Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi khuẩn trong quy trình sản xuất sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật PCR

Bộ giáo dục và đào tạo
Trường đại học bách khoa hà nội
----------------------------------------------

Luận văn thạc sĩ khoa học

Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi khuẩn
trong qui trình sản xuất sữa tiệt trùng
với sự hỗ trợ của kỹ thuật PCR

Ngành: Công nghƯ sinh häc

Phïng ThÞ Thủ

Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS. TS Nguyễn Thị Xuân Sâm

Hà Nội 2006


1

Mục lục
Chương I
Tổng quan
1. 1. Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt Nam

1

1.2. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa

1

2

1.3. Vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa

5

1.3.1. Các nhóm VSV thường gặp

5

1.3.2. Một số vi sinh vật gây bệnh có thể gặp trong sữa

7

1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nhiễm tạp vi sinh vật trong sữa

11

tươi nguyên liệu
1.4.1. ảnh hưởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp từ trong vú bò

11

1.4.2. ảnh hưởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp ngoài vú bò

12

1.4.3. ảnh hưởng của quá trình vệ sinh thiết bị

13

1.4.4. ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản

13

1.5. Một số nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật trong qui trình sản xuất

14

sữa tiệt trùng
2.6. Các phương pháp ph¸t hiƯn vi sinh vËt trong mÉu thùc phÈm

17

1.6.1. C¸c phương pháp truyền thống

18

1.6.2. Các phương pháp phát hiện nhanh

19

1


2

Chương II
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu và thiết bị

2.2. Phương pháp nghiên cứu

26
26
26
29

2.2.1. Phương pháp vi sinh vật
2.2.2. Phương pháp hóa sinh

30

2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử

32

Chương III
Kết quả và thảo luận

36

3.1.

36

Khảo sát qui trình chế biến sữa tiệt trùng tại cơ sở sản xuất

3.1.1. Qui trình chế biến sữa tiệt trùng

36

3.1.2 Phân tích điểm nguy cơ nhiễm cao

38

3.2.

39

Khảo sát khả năng nhiễm vi khuẩn hiếu khí tổng số

3.2.1. Kiểm tra nguyên liệu sản xuất

39

3.2.2. Kiểm tra bán thành phẩm và thành phẩm

42

3.3. Xác định một số VSV có nguy cơ lây nhiễm trong quá trỡnh sn xut

44

3.3.1. Xác định mt s vi khuẩn cú nguy c lõy nhim trong sữa bột nguyên

44

liệu
3.3.2. Xác định một số vi khuÈn có nguy cơ lây nhiễm trong các bán thành

45

phẩm
3.3.3. Xác định mt s vi khuẩn nhim trong các sản phẩm sữa hỏng

47

2


3

3.3. Xây dựng qui trình phát hiện một số vi sinh vật trong sữa tiệt trùng dựa

49

trên kỹ thuật PCR
3.3.1. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR

50

3.3.2. Khảo sát khả năng loại bỏ protein trong sữa bằng EDTA

53

3.3.3. Khảo sát khả năng ảnh hưởng của việc bổ sung EDTA đến khả năng

54

tăng sinh của vi sinh vật

3.3.4. Thit lp qui trình phát hiện B. cereus, Salmonella ssp, E.coli,

55

Staphylococcus aureus
3.2.5. Nghiên cứu khả năng phát hiện B.ceures và Salmonella ssp. Trong sữa

60

tiệt trùng khi có sự xuất hiện của các vi sinh vật khác
3.2.6. Kiểm định phương pháp

62

Chương IV

64

Kết luận

3


4

Lời cảm ơn
Trước hết tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn
Thị Xuân Sâm, người đà tận tình hướng dẫn tôi trong suốt qúa trình học tập, nghiên
cứu để hoàn thiện bản luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Lê
Quang Hoà đà giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm

Công nghệ Protein enzym và kỹ thuệt gen
Qua đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến toàn thể cán bộ Viện CNSH và CNTP
Trường ĐHBK đặc biệt là Phòng Hoá sinh nơi tôi đang công tác đà tạo điều kiện
cho tôi được học tập và nghiên cứu để hoàn thiện đề tài này.
Xin được Chân thành cảm ơn đến những người thân và gia đình đà động viên giúp
đỡ tôi trong quá trình làm luận văn.

4


5

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan những kết quả được trình bầy trong bản luận
văn này là hoàn toàn chính xác và do tôi tiến hành. Nếu có bất
cứ sai sót và tranh chấp về bản quyền tôi xin hoàn toàn chịu
trách nhiệm trước pháp luật
Hà Nội ngày 20/11/06
Người viết cam đoan

Phùng thị Thuỷ

5


6

Mở đầu
Lượng sữa tiêu thụ trên thị trường Việt Nam ngày càng tăng. Trong 10 năm vừa
qua mức tiêu thụ đà tăng lên khoảng 15 lần. ước tính từ nay đến năm 2010, nhu cầu

