Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá phèn vàng (polynemus melanochir valenciennes, 1831) tại đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ THỊ NHÀN

NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ PHÈN VÀNG
(Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) TẠI ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2017


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ THỊ NHÀN

NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ PHÈN VÀNG
(Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) TẠI ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60420201

Quyết định giao đề tài:

928/QĐ-ĐHNT ngày 26/9/2014

Quyết định thành lập hội đồng:

685/QĐ-ĐHNT ngày 02/8/2017

Ngày bảo vệ:

21/9/2017

Người hướng dẫn khoa học:
TS. ĐẶNG THÚY BÌNH
Chủ tịch Hội Đồng:
PGS - TS. NGƠ ĐĂNG NGHĨA
Khoa sau đại học:

KHÁNH HỊA - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn: “Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá phèn vàng
(Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) tại Đồng bằng Sơng Cửu Long”
Là cơng trình nghiên cứu và thực hiện của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn của
TS.Đặng Thúy Bình trên cơ sở các lý thuyết đã học và tìm hiểu thực tế tại địa phương.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chính xác.
Chưa cơng bố trong các cơng trình nghiên cứu nào khác.
Luận văn tham khảo tư liệu và sử dụng thông tin được đăng tải trong danh mục
tài liệu tham khảo.

Nha Trang, ngày 8 tháng 8 năm 2017
Tác giả luận văn

Lê Thị Nhàn

iii


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn tốt nghiệp, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ
sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản III, đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất cũng như thời gian cho tơi
trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Đặc biệt tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đặng
Thúy Bình -người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tơi trong q trình học tập, nghiên
cứu và hồn thiện luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã
giảng dạy, cung cấp kiến thức cho tơi trong suốt q trình học tập.
Cảm ơn dự án PEER 2-7 (USAID và NSF tài trợ) đã cung cấp kinh phí và hỗ trợ
thực hiện nghiên cứu này.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, người thân đã quan tâm, hỗ trợ
và động viên để tơi hồn thành tốt luận văn.
Trong q trình thực hiện khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, kính mong
nhận được sự những ý kiến đóng góp của hội đồng để luận văn được hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 8 tháng 8 năm 2017
Tác giả luận văn

Lê Thị Nhàn

iv


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.......................................................................................................... iii
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................iv
MỤC LỤC .......................................................................................................................v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.....................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................ix
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .............................................................................................xi
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Tổng quan về địa điểm nghiên cứu ..........................................................................3
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu.........................................................................5
1.2.1. Một số đặc điểm sinh học họ cá nhụ Polynemidae ...............................................5
1.2.2. Một số đặc điểm sinh học loài Cá phèn vàng (Polynemus melanochir
Valenciennes, 1831) ........................................................................................................6
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ...................................................................9
1.3.1. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể ....................................9
1.3.2. Một số phương pháp giải trình tự ........................................................................15
1.3.3. Tổng quan về phương pháp giải trình tự RAD (Restriction-site Associated DNA)...25
1.4. Một số các kết quả nghiên cứu liên quan đến nội dung của đề tài.........................29
1.4.1. Nghiên cứu ngoài nước .......................................................................................29
1.4.2. Nghiên cứu trong nước ........................................................................................32
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................34
2.1. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu và phương pháp thu mẫu ....................................34
2.1.1. Đối tượng, địa điểm nghiên cứu ..........................................................................34
2.1.2. Phương pháp thu mẫu..........................................................................................35

v


2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................35
2.2.1. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái..................................................................35
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể cá phèn vàng (Polynemus melanochir
Valenciennes, 1831) ứng dụng cơng nghệ giải trình tự thế hệ mới...............................37
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................46
3.1. Đặc điểm hình thái phân loại của cá phèn vàng (Polynemus melanochir
Valenciennes, 1831) ......................................................................................................46
3.2. Nghiên cứu di truyền cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) ......46
3.2.1. Tách DNA tổng số...............................................................................................46
3.2.2. Tạo thư viện gen ..................................................................................................47
3.2.3. Xác định chỉ thị phân tử SNP ở các quần thể cá phèn vàng (Polynemus melanochir
Valenciennes, 1831) ......................................................................................................48
3.2.4. Xây dựng cấu trúc quần thể cá phèn vàng P. melanochir tại Việt Nam..............52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................61
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT

Từ viết tắt

1

ĐBSCL

2

µl

3

DNA

4

g

5

PCR

Polymerase Chain Reaction

6

SNPs

Single-nucleotide polymorphism

7

GB

Genbank

8

AF

Allele Frequency

9

bp

Base pairs

10

MRC

11

AG

An Giang

12

DT

Đồng Tháp

13

BT

Bến Tre

14

TV

Trà Vinh

15

BirdLife International

Đọc là
Đồng bằng sông Cửu Long
Microliter
Deoxyribonucleic acid
Gam

Mekong River Commission

Hiệp hội các tổ chức phi chính phủ
quốc tế (iNGO) hoạt động trong lĩnh
vực bảo tồn đa dạng sinh học

vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Số lượng mẫu cá phèn vàng (Polynemus melanochir) được thu tại các địa điểm.... 34
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng của enzyme cắt giới hạn............................................39
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng của PCR để khuếch đại thư viện gen EzRAD...........41
Bảng 2.4. Bộ ký tự ASCII mã hóa giá trị Q – score 0 – 40...........................................42
Bảng 2.5. Các giá trị của thang đo Phred ......................................................................43
Bảng 3.1. Số lượng thư viện mẫu giải trình tự ..............................................................48
Bảng 3.2. Các giá trị độ bao phủ Coverage (cutoff1) và Cutoff2 sử dụng xây dựng
hệ gen tham chiếu ........................................................................................................50
Bảng 3.3. Các thông số đa dạng di truyền của các quần thể cá phèn vàng dựa trên chỉ
thị SNP...........................................................................................................................52
Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể cá phèn tại ĐBSCL.....................53
Bảng 3.5. Kết quả phân nhóm quần thể cá phèn (k=3) tại ĐBSCL dựa trên phần mềm
Structure.........................................................................................................................53

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tình hình xâm nhập mặn tại Đồng Bằng Sơng Cửu Long năm 2016 .............4
Hình 1.2. Phân loại họ Polynemidae ...............................................................................6
Hình 1.3. Hình cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831)..................7
Hình 1.4. Phân bố của cá phèn vàng (Polynemus melanochir).......................................8
Hình 1.5. Nguyên lý kỹ thuật AFLP..............................................................................10
Hình 1.6. Nguyên lý kỹ thuật RAPD.............................................................................12
Hình 1.7. Kỹ thuật SSR .................................................................................................13
Hình 1.8. SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) .....................................................14
Hình 1.9. Cấu tạo của dideoxynucleotides triphosphate (ddNTP) ................................15
Hình 1.10. Kết quả điện di trên gel polyacrylamide .....................................................16

Hình 1.11. Hai giai đoạn của giải trình tự Sanger .........................................................16
Hình 1.12. Nguyên tắc của kỹ thuật pyrosequencing....................................................18
Hình 1.13. Các bước thực hiện giải trình tự cơ bản ......................................................18
Hình 1.14. Ba giai đoạn của giải trình tự thế hệ mới (Illumina) ...................................19
Hình 1.15. So sánh phương pháp Sanger và giải trình tự thế hệ mới............................20
Hình 1.16. Các bước chuẩn bị thư viện và giải trình tự của hệ thống 454....................21
Hình 1.17. Các bước PCR nhũ tương............................................................................22
Hình 1.18. Các bước giải trình tự Illumina ...................................................................23
Hình 1.19. Sơ đồ biểu diễn các bước SOLID................................................................25
Hình 1.20. Nguyên tắc tạo thư viện của RAD...............................................................26
Hình 1.21. Phương pháp tạo thư viện gen của phương pháp mbRAD..........................27
Hình 1.22. Hình thức cắt của enzyme cắt giới hạn trong phương pháp ddRAD ..........27
Hình 1.23. Các bước giải trình tự và tạo thư viện gen của phương pháp 2bRAD. .......28
Hình 1.24. Quá trình tạo thư viện gen từ phương pháp EzRAD ..................................29
Hình 2.1. Bản đồ thu mẫu tại ĐBSCL...........................................................................34
ix


Hình 2.2. Một số bộ phận của bộ cá xương ..................................................................35
Hình 2.3. Các chỉ số đếm trong phân loại cá ................................................................36
Hình 2.4. Sơ đồ nghiên cứu di truyền quần thể cá phèn vàng (Polynemus melanochir) ...37
Hình 2.5. Quá trình Dam methyl hố ............................................................................38
Hình 2.6. Dam methyl hố của Enzyme giới hạn MboI và Sau3AI..............................38
Hình 2.7. Quá trình cắt enzyme tạo đầu đính ................................................................39
Hình 2.8. Cấu trúc của Adapter .....................................................................................40
Hình 2.9. Quy trình dDocent .........................................................................................41
Hình 2.10. Dữ liệu di truyền sau khi giải trình tự định đạng bằng file .FASTQ...........42
Hình 2.11. Quy trình tạo hệ gen tham chiếu cá phèn vàng ...........................................44
Hình 3.1. Hình thái cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831).........46
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số của cá phèn vàng tại Bến Tre ........................47

Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên 1.5% gel agarose ..................................48
Hình 3.4. Hình ảnh (phần mềm Seaview) của hệ gen tham chiếu dựa trên giá trị
cutoff=3. Mũi tên chỉ đoạn trùng lắp (block). Các đoạn này được hạn chế khi lựa chọn
hệ gen tham chiếu chuẩn ................................................................................................51
Hình 3.5. Phân tích cấu trúc di truyền quần thể cá phèn vàng theo phần mềm Structure.....54
Hình 3.6. Mơ hình 3D phân tích PCoA dựa trên chỉ thị SNPs của quần thể cá phèn
vàng P. melanochir ở ĐBSCL. Vịng trịn thể hiện phân nhóm quần thể.....................55

x


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Đồng bằng sơng Cửu Long (ĐBSCL) nằm ở hạ nguồn sơng Mê Cơng, với diện tích
tự nhiên khoảng 39,747 km2, chiếm 12% diện tích cả nước với 750 km bờ biển và có
7/13 tỉnh, thành giáp biển. Dựa trên thông tin về sự thay đổi của ĐBSCL, đặc biệt sự
xâm nhập mặn hiện nay có thể tác động đến loài cá phèn vàng (Polynemus melanochir
Valenciennes, 1831) là loài di cư giữa các thủy vực nước lợ, mặn và nước ngọt, nghiên
cứu di truyền quần thể có thể cho thấy đáp ứng của sinh vật đối với những thay đổi
môi trường. Mục tiêu của đề tài là áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới để phát
hiện các chỉ thị phân tử SNPs, ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc quần thể cá phèn
vàng ở ĐBSCL. Trên cơ sở đó có thể khảo sát sự phân tách và kết nối của các quần thể
cá phèn phân bố ở vùng nước ngọt và lợ.
Đề tài thu mẫu cá phèn vàng tại tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh, Bến Tre của
ĐBSCL và áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới để phát hiện các chỉ thị phân tử
SNPs ứng dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể cá phèn vàng. Trên cơ sở đó, có
thể khảo sát cấu trúc và kết nối của các quần thể cá phèn vàng phân bố ở vùng nước
ngọt và nước lợ đại diện là vùng thượng nguồn và vùng cửa sông.
Kết quả nghiên cứu thu được 113 thư viện gen (library) của 4 quần thể cá phèn
vàng tại các khu vực nghiên cứu. Sau khi xây dựng hệ gen tham chiếu và so sánh,
nghiên cứu phát hiện 427,474 SNPs thô. Sau các bước lọc, 530 SNPs trên 112 cá thể

cuối cùng được sử dụng để phân tích di truyền quần thể. So sánh các quần thể gồm
thượng nguồn (An Giang, Đồng Tháp), và cửa sông (Bến Tre, Trà Vinh) cho thấy quần
thể khu vực cửa sông thể hiện sự đa dạng di truyền cao hơn. Khảo sát khoảng cách di
truyền giữa các quần thể cho thấy sự phân tách di truyền có ý nghĩa thống kê các quần
thể Đồng Tháp với các quần thể còn lại (Bến Tre, Trà Vinh). Tuy nhiên, quần thể An
Giang lại không thể hiện cấu trúc với các quần thể còn lại (P>0,05). Kết quả phân tích
nhóm (Structure) và phân tích tọa độ (PCoA) đều cho thấy sự phân tách quần thể của
cá phèn vàng theo các khu vực địa lý ở vùng thượng nguồn và cửa sông. Tuy nhiên, do
cá phèn vàng là loài di cư tự nhiên giữa các thủy vực nước ngọt lợ và mặn trong quá
trình sinh sản và tìm kiếm thức ăn, vì vậy các quần thể vẫn chia sẻ những thông tin di
truyền đặc trưng cho quần thể. Xét về phương diện khoảng cách địa lý (<300 km) dọc
xi


theo sông Tiền và sông Hậu và sự kết nối giữa 2 nhánh sông (thông qua sông Vàm
Nao), và trên qui mô lớn là sự kết nối giữa ĐBSCL và các lưu vực của sơng Mê Cơng,
chúng ta có thể nhận thấy sự biến dị/khác biệt di truyền giữa các quần thể ở qui mô
nhỏ thể hiện sự đáp ứng đối với môi trường đang thay đổi, đặc biệt là khu vực dễ bị tác
động như ĐBSCL, Việt Nam.
Từ khóa: Di truyền quần thể, SNPs, Polynemus melanochir, EzRAD

xii


MỞ ĐẦU
Đồng bằng sông Cửu Long nằm ở hạ nguồn sơng Mê Cơng, với diện tích tự
nhiên khoảng 39,747 km2, chiếm 12% diện tích cả nước với 750 km bờ biển và có
7/13 tỉnh, thành giáp biển (Nguyễn Trung Vẹn, 2013). Với sự gia tăng dân số mạnh mẽ
làm cho nhu cầu sử dụng tài nguyên tăng cao, đặc biệt là đất nông nghiệp và nuôi
trồng thủy sản, dẫn đến sự sụt giảm đáng kể mức độ sinh cảnh tự nhiên và bán tự nhiên

