SEMINAR NGHIÊN cứu các CHẤT CHUYỂN hóa GINSENOSID BẰNG kỹ THUẬT UPLC QTOFMS ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG của 4 sản PHẨM NHÂN sâm đã CHẾ BIẾN sắc ký HIỆN đại

NGHIÊN CỨU CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA GINSENOSID BẰNG KỸ THUẬT
UPLC-QTOF/MS ỨNG DỤNG TRONG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA 4
SẢN PHẨM NHÂN SÂM ĐÃ CHẾ BIẾN

1


NỘI DUNG

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

2

TỔNG QUAN

3

ĐỐI TƯỢNG VÀ PPNC

4

KẾT QUẢ

5

BÀN LUẬN

6

TÀI LIỆU THAM KHẢO
2


ĐẶT VẤN ĐỀ

•

Nhân sâm là loại thảo dược quý phổ biến trên thế giới => kiểm soát chất lượng => phát
triển các phương pháp phân tích là cần thiết để đánh giá thành phần saponin và kiểm
sốt chất lượng.

•

Dạng chế biến:





•

Bạch sâm (WG),
Sâm Triều Tiên (TG),
Hồng sâm (RG)
Hắc sâm (BG)

Thành phần hóa học chính là các ginsenosid. Sau chế biến các ginsenosid bị cắt đường
và khử nhóm OH tạo thành các chất chuyển hóa ginsenosid kém phân cực

•

Kĩ thuật UPLC-QTOF / MS được áp dụng để xác định và đánh giá các chất chuyển hóa.
Đánh giá được chất lượng của 4 sản phẩm này.

3


TỔNG QUAN
NGUYÊN LIỆU NHÂN SÂM

PP chế biến

Bạch sâm

Sâm Triều Tiên

sấy nhân sâm

hấp với hơi nước ở
o
80-95 C
trong 20-

tươi

25’

Hồng sâm

hấp ở
95o
100 C trong 2- 3h

Hắc sâm

hấp WG 9 chu kỳ ở
o
95-100 C trong 2- 3h

Rd, Rk1, Rg5, Rg3
Thành phần đặc
trưng

M-Rb1, MRb2, M-Rc,
Re, Rg1

Rb2 , Rc, Rd, Re, Rg1,

Rb1, Rb2, Rc, Rd,

các hợp chất chưa biết

Re, Rg1

Đặc biệt: CK, CY,
Rh2, Rk2, Rh3

4

TỔNG QUAN
NGUYÊN LIỆU NHÂN SÂM
Tác dụng dược lý của ginsenosid trong 4 sản phẩm

nhân sâm.

Chống kết tập tiểu cầu, kháng viêm và
Chống ung thư
Rc, Rb2

Chống đái tháo đường

chống

Rk1, Rg5, Rg3

Rd, Rb2, Re

Chống ung thư, kháng viêm và bảo vệ
CK

Kháng viêm

WG, RG và TG

Rd, Rb2, Re,
Rg1

ung thư

Rh2, Rh3

gan

Chống ung thư và kháng viêm

BG

5


TỔNG QUAN
NGUN LIỆU NHÂM SÂM

•

Các cơng trình nghiên cứu chỉ ra rằng Nhân sâm sau chế biến có tác dụng dược lý gia tăng và
có nhiều tác dụng dược lý mới.

•

Hồng sâm và Hắc sâm thể hiện tác dụng dược lý mạnh hơn so với Bạch sâm, sâm Triều Tiên
như chống ung thư, chống kết tập tiểu cầu, chống oxy hóa do tạo ra các ginsenosides riêng
biệt.

Ginsenosid là thành phần tạo ra tác dụng dược lý chính và riêng biệt cho các loại nhân sâm, nên
việc xác định và đánh giá lượng ginsenosid trong 4 sản phẩm này là cần thiết.