về các sản phẩm sữa ở nước ta sẽ gia tăng khoảng 10-15% mỗi năm để đạt đến mức
khoảng 10 kg/đầu người/năm. Vốn là một thực phẩm bổ dưỡng, các sản phẩm sữa
cũng là môi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Do vậy,
công tác kiểm tra, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm các sản phẩm sữa luôn là mối
quan tâm hàng đầu của các nhà sản xuất lẫn người tiêu dùng. Trong thực tiễn sản
xuất, ngay ở các nhà máy có các hệ thống đảm bảo chất lượng ISO 9001 hay
HACCP, đôi khi vẫn xảy ra hiện tượng nhiễm các vi sinh vật gây hại. Các hiện
tượng nhiễm này thông thường được phát hiện quá muộn, kết quả là các biện pháp
xử lý kỹ thuật ít có hiệu quả và nhà sản xuất phải huỷ bỏ các lô hàng bị nhiễm gây
lÃng phí rất lớn về mặt kinh tế. Bởi vậy, việc xác định nhóm các vi sinh vật có khả
năng nhiễm tạp cao gây hại lớn trong qui trình sản xuất sữa, từ đó thiết lập các
phương pháp, qui trình xác định nhanh các vi sinh vật gây hại đó có khả năng ứng
dụng trong thực tiễn sản xuất sữa là rất cần thiết để giảm tổn thất cho nhà sản xuất
và bảo đảm sức khỏe cho người tiêu dùng. Thực hiện đề tài luận văn thạc sỹ Góp
phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi khuẩn trong qui trình sản xuất sữa tiệt trùng với
mong muốn giảm thiểu các tổn thất do vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa gây ra. Nội
dung của luận văn bao gồm những vấn đề chính sau:
- Khảo sát vi sinh vật tổng số và chúng loại một số vi sinh vật nhiễm tạp trong qui
trình sản xuất sữa tiệt trùng từ đó xác định được nguồn nhiễm tạp và chủng loại
có khả năng nhiễm tạp cao.
- Xây dựng qui trình phát hiện nhanh một số chủng vi sinh vật có khả năng nhiễm
tạp cao trong qui trình sản xuất sữa.
- Kiểm nghiệm qui trình trên mẫu sữa tươi.

6


7

Chương I

Tổng Quan

1. 1. Hiện trạng ngành công nghiệp sữa Việt Nam
Theo đánh giá của các nhà maketing ngành công nghiệp sữa Việt Nam có rất nhiều
triển vọng vì hiện giờ các nhà sản xuất trong nước mới chỉ đáp ứng được 11% nhu
cầu tiêu thụ. Nhu cầu tiêu thụ sữa trên thị trường cũng tăng không ngừng, năm 1990
tính bình quân trên đầu người mới chỉ ở mức 0,47kg/năm, đến năm 2000 con số này
tăng lên đén 6,5 kg/năm và đến năm 2005 đạt tới 9kg/năm. Cùng với sự gia tăng về
nhu cầu tiêu thụ thì sản lượng sữa sản xuất trong nước cũng tăng lên đáng kể. Theo
số liệu thống kê, năm 2000 sản lượng sữa trong nước đạt 54 000 tấn, năm 2003 tăng
gấp hơn hai lần (112 000 tấn) và đến năm 2004 con số này đà tăng lên thành xấp xỉ
198 000 tấn. Sản lượng sữa được dự báo còn tăng nhanh hơn nữa trong giai đoạn tới.
Mặc dù có sự tăng trưởng tốt về sản lượng tiêu thụ và sản xuất nhưng ngành sữa
Việt nam vẫn còn có rất nhiều vấn đề cần giải quyết trong bản thân các nhà máy
cũng như cơ chế quản lý sao cho đảm bảo chất lượng sản phẩm và quyền lợi người
tiêu dùng. ĐÃ có nhiều chương trình chăn nuôi bò sữa ở các vùng miền tuy nhiên
vẫn chưa đem lại lợi nhuận kinh tế đáng kể vì những nguyên nhân như mức đầu tư
chưa lớn, kỹ thuật chưa đủ đáp ứng và quản lý chưa hiệu quả. Chính vì những
nguyên nhân trên mà ngành chăn nuôi bò sữa nhiều khi vấp phải vòng luẩn quẩn đó
là nguồn thu từ bán sữa tươi chưa đủ để đầu tư cơ sở vật chất và kỹ thuật tốt, vì đầu
tư chưa tốt nên chất và lượng sữa không đủ đáp ứng yêu cầu và điều này lại là
nguyên nhân làm cho thu nhập từ chăn nuôi bò sữa không cao. Tại các nhà máy chế
biến sữa hiện nay cũng gặp phải một số vấn đề. Vào mùa hè khi lượng sữa tiêu thụ
mạnh thì hầu như các nhà máy phải sản xuất hết công xuất, mặc dù đa số các nhà
máy đà áp dụng hệ thống phòng ngừa HACCP tuy nhiên vẫn gặp phải những sự cố
7


8

do nhiễm tạp vi sinh vật gây tổn thất lớn cho nhà sản xuất và có thể còn gây hại đến
cả người tiêu dùng. Về nguyên liệu, hiện nay nguồn sữa tươi nguyên liệu sử dụng
cho sản xuất sữa tiệt trùng của các nhà máy ở Việt Nam không đáp ứng đủ nhu cầu
về số lượng và chất lượng nên các nhà máy phải sử dụng một lượng lớn sữa bột
nhập khẩu. Về đầu tư do các nhà máy hoạt động theo cơ chế thị trường nên luôn
phải tối đa lợi nhuận do đó đầu tư về con người và cơ sở vật chất cho kiểm soát an
toàn vệ sinh thực phẩm và chất lượng sản phẩm (ví dụ như các phòng QA, QC, )
còn nhiều hạn chế. Trong khi đó chưa có một cơ chế thoả đáng khuyến khích sự
hợp tác của các cơ sở nghiên cứu khoa học, cơ quan quản lý chất lượng với các nhà
máy nhằm hỗ trợ về mặt kỹ thuật cho các nhà sản xuất để nâng cao chất lượng sản
phẩm. Tuy nhiên những hạn chế này sẽ sớm được giải quyết khi nước ta gia nhập
WTO. Khi ấy nếu sản phẩm sữa của Việt Nam muốn bán được trên thị trường các
nước và cạnh tranh được với các sản phẩm nhập khẩu cùng loại trên thị trường trong
nước thì bắt buộc các nhà sản xuất phải đầu tư để đảm bảo và nâng cao chất lượng
và cạnh tranh về giá cả.
1.2. Tiêu chuẩn vi sinh vật cho một số sản phẩm sữa
Giới hạn tối đa về vi sinh vật cho phép có mặt trong các sản phẩm sữa khác nhau là
khác nhau. Trong cùng một sản phẩm nhưng ở mỗi quốc gia khác nhau thì giới hạn
này cũng khác nhau.
Tiêu chuẩn Việt nam
Hiện nay ở Việt Nam đang áp dụng tiêu chuẩn về giới hạn vi sinh vật trong các sản
phẩm sữa cụ thĨ nh­ b¶ng sau (theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31
tháng 08 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế) :

