Nghiên cứu tổng hợp hydrazinocurcumin và isoxazolcurcumin khảo sát một số hoạt tính sinh học của chúng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-----

LÊ XUÂN TIẾN

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
HYDRAZINOCURCUMIN và ISOXAZOLCURCMIN
- KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ HỐ HỌC

LUẬN VĂN THẠC SỸ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12 NĂM 2008


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Cán bộ hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA
TS. PHAN THANH SƠN NAM

Cán bộ chấm nhận xét 1:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẠNH

Cán bộ chấm nhận xét 2:
TS. PHẠM THÀNH QUÂN

Luận văn được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SỸ,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm 2008.


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Tp.HCM, ngày

tháng

năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SỸ
Họ và tên học viên: LÊ XUÂN TIẾN
Ngày tháng năm sinh: 13/04/1983

Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh

Chun ngành: CƠNG NGHỆ HOÁ HỌC

MSHV: 00506100

I. TÊN ĐỀ TÀI
Nghiên cứu tổng hợp hydrazinocurcumin và isoxazolcurcumin –
Khảo sát một số hoạt tính sinh học của chúng
II. NHIỆN VỤ VÀ NỘI DUNG

ƒ

Phân lập curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin từ hỗn hợp curcuminoid trích từ
củ nghệ vàng Curcuma longa L.

ƒ

Nghiên cứu, so sánh hoạt tính kháng oxy hoá, kháng nấm, kháng khuẩn và kháng ung thư của
từng thành phần curcuminoid.

ƒ

Tổng hợp hydrazinocurcumin, isoxazolcurcumin.

ƒ

Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hoá, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư của dẫn xuất
hydrazinocurcumin, isoxazolcurcumin tổng hợp được; so sánh với hoạt tính của curcumin.

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV. NGÀY HỒN THÀNH NHIỆM VỤ:
V. HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
PGS. TS. TRẦN THỊ VIỆT HOA
TS. PHAN THANH SƠN NAM
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

Nội dung và đề cương luận văn thạc sỹ đã được Hội đồng Chuyên ngành thơng qua.
Ngày

PHỊNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

tháng

năm 2008

KHOA QUẢN LÝ NGÀNH


Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn chân thành đến PGS. TS. Trần Thị Việt Hoa, TS. Phan
Thanh Sơn Nam, ThS. Phan Thị Hoàng Anh đã tận tình hướng dẫn và hỗ trợ phần lớn
kinh phí giúp tơi hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn chân thành đến KS. Nguyễn Thị Mạc Phượng, KS. Lâm
Thanh Xuyên, KS. Phạm Thị Thanh Tuyền, KS. Phan Chu Thuỳ Đoan, KS. Lê Thị Minh
Hoài đã nhiệt tình hỗ trợ tơi trong q trình thực nghiệm; và gửi lời cám ơn đến các thầy
cô, anh chị trong Bộ môn Kỹ Thuật Hữu cơ đã ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực hiện luận văn.
Cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên hỗ trợ tơi hồn thành luận văn này.


TĨM TẮT

TĨM TẮT
Curcuminoid trích ly từ củ nghệ vàng (Curcuma longa L.) là hỗn hợp 3 thành phần gồm
curcumin, demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC). Trong luận
văn này, các thành phần curcuminoid được phân lập và nghiên cứu hoạt tính kháng oxi
hoá, kháng nấm, kháng khuẩn và kháng ung thư. Curcuminoid và curcumin thể hiện hoạt
tính kháng oxi hố (theo phương pháp quét gốc tự do DPPH và xác định hàm lượng
malonyl dialdehyde - MDA) hơn DMC, BDMC và chất đối chứng trolox. Curcuminoid

thể hiện khả năng kháng yếu với vi nấm Candida albicans (MIC = 250 µg/ml) và 2 chủng
vi khuẩn Streptococcus haemolyticus (MIC = 250 µg/ml), Staphylococcus aureus (MIC =
62.5 µg/ml); DMC kháng yếu với vi nấm Candida albicans (MIC = 250 µg/ml) và vi khuẩn
Staphylococcus aureus (MIC = 250 µg/ml). Các thành phần curcuminoid cịn thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào ung thư gan dòng Hep-G2 và tế bào ung thư màng tim dòng RD
(ngoại trừ curcumin khơng có hoạt tính gây độc tế bào RD).
Trong luận văn này, hai dẫn xuất hydrazinocurcumin (HC) và isoxazolcurcumin (IOZ)
được tổng hợp, đánh giá hoạt tính sinh học và so sánh với hoạt tính sinh học của
curcumin. HC, IOZ và curcumin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng Hep-G2
với IC50 lần lượt là 1.556, 1.919, 2.919 µg/ml. Trong đó, HC có hoạt tính gây độc tế bào
ung thư gan dòng Hep-G2 cao gấp 2 lần so với curcumin. Bên cạnh đó, HC và IOZ cịn
thể hiện hoạt tính kháng oxi hố cao hơn chất đối chứng trolox.

