SEMINAR đánh giá tác dụng chống oxy hoá và ức chế αlpha glucosidase của các phân đoạn dịch chiết neptunia oleracea dựa vào h1 NMR và phương pháp UHPLC MSMS _ SẮC KÝ HIỆN ĐẠI

BMC Complementary and Alternative
Medicine

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ VÀ ỨC
CHẾ ΑLPHA GLUCOSIDASE CỦA CÁC PHÂN
ĐOẠN DỊCH CHIẾT NEPTUNIA OLERACEA DỰA
VÀO H1-NMR VÀ PHƯƠNG PHÁP UHPLC-MS/MS
Tác giả: Soo Yee Lee, Ahmed Mediani, Intan Safinar Ismail, Maulidiani
and Faridah Abas.

Antioxidants and α-glucosidase inhibitors from Neptunia oleracea fractions using 1H NMR-based metabolomics approach
and


NỘI DUNG CHÍNH
Giới thiệu
(Abstract,background)
Phương pháp
(Method)
Kết quả và bàn luận
(Result and discussion)
Kết luận
(Conclusion)
2


1

GIỚI THIỆU

GIỚI THIỆU

ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

4
IDF diabetes atlas - 2017 Atlas


GIỚI THIỆU

5
/>

GIỚI THIỆU

Neptunia oleracea
(rau nhút)
 Protein thô
 Chất xơ thô
 Các khoáng chất quan trọng

PHENOLICS

GỐC TỰ DO

α-glucosidase
6


2

PHƯƠNG PHÁP


PHƯƠNG PHÁP

Hố chất và ngun liệu

1. Hóa chất, thuốc thử
- Phosphat đệm, glycin, enzym αglucosidase, PNPG, DPPH
- Dung môi ethanol tuyệt đối, hexan,
chloroform, ethyl acetat và methanol
- Hóa chất NMR: DMSO-d6 và TSP
- Acetonitril và acid formic loại LC/MS
- Nước được điều chế bằng hệ thống lọc
Milli-Q.

2. Nguyên liệu thực vật
Neptunia oleracea
- Xác thực bởi Nhà thực vật học Tiến sĩ
Shamsul Khamis
- Trồng trong khu Nông nghiệp Đại học
Putra Malaysia
8


Sấy mẫu và chiết

PHƯƠNG PHÁP

Thu hoạch cây 3
tháng tuổi

Sơ chế cây

4g bột/100ml ethanol
tuyệt đối

Tạo chiết xuất thô

Tách lá

Làm sạch, đông
lạnh ở -80C

Nghiền
thành bột

Đông khô đến khối
lượng không đổi

Siêu âm
1 giờ

Lấy 6 mẫu chiết xuất
riêng lẻ để có được 6
lần lặp lại

Ly tâm 13000
vịng/phút trong

30 phút

Lấy phần dịch
và cơ đặc
9


Phân đoạn chiết suất thô

PHƯƠNG PHÁP

2g bột silica

1g chiết xuất thô

Cột SPE
Rửa liên tục với dung môi

Hexan

Chloroform

Ethyl acetat

Methanol

Phân đoạn
Hexan (HF)

Phân đoạn

Chloroform (CF)

Phân đoạn
Ethyl acetat (EF)

Phân đoạn
Methanol (MF)

Cô đặc, đông
khô giữ lạnh
4oC

Cô đặc, đông
khô giữ lạnh
4 oC

Cô đặc, đông
khô giữ lạnh
4oC

Cô đặc, đông
khô giữ lạnh
4 oC
10


PHƯƠNG PHÁP

Tổng hàm lượng phenolic (TPC)

Mẫu: hòa tan các phân đoạn trong DMSO
Trộn 20µl mẫu và 100µl TT Folin - Ciocalteu
đĩa 96 giếng, ủ 5’
Thêm 80µl dd Natri Carbonat 75%
Ủ 30’ trong bóng tối
Kiểm tra độ hấp thu ở bước sóng
765nm (đầu đọc microplate)
Mẫu phân tích 3 lần
Dựa vào đường chuẩn của acid gallic, tính tốn hàm lượng
phenolic (TPC)
11


PHƯƠNG PHÁP

Thử nghiệm kháng gốc tự do

• Chuẩn bị mẫu
• Mẫu thử (50μL) trộn DPPH (100μL) vào các giếng
• Làm song song mẫu trắng
• Ủ các giếng trong bóng tối 30’
• Đo độ hấp thu bằng bước song 515nm
%Ức chế = [(AB-AS)/AB] * 100
AB, AS lần lượt là độ hấp thu mẫu trắng và mẫu thử
Mỗi mẫu tiến hành phân tích 3 lần riêng biệt
12


