Nghiên cứu ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa lên quá trình thu nhận pepsin và khảo sát một số đặc tính của chế phẩm thu được

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRANG THÀNH LỄ

ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NHÂN
TỐ KẾT TỦA LÊN QUÁ TRÌNH THU NHẬN
PEPSIN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC

LUẬN VĂN CAO HỌC
CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

NĂM 2002


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

PHẦN I - TỔNG QUAN

1.

HỆ ENZYM PROTEASE

1

1.1.

1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.2.6
1.2.7

Phân loại heä enzym protease
Protease – serine
Protease – cysteine
Protease – metalo
Protease – aspartic
ng dụng của một số protease
Trong công nghiệp thịt
Trong công nghiệp sữa
Trong công nghiệp da
Trong sản xuất tơ tằm
Trong sản xuất các chất tẩy rửa
Trong mỹ phẩm
Trong y học

1
3
3

4
4
6
6
6
6
7
7
7
7

2.

PEPSIN

8

2.1.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.

Lịch sử – nguồn gốc của pepsin
Đặc tính của pepsin và pepsinogen
Tính chất vật lý
Thành phần hóa học và cấu trúc phân tử của pepsin và
pepsinogen
Thành phần hóa học
Cấu trúc phân tử
Sự hoạt hoạt hóa pepsinogen thành pepsin

Tính đặc hiệu thủy phân cuûa pepsin

8
8
8

2.2.2.1
2.2.2.2
2.2.3
2.2.4

9
9
11
13
14


2.2.5
2.2.5.1
2.2.5.2
2.2.6
2.3
2.4
2.4.1.
2.4.2.
2.4.3.

nh hưởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, chất hoạt hóa, chất kiềm
hãm lên pepsin và pepsinogen

nh hưởng của pH
nh hưởng của nhiệt độ
nh hưởng của chất hoạt hóa, chất kiềm hãm
Thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ dày động vật
Ứng dụng của pepsin
Trong công nghiệp thực phẩm
Trong nông nghiệp
Trong y học và dược phẩm

16
16
17
18
19
20
20
20
21

3.

PEPTON

21

3.1
3.2
3.3
3.4
3.5

Khái niệm về pepton
Phân loại pepton
Tính chất của pepton
Các dẫn xuất pepton
Ứng dụng của pepton

21
22
22
23
23

4

PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH ENZYM – LỌC GEL

24

4.1
4.2
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3

Nguyên lý lọc gel
Tính chất của gel
Ứng dụng của sắc ký lọc gel
Loại muối

Tách các chất có trọng lượng phân tử khác nhau
Cô đặc

24
25
27
27
27
27

PHẦN II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1.

NGUYÊN LIỆU

28

1.1.
1.2.

Nguyên liệu để thu enzym – dạ dày heo
Nguyên liệu dùng trong xác định hoạt tính của pepsin theo
Dược điển Việt Nam và sản xuất pepton

28
28


1.3.

Các hóa chất thí nghiệm

28

2.

THIẾT BỊ SỬ DỤNG

29

3.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

30

3.1.
3.2.
3.2.
3.3.
3.3.1
3.3.2

Sơ đồ nghiên cứu
Phương pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm pepsin
Phương pháp sản xuất pepton
Phương pháp tinh sạch enzym
Phương pháp thẩm tích
Phương pháp lọc qua gel sephadex

30
30
33
35
35
35

4.

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

37

4.1
4.1.1
4.1.2
4.2
4.3
4.4
4.4.1
4.4.2
4.5

Phương pháp xác định hoạt tính enzym pepsin
Phương pháp theo Dược điển Việt Nam
Phương pháp Anson cải tiến
Phương pháp xác định hoạt tính đông tụ sữa
Phương pháp định lượng protein theo Lowry
Xác định nitơ tổng theo phương pháp Kjeldahl

Vô cơ hóa
Chưng cất đạm
Xác định nitơ amin theo phương pháp Nihydrin

37
37
38
40
41
42
42
43
45

PHẦN III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1.

KHẢO SÁT TỶ LỆ % TRỌNG LƯNG MÀNG NHÀY SO VỚI TOÀN
BỘ DẠ DÀY
47

2.

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC TÁC NHÂN KẾT TỦA
HIỆU SUẤT THU HỒI CHẾ PHẨM PEPSIN

LÊN
47

2.1
2.2

Kết tủa pepsin bằng cồn tuyệt đối (99,9%)
Kết tủa pepsin bằng aceton

49
50


2.3
2.4
2.5

Kết tủa pepsin bằng izopropanol
Kết tủa pepsin bằng polyetylenglycol 6000 (PEG 6000)
Kết tủa pepsin bằng muối natri clorua và amonsulfat

52
54
56

3

HOẠT TÍNH CHẾ PHẨM PEPSIN THEO DƯC ĐIỂN
NAM

VIỆT
62

4

HOẠT TÍNH ĐÔNG TỤ SỮA

63

5

ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐÔÄ VÀ PH ĐẾN HOẠT TÍNH
CỦA CHẾ PHẨM PEPSIN