i


ABSTRACT

ABSTRACT
Curcuminoids extracted from yellow turmeric (Curcuma longa L.) is a mixture of 3
constituents: curcumin, demethoxycurcumin (DMC) and bis-demethoxycurcumin
(BDMC). In this thesis, these constituents were separated and comparatively studied some
anti-oxidant, anti-bacterial, anti-fungal and anti-cancer acvitities. Curcuminoids and
curcumin exhibited stronger anti-oxidant capacities (DPPH scavenging and malonyl
dialdehyde-MDA methods) than DMC, BDMC and the reference anti-oxidant, trolox.
Meanwhile, curcuminoids showed the anti-bacterial, anti-fungal properties against
Staphylococcus aureus (MIC = 62.5 µg/ml), Streptococcus haemolyticus (MIC = 250
µg/ml), Candida albicans (MIC = 250 µg/ml), DMC had inhibitory against Streptococcus
haemolyticus (MIC = 250 µg/ml), Candida albicans (MIC = 250 µg/ml). Curcuminoids

and its three constituents also demonstrated good abilities in suppressing the proliferation
of Hep-G2 cell-line.
In this study, hydrazinocurcumin (HC) and isoxazolcurcumin (IOZ) were synthesized,
evaluated for their biological activities and compared with those of curcumin. HC, IOZ
and curcumin were inhibitory for Hep-G2 cell line at IC50 of 1.556, 1.919, 2.919 (µg/ml).
HC exhibited twofold higher anti-tumor potency against Hep-G2 than curcumin. Besides,
HC and IOZ also exhibited higher anti-oxidant activity greater than trolox.

ii


MỤC LỤC

MỤC LỤC
TÓM TẮT ..................................................................................................................................................... i
ABSTRACT ................................................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ................................................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG ..................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT............................................................................................................x
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................... xi
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................................................1
1.1.

Curcuminoid .....................................................................................................................................1

1.1.1.

Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid......................................................................................1

1.1.2.

Tính chất hố lý của curcumin ...................................................................................................3

1.1.2.1.

Tính chất vật lý ...................................................................................................................3

1.1.2.2.

Tính chất hố học ...............................................................................................................5

a. Phản ứng phân huỷ ............................................................................................................................5
b. Phản ứng cộng H2 ..............................................................................................................................6
c. Phản ứng imine hoá............................................................................................................................7
d. Phản ứng tạo phức ...........................................................................................................................10
e. Phản ứng của nhóm hydroxyl trên vịng benzene .............................................................................11
1.1.3.

Phân lập các dẫn xuất curcuminoid ..........................................................................................11

1.1.4.

Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất curcuminoid ....................................................................15

1.2.

1.1.4.1.

Hoạt tính kháng oxy hố ..................................................................................................15

1.1.4.2.

Hoạt tính kháng ung thư ...................................................................................................18

Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine curcuminoid ..........................................................19

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM ..................................................................................27
2.1.

Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................................................27

2.2.

Tiến trình thí nghiệm .....................................................................................................................27

2.3.

Phân lập curcumin, DMC, BDMC................................................................................................28

2.3.1.

Kết tinh lại ................................................................................................................................28

2.3.2.

Sắc ký cột tinh thể (1) ..............................................................................................................29

2.3.3.

Sắc ký cột cắn (2) .....................................................................................................................30

2.4.

Tổng hợp dẫn xuất hydrazinocurcumin.......................................................................................30

2.4.1.

Quy trình tổng hợp hydrazinocurcumin ...................................................................................30

2.4.2.

Tinh chế hydrazinocurcumin bằng sắc ký cột ..........................................................................32

2.5.

Tổng hợp isoxazolcurcumin ..........................................................................................................32
iii


MỤC LỤC
2.5.1.