8


9

Bảng 1.1 Giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trong các sản phẩm sữa

của Việt Nam
Sản phẩm

Chỉ số
Tng s vi khuẩn hiếu khí

a. Sữa khơ, sữa bột

b. Sữa tươi tiệt trùng theo phương
pháp Pasteur

c. Sữa tươi tiệt trùng theo phương
pháp U.H.T.

TB/g
5.104

Coliforms

10

E.coli

0

S.aureus

0

Salmonella*

0

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

5.104

Coliforms

10

E.coli

3

Salmonella*

0

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

10

Coliforms

0

E.coli

0

S.aureus

0

Salmonella*

0

d. Sản phẩm chế biến của của sữa :

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

104

bơ, sữa chua, pho- mat, ...(dùng trực

Coliforms

10

9


10

tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi

E.coli

0

(*) Salmonella : Khụng c cú trong

S.aureus

0

25g thc phm

Salmonella*

0

s dng ).

Trong qui định trªn, chØ tiªu tổng số vi khuÈn hiÕu khÝ (VKHKTS) và Coliforms
luôn có trong các sản phẩm sữa. Chỉ tiêu E.coli, S. aures, Salmonella có trong hầu
hết các loại sản phẩm. Salmonella còn được qui định rõ ràng là không có trong 25 g
sản phẩm. Sản phẩm sữa tươi tiệt trùng theo phương pháp UHT trong qui định cho
phép có 10 tế bào VKHKTS, tuy nhiên tiêu chuẩn của đa số các nhà máy chỉ số này
là bng khụng. Trong qui định trên ở tất cả các sản phẩm sữa đều không có chỉ tiêu
cho B.ceures. Tuy nhiên trong các sản phẩm khác như thịt, và sản phẩm ngũ cốc
đều có loài này.
Tiêu chuẩn của một số khu vực khác
Bảng 1.2. Giíi h¹n vi sinh vËt cho phÐp cã trong các sản phẩm sữa
Loại thực
phẩm

Chỉ tiêu

vi sinh vật

Sữa tươi chuẩn bị Vi sinh vật tổng số
cho sản xuất
ở 30oC
S.aureus
Salmonella
Sữa tươi sư dơng
S.aureus
ngay cho con ng­êi
Vi sinh vËt tỉng sè
ë 30oC
S÷a thanh trùng
pasteur

Sữa tiệt trùng UHT

Giới hạn cho phép
105CFU/ml
5.105 hoặc 1,5.106
CFU/ml
500-2000 CFU/ml

Ghi chú
Sữa bò
Sữa trâu, dê,
cừu

Không có trong 25g
100-500CFU/ml

5.104CFU/ml

Vi sinh vật gây bệnh Không có mặt trong 25g
Coliforms

0-5 CFU/ml

VSV tổng số ở 21oC

5.104 5.105 CFU/g

Sau khi ủ sữa ở
6oC trong 5
ngày
Sau khi đ s÷a ë

10


11

Sữa bột

VSV tổng số ở 30oC

10 CFU/0,1ml

30oC - 15 ngày

Salmonella

Listeria
monocytogenes
S.aureus
Coliforms

Không có mặt trong 1g
Vắng mặt trong 1g
10-100 CFU/g
0-10 CFU/g

Bột sữa
Sản phẩm của
bột sữa

Theo qui định số 94/46/EEC
Theo qui định của khối cộng đồng châu âu (số 94/46/EEC) về tiêu chuẩn các vi
sinh vật trong các sản phẩm sữa thì Salmonella không được có mặt trong 25g sản
phẩm của đa số các sản phẩm sữa, trừ sữa bột cho phép không cã trong 1 g. Víi
S.aureus cho phÐp cã ë kho¶ng 102CFU/ml với các sản phẩm sữa chưa xử lý nhiệt,
còn với sản phẩm sữa đà qua xử lý nhiệt chưa thấy có qui định. Chỉ tiêu vi sinh vật
tổng số được đưa ra cho hầu hết các sản phẩm sữa (trừ sữa bột) dao động trong
khoảng 104 đến 106 CFU/ml tùy theo từng loại sữa. (bảng1.2)
Tiêu chuẩn của Israeli [ ] vỊ vi sinh vËt trong mét sè nhãm s¶n phẩm sữa có thể
tóm tắt theo bảng sau:
Bảng 1.3. Tiêu chuẩn vi sinh vật trong một số sản phẩm sữa cđa Israeli
(vi khn tỉng sè trong 1g, Salmonella trong 20g, Listeria trong 25g)
Tên sản