64

5.1
5.2

nh hưởng của nhiệt độ
nh hưởng của pH

64
68

6

KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA CHẾ PHẨM PEPSIN
LỌC KHI QUA CỘT GEL SEPHADEX G-75

73

7

BƯỚC ĐẦU THỬ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM PEPSIN THU
TRONG SẢN XUẤT PEPTON

PHẦN IV - KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐƯC
76


Pepsin là enzym protease chủ yếu trong dịch vị dạ dày của động vật có vú trưởng
thành. Trong màng nhầy dạ dày, pepsin tồn tại ở dạng không hoạt động, gọi là
pepsinogen. Để trích ly enzym pepsin từ màng nhầy dạ dày, chúng tôi ngâm màng
nhầy dạ dày đã được xay nhuyễn trong dung dịch acid clohydric 0,5% ở nhiệt độ 40 –
45 oC trong 24 giờ.
Chúng tôi sử dụng cồn tuyệt đối, aceton, izopropanol, PEG 6000, muối natri clorua,
muối amôn sulfat để kết tủa enzym. Các tác nhân này cho hiệu suất thu hồi enzym
lần lượt là 89,9; 72,1; 81,7; 37,8; 77,1; 89,1% và phần trăm protein bị kết tủa tương
ứng 32?%. Chế phẩm pepsin thu được có pH tối ưu bằng 2,0 ở nhiệt độ 35oC và bền
trong khoảng pH từ 2,0 đến 5,0 ở nhiệt độ phòng nhưng khi pH lớn hơn 6,0 hoạt tính
pepsin giảm đi nhanh chóng. Ngoài ra chế phẩm có nhiệt độ tối ưu bằng 55oC ở pH
2,0 và không bền ở nhiệt độ lớn hơn 55oC. Chế phẩm pepsin sau khi kết tủa bằng
cồn tuyệt đối, được cho qua cột gel sephadex G-75 (1,8 x 80 cm). Kết quả thu được
ba peak, trong đó chỉ có peak thứ hai gồm 10 phân đoạn có hoạt tính protease ở pH
bằng 2,0 với cơ chất là hemoglobin và hiệu suất thu hồi enzym sau khi qua cột là
84,5%. Sử dụng chế phẩm pepsin để thủy phân hai cơ chất là thịt bò và cá thát lát.
Sản phẩm pepton thu được có tỷ lệ Namin/Ntổng lần lượt là 15,4 và 14,7%.

Abstract

Pepsins (EC 3.4.23) are the principal proteases in gastric secretions of adult
mammals such as beef, swine, chicken, etc... They are members of the family of
aspartic protease. In the stomach, they exist in inactived form, called pepsinogen.
In order to extract pepsin, minced porcine gastric mucosa is

steeped in 0,5%

hydrochloric acid solution in 24 hours at 40 - 45oC.

Absolute alcohol, aceton, izopropanol, polyetylenglycole 6000, sodium chloride and
amonium sulfate were used for precipitating enzyms. Retrieving productivity of
those are 89,9; 72,1; 81,7; 37,8; 77,1; 89,1%, respectively.

Result of studying

characteration of pepsins showed that maximal hemoglobin – digestive activity at
around pH 2,0 at 35oC. They are stable at the range of pH between 2,0 and 5,0 at
the room temperature but at pH values above 6,0 activity of pepsins is decreased
rapidly. Besides the pepsin optimum temperature is around 55oC at pH 2,0 and they
are unstable at temperature above 55oC. Precipitated pepsins by absolute alcohol
were gel-filtered on a Sephadex G-75 (1,8 x 80 cm). Three peaks were detected but
only the second peak showed proteolitic activity against hemoglobin at pH 2,0.
Retrieving productivity of enzym is 84,5%. Pepsin have been used for hydrolysing
protein subtracts include beef and fish.

The ratio of a-amino nitrogen per total

nitrogen of Peptons from beef and fish are 15,4 and 14,7%, respectively.

MỞ ĐẦU

Nước ta là nước nông nghiệp, có tiềm năng về chăn nuôi gia súc, gia cầm. Vì vậy nguồn phụ
phế phẩm từ các lò mổ, đặc biệt là các cơ quan nội tạng rất dồi dào và các cơ quan này chứa
nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, có giá trị sử dụng cao hơn nhiều so với việc dùng
chúng làm thực phẩm.

Trong số các hợp chất này phải kể đến các enzym tiêu hóa mà tiêu biểu là enzym
pepsin. Trong dạ dày, pepsin tồn tại trong màng nhầy dưới dạng không hoạt động,
gọi là pepsinogen. Khi gặp môi trường acid chúng sẽ chuyển hóa thành enzym
pepsin. Hiện nay pepsin được ứng dụng trong nhiều lónh vực như công nghệ thực
phẩm, nông nghiệp, y học và dược phẩm. Do đó để nâng cao giá trị sử dụng của dạ
dày, việc nghiên cứu tách chiết, thu nhận enzym pepsin và ứng dụng chúng vào sản
xuất là điều cần thiết.
Trong những năm gần đây, cũng có một vài nghiên cứu về việc tách chiết pepsin
nhưng chủ yếu tập trung vào việc tối ưu hóa các thông số của quá trình tự phân màng
nhầy dạ dày nhằm giải phóng và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin (Nguyễn Thị
Quỳnh Anh, 1985; Vũ Ngọc Bội, 1999) và đây chỉ là một công đoạn trong đến quy
trình thu nhận enzym. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chủ yếu đi sâu khảo sát sự
ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa lên hiệu suất thu hồi enzym.