Quy trình tổng hợp isoxazolcurcumin ......................................................................................32

2.5.2.

Tinh chế isoxazole bằng sắc ký cột ..........................................................................................34

2.6.

Phân tích cấu trúc ..........................................................................................................................34

2.6.1.

Đo điểm chảy ...........................................................................................................................34

2.6.2.

Phổ tử ngoại khả kiến ...............................................................................................................35

2.6.3.

Phân sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) các dẫn xuất curcuminoid ........................................35

2.6.4.

Phổ hồng ngoại .........................................................................................................................35

2.6.5.

Khối phổ ...................................................................................................................................35

2.6.6.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .....................................................................................................35

2.7.

Khảo sát hoạt tính sinh học ...........................................................................................................35

2.7.1.

Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH ...........................................35

2.7.2.

Đánh giá hoạt tính kháng oxy hố tiền in vivo – phương pháp MDA ......................................37

2.7.3.

Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn – phương pháp MIC ..........................................37

2.7.4.

Đánh giá hoạt tính kháng ung thư ............................................................................................38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................................................................................40
3.1.

Phân lập curcumin, DMC, BDMC................................................................................................40

3.1.1.

Kết tinh lại ................................................................................................................................40

3.1.2.

Kết quả sắc ký cột ....................................................................................................................42

3.1.3.

Nhận danh cấu trúc hố học .....................................................................................................44

3.1.3.1.

Tính chất vật lý đặc trưng của các dẫn xuất curcuminoid ................................................44

3.1.3.2.

Biện luận cấu trúc của curcumin ......................................................................................46

3.1.3.3.

Biện luận cấu trúc của bisdemethoxycurcumin ................................................................48

3.1.3.4.

Biện luận cấu trúc của demethoxycurcumin ....................................................................50

3.1.4.
3.2.

Kết luận ....................................................................................................................................52

Tổng hợp isoxazolcurcumin ..........................................................................................................52

3.2.1.

Tính chất vật lý đặc trưng của isoxazolcurcumin .....................................................................52

3.2.2.

Biện luận cấu trúc của isoxazolcurcumin .................................................................................53

3.3.

Tổng hợp hydrazinocurcumin.......................................................................................................56

3.3.1.

Tính chất vật lý đặc trưng của hydrazinocurcumin ..................................................................56

3.3.2.

Biện luận cấu trúc của hydrazinocurcumin ..............................................................................57

3.4.

Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học .............................................................................................61

3.4.1.

So sánh hoạt tính sinh học của các thành phần curcuminoid ...................................................61

3.4.1.1.

Hoạt tính kháng oxy hố ..................................................................................................61

a. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH ..................................................61
iv

MỤC LỤC
b. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hố tiền in vivo – phương pháp MDA ..............................................64
3.4.1.2.

Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................................................66

3.4.1.3.

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ..................................................................................67

3.4.1.4.

Kết luận ............................................................................................................................68

3.4.2.

Hoạt tính sinh học của isoxazolcurcumin và hydrazinocurcumin ............................................68

3.4.2.1.

Hoạt tính kháng oxy hố ..................................................................................................68

a. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH ..................................................68
b. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hố tiền in vitro – phương pháp MDA .............................................70
3.4.2.2.

Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................................................72

3.4.2.3.

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ..................................................................................73

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN ....................................................................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................................................76

PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc của các thành phần curcuminoid .......................................................... 1
Hình 1.2: Các đồng phân cis-keto, trans-keto, enol của curcumin...................................... 2
Hình 1.3: Đồng phân cis-trans-curcumin ............................................................................ 2
Hình 1.4: Q trình tautomer hố của các dẫn xuất curcuminoid ....................................... 3
Hình 1.5: Sự phân ly của curcumin theo pH ....................................................................... 4
Hình 1.6: Sự phân huỷ của curcumin trong mơi trường kiềm ............................................. 5
Hình 1.7: Phản ứng cộng H2 của curcumin ......................................................................... 7
Hình 1.8: Cơ chế phản ứng imine hố ................................................................................. 7
Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và hydroxylamine vào
pH môi trường ..................................................................................................................... 8
Hình 1.10: Cấu trúc dẫn xuất base Schiff của curcumin ..................................................... 9
Hình 1.11: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcumin .................................... 9
Hình 1.12: Cơ chế phản ứng tổng hợp dẫn xuất isoxazole từ pentane-2,4-dione và
hydroxylamine ................................................................................................................... 10