Tiêu

phẩm

chuẩn số

VKTS

Sữa bò tươi

55

25.104

Sữa bò để

284

105

Coliform

Mốc

50

Salmonella

Khác

không có

uống

phosphatase và L
monocytogenes

Sữa lên men

285

100

500

không có L.
monocytogenes

Trong các tiêu chuẩn và qui định trên cho thấy một số chỉ tiêu như vi sinh vật tổng
số, Salmonella, Staphylococcus, Coliform là những chỉ số mà đa số các qui định và
11


12

các sản phẩm đều yêu cầu có. Còn tuỳ theo điều kiện sản xuất cũng như điều kiện
tự nhiên của mỗi nước mà các giới hạn hoặc các chỉ tiêu có thể nhiều hoặc ít hơn
các khu vực khác một chút để sản phẩm sản xuất ra có thể được ngi tiêu dùng
chấp nhận được.
1.3. Vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa
1.3.1. Các nhóm VSV thường gặp
Trong sữa luôn chứa một lượng vi sinh vật nhất định ngay cả khi sữa được thu

hoạch trong điều kiện vệ sinh tốt. Hệ vi sinh vật trong sữa cũng rất đa dạng bao
gồm nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn. Trong các đối tượng trên thì vi
khuẩn được quan tâm hơn cả vì trong sữa chúng thường phát triển vượt trội hơn. Vi
khuẩn trong sữa hay gặp nhất đó là nhóm vi khuÈn lactic nh­ Streptococcus lactic,
S. diaxetylactic, S. paracitrovorus, Lactobacillus bulgaricum, L.acidophilum, L.
lactic, L. helveticum. Nhóm vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong sản xuất các
sản phẩm lên men từ sữa như sữa chua, phomát. Tuy nhiên nếu chúng có xuất hiện
trong các sản phẩm sữa tươi tiệt trùng hoặc sữa tươi thanh trùng thì sẽ là các tác
nhân làm hỏng sản phẩm dưới dạng tạo kết tụ protein.
Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta có thể chia các vi sinh vật thường nhiễm trong
sữa thành các nhóm chính sau:
Vi sinh vật chịu lạnh (Psychrotrophs) là những vi sinh vật có khả năng phát triển
được ở nhiệt độ dưới 7C.Trong công nghệ sản xuất sữa nhóm vi sinh vật chịu lạnh
hay gặp trong các mẫu sữa hỏng nhất là nhóm trực khuẩn Gram (-), thường được
xác định thuộc loài Pseudomonas hầu hết những vi sinh vật chịu lạnh này sẽ nhanh
chóng làm hỏng sữa khi được bảo quản ở khoảng nhiệt độ từ 0 đến 10oC. Tuy nhiên
nó lại bị tiêu diệt dễ dàng trong quá trình gia nhiệt vì vậy ở sản phẩm đà qua gia
nhiệt thì thường hay bị tái nhiễm sau gia nhiệt do điều kiện vệ sinh không đảm bảo.

12


13

Nhãm ­a Êm (Mesophilic) nh÷ng vi khuÈn ­a Êm quan trọng nhất đó là
streptococci, lactobacilli và coliforms, những vi khuẩn này sản sinh axit, sinh khí
và làm mất mùi của sữa. Tuy nhiên chúng lại dễ dàng bị tiêu diệt trong quá trình gia
nhiệt pasteur.
Nhóm chịu nhiệt (Thermoduric) là nhóm có thể không bị tiêu diệt trong quá trình
gia nhiệt pasteur hoặc các xử lý nhiệt khác. Tuy nhiên nhóm này không phát triển ở

nhiệt độ xử lý pasteur. Giống chịu nhiệt hay gặp nhất đó là Microbacterium,
Corynebacterium, Micrococcus, Streptococcus và Bacillus.
Nhóm ưa nhiệt (Thermophilic) là nhóm vi khuẩn phát triển tốt trong điều kiện
nhiệt độ xử lý paster. Loài ­a nhiƯt th­êng thÊy nhÊt trong 2 nhãm Bacillus vµ
Clostridium
Nhãm ưa nhiệt có thể phát triển trong điều kiện lạnh (Thermoduric
Psychrotrophs) là một số ít các vi sinh vật chịu nhiệt hoặc tạo bào tử chịu nhiệt
nên vẫn có thể sèng sãt sau khi gia nhiƯt nh­ng chóng cịng cã khả năng phát triển
được trong điều kiện lạnh. Nhóm này đôi khi làm hỏng sữa trong điều kiện không bị
tái nhiƠm c¸c trùc khn gram (-) sau gia nhiƯt. Nhãm này thưòng phát triển chậm
sau đó gây hỏng sản phẩm trong quá trình lưu thông sản phẩm. Nhóm thermoduric
psychrotrophs hay gặp nhất là nhóm vi sinh vật tạo bào tử nh­ Bacillus [The
Evaluation of Shelf-Life]
1.3.2. Mét sè vi sinh vËt gây bệnh có thể gặp trong sữa
Sữa là một sản phẩm giầu dinh dưỡng nên khi vi sinh vật có mặt trong đó là chúng
tăng sinh rất nhanh. Sẽ rất nguy hiểm nếu các loài nhiễm tạp lại là những vi sinh vật
gây bệnh hoặc gây độc. ở nước ta do mức tiêu thụ sữa chưa cao và sản phẩm sữa
chưa phong phú đa dạng nên rất may mắn là chưa có vụ ngộ độc lớn nào gây ra bởi
sản phẩm sữa. ở các nước khác mặc dù điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm được

