SEMINAR PHÁT TRIỂN và THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP UPLC MSMS để xác ĐỊNH ĐỒNG THỜI FOTAGLIPTIN và 2 CHẤT CHUYỂN hóa TRONG HUYẾT TƯƠNG và nước TIỂU

PHÁT TRIỂN VÀ THẨM ĐỊNH

PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS
ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI

FOTAGLIPTIN VÀ 2 CHẤT CHUYỂN HÓA
TRONG HUYẾT TƯƠNG VÀ NƯỚC TIỂU
Tác giả: Zhenlei Wang, Ji Jiang, Pei Hu & Qian Zhao

HÌNH

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A UPLC-MS/MS METHOD OF SIMULTANEOUS DETERMINATION OF FOTAGLIPTIN AND ITS TWO MAJOR
METABOLITES IN HUMAN PLASMA AND URINE


1 Đặt vấn đề
2 Phương pháp nghiên cứu
3 Kết quả - Bàn luận
4 Kết luận
2


1. Đặt vấn đề

Tỉ lệ bệnh đái
tháo đường tăng
360 triệu người
(2030)

Đái tháo đường
tp II chiếm

90-95%

Kiểm sốt
đường huyết
tối ưu gặp
khó khăn

Fotagliptin
benzoate
(ức chế DPP-4)

3


1. Đặt vấn đề

4


1. Đặt vấn đề
Nghiên cứu dược lý
tiền lâm sàng
an toàn, hiệu quả

FDA Trung Quốc
chấp nhận để thử
nghiệm
lâm sàng (2013)

Fotagliptin có 2

chất chuyển hóa
chính M1 và M2-1

Xây dựng và thẩm định
phương pháp UPLC-MS/ MS
để xác định đồng thời
fotagliptin và hai chất chuyển hóa chính
trong huyết tương và nước tiểu người

Kỹ thuật khối phổ liên tục
(MS/MS) được ứng dụng rộng
trong hoá sinh lâm sàng
 

5


2. Phương pháp nghiên cứu
a/ Vật liệu và hóa chất
b/ Trang thiết bị
c/ Thông số và điều kiện tiến hành sắc ký
d/ Thông số và điều kiện tiến hành phổ khối
e/ Quy trình chuẩn bị mẫu hiệu chỉnh và mẫu kiểm
định
f/ Quy trình chuẩn bị mẫu thử
g/ Thẩm định phương pháp

6

2. Phương pháp nghiên cứu
a/ Vật liệu và hóa chất
Vật liệu

Hóa chất

Chất chuẩn

Fotagliptin độ tinh khiết 99,70%
Chất chuyển hóa của fotagliptin M1: độ tinh khiết 99,90%
Chất chuyển hóa của fotagliptin M2-1: độ tinh khiết 99,50%
Chất chuẩn nội của fotagliptin- IS: độ tinh khiết 99,22%

Dung môi

Acetonitrile và metanol HPLC-grade
Acid formic và acid triflouroacetic
Dung dịch amoniac và amonium acetat
Nước khử ion

Dịch sinh học sạch

Huyết tương người khơng nhiễm thuốc, có dùng tác nhân chống đông là
Heparin lithium
Nước tiểu

Fotagliptin

M1

M2-1
7


2. Phương pháp nghiên cứu
b/ Trang thiết bị
Bộ phận ion hóa ESI

Hệ thống Acquity
UPLC bao gờm:
+ bộ lấy mẫu tự động
+ b̀ng cột
+ bộ kiểm sốt bơm
nhị phân

Hệ thống khối phổ API
5500 triple quadrupole

8


2. Phương pháp nghiên cứu
c/ Thông số và điều kiện tiến hành sắc ký
Thơng số hệ thống
Cột sắc kí

BEH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm

Nhiệt độ cột
Nhiệt độ của bộ phận

tiêm mẫu

40 oC

Dung mơi pha động
Chương trình chạy
pha động
Tốc độ dịng
Quy trình rửa giải

15 oC
A: 5 mM amonium acetate trong hỗn hợp
acid formic-acetonitrile-nước (1:50:1000)
B: acetonitrile 100%
Gradient nồng độ
0.25 ml/phút
Bước 1: bắt đầu với 89,5% dung môi A cho đến phút thứ 1.
Bước 2: tiếp tục với 73,7% dung môi A cho đến phút thứ 3.
Bước 3: chuyển sang 10,5% dung môi A và giữ cho đến phút
thứ 3,50

9


2. Phương pháp nghiên cứu
d/ Thông số và điều kiện tiến hành phổ khối
Thơng số hệ thống
Màng chắn khí

35 psi

Khí va chạm

8 psi

Điện áp phun ion

5000 V

Nhiệt độ

600 oC

Khí nguồn ion 1
(khí nebulizer)

40 psi

Khí nguồn ion 2
(khí turbo)

60 psi

10


2. Phương pháp nghiên cứu
d/ Thông số và điều kiện tiến hành phổ khối
Cách phân mảnh và m/z

343  217,1

344,2  193,1

359,3  133,9

347,4  221,0
11


2. Phương pháp nghiên cứu
e/ Quá trình chuẩn bị mẫu CS và mẫu QC
Mẫu

Cách pha

Dung dịch mẹ

Pha trong acetonitril ở nờng độ 1 mg/ml

Dung dịch làm việc

Pha lỗng các dung dịch mẹ bằng hỗn hợp acetonitril – nước với tỷ lệ 1:1
Pha loãng dung dịch làm việc tương ứng với hệ số pha loãng 50 lần bằng
huyết tương hoặc nước tiểu người
Trong nước tiểu