Hình 1.13: Phức curcumin với kim loại ............................................................................ 10
Hình 1.14: Phản ứng của curcumin với gốc tự do ............................................................. 11
Hình 1.15: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và curcumin ............................ 13
Hình 1.16: 1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene3,5-dione; 1,7-bis(4methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione ; 1,7-diphenyl-1,6-heptadiene-3,5-dione ...... 16
Hình 1.17: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của curcumin ............................................ 17
Hình 1.18: Cơ chế quét cation gốc ABTS•+ của curcumin ................................................ 18
Hình 1.19: Cơ chế quét gốc tự do của curcuminsemicarbazone ....................................... 21
Hình 1.20: Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin .......................................................... 21
Hình 1.21: Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin .............................................. 22
Hình 1.22: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinocurcumin với các chủng tế bào ung thư
khác nhau ........................................................................................................................... 23
vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG

Hình 1.23: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine của curcumin ............................... 24
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập curcumin, DMC, BDMC .......................................................... 28
Hình 2.2: Cột sắc ký và TLC các phân đoạn sau chạy cột ................................................ 30
Hình 2.3: Quy trình tổng hợp hydrazinocurcumin ............................................................ 31
Hình 2.4: Quy trình tổng hợp isoxazolcurcumin ............................................................... 33
Hình 2.5: Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hố .................................. 36
Hình 3.1: Kết quả TLC của curcuminoid ban đầu, hỗn hợp kết tinh lần 1, kết tinh lần 2,
kết tinh lần 3 ...................................................................................................................... 41
Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của mẫu curcuminoid ban đầu và tinh thể sau 3 lần kết tinh 41
Hình 3.3: TLC các phân đoạn sau chạy cột ....................................................................... 43
Hình 3.4: Curcumin; DMC; BDMC .................................................................................. 44
Hình 3.5: Sắc ký đồ HPLC của curcumin; DMC; BDMC ................................................ 45
Hình 3.6: Phổ UV-vis (trong ethanol) của curcumin; DMC; BDMC ............................... 45
Hình 3.7: Curcumin, C21H20O6 (M=368) ......................................................................... 47

Hình 3.8: Bisdemethoxycurcumin, C19H16O4 (M=308) .................................................... 49
Hình 3.9: Demethoxycurcumin, C20H18O5 (M=338) ......................................................... 50
Hình 3.10: Isoxazolcurcumin và TLC của Isoxazolcurcumin ........................................... 52
Hình 3.11: Phổ UV-vis (trong ethanol) của isoxazolcurcumin ......................................... 53
Hình 3.12: Isoxazolcurcumin, C21H19O5N (M=365) ......................................................... 54
Hình 3.13: Hydrazinocurcumin và TLC của hydrazinocurcumin ..................................... 56
Hình 3.14: Phổ UV-vis (trong ethanol) của hydrazinocurcumin ...................................... 57
Hình 3.15: Hydrazinocurcumin, C21H2004N2 (M=364) ..................................................... 58
Hình 3.16: Hoạt tính kháng oxy hố của curcuminoid, curcumin, DMC, BDMC xác định
theo phương pháp DPPH ................................................................................................... 62
Hình 3.17: Hoạt tính kháng oxy hoá của curcuminoid, curcumin, DMC, BDMC xác định
theo phương pháp MDA .................................................................................................... 65
Hình 3.18: Hoạt tính kháng oxy hoá của isoxazolcurcummin, hydrazinocurcumin,
curcumin xác định theo phương pháp DPPH ................................................................... 69

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG

Hình 3.19: Hoạt tính kháng oxy hoá của isoxazolcurcummin, hydrazinocurcumin,
curcumin xác định theo phương pháp MDA .................................................................... 71
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất curcuminoid ............................................ 3
Bảng 1.2: Kết quả phổ H1NMR của các dẫn xuất curcuminoid ........................................ 13
Bảng 1.3: Kết quả phổ C13NMR của các dẫn xuất curcuminoid ....................................... 14
Bảng 1.4: Giá trị IC50 của các dẫn xuất curcuminoid, hydrazinocurcuminoid,
hydrazinobenzoyl curcuminoid đối với tế bào BAEC ...................................................... 22
Bảng 1.5: Khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư sau 72 giờ xử lý ........................ 25
Bảng 1.6: Hoạt tính kháng ký sinh trùng Plasmodium falciparum ................................... 25