13


14

quản lý chặt chẽ nhưng vẫn thường xuyên xảy ra các vụ ngộ độc thực phẩm do sản
phẩm sữa gây ra Cụ thể về các vụ ngộ độc từ sản phẩm sữa ở Mỹ từ 1990-1995 do
CDC thống kê được trình bày trong bảng sau
/>
Bảng 1.4. Một số vụ ngộ độc do sử dụng sữa

Nguyên nhân Bang Tháng Năm

Số người
ốm

Sản phẩm

Nơi ăn

Vi khuẩn
Bacillus cereus MN
Campylobacter
jejuni
Campylobacter
jejuni
Campylobacter
jejuni
Campylobacter
jejuni
Campylobacter
spp.
Campylobacter
spp.
Escherichia
coli O104:H21

chocolate Nơi làm việc

8

94

4

WA

7

91

3

Sữa dê tươi Nông trại

TX

5

90

42

Sữa tươi

Cơ sở SX sữa

NY

4

92

23

Sữa

Trang trại

MN

5

92

50

Sữa tươi

Nhà thờ

ME

2

92

11

Sữa tươi

Nhà riêng

WA

3

90

13

Sữa tươi

Trường học

MT

2

94

18

Sữa

nóng

ở nhà và chỗ
khác

14

15

Escherichia
coli O157:H7
Escherichia
coli O157:H7
Listeria
monocytogenes
Salmonella
Tennessee
Salmonella
Typhimurium

Sữa tươi

Nhà điều

OR

6

93

4

OR

12

92

6

Sữa tươi

ML

6

94

69

Sữa socola ở nhiều chỗ

ML

5

93

3

Sữa bột

MI

3

91

37

Sữa socola Nông trại

CA

4

95

3

Sữa tươi

Nhà riêng

dưỡng
Không biết

Không biết

Salmonella
Typhimurium
variate
Copenhagan
Không biết nguyên nhân

Không biết

WI

7

93

25

Sữa

Nơi cắm trại

Không biết

WA

7

92

2

Sữa

Nhà hàng

Không biết

WA

4

90

3

Sữa tươi

Nhà riêng

Không biết

ID

8

90

5

Sữa tươi

Nhà riêng

Không biết

WA

8

90

2

Sữa tươi

Nhà riêng

Không biết

WI

10

90

19

Sữa

Sân chơi
bowling

15


16

Không biết

OH

11

90

7

Sữa

Nhà hàng

Dưới đây là một số loài VSV gây bệnh có khả năng gây nhiễm vào sữa.
Bacillus cereus: là một nhóm vi khuẩn hô hấp hiếu khí và hô hấp tùy tiện, có khả
năng sinh bào tử và được tìm thấy trong đất, bụi và không khí. Sự có mặt của B.
cereus với liều lượng vượt quá mức kiểm soát là nguyên nhân gây nên nôn, buồn
nôn và tiêu chảy. Khi thức ăn bị nhiễm B. cereus được tiêu thụ, vi khuẩn sẽ tạo ra
chất độc trong đường ruột. Sau khoảng 8 đến 10 giờ, người bị ngộ độc sẽ nôn
mửa, đau bụng quặn và tiêu chảy. Cả hai biểu hiện ngộ độc gây ra bởi B.cereus
đều ở mức độ không trầm trọng và có thể hồi phục sau 24 giờ. Tuy nhiên, đà có
trường hợp tử vong do ngộ độc B.cereus do sự gia tăng về mặt số lượng của các
độc tố [ ].
Salmonella spp: có trong dạ dày, ruột người và động vật. Có nhiều trong các loại
thực phẩm có hàm lượng protein cao như trứng, sữa, cá, thịt gia cầm nấu chưa
chín. Có khả năng gây bệnh thương hàn. Khi vi khuẩn này xâm nhập vào cơ thể
sẽ gây nên triệu chứng tiêu chảy, co thắt bụng, sốt, buồn nôn, nhức đầu [ ].
Campylobate jejuni: được phân lập từ chất thải của người vào năm 1971[30], có
trong sữa tươi, nước chưa khử trùng hoặc đun sôi, thịt gia cầm nấu chưa chín. Các

triệu chứng ngộ độc là buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy và phân có lẫn máu.
Clostridium botulinum: có trong thực phẩm đóng hộp bị ô nhiễm trong quá trình
chế biến: cá, thịt, các loại rau ... làm giảm lực cơ, đặc biệt là ở mắt (gây mờ mắt)
và ở phổi (làm khó thở).
Escherichia coli: các độc tố E. coli sinh ra chủ yếu là hai loại độc tố chịu nhiệt và
không chịu nhiệt. Vi khuẩn này gây rối loạn tiêu hóa, buồn nôn, tiêu chảy, đau
bụng, mất nước; có loại gây triệu chứng giống hội chứng lị hoặc phân có máu,
bệnh tả.
16