PHẦN I
I.

HỆ ENZYM PROTEASE [12][13][16][18]

Quá trình thủy phân protein đóng một vai trò quan trọng trong nhiều ngành sản

xuất công nghiệp. Hiện nay sự thủy phân protein thường được thực hiện bởi các
protease có trong bản thân nguyên liệu thực động vật; các enzym này cũng có thể
do vi sinh vật tiết ra hoặc được bổ sung vào môi trường phản ứng dưới dạng chế
phẩm enzym.
Protease là enzym xúc tác thủy phân liên kết peptid (-CO-NH-)

H2N-CH-CO -NH-CH-CO-...-NH-CH-COOH
R1

R2

H2O

Rx

H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO-...-NH-CH-COOH
R1

R2

Rx

amin [Ryle]pepsin>
1.1.

Phân loại hệ enzym protease [15][16][17]

Protease thuộc loại enzym thủy phân, căn cứ vào vị trí phân cắt trên mạch
polypeptide, người ta phân hệ này ra thành hai nhóm chính sau (Bảng – 1):

- Exopeptidase: chỉ có khả năng thủy phân các liên kết ở hai đầu mạch, kết quả
giải phóng lần lượt các acid amin cuối mạch.
- Endopeptidase: thủy phân các liên kết ở giữa mạch polypeptid, phân cắt các
phân tử protein có phân tử lượng lớn thành các polypeptide có phân tử lượng nhỏ
hơn.

2


Bảng 1 – Phân loại các enzym protease [18]
Mã số

EC 3.4.11
EC 3.4.13
EC 3.4.14
EC 3.4.15
EC 3.4.16

EC 3.4.17

EC 3.4.18

EC
EC
EC
EC

3.4.21
3.4.22
3.4.23

3.4.24

Nhóm enzym
Các exopeptidase

Chú thích
Thủy phân protein/peptid từng bước từ
hai đầu mạch (đầu amino và đầu
carboxyl)
Aminopeptidase
Thủy phân giải phóng một amino acid
từ đầu amino của mạch polypeptid
Dipeptidase
Thủy phân các dipeptid tạo ra 2
amino acid
Dipeptidyl và tripeptidyl Thủy phân các dipeptid, tripeptid từ
peptidase
đầu amino
Peptidyl-dipeptidase
Thủy phân các dipeptid từ đầu
carboxyl
Serine carboxypeptidase Thủy phân peptid giải phóng các
amino acid từ đầu carboxyl, có một
gốc serine ở trung tâm xúc tác
Metalo carboxypeptidase Thủy phân peptid giải phóng các
amino acid từ đầu carboxyl, có ion
Zn2+ và Co2+ ở trung tâm xúc tác
Cysteine
Thủy phân peptid giải phóng các
carboxypeptidase

amino acid từ đầu carboxyl, có một
gốc cysteine ở trung tâm xúc tác
Các endopeptidase
Thủy phân các liên kết của protein/
peptide tại các vị trí không phải ở các
đầu mạch.
Serine peptidase
Gốc serine ở trung tâm xúc tác
Cystein peptidase
Gốc cysteine ở trung tâm xúc tác
Aspartic peptidase
Hai gốc aspartic ở trung tâm xúc tác
Metalo peptidase
Các ion kim loại ở trung tâm xúc tác

Ngoài ra, nếu dựa vào acid amin ở trung tâm hoạt động của phân tử enzym người
ta phân hệ protease ra bốn nhóm nhỏ sau:

3


1.1.1 Protease – serine [16][18]
Những enzym thuộc nhóm này có khoảng pH hoạt động từ 7 – 10, hay gọi là các
protease kiềm.

Những enzym điển hình có nguồn gốc động vật như trypsin,

chymotrypsin, elastase, plasmin và thromin. Một số vi sinh vật cũng có thể sinh
tổng hợp được các enzym protease serine nhö Bacillus cereus, B. firmus, B.
licheniformis, B. subtilis, Streptomyces fradiae, Aspergillus flavus, A.oryzae, A.

sojae, v.v….
Ở trung tâm hoạt động của những enzym này có mặt của một gốc serine và một
gốc histidine. Các enzym này chủ yếu chỉ tấn công vào các liên kết peptide giữa
một số acid amin (các liên kết này được trình bày cụ thể ở bảng – 2)
Diisopropylflourophosphate (DIFP) hay phenylmethanesulfonylflouride (PMSF)
là những chất ức chế các enzym này do chúng làm acyl hóa bất thuận nghịch gốc
serine ở trung tâm hoạt động của các enzym. Ngoài ra những chất ức chế tự
nhiên được tìm thấy ở những cơ quan của động vật như tuyến tụy, lòng trắng
trứng, khoai tây và trong một số thực vật như hạt của nhiều cây họ đậu.
1.1.2 Protease – cysteine [16][18]
Có nhóm -SH của gốc cystein trong trung tâm hoạt động trực tiếp tham gia xúc
tác phản ứng thủy phân. Các enzym điển hình đại diện cho nhóm này bao gồm
bromelain, papain, ficin, enzym từ Streptococcus. Khoảng pH hoạt động của
chúng rất rộng từ 4,5 – 10, khoảng pH tối ưu là 6 – 7,5. Các enzym này thể hiện
tính đặc hiệu rộng, được trình bày ở bảng –2.
Các chất ức chế thường dùng đối với các enzym này là các tác nhân oxy hóa, các
ion kim loại hay các tác nhân alkyl hóa.