6

TỔNG QUAN
NGUYÊN LIỆU NHÂN SÂM
Cấu trúc các
ginsenosid

7


TỔNG QUAN
NGUYÊN LIỆU NHÂN SÂM
Qúa trình hình thành các chất chuyển hóa

WG

8


TỔNG QUAN
NGUYÊN LIỆU NHÂM SÂM
Qúa trình hình thành các chất chuyển hóa

9


TỔNG QUAN
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

•

Trong phân tích nhân sâm, HPLC kết hợp với các loại đầu dò như UV, DAD (PDA), ELSD, CAD,
PAD và MS được sử dụng phổ biến.

•
•

Đặc biệt, UPLC-QTOF/MS sử dụng để phân tích các chất chuyển hóa trong nhân sâm.
QTOF/MS là kết hợp của 2 bộ phận phân tích:

Phân tích tứ cực (Quadrupole) + thời gian bay ( Time of Fly)

Đơn giản, có thể chạy ở chế độ scan mode hoặc

Độ phân giải cao, đo được chính xác số khối, có chế độ full

chọn lọc ion (SIM)

scan

Áp dụng cho định lượng và theo dõi chất mục tiêu

Chọn lọc được các ion mục tiêu, giúp phân tích được chính xác hơn

10


TỔNG QUAN
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

UPLC-QTOF/MS

UPLC giúp phân tích nhanh

QTOF/MS rất hiệu quả

các hợp chất với độ phân

hiện các chất chuyển hóa khác

giải cao.

bao gồm các

trong việc phát
nhau

ginsenosid, dựa vào

các nhóm chức của chúng.

11


TỔNG QUAN
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

CÁC PHÂN TÍCH ĐA BIẾN

PAC giúp phân tích và cho biết sự

OPLS-DA giúp phát hiện các thành phần

khác biệt giữa các mẫu

ginsenosid chuyển hóa khác biệt =>phân
biệt TG với RG, TG với BG và RG với BG,
theo thứ tự lần lượt

12


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CHẤT CHUẨN VÀ DUNG MÔI THỬ

1

Methanol, nước và acetonitril
For HPLC
(Seoul, Hàn Quốc)

Acid formic

2

For HPLC
(Buchs, Thụy Sĩ)

Các ginsenoside tiêu chuẩn
3

Mua/phân lập và tinh chế từ rễ P. ginseng và
hồng sâm bằng các quá trình sắc ký

13


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
MẪU THỬ

14


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CHUẨN BỊ MẪU

Ly tâm (13.500 vịng/phút trong 5p).
Lọc 0,22 µm và tiêm mẫu vào hệ
thống UPLC
Bột mịn (200 mg) /2ml metanol
70%chiết xuất bằng

siêu âm

o
50 C/30 phút
Nghiền mịn và
đồng nhất

trộn

từng mẫu

Rễ củ của 4 loại sâm có
kích thước tương đương,
loại bỏ rễ nhỏ.

15


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ UPLC-QTOF/MS

Loại máy

Waters ACQUITY H-Class UPLC (Waters Corp, Milford, MA, USA)

Cột

C18 ACQUITY BEH (2.1 mm x 100 mm x 1.7µm)

Nhiệt độ cột

o
40 C

Nhiệt độ bộ phận

o
4 C

tiêm mẫu

Pha động

Dung môi A

Nước: acid formic = 100:0,1, v/v

Dung môi B

Acetonitril: acid formic = 100: 0,1, v/v

Tốc độ dịng

0,4 mL/phút

Thể tích tiêm mẫu

2 µL

16


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ UPLC-QTOF/MS
Chương trình rửa giải gradient

Thời gian (phút)

%A (Nước: acid formic)

%B (Acetonitril: acid formic)

0.5

85

15

1

85-80

15-20

6

80

20

13

80-70

20-30

23

70-65

30-35

24

65-62

35-38

27

62-40

38-60

31

40-10

60-90

32

10-85

90-15

35

85

15

17


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ UPLC-QTOF/MS
Loại máy

Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp, Milford, MA, USA)