ở vùng đồng bằng (Cambell, 2012). Thêm vào đó, các chương trình dự án phát triển
trên dịng chính ở thượng nguồn đã và đang tác động mạnh đến lưu vực sông Mê Công
trong việc giảm thiểu nguồn lợi và biến động đa dạng sinh học (Cambell, 2012). Ngồi
ra, biến đổi khí hậu đã làm cho mực nước biển dâng cao từ 1,7 tới 1,8 mm hàng năm
trong suốt thế kỉ vừa qua và tăng với tốc độ 3 mm/năm trong suốt thập kỉ trước (ADB,
2008). Mức gia tăng mực nước biển ở đồng bằng châu thổ sông Mê Công là khá lớn,
khoảng 6 mm/năm và lên đến khoảng 150 mm/năm ở đồng bằng châu thổ Chao Phraya
(Syvitski và cs, 2009). Sụt đất do khai thác nước ngầm và do trầm tích bị các đập thủy
điện giữ lại đã và đang làm vùng đồng bằng châu thổ sơng Mê Cơng chìm dần và mực
nước biển dâng đang làm cho vấn đề trở nên trầm trọng hơn (Syvitski và cs, 2009).
Các vùng châu thổ ĐBSCL có tính đa dạng sinh học cao nhưng rất nhạy cảm
với sự thay đổi của các yếu tố thời tiết cực đoan và biến đổi khí hậu. Vùng ĐBSCL
được xác nhận là nơi chịu tác động mạnh mẽ của biến đổi khí hậu và nước biển dâng
(Adger et al., 2007). Biến đổi khí hậu sẽ làm thay đổi các hệ sinh thái thủy sinh, và
làm thay đổi sự phân bố của các loài và ngành sản xuất thủy sản. Sự di cư, các bãi đẻ
và khu vực kiếm mồi của cá cũng sẽ bị thay đổi và ảnh hưởng không nhỏ đến hoạt
động của các cộng động dân cư làm nghề thủy sản. Các hoạt động khai thác thủy sản
nội địa rất dễ bị tác động bởi các thay đổi trong chế độ thủy văn và các thành phần hóa
học của nước (Hoegh-Guldberg & Bruno, 2010).
Để quản lý tài nguyên và xây dựng chiến lược bảo tồn đa dạng sinh học, nghiên
cứu di truyền quần thể và thông tin về sự kết nối quần thể, mức độ khác biệt di truyền
giữa các quần thể địa phương sẽ cung cấp bằng chứng quan trọng, phản ánh quy mơ
phát tán của các lồi sinh vật và có ý nghĩa quan trọng trong cơng tác bảo tồn và quản
lý nguồn lợi.
- Tính cấp thiết của đề tài
Dựa trên thông tin về sự thay đổi của Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt sự xâm
nhập mặn hiện nay có thể tác động đến lồi cá phèn vàng là loài di cư giữa các thủy
1

vực nước lợ, mặn và nước ngọt, nghiên cứu di truyền quần thể có thể cho thấy đáp ứng
của sinh vật đối với những thay đổi mơi trường. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện
đề tài “Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá phèn vàng (Polynemus melanochir
Valenciennes, 1831) tại Đồng bằng sông Cửu Long”. Nghiên cứu này nằm trong
khuôn khổ của dự án PEER 2-7 - “Conservation genetics for improved biodiversity
and resource management in a changing Mekong Delta” do TS. Đặng Thúy Bình thuộc
Viện Cơng nghệ Sinh học và Mơi trường, Trường Đại học Nha Trang chủ trì.
- Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của đề tài là áp dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới để phát hiện các
chỉ thị phân tử SNPs, ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc quần thể cá phèn vàng ở
ĐBSCL. Trên cơ sở đó có thể khảo sát sự phân tách và kết nối của các quần thể cá
phèn phân bố ở vùng nước ngọt và lợ.
- Nội dung nghiên cứu
+ Thu mẫu cá phèn (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831) tại tỉnh An
Giang, Đồng Tháp, Trà Vinh, Bến Tre của ĐBSCL.
+ Phát hiện các chỉ thị phân tử SNPs ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc quần
thể cá phèn (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831)
+ Khảo sát cấu trúc và sự kết nối quần thể của cá phèn vàng ở khu hệ nước ngọt
(An Giang, Đồng Tháp) và vùng cửa sơng có sự xâm nhập mặn (Bến Tre, Trà Vinh).
- Ý nghĩa của đề tài
Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu đầu vào về cấu trúc và sự kết nối quần thể cá
phèn vàng làm cơ sở cho việc xây dựng chiến lược bảo tồn và quản lý nguồn lợi.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về địa điểm nghiên cứu
Hệ thống sông Mê Công là một trong những hệ thống sông lớn nhất trên thế
giới, lưu vực sông Mê Cơng có tính đa dạng sinh học rất cao, có hơn 1200 loài cá với