4


1.1.3 Protease – metalo [16][18]
Trung tâm hoạt động của các enzym này có chứa các ion kim loại trực tiếp tham
gia xúc tác phản ứng. Nhóm này bao gồm các exopeptidase như
carboxypeptidase A và B, aminopeptidase, dipeptidase, prolidase, prolinase và
enzym từ các vi sinh vật sau: Bacillus cereus, B. megaterium, B. subtilis, B.
thermoproteolyticus (thermolysin), Streptomyces griseus và Aspergillus oryzae.
Hầu hết các enzym này đều chứa một mol Zn2+ trên một mol protein nhưng
prolidase và prolinase chứa một mol Mn2+. Các ion kim loại này hoạt động như
một acid Lewis trong carboxypeptidase A, chúng tạo mối liên kết với nhóm

carbonyl của liên kết peptid bị phân cắt. Tính dặc hiệu của các enzym này cũng
được trình bày ở bảng –2.
1.1.4 Protease – aspartic [16][18][28]
Nhóm γ – carboxyl của aspartat trong trung tâm hoạt động của các enzym này
tham gia trong xúc tác phản ứng. Nhóm này bao gồm các enzym điển hình như
pepsin, rennin, cathepsin D. pH hoạt động của các enzym này trong khoảng 2 –
5, nó tuỳ thuộc vào loại cơ chất và loại enzym.
Các protease acid từ VSV được phân thành hai loại: giống pepsin và giống rennin
. Hai loại này đều có khả năng đông tụ sữa. Các loài vi sinh vật tổng hợp được
hai loại enzym trên là Aspergillus awamori, Asp. Niger, Asp. oryzae, Penicilium
spp, Aps. usamii, Mucor spp, M. pusillus.
Cấu trúc của trung tâm hoạt động của các enzym này gồm hai nhóm carboxyl của
hai gốc aspartate.

Cơ chế thủy phân của các enzym này sẽ được trình bày chi

tiết trong các phần sau.

5


1.2

Ứng dụng của một số protease [10][13][17][29]

Các chế phẩm protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khác nhau.
Sau đây là một số ứng dụng của chúng:
1.2.1 Trong công nghiệp thịt
Trong công nghiệp chế biến thịt, có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm
mềm thịt, các chế phẩm thường dùng là papain, bromelain, ficin và các chế phẩm

protease từ VSV như Aspergillus oryzae. Khi sử dụng các chế phẩm protease thì
chất lượng thịt được nâng lên, thời gian chín được rút xuống rất nhiều.
1.2.2 Trong công nghiệp sữa
Protease còn có khả năng làm đông tụ sữa. Các enzym có hoạt tính đông tụ sữa
cao như rennin, pepsin. Các protease từ nấm mốc và vi khuẩn cũng có tính chất
đó, tuy nhiên các protease này không những làm đông tụ protein sữa mà còn thủy
phân sâu casein, do đó ảnh hưởng xấu đến chất lượng của phomat.
1.2.3 Trong công nghiệp da
Trong công nghiệp da, protease của vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trên
hai quá trình: làm mềm và tách lông. Dưới tác dụng của protease, các chất nhờn
bị tách ra và một số liên kết trong sợi colagen bị phá hủy. Kết quả là da thu được
có độ mềm nhất định.
Thực tế chứng tỏ rằng, khi xử lý nguyên liệu da bằng chế phẩm protease vi sinh
vật thì có thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần.
1.2.4 Trong sản xuất tơ tằm

6


Quá trình làm sạch các sợi tơ tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn. Sợi tơ
gồm hai sợi fibroin sơ cấp dính lại với nhau nhờ lớp vỏ bằng xerixin. Sau khi
tách hết xerixin thì sẽ được sợi fibroin tinh khiết.
Sợi tơ sau khi xử lý bằng dung dịch xà phòng vẫn còn lại một phần nhỏ xerixin.
Chính phần xerixin làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đều.
Để tách lượng xerixin này người ta sử dụng chế phẩm protease từ vi sinh vật, đặc
biệt là từ vi khuẩn.
1.2.5 Trong sản xuất các chất tẩy rửa
Trong quá trình sản xuất bột giặt người ta có bổ sung các enzym có pH tối thích
nằm trong cùng kiềm trong đó có enzym protease để tẩy các vết bẩn, đặc biệt là
các vết máu, sữa trên áo quần.

1.2.6 Trong mỹ phẩm
Hiện nay ở một số nước người ta đã sản xuất các loại kem có chứa protease dùng
để xoa mặt, xoa tay và cạo râu, v.v... Dưới tác dụng của protease trong kem, các
biểu bì của da đã chết sẽ được tách ra, da non và mới sẽ hình thành trên bề mặt.
1.2.7 Trong y học
Trong y học, các chế phẩm protease được dùng để sản xuất các môi trường dinh
dưỡng chứa các acid amin, peptid dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật
khác. Người ta còn dùng protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh miễn
dịch để chữa bệnh.
II.
2.1.