Bảng 3.1: Kết quả quá trình kết tinh curcuminoid 3 lần trong dung mơi methanol:nước 40
Bảng 3.2: Kết quả tính HPLC của hỗn hợp curcuminoid.................................................. 42
Bảng 3.3: Kết quả định lượng phần tinh thể sau 3 lần kết tinh ......................................... 42
Bảng 3.4: Kết quả định lượng phần nước cái sau 3 lần kết tinh ....................................... 43
Bảng 3.5: Tính chất vật lý đặc trưng của các dẫn xuất curcuminoid ................................ 46
Bảng 3.6: Dữ liệu phổ NMR của curcumin ....................................................................... 48
Bảng 3.7: Dữ liệu phổ NMR của bisdemethoxycurcumin ................................................ 49
Bảng 3.8: Dữ liệu phổ NMR của demethoxycurcumin ..................................................... 50
Bảng 3.9: Tính chất vật lý đặc trưng của isoxazolcurcumin ............................................. 53
Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR của isoxazolcurcumin ....................................................... 55
Bảng 3.11: Tính chất vật lý đặc trưng của hydrazinocurcumin ........................................ 57
Bảng 3.12: Dữ liệu phổ NMR của hydrazinocurcumin..................................................... 58
Bảng 3.13: Kết quả phổ NMR của hydrazinocurcumin theo tài liệu ............................... 59
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hố của các thành phần curcuminoid
theo phương pháp DPPH ................................................................................................... 61
Bảng 3.15: Hoạt tính kháng oxy hố của vitamin C theo phương pháp DPPH ................ 62
Bảng 3.16: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố DPPH ....................... 63
viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BẢNG

Bảng 3.17: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hố của các thành phần curcuminoid
theo phương pháp MDA .................................................................................................... 64
Bảng 3.18: Hoạt tính kháng oxy hoá của trolox theo phương pháp MDA ....................... 64
Bảng 3.19: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA ........................ 65
Bảng 3.20: Kết quả xác định giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư
của curcumin, DMC, BDMC, hỗn hợp curcuminoid với 2 dòng tế bào Hep-G2 và RD .. 66
Bảng 3.21: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml mơi trường) của các thành phần
curcuminoid đối với một số chủng vi khuẩn, vi nấm ........................................................ 67

Bảng 3.22: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hố của isoxazolcurcumin (IOZ),
hydrazinocurcumin (HC), curcumin theo phương pháp DPPH ........................................ 68
Bảng 3.23: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố DPPH ....................... 69
Bảng 3.24: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hoá của isoxazolcurcumin (IOZ),
hydrazinocurcumin (HC), curcumin theo phương pháp MDA ......................................... 70
Bảng 3.25: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố MDA ........................ 71
Bảng 3.26: Kết quả xác định giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của
isoxazolcurcumin (IOZ), hydrazinocurcumin (HC), curcumin với 3 dòng tế bào Hep-G2,
Lu và RD ........................................................................................................................... 72
Bảng 3.27: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml mơi trường) của isoxazolcurcumin,
hydrazinocurcumin và curcmin đối với một số chủng vi khuẩn, vi nấm .......................... 73

ix


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
Cur

: Curcumin

DMC

: Demethoxycurcumin

BDMC

: Bisdemethoxycurcumin

HC

: Hydrazinocurcumin

IOZ

: Isoxazolcurcumin

OD

: Mật độ quang

HTCO

: Hoạt tính kháng oxi hố

IC50

: Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc
gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration)

IC70

: Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc
gốc tự do

MIC

: Nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát triển
của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration)

HPLC

: Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography)

IR

: Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MS

: Khối phổ (Mass spectrometry)

NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy)

TLC

: Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

x


MỞ ĐẦU

MỞ ĐẦU
Hỗn hợp curcuminoid thương mại trích lý từ củ nghệ vàng (Curcuma longa L.) gồm 3
thành

phần

curcumin,

demethoxycurcumin,

bisdemethoxycurcumin.