sản lượng 3 triệu tấn/năm (Hortle & Bush, 2003). Đồng bằng sông Cửu Long là vùng
hạ lưu cuối cùng của sông Mê Công trước khi đổ ra Biển Đông và vịnh Thái Lan. Hiện
nay ĐBSCL ghi nhận có 322 lồi cá, trong đó có 186 lồi cá nước ngọt (Trần Đắc
Định và cs, 2013). Tuy nhiên, sự đa dạng sinh học ở ĐBSCL đang phải đối mặt với
những thách thức từ sự tăng dân số dẫn đến áp lực việc khai thác thủy sản quá mức
(Kỷ Quang Vinh, 2012; Campbell, 2012), xây dựng đập ảnh hưởng đến sự di cư của cá
(MRC, 2010) và biến đổi khí hậu (WWF, 2009). Nguồn lợi cá sơng Mê Cơng bị suy
giảm ước tính từ 26% đến 42%, hơn 100 lồi sẽ có nguy cơ tuyệt chủng (MRC, 2010).
Theo thống kê năm 2012 của Tổng cục thống kê Việt Nam, dân số ĐBSCL hơn 18,6
triệu người, mật độ dân số bình qn hơn 400 người trên cây số vng, gần gấp đôi
mật độ dân số cả nước. Dân số tăng cao làm cho nhu cầu sử dụng tài nguyên vật chất
tăng cao, đặc biệt số người nghèo còn cao rất dễ tác động tiêu cực đến các chính sách
bảo vệ tài nguyên môi trường của nhà nước. Với sự gia tăng dân số (ước tính mức tăng
2,3%) (Kỷ Quang Vinh, 2012) tạo nên một áp lực lên hệ sinh thái nhiệt đới và tài
nguyên khu vực. Suốt 2 thập niên vừa qua, nhiều khu rừng ngập mặn đã bị tàn phá để
dành chỗ cho việc nuôi trồng thủy sản, chủ yếu là ni tơm, các lồi cá và nghêu sị.
Do đó, đa dạng sinh học ở các vùng đất ngập nước quan trọng đang bị đe dọa do khai
thác thiếu tái tạo và quản lý yếu kém.
Thêm vào đó, các chương trình, dự án phát triển trên dịng chính ở phía thượng
nguồn đã và đang tác động mạnh đến lưu vực sông Mê Công trong việc giảm thiểu
nguồn lợi và biến động đa dạng sinh học do các tác động kép của việc giảm lưu lượng
nước trong các dòng chảy từ việc xây đập và đồng thời sự xâm nhập của nước biển do
biến đổi khí hậu gia tăng (Campbell, 2012). Dự kiến sẽ có thêm 88 đập thủy điện mới
cho đến năm 2030 dọc theo con sông này (Stone, 2011).
Sự biến đổi khí hậu đặc biệt là xâm nhập mặn gây ra những hậu quả hết sức
nặng nề, ảnh hưởng đến đời sống sinh hoạt, sản xuất của cả vùng ĐBSCL. Đặc biệt,
cuối năm 2015 và những tháng đầu năm 2016, diễn biến xâm nhập mặn tại ĐBSCL
3

được đánh giá nặng nề nhất trong 100 năm qua. Ngay từ tháng 2, độ mặn đã duy trì ở
mức cao và nghiêm trọng. Trên sông Tiền và sông Hậu, độ mặn là trên 45 ‰, xâm
nhập sâu tới 70 km tính từ cửa sơng, thậm chí có nơi lên đến 85 km (trong khi theo
Trung tâm phòng tránh và giảm nhẹ thiên tai thì độ mặn bằng 4 ‰ đã được coi là bị
xâm nhập mặn).
( />
Theo kết quả khảo sát của Viện Khoa học Thủy lợi Miền Nam, toàn bộ vùng
Nam Măng Thít (Vĩnh Long) có trên 8,000 ha đất canh tác bị xâm mặn nặng, biên độ
mặn lên tới 0,4 g/l độ mặn được xem là gây ảnh hưởng lớn đến năng suất cây trồng. Ở
vùng phía Nam tỉnh Vĩnh Long, các tuyến sông, kênh rạch ven biển như: sông Tân
Dinh, Rạch Chiếc - Bào Môn, Rạch Mương Điều, Bang Chang, Rạch Tra chưa được
xây cống ngăn mặn, vì vậy độ mặn có thể tiếp tục tăng cao hơn về phía thượng lưu
sơng Tiền, sơng Hậu. Việc cấp nước tưới và nước cho sinh hoạt ở huyện Vũng Liêm
và Trà Ơn sẽ gặp khó khăn hơn vào những ngày độ mặn lên cao.

Hình 1.1. Tình hình xâm nhập mặn tại Đồng Bằng Sông Cửu Long năm 2016
(Nguồn Viện khoa học thủy lợi Miền nam)

4


ĐBSCL có hai hệ sinh thái thủy vực đặc trưng gồm: nước ngọt và nước lợ,
mặn. Sự tương tác của thủy triều biển và hệ thống sông Cửu Long tạo ra vùng nước lợ,
vào thời điểm tương tác của thủy triều mạnh hơn sông làm cho độ mặn tăng cao. Từ
cửa Tiểu (Tiền Giang) đến Hà Tiên (Kiên Giang) có nhiều sơng, kênh, rạch đổ ra biển,
trong đó 17 sơng và 3 kênh lớn đổ ra biển Đông và biển Tây, có tác động mạnh đến
vùng ven bờ. Hệ sinh thái thủy vực mặn, lợ ở ĐBSCL có vai trị quan trọng cũng
không kém so với hệ sinh thái thủy vực nước ngọt ở ĐBSCL. Hệ sinh thái thủy vực
nước lợ là hệ sinh thái chuyển tiếp, tạo nên sự phong phú và đa dạng, là vùng chuyển
tiếp các quần thể và tạo cơ hội cho các loài sống rộng sinh thái, các loài di cư kiếm ăn,