PEPSIN
Lịch sử – nguồn gốc của pepsin [2][18]

7


Pepsin, một protease axit điển hình, được phát hiện từ thế kỷ thứ XIX (Theodor
Schwann, 1836), là enzym thứ hai được thu nhận dưới dạng tinh thể (John H.
Northrop, 1930) sau enzym urease.
Pepsin được tìm thấy trong dịch vị và niêm mạc dạ dày các động vật có xương
sống. Trong niêm mạc, pepsin tồn tại dưới dạng không hoạt động zimogen gọi là
pepsinogen, nhưng khi gặp môi trường axit thì nó chuyển hóa nhanh chóng thành
pepsin hoạt động. Bằng phương pháp sắc ký phân đoạn, người ta xác định được
các dạng pepsin khác nhau trong đó chủ yếu là pepsin A (EC 3.4.23.1) và các
pepsin phụ: pepsin B, C, D. Các pepsinogen cũng được gọi tên tương ứng như
pepsin, bao gồm pepsinogen A, B, C, D.
Hiện nay người ta đã tạo nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các
enzym như

Aspergillopepsin I (EC 3.4.23.18), Aspergillopepsin II (EC

3.4.23.19), Penicillopepsin (EC 3.4.23.20), v.v…. Các enzym này có những đặc
tính rất giống với pepsin từ dạ dày động vật nên chúng đã được thay thế một phần
trong các ứng dụng của pepsin.
2.2.

Đặc tính của pepsin và pepsinogen

2.2.1. Tính chất vật lý [1]
Pepsin sau khi tách ở dạng bột vô định hình có màu trắng hay vàng nhạt, cũng có
thể ở dạng mảnh nhỏ màu hơi đục, có mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, có vị hơi
chua.
Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước tạo ra dung dịch đục lờ, không tan trong cồn,
ether, chloroform. Chế phẩm pepsin thô ở trạng thái khô khá bền có thể giữ được
trong nhiều năm ở nhiệt độ 0–4 oC. Còn khi ở dạng dung dịch thì kém bền hơn,
đặc biệt ở pH thấp vì khi đó xảy ra sự tự phân của pepsin.
2.2.2. Thành phần hóa học và cấu trúc phân tử của pepsin và pepsinogen

8


2.2.2.1 Thành phần hóa học [2][27]
Nitơ chiếm khoảng 14,7% trong thành phần hóa học của pepsin. Một mol
pepsinogen có chứa ba mol đường và đường này bị mất đi trong quá trình hoạt
hóa thành pepsin.
Các loại pepsinogen và pepsin có phân tử lượng khác nhau không đáng kể, chúng
đều xấp xỉ 42.000 dalton và 35.000 dalton (Bảng – 3).
Bảng 3 – Khối lượng phân tử của các loại pepsinogen và pepsin

Loại pepsinogen và pepsin
Trọng lượng phân tử
Acid amin ở đầu N
(dalton)
Pepsinogen A
40.400 ± 1600
Leu
Pepsin A
32.700 ± 1200
Ile
Pepsinogen B
39.000
Met, His
Pepsin B
38.600
Ala
Pepsinogen C
41.400
Ser
Pepsin C
36.000
Ser và Leu hoặc Ile
Pepinogen D
41.000
Leu
Pepsin D
35.000
Ile
Pepsin được cấu tạo từ khoảng 321 axit amin, trong đó chứa rất nhiều gốc acid
amin có tính acid (ví dụ pepsin A bao gồm 40 gốc Asx, 26 gốc Glx và chỉ chứa 2

gốc Arg và 1 gốc Lys (bảng – 4)). Do đó pepsin có tính acid rất mạnh, pepsin
tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi trường HCl 0,1N. Pepsin có
điểm đẳng điện rất thấp pI=1, điều này có thể do có sự hiện diện của gốc acid
phosphoric trong phân tử, bởi vì sau khi loại bỏ gốc acid phosphoric này thì
pI=1,7 (Perlman, 1955).
Ngược lại pepsinogen A lại chứa đến 4 gốc Arg và 10 gốc Lys, từ đây cho thấy
đoạn peptide bị loại bỏ ra trong quá trình hoạt hóa pepsinogen thành pepsin có
tính kiềm rất mạnh.