Hỗn

hợp

curcuminoid được dùng làm màu thực phẩm và dùng trong các bài thuốc dân gian từ rất
lâu. Curcuminoid đã được sử dụng như một vị thuốc dân gian để chữa một số bệnh như
bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh ngoài da, viêm loét dạ dày, phòng và chữa một số loại ung
thư… Curcuminoid tương đối trơ và không gây độc đối với người ngay cả khi dùng với
liều lượng lớn. Chính vì tính an tồn nên curcuminoid có nhiều tiềm năng sử dụng trong
dược phẩm. Những nghiên cứu gần đây chứng tỏ curcuminoid có nhiều hoạt tính sinh học
quan trọng như: kháng oxy hố; kháng viêm; kháng nhiều chủng tế bào ung thư như ung
thư vú, ung thư ruột kết…; làm lành vết thương; giảm cholesterol; chữa một số bệnh như
Alzheimer, đái tháo đường, HIV-AIDS…Tuy nhiên, đa số các công bố này chỉ tập trung
nghiên cứu hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminoid, chưa có nhiều nghiên cứu xác
định thành phần curcuminoid nào tạo nên hoạt tính sinh học của hỗn hợp curcuminoid.
Nhiều nghiên cứu gần đây cịn cho thấy curcumin có khả năng phản ứng với một số
amine tạo các imine, dẫn xuất imine như curcuminoxime, curcuminsemicarbazone,
curcuminthiosemicarbazone, các dẫn xuất pyrazole và isoxazole curcumin như
hydrazinocurcumin, hydrazinobenzoylcurcumin, isoxazolcurcumin... Trong đó các dẫn
xuất pyrazole và isoxazole curcumine rất được quan tâm vì các dẫn xuất này có hoạt tính
kháng một số dịng ung thư thường, ung thư đa kháng thuốc; kháng kí sinh trùng gây bệnh
sốt rét đa kháng thuốc… cao hơn nhiều lần so với curcumin. Với các hoạt tính sinh học

cao như vậy, các dẫn xuất pyrazole và isoxazole curcumin thể hiện tiềm năng được ứng
dụng như một loại thuốc chữa bệnh ung thư.
Trước các vấn đề nêu trên, luận văn này tập trung nghiên cứu tác dụng sinh học của từng
thành phần curcuminoid; hoạt tính kháng oxi hố, kháng ung thư, kháng nấm và kháng
khuẩn của hydrazinocurcumin và isoxazolcurcumin.

xi


TỔNG QUAN

Chương 1:

TỔNG QUAN
1.1.

Curcuminoid

1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid
Hỗn hợp curcuminoid là một trong những thành phần quan trọng, có nhiều hoạt tính q
được chiết từ củ nghệ vàng (Curcuma longa L.). Hỗn hợp curcuminoid có dạng bột màu
vàng và là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của củ nghệ [1].
Hỗn hợp curcuminoid bao gồm curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin
(hình 1.1). Trong đó, curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin chiếm
lần lượt khoảng 77%, 17%, 3% [1-4].

(1)

R1=R2=OCH3

(Cur)

(2)

R1=OCH3, R2=H

(DMC)

(3)

R1=R2=H

(BDMC)

Hình 1.1: Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [1]
(1) Curcumin:
Danh pháp quốc tế: 1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione.
Công thức phân tử: C21H20O6 (M=368 đvc).
(2) Demethoxycurcumin:
Danh pháp quốc tế: 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6diene-3,5-dione.
Công thức phân tử: C20H18O5 (M =338 đvc).
1


TỔNG QUAN

(3) Bisdemethoxycurcumin:
Danh pháp quốc tế: 1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione.
Công thức phân tử: C19H16O4 (M=308 đvc).
Curcuminoid có cấu trúc β-diketone vì vậy chúng có thể tồn tại dưới dạng đồng phân hình

học: s-cis-diketone hoặc s-trans-diketone và dạng đồng phân tautomer hố cis-enol (hình
1.2) [5].

Hình 1.2: Các đồng phân cis-keto, trans-keto, enol của curcumin [5]
Ngồi ra cịn curcuminoid cịn có các dạng đồng phân hình học khác như cis-trans (hình
1.3). Tuy nhiên các đồng phân này đều kém bền vì chúng có thế năng lớn do yếu tố cản
trở khơng gian.

Hình 1.3: Đồng phân cis-trans-curcumin [4]
Curcumin (hình 1.1) là đồng phân trans-trans-curcumin.

2


TỔNG QUAN

Trong các đồng phân trên thì đồng phân enol và s-cis-ketone là bền hơn cả. Ở dạng rắn
curcumin tồn tại dưới dạng ketone. Còn trong dung dịch, curcumin tồn tại dưới dạng cân
bằng enol-ketone đối xứng và ổn định (hình 1.4). Cân bằng giữa hai dạng này phụ thuộc
vào loại dung mơi, pH và nhiệt độ [6, 7].