sinh sản. Hệ sinh thái vùng cửa sông ven biển ở ĐBSCL là một phần của vùng hạ lưu
hệ thống sông Mê Công, chịu ảnh hưởng mạnh của thủy triều biển Đông và biển Tây,
sự tương tác, giao thoa mạnh giữa sông và biển.
Cá phèn vàng (Polynemus melanochir) sống ở vùng nước sâu khoảng 30 mét,
hiếm khi bắt gặp ở vùng nước lợ, phân bố ở Thái Lan, Malay Peninsula, Sumatra,
Campuchia và ĐBSCL Việt Nam. Cá có khả năng sinh sản và phát triển nhanh, thích
nghi tốt với điều kiện mơi trường, chúng sử dụng những cái tua dài để cảm nhận môi
trường xung quanh. Thích sống ở đáy, nơi có nhiều bùn hoặc cát pha bùn. Mùa đánh
bắt thường là nguyên năm. Cá phèn là loài cá đẻ trứng ngoài biển cả; nghĩa là chúng sẽ
đẻ nhiều trứng nhỏ trôi nổi trên mặt nước và các trứng này sẽ trơi theo dịng nước cho
đến khi nở (www.fishbase.org).
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.2.1. Một số đặc điểm sinh học họ cá nhụ Polynemidae
1.2.1.1. Phân loại
Trên thế giới, họ Polynemidae có 8 giống với 41 loài (Motomura, 2004). Theo
Rainboth (1996) họ Polynemidae có 2 giống cá nước ngọt là Eleuthronema (2 lồi) và
polynemus (4 loài). Ở Việt Nam, họ cá nhụ Polynemidae thuộc bộ cá vược
Perciformes, giống Polynemus có 7 lồi. Theo tài liệu phân loại cá tại ĐBSCL của Mai
Đình Yên và cs (1993), ở Nam Bộ giống Polynemus có 2 loài là cá phèn vàng (Polynemus
melanochir) và cá phèn trắng (Polynemus dubius).
1.2.1.2. Phân bố
Họ cá nhụ phân bố khá rộng, chúng chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
(Nelson, 1994). Chúng có thể sống trong mơi trường với sự dao động lớn về độ mặn,
đặc điểm này cho phép chúng có thể sống được ở vùng cửa sơng. Có thể bắt gặp họ
5


Polynemidae ở những thủy vực tự nhiên của sông Mê Cơng từ Tonle Sap đến vùng
cửa sơng (Mai Đình n và cs, 1992; Rainboth, 1996).
1.2.1.3. Đặc điểm sinh học họ Polynemidae

Họ cá nhụ Polynemidae có 3 - 16 tia vây ngực rất dài và mịn, tách biệt, mõm
nhô ra trước hàm, miệng rộng, hàm kéo dài đến sau mắt (Trần Đắc Định, 2013).
Họ

Giống

Lồi

Hình 1.2: Phân loại họ Polynemidae (Motomura, 2004)

1.2.2. Một số đặc điểm sinh học loài Cá phèn vàng (Polynemus melanochir
Valenciennes, 1831)
1.2.2.1. Hệ thống phân loại
Theo hệ thống phân loại của Fishbase cá phèn vàng được xác định vị trí phân loại
như sau:
Giới: Động vật (Animalia)
Ngành: Động vật có dây sống (Chordata)
Tổng lớp: Cá xương (Osteichthyes)
Lớp: Cá vây tia (Actinopterygii)
Bộ: Cá vược (Perciformes)
Họ: Cá nhụ (Polynemidae)
Giống: Cá phèn (Polynemus)
Loài: Cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831).
6


Tên địa phương: Cá phèn vàng
Tên tiếng anh: Paradise threadfin
Cá phèn vàng (Polynemus melanochir) thuộc họ cá nhụ (Polynemidae), bộ cá vược
(Perciformes) là một trong những loài cá kinh tế của Việt Nam (Bộ Thủy sản, 1996).

Hình 1.3. Hình cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831)
(Nguồn Motomura, 2004)

1.2.2.2. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm phân loại: Cá phèn vàng (Polynemus melanochir Valenciennes, 1831)
có 7 tia vây ngực dài, vây ngực đen, bụng vàng nhạt, thân dài đến 20cm. Phân bố lưu
vực sông Mê Công và Chao praya (Trần Đắc Định, 2013).
Thân cá phèn vàng thon dài, dẹp bên, mõm ngắn, hơi tù. Răng hàm nhỏ mịn,
mắt cá nhỏ, có màng da che phủ. Vây lưng thứ nhất có 7 gai cứng, vây lưng thứ hai có
1 gai cứng và 14 – 15 tia mềm, vây hậu mơn có 2 gai cứng và 12 tia mềm. Vây ngực
có 15 - 18 tia mềm. Vây đuôi chẻ hai, đường bên kéo dài từ mép trên lỗ mang đến
điểm giữa gốc của các tia vây đuôi. Mặt lưng màu xám đen, màu vàng ở mặt bụng.
1.2.2.3. Đặc điểm phân bố
Trên thế giới cá phèn vàng phân bố từ phía đơng Ấn Độ đến phía tây Thái Bình
Dương. Ở Đơng Nam Á, cá phèn vàng phân bố ở Miến Điện, Ấn Độ, Thái Lan, Mã
Lai, Cam Pu Chia và Đồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam. Hầu hết các loài cá
thuộc họ Polynemidae là cá biển nhưng các loài thuộc giống Polynemus chủ yếu là
cá nước ngọt (Motomura, 2004; Fishbase, 2012).