9


Pepsinogen được tách từ các động vật khác nhau (heo, dê, khỉ) hay các
pepsinogen (A, B, C, D) khác nhau của cùng một nguồn gốc thì không có sự khác
nhau nhiều về thành phần acid amin. Sự khác nhau đáng kể nhất là tỷ lệ của
Glx/Asx và Leu/Ile trong các loại pepsinogen. Sự khác nhau này được đặc trưng
cho các loại pepsinogen từ các nguồn động vật khác nhau.
Bảng 4 – Thành phần acid amin của một số loại pepsinogen và pepsin
Số nhóm acid amin trong phân tử
Heo [28]
Dê [26]

Amino
acid

Bò [19]

Pepsinogen
A

Pepsin
A

Pepsinogen
C

Pepsin
C

Pepsinogen
A-1

Pepsinogen
C-2

Pepsinoge
nC

Asp+Asn
Thr
Ser
Glu+Gln
Pro
Gly
Ala
Cys
Val
Met
Ile
Leu

Tyr
Phe
Lys
His
Arg
Trp
NH3

44
26
46
28
19
35
19
6
23
4
25
33
17
15
10
3
4
6
27

40
25

43
26
16
34
16
6
20
4
23
28
16
14
1
1
2
6
27

30
25
35
46
20
35
23
6
22
5
16
40

22
24
12
2
7
6
34

28
25
35
41
18
32
21
6
20
4
14
34
18
21
4
1
4
6
32

42
29

56
34
19
38
13
6
22
3
28
25
16
17
8
4
5
5
-

39
24
27
51
23
41
19
6
18
4
14
34

14
20
15
5
11
5

40
27
50
32
15
35
16
6
25
4
32
25
18
15
8
2
6
6
37

Tổng
cộng
Glx/Asx

Leu/Ile

363

321

376

332

370

370

362 ± 2

0,63
1,32

0,65
1,21

1,53
2,50

0,81
0,89

0,81
0,89

1,31
2,43

0,8
0,78

10


2.2.2.2.

Cấu trúc phân tử [13][21][22][24][27]

Pepsin là một mạch polypeptide đơn giản, acid amin đầu amino là Izoleucine và
đầu carboxyl là Alanin. Từ kết quả phân tích cấu trúc tinh thể bằng tia X, người
ta thấy rằng phân tử pepsin có dạng hình cầu. Ngoài ra pepsin cũng có cấu bậc 4,
chúng gồm 4 tiểu phần.

Hình 1 - Cấu trúc phân tử và trung tâm hoạt động của pepsin
Trung tâm hoạt động của các protease axit có đặc điểm chung là dựa vào hai
nhóm aspartate có tính axit, một gốc dưới dạng –COOH còn gốc còn lại dưới
dạng –COO-, hai nhóm này nằm sâu bên trong trung tâm hoạt động được thể
hiện bằng hai hình cầu màu đỏ trong hình –1a và chúng đóng vai trò kép trong
quá trình xúc tác: (1) chúng hoạt hóa một phân tử nước và (2) đóng vai trò như
chất nhận và cho proton. Ngoài ra trong phân tử pepsin còn có ba liên kết cầu

11

disulfua được tạo thành bởi các nguyên tử lưu huỳnh (hình cầu màu vàng trong
hình –1b) trong các gốc cystein, những liên kết này có vai trò làm cho chuỗi
protein bền vững hơn. Ba cầu nối được thể hiện bằng các hình cầu màu trắng và
vàng trong hình – 1b và các chuỗi acid amin ở ba cầu nối disulfua này được trình
bày trong bảng – 5.
Bảng 5 – Một số chuỗi acid amin trong phân tử pepsin và pepsinogen
Tên chuỗi acid amin
Chuỗi acid amin
Đầu amino của
Leu-Val-Lys-Val-Pro-Leu-Val-Arg-Lys-Lys-Ser-Leupepsinogen
Arg-Gln-Asn-Leu-Ile-Lys-Asp-Gly-Lys-Leu-Lys-AspPhe-Leu-Lys-Thr-His-Lys-His-Asn-Pro-Ala-Ser-LysTyr-Phe-Pro-Ala-Glu
Đầu amino của
pepsin
Đầu carboxyl của
pepsin

Ile-Gly-Asp-Glu-Pro

Liên kết Tryptophan
của pepsin

Val-Phe-Asp-Asn-Leu-Trp-Asp-Gln-Gly
Leu-Trp-Val-Pro-Ser
Val-Glu-Gly(Trp, Gln)
Leu-Asn-Trp-Val-Pro

Liên kết Cystein của
pepsin (3 cầu
disulfua)

Asp-Val-Pro-Thr-Ser-Gly-Glu-Leu-Trp-Ile(Asp, Thr,
Ser, Glu, Pro, Gly, Val, Leu, Tyr, Phe), Ile-Leu-GlyAsp-Val-Phe-Ile-Arg-Gln-Tyr-Tyr-Thr-Val-Phe-AspArg-Ala-Asn-Lys-Val-Gly-Leu-Ala-Pro-Val-Ala

Cys-Ser-Ser-Ileu-Asp-Glu-Glx-Asx(Asx, Ser)-Cys
(Thr, Ser, Asp, Glu)
Cys-Ser-Gly-Gly-Cys-Glu
Cys-Ser-Ser-Leu-Ala-Cys-Ser-Asx-His (Glx,
Asx)

Chuỗi acid amin ở
trung tâm hoạt động

Ile-Val-Asp-Thr-Gly-Thr-Ser

12


2.2.3. Sự hoạt hoạt hóa pepsinogen thành pepsin [21][25]
niêm mạc dạ dày, pepsin tồn tại ở dạng zymogen, gọi là pepsinogen. Điều này
là do pepsinogen chứa một đoạn peptide kìm hãm gồm 44 gốc acid amin và đoạn
peptide này bị cắt đứt trong quá trình hình thành pepsin. Quá trình hoạt hóa tự
xảy ra khi pH < 5, khi đó liên kết Leu16 và Ile17 trong đoạn peptide kìm hãm bị
cắt đứt. Tốc độ hình thành pepsin phụ thuộc vào nồng độ của pepsinogen.

