SEMINAR PHƯƠNG PHÁP UPLC – MSMS để xác ĐỊNH ĐỒNG THỜI IMATINIB, VORICONAZOLE và CHẤT CHUYỂN hóa TRONG mẫu HUYẾT TƯƠNG CHUỘT

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG

PHƯƠNG PHÁP UPLC – MS/MS ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI IMATINIB,
VORICONAZOLE VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA
TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG CHUỘT


3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
GIỚI THIỆU

1

2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

3

4
KẾT LUẬN


Giới thiệu
4

Bệnh bạch cầu mạn dòng tủy

Rối loạn tăng sinh tủy xương
mãn tính

15 % trong tổng số các bệnh
bạch cầu

Imatinib


Giới thiệu
5

Suy giảm miễn dịch

Voriconazole

Nhiễm nấm


Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
6
Đối tượng nghiên cứu

CYP3A4

Imatinib

N-desmethyl Imatinib

CYP2C19

Voriconazole

N-oxide Voriconazole


Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
7
Đối tượng nghiên cứu

Imatinib

Voriconazole

N-Desmethyl Imatinib

N-Oxide Voriconazole


Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
8
Vật liệu:

Tên nguyên liệu

Số lơ

Imatinib

20140213

N-Desmethyl Imatinib

A8029

Độ tinh khiết

Nơi mua

Viện kiểm sốt thực phẩm và dược phẩm quốc gia(BeiVoriconazole

100862-200701

N-Oxide Voriconale

100596-200809

Diazepam

171225-200902

Acetonitril và Methanol

≥ 98 %

jing, China)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Merck Company (Darmstadt, Germany)

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
9
Khảo sát điều kiện sắc ký:

•
•
•

Hệ pha động:

UPLC BEH C18
UPLC CSH C18
UPLC HSS C18

•
•

Acetonitril + nước
Acetonitril + acid fomic 0.1%


Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
10
Khảo sát điều kiện sắc ký:

Ion bằng sự phun ion ESI

Đầu dò khối phổ 3 tứ cực

MRM

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
11
Dung dịch chuẩn, mẫu QC:

10 µl mẫu chuẩn, mẫu QC
Imatinib, N-desmethyl Imatinib,
90 µl huyết tương

Voriconazole, N-oxide Voriconazole,

trắng

Diazepam (IS)

MeOH
Đường chuẩn
1 mg/ml chuẩn gốc

ACN

DD chuẩn nội

MeOH

DD chuẩn Imatinib, N-desmethyl
Imatinib, Voriconazole, N-oxide
Voriconazole

Mẫu QC huyết tương


Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
12
Chuẩn bị mẫu thử

100 µl huyết tương

200 µl chuẩn nội

Vortex 1 phút

Ly tâm 15000 x g x 15 phút

Mẫu thử

UPLC – MS/MS


Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
13
Thẩm định quy trình

HƯỚNG DẪN CỦA FDA CHO CÁC PHƯƠNG
PHÁP SINH HĨA CƠNG NGHIỆP

•

Độ chọn lọc

•

Tính tuyến tính

•

Độ chính xác

•

Độ đúng, độ phục hồi

•

Độ nhiễu


Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
14

Độ ổn định:

Ứng dụng trong nghiên cứu Dược động học:

2,0

1,0

0,5

1,5

4,0

3,0

8,0

6,0

24,0

12,0

36,0


Kết quả và bàn luận
15
Điều kiện sắc ký: UPLC – MS/MS

Cột sắc ký: Cột Acquity BEH C18 (2,1 x 50 mm; 1,7 µm)

Hệ pha động: Gradient

Detector: MS/MS

Thời gian (phút)

ACN (%)

Acid formic 0,1 % (%)

0

20

80

1,0

90

10

2,0

90

10

2,1

20

80

4,0

20

80


Kết quả và bàn luận
16
Thẩm định quy trình: Tính chọn lọc
Mẫu trắng


Kết quả và bàn luận
17
Thẩm định quy trình: Tính chọn lọc

Mẫu chuân thêm dịch sinh học

Imatinib

N-desmethyl Imatinib

N-oxide Voriconazole

Voriconazole

IS


Kết quả và bàn luận
18

Thẩm định quy trình: Tính chọn lọc

Mẫu thử thu được sau khi dùng thuốc

Imatinib

N-desmethyl Imatinib

N-oxide Voriconazole

Voriconazole

IS


Kết quả và bàn luận
19
Tính tuyến tính

Tên chất

Phương trình hồi quy

Y = 2,70755X + 166,088
Imatinib

2
r = 0.99818

Y = 248,161X + 178,966

N-desmethyl imatinib

2
r = 0.99957

Y = 5,20704X + 3,45498
Voriconazole

2
r = 0.99939

Y = 0,380534X + 0,084044
N-Oxide voriconazole

2
r = 0.99933


Kết quả và bàn luận
20
Độ chính xác, Độ đúng

Analytes

Concentration added

Intra-day

Inter-day

(ng/mL)