7


Hình 1.4. Phân bố của cá phèn vàng (Polynemus melanochir) (www.fishwise.co.za)

Cá phèn vàng sống chủ yếu ở nước lợ và mặn, tuy nhiên cũng có thể gặp
ở vùng nước ngọt (Motomura, 2004). Cá phèn vàng thường di cư vào vùng nước ngọt
để sinh sản. Cá phèn vàng là loài sống đáy, chủ yếu là nền đáy cát. Một số loài cá
thuộc giống Polynemus như P. dubius, P. aquilonaris có tập tính sống giống như cá
phèn vàng chúng phân bố ở cả vùng nước ngọt và nước lợ. Tuy nhiên hai loài P.

hornadayi và P. multifilis chỉ phân bố ở vùng nước ngọt (Motomura, 2004).
Tại ĐBSCL cịn có thể cịn bắt gặp cá phèn trắng Polynemus dubius Bleeker,
1853 (Tống Xuân Tám, 2012) hoặc cá phèn chấm Polydactylus sextarius (Bloch
&Schneider, 1801).
1.2.2.4. Đặc điểm dinh dưỡng
Cá phèn vàng cùng một số loài trong họ Polynemidae như: Polynemus aquilonaris,
Polynemus dubius và Polynemus multifilis được ghi nhận là những loài ăn tạp thiên về
động vật với các loại thức ăn chủ yếu là giáp xác (chủ yếu là tôm), cá nhỏ và sinh vật
đáy (Motomura, 2004, Fishbase, 2012).
1.2.2.5. Đặc điểm sinh sản

Cá phèn vàng có buồng trứng dạng ống dài, màu trắng hồng đến vàng nhạt tùy
theo theo các giai đoạn phát triển của buồng trứng. Tinh sào cá phèn vàng là hai dãy
dẹp có màu trắng đục, nằm bên dưới xương sống, thuộc dạng buồng tinh không phân
thuỳ. Cá phèn vàng cái thành thục sinh dục khi cơ thể đạt kích cỡ 16 g và cá phèn vàng đực
có kích thước thành thục là 14,4 g/con. Tỉ lệ đực: cái trong quần đàn là vào khoảng 1:2,1.
8


Sức sinh sản của cá phèn vàng tương đối cao, sức sinh sản tuyệt đối khoảng 23,765
± 10,545 (trứng/cá thể) và sức sinh sản tương đối là 218,239 ± 75,926 (trứng/kg cá).
Đường kính trứng trung bình ở giai đoạn IV là 0,69 ± 0,05mm. Mùa vụ sinh sản của cá
phèn vàng trên tuyến sông Hậu tập trung vào khoảng từ tháng 3 đến tháng 6 và tháng
11 đến tháng 12 (Bùi Sĩ Văn, 2013).
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu
1.3.1. Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể
1.3.1.1. Chỉ thị phân tử DNA
Các chỉ thị phân tử DNA là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình DNA.
Chúng được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc
giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hố giữa lồi, dùng để lựa chọn

tổ hợp lai.
Chỉ thị phân tử DNA có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu. Chỉ thị
phân tử có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mơ với độ chính
xác cao mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện của môi trường. Chỉ thị phân tử được
chia làm hai nhóm chính:
 Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai DNA: chỉ thị RFLP.
 Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR)
 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn
phân cắt giới hạn)
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn
DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Khi ủ DNA
với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với
kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen. Kỹ thuật này được sử dụng phổ
biến từ thập niên 80 đến nay.
Nguyên lý:
Nguyên lý của kỹ thuật này dựa trên sự khác biệt tự nhiên của các chuỗi
nucleotide trong phân tử DNA và khi phân tử DNA bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi
enzyme cắt giới hạn thì các đoạn DNA có thể khác nhau về kích thước hay chiều dài.
Ưu điểm: RFLP là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp
và dị hợp. RFLP là cơng nghệ nghiên cứu đa hình DNA đầu tiên đủ rẻ để có thể được
ứng dụng một cách rộng rãi. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số
lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu.
9


Nhược điểm: Quy trình thực hiện với chỉ thị RELP phức tạp, đòi hỏi chất
lượng DNA phải cao là hạn chế của việc sử dụng kỹ thuật này.
 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism)
AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1995) phát
minh. Sau đó được Vos và cs (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. AFLP

được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, AFLP sử dụng enzyme cắt giới
hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch
đại PCR.
Nguyên lý:
Nguyên tắc của phương pháp AFLP cũng giống như RFLP, điểm khác biệt cơ
bản là AFLP không cần tiến hành lai phân tử (lai Southern blot), do vậy thực hiện
nhanh hơn.