17

Staphylococcus aureus: phát tán qua đuờng hô hấp, trên da hay bề mặt vết thương.
Khi xâm nhiễm vào thực phẩm chúng sẽ sản sinh ra các độc tố ngoại bào bao
gồm nhiều loại độc tố ruột bền nhiệt và các enzym có khả năng hỗ trợ cho độc tố
gây độc cho người [ ]. Vi khuẩn này khi xâm nhiễm gây buồn nôn, nôn, tiêu
chảy, đau bụng, mất nước nặng.
Shigella spp: có hai loại độc tố điển hình là độc tố đường ruột và độc tố thần kinh
gây tiêu chảy, nôn, mất nước và nặng nhất là lị. Vi khuẩn này có trong sữa và các
thực phẩm bị ẩm ướt, nhiễm phân.
Clostridium butulinum: là vi khuẩn gây ngộ độc týp A, B. Nó là trực khẩn kị khí
tuyệt đối, tồn tại trong đất, phân động vật, ruột cá, từ đó vi khuẩn đột nhập vào
thực phẩm, dưới ảnh hưởng của nhiệt độ cao vi khuẩn hình thành các bào tử rất
bền vững. Dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là liệt thần kinh do tổn thương thần kinh
trung ương và hành tủy.
Vibrio spp: gây ra các vụ dịch tả lớn do tạo các độc tố tả cholerae-toxin rất mạnh.
Ngoài ra còn cã ®éc tè nh­ hemolysin bỊn nhiƯt. triƯu chøng ngé độc Vibrio là
đau thắt vùng bụng, viêm nhiễm đường ruột, tiêu chảy mạnh và nôn mửa.
Yersinia enterocolitica: sản sinh độc tố bền với quá trình thanh trùng, gây sốt, đau

quặn bụng và tiêu chảy. Đôi khi gây nhiễm độc thần kinh, nhiễm độc máu và các
bộ phận khác.
Listeria: có mặt trong các thực phẩm chưa qua xử lí nhiệt, bảo quản lạnh trong
thời gian dài. Khi bị nhiễm độc, người bệnh có thể bị nhiễm trùng máu, viêm
màng nÃo. Phụ nữ có thai có thể bị sảy thai hoặc sinh non.
1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nhiễm tạp vi sinh vật trong sữa tươi
nguyên liệu
Vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa tươi có thể gồm nhiều loài khác nhau và từ nhiều
nguồn khác nhau. Mật độ vi sinh vật trong sữa cao thường là hậu quả cña sù kÕt

17


18

hợp của một vài nguyên nhân ví như điều kiện vệ sinh không đảm bảo và điều
kiện lạnh không đảm bảo.
Sữa được tổng hợp từ những tế bào đặc biệt của tuyến vú vì vậy nó hoàn toàn vô
trùng khi được tiết vào các tia sữa của tuyến vú (Tolle, 1980). Do đó khi được vắt
ra khỏi bò thì sữa cã thĨ bÞ nhiƠm theo 3 ngn chÝnh (Bramley ADN McKinnon,
1990); từ vú bò bị bệnh, từ bề mặt kém vệ sinh của vú bò, từ tay người vắt sữa và
dụng cụ chứa sữa. Chính vì vậy để kiểm soát mức độ nhiễm tạp vi sinh vật trong
sữa thì các yếu tố như sức khoẻ và độ vệ sinh của bò, môi trường nuôi, vắt sữa,
qui trình vệ sinh thiết bị vắt sữa và thiết bị bảo quản sữa chính là những yếu tố
quyết định. Bên cạnh đó còn có yếu tố nhiệt độ và thời gian bảo quản là những
điều kiện ảnh hưởng đến sự tăng sinh cuả vi sinh vật trong sữa. Tất cả các yếu tố
trên sẽ ảnh hưởng đến số lượng cũng như chủng loại vi sinh vật trong sữa.
1.4.1. ảnh hưởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp từ trong vú bò
Sữa tươi nguyên liệu được lấy từ những con bò khoẻ mạnh có chứa lượng vi sinh
vật khá thấp khoảng 1000 CFU/ml (Kurweil, 1973). Nói chung trong vú những

con bò khoẻ mạnh cũng có nhiều loại vi sinh vật, tuy nhiên những vi sinh vật này
lại không được coi là nguồn vi sinh vật chính trong tổng số vi sinh vật của sữa và
nó cũng không phải là nguồn vi sinh vật tiềm tàng làm tăng nhiều chỉ số vi sinh
vật tổng số trong sữa qua quá trình bảo quản lạnh. Ngược lại với những con bò bị
viêm vú thì hệ vi sinh vật từ vú bò là nguồn vi sinh vật tiềm tàng làm tăng mạnh
chỉ số vi sinh vật tổng số trong sữa. Tuy nhiên mức độ tăng chỉ số này cũng phụ
thuộc nhiều vào chủng loại vi sinh vật gây viêm vú và tình trạng bệnh viêm vú
cũng như tỷ lệ bò bị bệnh. Sữa từ những con bò bị bệnh này có thể chứa lượng vi
sinh vật nhiều hơn 107CFU/ml. Nếu có khoảng 1% sữa được lấy từ bò bị bệnh thì
có thể làm chỉ số vi sinh vật tổng số trong cả thùng sữa lên đến 105CFU/ml
(Bramley ADN McKinnon, 1990). Nhóm vi sinh vật gây viêm vú bò thường làm
tăng chỉ số vi khuẩn tổng số trong sữa đó lµ nhãm Streptococcus spp., nh­ S.
18


19

agalactiae vµ S. uberis (Bramley vµ McKinnon, 1990; Bramley et al., 1984;
Gonzalez et al., 1986; Jeffrey vµ Wilson, 1987. Staphylococcus aureus không
được cho là nhóm làm tăng chỉ số vi khuẩn tổng số trong sữa lên cao nhưng cũng
có nghiên cưú cho thấy mật độ của chúng trong sữa có thể lên đến 60
000CFU/ml (Gonzalez et al., 1986). Việc phát hiện thấy vi sinh vật gây bệnh
trong sữa cũng không hẳn đều là do bò bị viêm vú mà có thể còn do các nguyên
nhân khác như mức độ vệ sinh của bò, dụng cụ vắt và chứa sữa kém.
1.4.2. ảnh hưởng của nhóm vi sinh vật nhiễm tạp ngoài vú bò
Những vi sinh vật ở bề ngoài của vú bò chính là ở trên lớp da bò. Những vi sinh vật
này thường từ môi trường sống, môi trường vắt sữa bám trên da bò sau đó đi vào sữa
trong quá trình vắt. Thường thì vú bò bao giờ cũng được vệ sinh trước khi vắt sữa vì
vậy nhóm vi sinh vật này không làm tăng nhiều chỉ só vi sinh vật tổng số trong sữa
và chúng cũng thường không có tính cạnh tranh trong quá trình phát triển trong sữa.