PHƯƠNG PHÁP

Thử nghiệm ức chế αGlucosidase

• Chuẩn bị mẫu
• Thêm vào 96 giếng: 10Lmẫu thử, 130 μL đệm 30
mM phosphate và 10 μL enzyme α-glucosidase
• Làm song song mẫu chứng âm
• Ủ 5’ nhiệt độ phịng
• Thêm vào đĩa 50L chất nền PNPG, ủ 15’
• Thêm 50L glysine 2M pH10
• Đo độ hấp thu tại bước sóng 405nm
% Ức chế = [(An-As)/An]
An và As lần lượt là độ hấp thụ của chứng âm và mẫu
thử tương ứng
Mỗi mẫu tiến hành phân tích 3 lần
13


Đo NMR

PHƯƠNG PHÁP

5mg mẫu + 500L
DMSO-d6 (chứa 0,1%
TSP)

Siêu âm 15’

Ly tâm 13000
vòng/phút trong
10’

Máy đo quang kế INOVA NMR 500MHz
Tần số 499,887 MHz

Phân tích NMR

Nhiệt độ 26C
Thời gian quét 3,54 phút, gồm 64 lần quét
Chiều rộng phổ 20 ppm

14


PHƯƠNG PHÁP

4 mg mỗi phân
đoạn + 2 ml
methanol

UHPLC-MS / MS

Ly tâm

Cột Thermo C18 (2.1 mm × 100 mm, 1,9μm)
Pha động: 0,1% HCOOH/H2O (A)
0,1% HCOOH/acetonitril (B)
Tốc độ dịng: 250 μL/phút.
Thể tích tiêm: 5 μL.
Chương trình rửa giải:
5% B tại 0 phút,

15% B tại 6 phút,
20% B tại 15 phút,
25% B tại 28 phút,
100% B tại 30 phút

Lọc qua màng 0,22 m

UHPLC-MS/MS

15


3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN


KẾT QUẢ

Phổ 1H NMR của các phân đoạn
N. oleracea
1 - acid béo
2 - alanin
3 - leucin
4 - valin
5 - acidoleanolic
6 - phytosterol
7 - α-glucose
8 - β-glucose
9 - fructose

10* - quercetin
11* - kaempferol
12* - myricetin
13* - apigenin
14 - catechin
15 - acidgallic
16 - 4-Odimethylgallic acid
17 - acid caffeic 
* dẫn xuất

Phổ 1H-NMR của HF (a), CF (b), EF (c) và MF (d) của N. oleracea
17


KẾT QUẢ

Phân loại chuyển hóa của các
phân đoạn N. olunacea

Điểm số PCA (a) và ô dữ liệu-loading plot (b) của các phân đoạn khác
nhau của N. oleracea

18


KẾT QUẢ

Mối tương quan giữa phenolic và hoạt
tính sinh học của các phân đoạn N.
oleracea

Tổng hàm lượng phenolic (a), thử
nghiệm kháng gốc tự do DPPH (b),
thử nghiệm ức chế α-glucosidase
(c) của các phân đoạn N. oleracea

19


KẾT QUẢ

Mối tương quan giữa phenolic và hoạt
tính sinh học của các phân đoạn N.
oleracea

Mơ hình PLS

Các hợp chất phenolic đều nằm ở phía các phân đoạn có hoạt tính sinh học (EF, MF)
20


KẾT QUẢ

UHPLC–MS/MS xác định các phân
đoạn có hoạt tính sinh học của
N.oleracea

Sắc kí đồ tồn bộ ion trong
EF

Aglycones flavonoid chỉ được phát hiện trong EF
*Quercetin, apigenin, myricetin, kaempferol, các flavonoid khác,
dẫn xuất axit phenolic và các chất chuyển hóa khác
21


KẾT QUẢ

UHPLC–MS/MS xác định các phân
đoạn có hoạt tính sinh học của N.
oleracea

Sắc kí đồ tồn bộ ion trong
MF

Các dẫn xuất của axit phenolic cũng như một số di-flavonoid và
triglycoside chỉ có trong MF
*Quercetin, apigenin, myricetin, kaempferol, các flavonoid khác, dẫn xuất
axit phenolic và các chất chuyển hóa khác
22


BÀN LUẬN
HF và CF
Nguyên tắc

Phytosterol
Acid oleanolic
Amino acid béo

“like-dissolves-like”
EF và MF

quercetin

sự thay thế o-dihydroxyl
(catechol)

làm tăng hoạt
tính

acid caffeic

Các hợp chất
phenolic
kaempferol

apigenin

sự hiện diện và số lượng nhóm
hydroxyl phenolic

Khả năng chống oxy hóa và ức chế
α-glucosidase
23


BÀN LUẬN
Bảng: Xác định thành phần có hoạt tính sinh học trong các phân đoạn của N.
oleracea bằng UHPLC-MS/MS

24


BÀN LUẬN

25