Imatinib

N-desmethyl imatinib

Voriconazole

N-Oxide voriconazole

RSD (%)

RE (%)

RSD (%)

RE (%)

10

5.9

1.2

2.1

0.2

800

4.4

10.2

9.8

1.8

4000

6.1

0.4

3.2

-3.0

10

5.8

4.7

1.6

6.5

80

10.7

9.7

1.4

8.1

400

6.7

-4.8

2.5

-4.9

10

2.6

2.4

13.1

-11.1

800

5.1

5.1

0.5

5.5

4000

2.4

-7.9

0.3

-8.0

10

14.8

-6.1

6.3

-12.5

800

9.1

4.5

14.8

-10.0

4000

12.1

-3.4

5.1

-7.9


Kết quả và bàn luận
21
Độ phục hồi, Độ nhiễu

Recovery
Analytes

Imatinib

N-desmethyl imatinib

Matrix effect (%)

Concentration added
(ng/mL)

Mean ±SD

RSD (%)

Mean ±SD

RSD (%)

10

83.8 ± 7.2

8.6

97.2 ± 5.6

5.8

800

90.3 ± 5.4

6.0

107.9 ± 6.0

5.5

4000

88.5 ± 5.9

6.6

102.3 ± 7.6

7.5

10

91.1 ± 6.7

7.3

93.4 ± 10.4

11.1

80

87.3 ± 5.3

6.0

99.9 ± 7.0

7.0

400

94.6 ± 9.1

9.6

93.6 ± 13.0

13.9

10

85.1 ± 8.1

9.6

99.0 ± 12.3

12.4

800

88.9 ± 2.0

2.2

103.0 ± 5.3

5.2

4000

91.5 ± 3.8

4.1

108.7 ± 6.2

5.7

10

88.4 ± 12.0

13.6

100.0 ± 8.2

8.2

800

91.6 ± 11.8

12.9

97.0 ± 11.7

12.0

4000

91.0 ± 6.0

6.6

111.1 ± 4.0

3.6

Voriconazole

N-oxide voriconazole


Kết quả và bàn luận
22
Độ ổn định

o
Autosampler 4 C, 12h

Room temperature, 6h

Analytes

Imatinib

Three freeze -thaw

o
-80 C, 28 days

Added (ng/mL)

RSD (%)

RE (%)

RSD (%)

RE (%)

RSD (%)

RE (%)

RSD (%)

RE (%)

10

4.4

-9.8

12.3

-0.1

12.1

-1.3

12.0

4.3

800

5.3

-0.1

8.7

4.8

4.3

3.2

12.7

7.1

4000

3.8

2.8

14.3

2.5

4.4

-6.9

8.7

-4.2

10

6.9

3.5

10.3

5.0

5.6

-2.3

14.7

6.1

80

5.9

6.9

8.8

9.5

4.5

9.2

14.0

0.6

400

4.9

-8.8

6.6

11.8

4.5

1.2

8.5

-5.3

10

5.0

-7.1

11.9

1.6

5.1

-4.5

14.6

7.0

800

5.5

4.4

4.8

8.0

4.9

6.7

12.1

-3.1

4000

3.4

-11.3

9.5

14.8

3.0

-1.2

12.8

-11.1

10

7.4

7.1

9.8

9.0

6.5

-3.5

9.0

-3.4

800

4.3

-2.6

9.8

4.9

3.4

6.7

10.4

3.9

4000

4.7

-9.6

8.4

8.4

4.2

0.6

7.9

-4.7

N-desmethyl imatinib

Voriconazole

N-oxide voriconazole


Kết quả và bàn luận
23
Ứng dụng trong nghiên cứu Dược động học:

Imatinib
T1/2 = 4.9 h

Voriconazole
T1/2 = 3.76 h

N-desmethyl Imatinib
T1/2 = 6.77 h

N-oxide Voriconazole
T1/2 = 7.46 h


Kết luận
24

•

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 4 chất Imatinib, N-desmethyl Imatinib,

Voriconazole, N-oxide Voriconazle

•

Hiệu suất chiết cao và khơng có độ nhiễu

•

Ứng dụng thành cơng phương pháp để xác định đồng thời 4 chất trong mẫu huyết thanh chuột
trong thời gian ngắn (4 phút)


Cảm ơn Thầy và các bạn đã lắng nghe !