Hình 1.4: Q trình tautomer hố của các dẫn xuất curcuminoid
Đồng phân enol bền hơn đồng phân ketone nhờ có sự hình thành liên kết nội phân tử và
phân tử ở dạng liên hợp. Cấu trúc enol hoàn toàn phẳng và cho phép có cộng hưởng với
hai vịng benzen [8].
1.1.2. Tính chất hố lý của curcumin
1.1.2.1.

Tính chất vật lý

ƒ Curcuminoid là chất màu cam huỳnh quang; tan trong chất béo, ethanol, methanol,
dichloromethane, acetone, acetic acid băng và hầu như không tan trong nước ở mơi
trường acid hay trung tính (độ tan <10µg/ml ở 25oC). Curcuminoid tan trong môi
trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ [1, 4, 9].
ƒ Dung dịch curcumin trong dung mơi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng từ
420-430nm [1].
Bảng 1.1: Các thơng số hố lý của các dẫn xuất curcuminoid [10]

Thông số

Đặc trưng
Curcumin

DMC

BDMC

Điểm chảy (oC)

184

172

222

UV-Vis λmax trong ethanol (nm)

429

424

419

3


TỔNG QUAN

Sự điện ly của curcumin (hình 1.5) khi nghiên cứu bằng kỹ thuật HPLC [4] cho kết quả
như sau:
ƒ pH<1: dung dịch curcumin có màu đỏ do curcumin ở trạng thái proton hoá H4A+.
ƒ pH=1-7: curcumin ở dạng trung tính H3A. Trong khoảng pH này, curcumin khó tan
trong nước và tạo huyền phù màu vàng.
ƒ pH>7.5: dung dịch curcumin có màu đỏ vì curcumin tồn tại dưới các dạng H2A-,
HA2-, HA3-.

Hình 1.5: Sự phân ly của curcumin theo pH [4]

4


TỔNG QUAN

1.1.2.2.

Tính chất hố học

a. Phản ứng phân huỷ
ƒ Phân huỷ trong môi trường kiềm
Nghiên cứu của Tonnesen và Karlsen [4] về sự phân huỷ của curcumin trong các môi

trường pH khác nhau bằng kỹ thuật HPLC cho thấy curcumin tương đối bền trong môi
trường acid nhưng lại bị phân huỷ nhanh chóng trong mơi trường kiềm. Ở pH 8.5, chỉ sau
5 phút curcumin đã bắt đầu bị phân huỷ. Đầu tiên, curcumin bị phân huỷ thành ferulic
acid và feruloylmethane. Sau đó, feruloymethane nhanh chónh ngưng tụ thành các chất
có màu vàng đến nâu. Bên cạnh đó, feruloymethane cịn bị phân huỷ thành vanillin và
aceton. Hình 1.6 mơ tả sự phân huỷ của curcumin trong môi trường kiềm.
O

O

HO

OH
OH-

OCH3

OCH3

OH-

O

O
HO

HO

OH
OCH3

OCH3

feruloyl methane

Sản phẩm ngưng

CHO

ferulic acid

O

HO
OCH3

acetone

vanillin

Hình 1.6: Sự phân huỷ của curcumin trong mơi trường kiềm [4]

5


TỔNG QUAN

Erika Pfeiffer và cộng sự [11] nghiên cứu sự phân huỷ của các thành phần curcuminoid
trong hệ đệm phosphate pH 7.4, 37oC trong điều kiện có và khơng có huyết thanh bào thai
bò. Kết quả cho thấy curcuminoid phân huỷ nhanh chóng trong điều kiện khơng có huyết

thanh (phân huỷ 90% trong 12 giờ ủ) và curcuminoid ổn định hơn trong điều kiện có
huyết thanh. Độ bền của các dẫn xuất curcuminoid là khác nhau, kém bền nhất là
curcumin, tiếp đến là demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin. Các curcuminoid
này bị phân huỷ tạo thành vanilin, ferulic acid, feruolymethane và trans-6-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal.
Nghiên cứu của Ying Jan Wang và cộng sự [12] cũng cho thấy curcumin phân huỷ 90%
sau 30 phút trong môi trường đệm phosphate pH 7.2, 37oC.
ƒ Phân huỷ dưới tác dụng của ánh sáng
Curcumin không bền ánh sáng. Khi tiếp xúc với ánh sáng, curcumin bị phân huỷ ngay cả
ở dạng rắn, và bị phân huỷ nhanh hơn khi ở trạng thái dung dịch. Khi có mặt oxy và ánh
sáng, curcumin phân huỷ tạo thành 4-vinylguaialcol và anilin [4].
b. Phản ứng cộng H2
Curcumin có thể phản ứng với 1, 2 hoặc 3 phân tử H2 tạo thành các dẫn xuất
dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin tương ứng (hình 1.7), các
sản phẩm này cũng là các chất kháng oxy hoá [13, 14].