Chế độ ion hóa

ESI− (m/z = 100-2500 Da)

Điện thế cone

40V

Điện thế mao quản

3.0 kV

Nhiệt độ nguồn

o
120 C

Nhiệt độ khí bay hơi

o
550 C

Tốc độ dịng khí cone

30 L/h

Tốc độ dịng khí bay hơi

800 L/h

Chất đối chiếu

Leucine-enkephalin (200 pg/mL, 10 µL/phút)

Độ chính xác

Hệ số biến thiên (CV)

RT (0,1%)

Cường độ peak

7,9%

Dữ liệu được thu thập và xử lý bằng phương pháp phát hiện peak và thuật tốn UNIFY 1.8, sau đó được xuất đến phần mềm EZinfo 3.0 để thực
hiện các phân tích đa biến PCA và OPLS-DA
18

KẾT QUẢ

CÁC CHẤT CHUYỂN HĨA CỦA NHÂN SÂM CHẾ BIẾN
WG

TG

RG

BG

Hình 1:

Sắc ký đồ của các chất từ WG, TG, RG và BG.

19


KẾT QUẢ

CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NHÂN SÂM CHẾ BIẾN

Thứ tự rửa giải cũng như hàm lượng của ginsenosid từ 4 sản phẩm nhân sâm chế biến
20


KẾT QUẢ

PHÂN TÍCH ĐA BIÊN PHÂN BIỆT 4 SP NHÂN SÂM CHẾ BIẾN
Dựa vào đồ thị OPLS-DA và S-PLOT

 

WG

TG

RG

BG

Số lượng mẫu

10

10

10

10

Số lượng

26

28

34

36

M-Rb1, M-Rb2,

Rb2 , Rc, Rd, Re,

Rb1, Rb2, Rc, Rd,

Rd, Rk1, Rg5, Rg3

M-Rc, Re, Rg1

Rg1, các hợp chất

Re, Rg1

ginsenosid
Thành phần đặc
trưng

chưa biết

Đặc biệt: CK, CY, Rh2,
Rk2, Rh3

21


BÀN LUẬN

•

Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng phương pháp UPLC–QTOF/MS đánh giá chất chuyển hóa và chất lượng của 4
sản phẩm nhân sâm, nghiên cứu này cũng chứng minh được sự hữu ích của nó trong phân tích => tương lai ứng
dụng đánh giá các sản phẩm chế biến khác từ các bộ phận khác của nhân sâm như lá, hoa, thân, quả

•

Các phân tích đa biến cho ta biết các ginsenosid và các chất chuyển hóa đặc trưng của 4 loại nhân sâm => sử dụng
để đánh giá tác dụng dược lý của nhân sâm và các sản phẩm chế biến, đồng thời tối ưu hóa quy trình sản xuất.

22


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1: JaeWon Lee, Seung-Heon Ji, Bo-Ram Choi, Doo Jin Choi, Yeong-Geun Lee, Hyoung-Geun Kim, GeumSoog Kim, Kyuil Kim, Youn-Hyung Lee, Nam-In Baek and Dae Young Lee (2018), UPLC-QTOF/MS-Based
Metabolomics Applied for the Quality Evaluation of Four Processed Panax ginseng Products, Molecules
2018, 23, 2062.
2: Le Thi Hong Van, Nguyen Thanh Dat, Nguyen Ngoc Khoi, Jeong Hill Park, Nguyen Minh Duc,
Ginsenoside-Rk1 and ginsenoside-Rg5 isolated from processed Vietnamese ginseng, Journal of medicinal
materials, 2015.
3: Le Thi Hong Van, Nghien cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của sâm Việt Nam chế biến,
Luận án tiến sĩ dược học 2018.

23


Xin chân thành cảm ơn sự chú ý lắng nghe !

Insert the title of your subtitle Here

24