Hình 2 – Cấu trúc phân tử pepsin và pepsinogen
Khi nghiên cứu cấu trúc của pepsinogen, người ta thấy trung tâm hoạt động được
hình thành một cách đầy đủ trong phân tử pepsinogen nhưng trong môi trường
trung tính nó bị khóa chặt bởi một đoạn peptide kìm hãm, được biểu thị bằng
phần xanh lá cây trong hình - 2b và hình - 2a là cấu trúc phân tử pepsin sau khi
tách khỏi đoạn peptid kìm hãm.

13


Trong đó, sáu mạch nhánh lysin và arginin của đoạn peptide kìm hãm hình thành
các cầu muối với các chuỗi carboxylate của glutamate và gốc aspartate của
pepsin. Đặc biệt là tương tác tónh điện giữa một mạch nhánh lysin của đoạn
peptide kìm hãm với cặp gốc aspartate của trung tâm hoạt động. Kết quả là
pepsinogen không có hoạt tính thủy phân. Còn khi môi trường có tính acid thì
cầu muối giữa đoạn peptide kìm hãm và pepsin bị phá vỡ , pepsin trở nên hoạt
động.
2.2.4 Tính đặc hiệu thủy phân của pepsin [19][25][26][28][29][30]
Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptide của các
protein. Pepsin có khả phân cắt khoảng 30% liên kết peptide tạo thành sản phẩm
chính là proteose, pepton và một ít acid amin tự do.
Cơ chế của sự phân cắt liên kết peptid được minh họa bằng sơ đồ phản ứng theo
sau:

14


Trong sự thủy phân liên kết peptide, hai gốc aspartate trong tâm hoạt động của
pepsin hoạt hóa một phân tử nước và chính phân tử nước này tham gia xúc tác
phản ứng thủy phân
Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loại pepsin (A, B, C, D). Pepsin A và D
thì khoảng đặc hiệu rộng hơn pepsin B và C. Sự khác nhau về tính đặc hiệu giữa
các loại pepsin (A, B, C, D) rõ rệt nhất là khi chúng tác động lên loại cơ chất
hemoglobin (Hb) và acetyl-L-phenylalanyl-L-diiodtyrosine (APD). Pepsin A và
pepsin D thì đều thể hiện hoạt tính thủy phân lên cả hai cơ chất Hb và APD còn
pepsin B chỉ thể hiện hoạt tính lên cơ chất APD và pepsin C thì chỉ thể hiện lên

cơ chất Hb.
Khi thủy phân protein, pepsin chủ yếu tấn công vào các liên peptid giữa các acid
amin Ala-Leu, Leu-Tyr, Leu-Val, Phe-Tyr, Tyr-Leu, Phe-Phe (Bảng - 2). Trong
quá trình thủy phân chuỗi insulin B đã bị oxy hóa, pepsin tách từ dê chủ yếu thủy
phân liên kết Ala14-Leu15 và Leu15-Tyr16 (Masaki Suzuki và cộng sự, 1999),
kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước.
Ngoài khả năng pepsin thủy phân các protein tự nhiên, pepsin còn thủy phân
được nhiều cơ chất tổng hợp. Trong đó các liên kết peptide chứa pnitrophenylalanine,

3,5-dibromotyrosine

hay

3,5-dinitrotyrosine

và

diiodotyrosine đều bị thủy phân và chúng được dùng trong nghiên cứu động học
phản ứng của pepsin.

15


Bảng 6 – Pepsin tác dụng lên một số cơ chất tổng hợp
Cơ chất
Acetyl-L-phenylalanyl-Ldiiodtyrosine

Ko (s-1)
2 x 10-1

Km (M)
7,5 x 10-5

Điều kieän
pH 2,0; 37 oC

Acetyl-L-phenylalanyl-Lphenylalanyl

1,9 x 10-2

4,3 x 10-4

pH 1,85; 37 oC

Carbobenzoxy-L-glutamyl-Ltyrosine
Carbobenzoxy-L-glutamyl-Ltyrosine ethyl ester

1,08 x 10-3

1,89 x 10-3 pH 4,0; 31,6 oC

1,41 x 10-3

1,78 x 10-3

Acetyl-L-phenylalanyl-L-tyrosine

-

2,4 x 10-3

Acetyl-L-tyrosyl -L-tyrosine

-

6,3 x 10-3

pH 2,0; 37 oC

Chuỗi poly-L-glutamic acid bị thủy phân nhanh chóng thành oligopeptide. Ngoài
ra theo một số nghiên cứu, pepsin thể hiện như một esterase. Nó xúc tác thủy
phân liên kết ester trong acetyl-L-phenylalanin-L(β-phenyl)-lactic acid và trong
benzyloxycarbonyl-L-histidyl-p-nitro-L-phenylalanin-L(β-phenyl)-lactic

acid

metyl ester. Pepsin còn xúc tác thủy phân những hợp chất ester sulfit có nhân
thơm.
2.2.5 nh hưởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, chất hoạt hóa, chất kìm hãm
lên pepsin và pepsinogen
2.2.5.1 nh hưởng của pH [13][17][26][28]
nh hưởng của pH lên các loại pepsin (A, B, C, D) hoàn toàn khác nhau. Chẳng
hạn như pepsin B bền ở pH = 6,9 và 25oC và ở cùng điều kiện này pepsin C sẽ
bền hơn pepsin A. Còn ở pH = 8,5 pepsin C bị vô hoạt nhanh chóng, pepsin D thì
không bền ở pH > 6.