Trong huyết tương
Mẫu CS và QC

Nồng độ CS

Từ 0.200/0.200/0.200 đến
1000/160/1000 ng/ml

Từ 20.0/20.0/20.0 đến
20000/10000/10000 ng/ml

Nồng độ QC

0.500/0.500/0.500
20.0/5.00/20.0
800/120/800 ng/ml

40.0/40.0/40.0
800/400/400
16000/8000/8000 ng/ml

Dung dịch kiểm tra chất
lượng pha loãng

Pha loãng các dung dịch làm việc tương ứng với huyết tương và nước tiểu

Dung dịch mẹ của IS

Được hoà tan trong hỗn hợp nước – acetonitril (1:1)
với nồng độ 1 mg/ml

Dung dịch làm việc của IS

Được hoà tan bằng nước - acid formic(50:1) với nờng độ:
• Huyết tương: 10 ng/ml
• Nước tiểu: 200 ng/ml

12


2. Phương pháp nghiên cứu
f/ Quá trình chuẩn bị mẫu thử
Các đĩa SPE tiếp xúc 800 µl metanol và 800 µl nước - acid formic (50:1)
mẫu huyết tương: nạp 800 µl dung dịch làm việc IS + 50,0 µl mẫu huyết tương
HOẶC mẫu nước tiểu: 990 µl dung dịch làm việc IS + 100 µl mẫu nước tiểu,
sau đó,được pha loãng 100 lần bằng acetonitril - nước (1:9)
rửa lần lượt bằng 800 µl metanol – nước - acid formic (40:60:2)
và metanol - nước (40:60)
cột được hút chân không đến khô và
rửa giải bằng 700 ml dung dịch amoniac - metanol (20:1)
Dịch rửa giải được tập trung và làm bay hơi đến khơ dưới dòng N2 ở 40 oC
và sau đó hồn ngun lại với 200 µl acetonitril - nước (1:9)
13


2. Phương pháp nghiên cứu
g/ Thẩm định phương pháp
.

1. Độ đặc hiệu
- Phân tích độ nhiễu của dịch sinh học từ sáu cá thể khác nhau
- Mẫu trắng đã được kiểm tra về độ nhiễu, so sánh với mẫu huyết tương và nước
14

tiểu sau khi thêm chất phân tích ở LLOQ


2. Phương pháp nghiên cứu
g/ Thẩm định phương pháp
2. Độ đúng, độ chính xác và độ lặp lại
Độ đúng, độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp được xác định từ
nồng độ của các mẫu QC với 3 nờng độ thấp, trung bình, cao.
Độ chính xác được biểu thị bằng phần trăm hệ số của RSD (RSD%) và độ
đúng được biểu thị bằng phần trăm của tỉ lệ thu hồi (sai số tương đối, RE%)
so với nồng độ thực.

15


2. Phương pháp nghiên cứu
g/ Thẩm định phương pháp
3. Tỷ lệ thu hồi
Được xác định bằng cách so sánh nồng độ của từng chất phân tích thêm
vào và chiết ra từ dịch sinh học ở ba mức nồng độ QC
4. Độ ổn định
Đánh giá độ ổn định trong buồng bơm mẫu tự động, bảo quản ở nhiệt độ
phòng, điều kiện lạnh và đông, độ ổn định dài hạn

16


3. Kết quả - Bàn luận
A) Phát triển phương pháp
a/ MS

b/ UPLC
B) Thẩm định phương pháp
a/ Độ tuyến tính, độ nhạy, độ đặc hiệu
b/ Độ đúng, độ chính xác
c/ Độ phục hồi, ảnh hưởng nội tại
d/ Độ ổn định
C) Ứng dụng phương pháp

17


3. Kết quả - Bàn luận
A.a. Phát triển phương pháp - MS

18


3. Kết quả - Bàn luận
A.b. Phát triển phương pháp - UPLC

19


3. Kết quả - Bàn luận
A.b. Phát triển phương pháp - UPLC

20


3. Kết quả - Bàn luận

B/ Thẩm định phương pháp
a) Độ tuyến tính, độ nhạy, độ đặc hiệu
+ Tất cả các đường cong hiệu chuẩn được đánh giá bằng phương
trình bậc hai với hệ số gia trọng (weighting factor) là 1/x 2
+ Hệ số tương quan của tất cả các đường cong hiệu chuẩn được tìm
thấy là trên 0,99 và nồng độ quan sát được của các mẫu trong
đường cong hiệu chuẩn dao động trong khoảng 85-115% giá trị lý
thuyết. 
+ Khơng có sự nhiễm chéo đáng kể nào được quan sát trong tất
cả các phân tích. 
+ Khơng có sự chập đỉnh đáng kể tại thời gian lưu của mỗi chất
phân tích

21


3. Kết quả - Bàn luận
B/ Thẩm định phương pháp
a) Độ tuyến tính, độ nhạy, độ đặc hiệu
Trong mẫu huyết tương

22


3. Kết quả - Bàn luận
B/ Thẩm định phương pháp
a) Độ tuyến tính, độ nhạy, độ đặc hiệu
Trong mẫu huyết tương

23

3. Kết quả - Bàn luận
B/ Thẩm định phương pháp
a) Độ tuyến tính, độ nhạy, độ đặc hiệu
Trong mẫu nước tiểu

24


3. Kết quả - Bàn luận
B/ Thẩm định phương pháp
a) Độ tuyến tính, độ nhạy, độ đặc hiệu
Trong mẫu nước tiểu

25