗi loạn bằng cách can thiệp vào sự truyền dẫn thần kinh giác
quan, ngoài ra còn được dùng trong điều trị suy động mạch ngoại biên và rối loại
tuần hoàn. [22]

- Nụ cây Hoa Hòe, tên khoa học là Sophora japonica L., có chứa các hợp chất
sau: Quinolizidin (0-0.04%) như Cytisine, N-methyl cytisine, Matrine, Sophocarpine..
Flavonoids (1.75%) như Rutin (có thể đến 0.5%), Sophorine Các Polysaccharides
như galactomannans : thành phần của các galactomannan thay đổi tuỳ theo phương
pháp, dầu béo ( 6.9-12.1%), protein (17.2-23%) các chất khoáng Calcium,

Trần Chấn Đại

Trang 13


Chương 1.Tổng quan tài liệu

phosphoris, Potassiuma. Hoa Hòe có chức nhiều Rutin (có thể đến 34%) ngoài ra
còn có các saponin. Tác dụng của hoa hòe làm tăng lượng fibrinogen, tăng tiểu cầu,
có tác dụng chống ung thư cổ tử cung trên chuột liều lượng 60g/kg thể trọng. Có tách
dụng kháng sinh, chống lại các vi trùng lao

Mycobacterium tuberculosis,

Staphylococcus (đặc biệt là Staphylococ cus aureus đã kháng methicillin; chống siêu
vi trùng Coxsackievirus B3 (CVB3); ngoài ra còn có tác dụng chống loại nhịp tim
bằng cách làm chậm nhịp tim, gia tăng thời gian chuyển dẫn nới tim và gây giảm
phản ứng kích ứng cơ tim hoạt tính này không bị ảnh hưởng bởi atropin nor-betaadrenergic...[4]
- Diếp Cá Herba Houttuyniae, cây còn được gọi là cây dắp cá được dùng toàn
thân. Thành phần hóa học của cây gồm có quercitrin, và iso-quercitrin, tinh dầu_
đây là thành phần chủ yếu tạo mùi cho dược liệu, một số acetaldehyd, alcaloid…
Cây có tác dụng kháng nhiều loại virus đã dược nhiên cứu, thành phần có tác dụng
là quercitrin và tinh dầu. Cây còn có tác dụng kháng viêm, thông tiểu, làm bền
thành mạch của quercitrin. Trong dân gian người ta dùng cây diếp cá để trị đau mắt

có tụ máu, bệnh tró (chiết lấy nước uống và rữa), ngoài ra Diếp cá còn là nguồn cung
cấp Vitamin P tốt cho cơ thể. [4]
-

Cây Actisô Folium Cynarae, Bộ phận dùng thuốc là lá và hoa của Actisô.

Chất Cynarin được coi là hoạt chất chính của cây, ngoài ra còn có các thành phần có
công dụng khác như các flavonoid luteolin, cynarosid và cynatriosid. Tác dụng dược
lý: Cây được dùng từ lâu để chữa các bệnh sỏi bàng quan, phù thủng, các bệnh về
gan. Tác dụng tăng tiết mật (được chứng minh năm 1931), nhiều công trình nghiên
cứu chứng minh tác dung phục hồi tế bào gan, tăng chức năng chống chất độc của
gan, phòng ngừa bệnh xơ vữa động mạch, làm hạ cholesterol, thông tiểu. [4]

Trần Chấn Đại

Trang 14


Chương 1.Tổng quan tài liệu

1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU NHẬN HP CHẤT THỨ CẤP
1.3.1 Lịch sử nghiên cứu
-

Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra ý kiến cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể,

trong ống nghiệm (in vitro) đã được thử nghiệm nhưng không được thành công
-

do dùng tế bào quá chuyên biệt.

- Năm 1919 Mô động vật được A.Carrel cấy trước tiên. Đến năm 1934 mô thực
vật được cấy thành công.
- Năm 1934 White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc
nuôi cấy tế bào rễ cà chua
- Năm 1947, James đã tiến hành nuôi cấy tế bào và một vài cơ quan của thực vật
để thu nhận alkaloid.
- Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự
nhân chồi.[6]
- Năm 1959, Tulecke, Nike đã thành công trong việc nuôi huyền phù tế bào cây
thuốc lá trong các bình phản ứng sinh học với dung tích 10lít. sau đó Noguchi và
các cộng tác đã phát triển dung tích bình sinh học lên đến 20.000 lit với việc sử
dụng hệ thống khuấy trộn. Cùng năm, Zaitin đã dùng kỳ thuật phân tách tế bào
bằng các enzyme và thu nhận được các tế bào sống từ cây thuốc lá.
- Từ năm 1960-1970, các nhà khoa học Nhật bản chủ yếu nghiên cứu các điều
kiện nuối cấy, trong đó các điều kiện tự động và ảnh hưởng cá loại muối dinh
dưỡng được đặc biệt chú ý.
- Năm 1962, Muashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một
bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường này được dùng làm môi trường
cơ bản cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn được sử dụng rộng rãi cho đến nay.
- Từ năm 1960-1964, Mỏel cho rằng có thể nhân giống vơ tính lan bằng ni cấy
đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó lan được xem là cây ni cấy mơ đầu tiên được
thương mại hóa
- Từ những năm 1970, các nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc thu
nhận hàng loại các sản phẩm trao đổi chất thứ cáp phục vụ cho sản xuất các dược
phẩm.

Trần Chấn Đại

Trang 15