16


Tóm lại, pepsin là protease acid điển hình, hoạt động mạnh trong môi trường

acid, bền trong môi trường có pH acid thậm chí ở pH = 1. Pepsin bắt đầu bị vô
hoạt thuận nghịch ở pH = 5 - 6 nhưng khi pH > 7 thì chúng bị vô hoạt bất thuận
nghịch. Sự phục hồi hoạt tính khi bị vô hoạt tùy thuộc vào pH, thời gian biến
tính, nồng độ enzym.
Đối với các pepsin có nguồn gốc khác nhau hay các pepsin (A, B, C, D) có cùng
nguồn gốc, pH tối thích cho chúng hoạt động là khác nhau. Chẳng hạn như
pepsin A và C tách chiết từ dạ dày dê thể hiện hoạt tính thủy phân hemoglobin
cao nhất ở pH = 2 và 3 hay pepsin A-2/3 vẫn duy trì được hoạt tính ở vùng có pH
> 3 nhưng pepsin A-1 thì không duy trì được. Ngoài ra pH tối thích cho mỗi loại
pepsin còn phụ thuộc vào từng loại cơ chất, chẳng hạn nếu cơ chất là hemoglobin
thì pHotp = 2,2 còn nếu cơ chất là albumin thì pHotp = 1,5.
Pepsinogen không bền ở pH < 5, khi đó pepsinogen bị hoạt hóa chuyển thành
pepsin hoạt động nhưng pepsinogen bền ở pH = 5,6.
Tương tự như pepsin, các loại pepsinogen khác nhau chịu ảnh hưởng của pH môi
trường cũng khác nhau. Pepsinogen C bền ở pH = 8,5 và nhiệt độ 37oC còn
pepsinogen D bắt đầu bị mất hoạt tính ở pH > 7,5 và nhiệt độ 35,5 oC. Nhìn
chung các pepsinogen ở khoảng pH = 8,5 – 11 đều bị biến tính thuận nghịch.
2.2.5.2 nh hưởng của nhiệt độ [13][17]
Tốc độ phản ứng do enzym xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ ở một giới hạn nhất
định. Đại lượng đăïc trưng cho ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ phản ứng là Q10
Kt + 10
Q10 = ----------------Kt

17


Trong đó: Kt: hằng số tốc độ phản ứng ở nhiệt độ t oC
Kt+10: hằng số tốc độ phản ứng ở nhiệt độ t+10 oC
Pepsin cũng như các loại protease khác, nhiệt độ tối ưu cho enzym hoạt động vào
khoảng 50-55 oC. Khi nhiệt độ phản ứng cao hơn nhiệt độ tối ưu thì tốc độ phản

ứng sẽ giảm nhanh vì lúc đó nhiệt làm hỏng cấu trúc, làm biến đổi trung tâm hoạt
động của enzym và làm vô hoạt enzym. Tuy nhiên ở nhiệt độ thấp, hoạt tính xúc
tác enzym cũng giảm nhưng không làm vô hoạt enzym.
Tốc độ xúc tác phản ứng thủy phân của pepsin không cao bằng các protease từ
động vật khác và các protease từ vi sinh vật nhưng độ bền nhiệt của pepsin cao
hơn so với các enzym này. Độ bền nhiệt của enzym cũng tăng lên khi có cơ chất
hoặc một số ion kim loại, đặc biệt là ion Ca2+.
2.2.6 nh hưởng của chất hoạt hóa, chất kìm hãm [19][26][28]
Cho đến nay chưa có một báo cáo nào về chất hoạt hóa kích thích làm tăng hoạt
tính của pepsin. Tuy nhiên các chất kìm hãm pepsin đã được nghiên cứu rất
nhiều. Với chất kìm hãm p-bromophenacyl bromide, hoạt tính của các protease
nói chung bị phá huỷ từ 70-80%, hoạt tính đối với cơ chất benzyloxycarbonyl-Lglutamyl-L-tyrosine hầu như mất hoàn toàn.

Tương tự hợp chất α-diazo-p-

bromoacetophenone cũng làm vô hoạt hoàn toàn pepsin. Nồng độ vô hoạt của
hai chất vô hoạt trên đều là 1 mol/mol pepsin. Những hợp chất này dường như
phản ứng với những nhóm acid amin khác nhau trong phân tử enzym.
Còn hợp chất diphenyldiazomethane (2 mol chất ức chế/1 mol enzym) làm giảm
50% hoạt tính của pepsin khi tác dụng lên hemoglobin. Các chất ức chế này
cũng phản ứng và ngăn cản sự hoạt hóa của pepsinogen và người ta cũng thấy
rằng sự vô hoạt pepsin tăng lên khi có mặt của những cơ chất peptide.

18