Nhưng nếu vú bò còn vương lại bẩn do phân, bùn, thức ăn hoặc ổ rơm nằm thì số
lượng và chủng loại vi sinh vật nguy hiểm sẽ tăng nhanh. Vi sinh vật tổng số trong
các ổ nằm của bò thường rất cao khoảng 108-1010 CFU/g (Bramley, 1982; Bramley
và McKinnon, 1990; Hogan et al., 1989; Zehner et al., 1986). Vi sinh vật có liên
quan đến ổ nằm của bò và nhiễm tạp trên bề mặt của vú bò bao gồm các loại
streptococci, staphylococci, các chủng tạo bào tử, coliforms và các vi khuẩn
gram âm khác. Trên bề mặt vú bò có xuất hiện cả những loài chịu nhiệt và những
loài chịu lạnh (Bramley ADN McKinnon, 1990). Điều đó cho thấy sự nhiễm tạp
ở ngoài vú bò sẽ ảnh hưởng đến chØ sè Lab Pasteurization Counts (LPCs),
Preliminary Incubation Counts (PICs)
1.4.3. ¶nh hưởng của quá trình vệ sinh thiết bị
Quá trình vệ sinh thiết bị có thể ảnh hưởng đến mức độ cũng như chủng loại vi
sinh vật nhiễm tạp trong sữa. Mỗi qui trình vệ sinh khác nhau cũng có thể kh«ng

19


20

hiệu quả đối với một loài đặc biệt nào đó. VÝ dơ khi vƯ sinh b»ng n­íc nãng th×
vÉn cã thể còn một số loài chịu nhiệt cao còn sống sót. Ngược lại nếu vệ sinh
không tốt bằng nước ở nhiệt độ thấp và không sử dụng muối thì sẽ làm cho các
trực khuẩn gram âm (coliforms và Pseudomonads) và lactic streptococci phát
triển nhanh hơn và làm tăng chỉ số PICs. Sử dụng clo và iod để vệ sinh sẽ làm
giảm các loài ưa lạnh và làm giảm chỉ số PICs (Jackson ADN Clegg, 1965). Sù
xt hiƯn nhiỊu c¸c vi khuẩn ưa lạnh thường liên quan đến quá trình vệ sinh thiết
bị không tốt và không thường xuyên (Olson và Mocquat, 1980; Thomas et al.,
1966, MacKenzie, 1973; Thomas, 1974). S÷a còn dính trên bề mặt thiết bị nếu
không đuợc làm vệ sinh tốt sẽ là điều kiện lý tưởng cho nhiều loại vi sinh vật
phát triển. Nước dùng trong các nông trại cũng có thể là một nguồn chứa vi sinh

vật (Bramley và McKinnon, 1990).
1.4.4. ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản
Nhiệt độ và thời gian bảo quản có ảnh hưởng rất lớn đến chỉ số và chủng loại vi
sinh vật trong sữa. Việc bảo quản lạnh chỉ ức chế đựoc những vi sinh vật thuộc
nhóm ưa ấm, trong khi đó nhóm vi khuẩn ưa lạnh nhiễm tạp vào sữa vẫn có khả
năng phát triển. Thời gian bảo quản sữa tươi nguyên liệu trước khi vào sản xuất
càng lâu (được phép đến 5 ngày) càng có cơ hội cho nhóm vi khuẩn này tăng
sinh.
Nhiệt độ bảo quản cũng rất quan trọng, nhiệt độ bảo quản càng gần với giới hạn
trên cho phép bảo quản (7.2C) thì vi sinh vật sẽ phát triển rất nhanh so với bảo
quản ở nhiệt độ thấp dưới 4.4C. Mặc dù sữa được sản xuất trong điều kiện lý
tưởng với mật độ vi khuẩn ưa lạnh nhỏ hơn 10% vi khuẩn tổng số nhưng sau 2-3
ngày bảo quản ở nhiệt độ 4.4C thì mật độ vi khuẩn chịu lạnh này có thể chiếm
đa số (Gehringer, 1980), và hậu quả là làm tăng chỉ số PICs. Nếu nhiệt độ bảo
quản thấp hơn, khoảng 1-2C thì có thể hạn chế hiện tượng này.