Enzyme cắt giới sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme.

 Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI – MseI.
 Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được
gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase.


Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí
cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và
chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide.



Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide
chọn lọc mới được khuếch đại.

Hình 1.5. Nguyên lý kỹ thuật AFLP

10

Ưu điểm: AFLP là một kỹ thuật có độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong tồn
bộ hệ gen. AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng
dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống (Vos và cs, 1995). AFLP cho đa hình cao,
vì vậy kỹ thuật AFLP hứa hẹn cho phép xem xét kỹ sự đa hình ở một số lượng lớn
locus trong một thời gian rất ngắn và đòi hỏi một lượng rất nhỏ DNA. Điều này tạo
cho AFLP trở thành một hệ thống chỉ thị lý tưởng cho hàng loạt nghiên cứu di truyền.
Nhược điểm: AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó khơng có khả năng phân biệt
được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Phương pháp phức tạp, giá thành cho
nghiên cứu là tương đối cao (Vos và cs, 1995).
 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)
Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu
nhiên bằng việc sử dụng các đoạn mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên dài từ 9
- 12 nucleotide, tối thiểu là 4 nucleotide. Kết quả là sau khi điện di sản phẩm RAPD sẽ
phát hiện được tính đa hình dựa trên các phân đoạn DNA được nhân bản (Lê Duy
Thành và cs, 1995).
Chỉ thị RAPD thường ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn
gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được
sử dụng cho những mục đích sau:
+ Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như
tính trạng chất lượng sợi ở cây bơng, tính trạng kháng virus ở cá.
+ Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.
+ Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation).
Nguyên lý:
Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước: (1) Tách chiết DNA tổng
số, nhân DNA bằng máy PCR; (2) Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid; (3)
Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng.

11

Hình 1.6 Nguyên lý kỹ thuật RAPD
wssp/studentscholars/project/achives/onions/rapdl.gif
1, 2, 3, 4, 5, 6: các đoạn mồi.
(A) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 2 và 5
(B) sản phẩm khuếch đại đoạn DNA được giới hạn giữa 2 mồi 3 và 6

Ưu điểm: Tiến hành nhanh, dễ, khá rẻ và các bộ mồi cho RAPD đã được thương
mại hóa
Nhược điểm:
+ Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể
dị hợp tử.
+ Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường khơng thống nhất.
+ Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao. Không ổn định (thể hiện ở
mức độ lặp lại giống nhau thấp). Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng
khả năng xuất hiện đa hình thấp. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin
cậy khơng cao (Brown, 1996).
 Chỉ thị Microsatellite (SSR – Simple Sequence Repeats - sự lặp lại của một trật
tự đơn giản)
Microsatellites (SSR), còn được gọi là sự lặp lại trình tự đơn giản (SSRS) là sự
lặp đi lặp lại trình tự từ 2 - 6 cặp base của DNA.
Kỹ thuật SSR được thực hiện bằng phản ứng PCR với mồi SSR xuôi và ngược.
Sản phẩm PCR được phân tách trên gel polyacrylamide kết hợp nhuộm bạc (AgNO3)
hoặc bằng máy giải trình tự tự động. Việc phát triển chỉ thị SSR được tiến hành theo
một số bước như: xây dựng thư viện SSR, xác định locus SSR, xác định vùng phù hợp
để thiết kế mồi, PCR với các mồi được thiết kế, đánh giá và phân tích mẫu băng, đánh
giá đa hình của sản phẩm PCR.
12


Sequence

microsatellite

Chiều
Điện di

Hình 1.7. Kỹ thuật SSR

Nguyên lý:
Dựa vào hai đầu (vùng sườn) của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc biệt và
thống nhất chung cho cùng một đoạn DNA trên gen, không phân biệt cá thể trong cùng
một loài, nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số lần lặp lại của đơn vị lặp lại là
khác nhau. Từ đó, thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các cặp DNA trên gen
chứa các trình tự lặp lại. Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và
khác nhau giữa các cá thể trong cùng lồi.
Ưu điểm:
 Nhóm chỉ thị này rất đặc hiệu, có độ chính xác cao. Tương đối đơn giản,
dễ thực hiện.
 Cho nhiều allen trong một locus.
 Phân bố đều trong bộ gen
 SSR cho thông tin cụ thể hơn so với di truyền ty thể theo đường mẹ (vì
có mức đột biến cao) và di truyền theo cả bố và mẹ.
 Là chỉ thị đồng trội.
 Có tính đa hình và đặc thù cao.
 Chỉ thị SSR có khả năng nhân bản ổn định và dễ dàng lặp lại. Đặc biệt
các chỉ thị SSR có thể dễ dàng tiến hành và có thể phân tích hàng loạt, tự động .
13