6


TỔNG QUAN

HO

OH

H3CO

+ H2
Ni (PtO2)

OCH3

O

H

HO

OH

H3CO

O

OCH3
O

O

H
dihydrocurcumin
HO

OH

H3CO

OCH3
O

O

H
tetrahydrocurcumin

HO

OH

H3CO

OCH3
O
OH
hexahydrocurcumin

Hình 1.7: Phản ứng cộng H2 của curcumin
c. Phản ứng imine hoá
Curcumin là hợp chất diketone nên có thể cho với các amin bậc nhất (RNH2),
hydroxylamine (NH2OH), hydrazine (NH2-NH2), semicarbazide (NH2NHCONH2) … để
tạo thành các dẫn xuất imine (base Schiff) hoặc dẫn xuất imine tương ứng [15-18].
Cơ chế phản ứng imine hố được trình bày ở hình 1.8.

Hình 1.8: Cơ chế phản ứng imine hố [15]
7


TỔNG QUAN

Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên tử nitrogen
của amine vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm carbonyl.
Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thơng thường, hình thành hợp chất trung

gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxide và cation ammonium. Hợp chất trung
gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian bền hơn là carbinolamin. Phản ứng
này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho cân bằng chuyển dịch về phía tách
nước từ hợp chất trung gian carbinolamine, sinh ra dạng proton hoá của imine hoặc các
dẫn xuất của imine. Cuối cùng là giai đoạn tách proton, hình thành sản phẩm là imine
hoặc các dẫn xuất của imine [15, 17].
Trong cơ chế của phản ứng imine hố, pH của mơi trường đóng vai trị quan trọng. Nếu
mơi trường phản ứng q acid, tồn bộ amine bị proton hố. Các amine bị proton hố
khơng có tính ái nhân nên chúng khơng phản ứng với các nhóm ketone. Ngược lại, giảm
mơi trường acid sẽ làm giảm q trình tách nước tạo imine. Điều kiện pH thích hợp cho
phản ứng imine hố là khoảng pH~4.5 [16]. Hình 1.9 mô tả sự phụ thuộc của tốc độ phản
ứng giữa acetone và hydroxylamine vào pH mơi trường phản ứng.

Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và hydroxylamine vào
pH môi trường [16]
8


TỔNG QUAN

Hình 1.10: Cấu trúc dẫn xuất base Schiff của curcumin
Curcumin cũng là hợp chất β-diketone nên ngoài khả năng tạo các imine (hình 1.10) và
dẫn xuất imine, curcumin cịn có thể tạo các hợp chất dị vịng khác nhau [19-21]. Hiện
nay có một số nghiên cứu tổng hợp các hợp chất dị vòng của curcumin như dị vòng
pyrazole, isoxazole curcumin (hình 1.11) [22-25]. Cơ chế của các phản ứng này tương tự
như phản ứng imine hố thơng thường.

Hình 1.11: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcumin
Hình 1.12 mô tả cơ chế phản ứng tổng hợp dẫn xuất isoxazole từ pentane-2,4-dione và
hydroxylamine. Phản ứng xảy ra thông qua giai đoạn hình thành hợp chất oxime để đóng

vịng.

9


TỔNG QUAN

Hình 1.12: Cơ chế phản ứng tổng hợp dẫn xuất isoxazole từ pentane-2,4-dione và
hydroxylamine [26]
d. Phản ứng tạo phức
Curcumin tồn tại dạng hỗ biến β-diketone và keto-enol bền nên curcumin có khả năng
phản ứng tạo phức mạnh với các ion kim loại chuyển tiếp như Fe3+, Mn2+, Cu2+, Co2+,
Ni2+,…[27-33].

Hình 1.13: Phức curcumin với kim loại
(a) Phức 1-2

(b) Phức 1-1
10

(M) Kim loại