20


21

Trong điều kiện lạnh kém, nhiệt độ lớn hơn 7,2C, ngoài nhóm vi sinh vật ưa lạnh
thì các nhóm vi khuẩn khác cũng có thể phát triển rất nhanh và có thể chiếm đa số
trong sữa tươi nguyên liệu. Streptococci được coi là loài thường có liên quan đến sự
tăng chØ sè vi sinh vËt tỉng sè trong s÷a khi điều kiện lạnh của sữa không đảm bảo,
loài này khi soi trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu và 2 tế bào dính lại nhau
(Phụ lục 2). Những vi khuẩn này sẽ nhanh chóng làm tăng độ axit của sữa. Một số
loài khác lại có thể gây cho sữa có mùi mạch nha (malt) mùi này rất dễ nhận thấy
bởi tính chất đặc trưng của nó. Nguyên nhân là do nhiệt độ bảo quản lớn hơn 15C
do đó ưu tiên cho nhóm vi sinh vật tạo mùi này phát triển (Gehringer, 1980). ở điều

kiện lạnh kém các vi sinh vật không chịu lạnh có thể phát triển, tuy nhiên sự phát
triển cuả nhóm vi sinh vật này cũng không ngăn cản sự phát triển của nhóm vi sinh
vật chịu lạnh. Kết quả loài nào sẽ chiếm ưu thế phụ thuộc vào mật độ nhiễm ban
đầu của loài đó trong sữa (Bramley ADN McKinnon, 1990).
1.5. Một số nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật trong qui trình sản xuất
sữa tiệt trùng
Tại các cơ sở sản xuất, mặc dù luôn áp dụng các qui định về vệ sinh an toàn thực
phẩm cũng như các hệ thống quản lý chất lượng HACCP hoặc CIP nhưng trên cả
dây truyền sản xuất có rất nhiều điểm có nguy cơ nhiễm tạp cao và nhiều nguyên
nhân ảnh hưởng đến mật độ vi sinh vật này trong nguyên liệu, bán thành phẩm và
thành phẩm. Việc phân tích và hiểu rõ nguyên nhân nhiễm tạp sẽ giúp nhà máy
giảm thiểu các tổn thất không đáng có bằng cách đơn giản đó là loại trừ hoặc hạn
chế nguyên nhân đó.
Nguyên nhân do nguyên liệu ban đầu
Nguyên nhân đầu tiên gây nhiễm tạp trong qui trình sản xuất sữa tiệt trùng chính là
ở nguyên liệu và đặc biệt là sữa tươi. Như phần trên đà phân tích có rất nhiều
nguyên nhân gây nhiễm tạp vi sinh vật trong sữa tươi. Việc hạn chế các nguyên
21


22

nhân gây nhiễm từ nông trại sẽ làm giảm số lượng vi sinh vật trong sữa tươi sử dụng
trong nhà máy. Sữa tươi là một loại nguyên liệu chính với thành phần dinh dưỡng và
điều kiện ẩm độ thích hợp cho rÊt nhiỊu vi sinh vËt ph¸t triĨn. ViƯc kiĨm soát sự
nhiễm tạp trong sữa tươi sẽ giúp nhà máy vừa giảm được tổn thất do sản phẩm hỏng
vừa nâng cao được chất lưọng của sữa thành phẩm.
Sữa bột thường được nhập khẩu từ các nước tiên tiến với qui định về vệ sinh an toàn
thực phẩm khắt khe do đó tổng số vi sinh vật nhiễm tạp trong sữa bột thường không
cao. Mặt khác độ ẩm của sữa bột thấp, không thuận lợi cho sự phát triển của VSV

nên mật độ vi sinh vật trong sữa bột không biến động nhiều. Sữa bột là sữa đà được
gia nhiệt trong chế biến nên nếu có vi sinh vật trong đó thì chủ yếu là các loài tương
đối chịu nhiệt như Bacillus. Thậm chí có loài còn tồn tại sau khi tiƯt trïng ë 130140 oC [M.C. te Giffel vµ céng sự, 2002; BERTIL PETTERSSON, 1996 ].

Các nguyên liệu khác như đường, bơ, hương liệu, vitamincũng có thể có một
lượng vi sinh vật nhất định, tuy nhiên về số lượng cũng không nhiều vì đây không
phải là môi trường dinh dưỡng tốt cho sự phát triển của vi sinh vật, mặt khác các
thành phần này cũng là những thành phần dễ kiểm soát về mặt vi sinh vật nên hầu
như các cơ sở sản xuất ít chú ý đến nhóm nguyên liệu này.
Nước là một nguyên liệu đuợc sử dụng tương đối nhiều. Chất lượng nước ở mỗi cơ
sở sản xuất có thể khác nhau do công nghệ xử lý nước khác nhau. Nước sản xuất
bình thường cũng chứa một lượng lớn vi sinh vật tuy nhiên để xử lý loại bỏ hoặc
tiêu diệt lượng vi sinh vật này thì cũng không mấy khó khăn.
Hộp chứa đôi khi cũng là nguy cơ tiềm ẩn cho sự nhiễm VSV của sữa. Mặc dù
nguồn hộp này thưòng có độ sạch về hoá học và vi sinh vật khá cao và được khử
trùng bằng tia tư ngo¹i tr­íc khi giãt hép nh­ng vÉn cã thể có vi sinh vật còn sót
lại. Theo thống kê của trung tâm đào tạo kỹ thuật Lund của Thuỵ sỹ thì nhóm hay
nhiễm trong hộp là Bacillus, Actinomyces, micrococcus, staphylococcus vµ sarcina

22


23

(phụ lục 2). Tuy nhiên sự nhiễm tạp gây ra trong túi cũng ít xảy ra và thường không
xảy ra trên diện rộng.
Nguyên nhân do thời gian và nhiệt độ tàng trữ các bán thành phẩm
Trong các bán thành phẩm trước khi vào tiệt trùng luôn có sẵn một lượng vi sinh
vật nhất định. Cũng giống như sữa tươi nguyên liệu nếu nhiệt độ bảo quản cao và
thời gian bảo quản dài sẽ làm tăng số lượng vi sinh vật trong các bản thành phẩm

này. Trong điều kiện sản xuất bình thường thời gian lưu của mỗi bán thành phẩm
sẽ hầu như cố định.
Phần lớn các cơ sở sản xuất sữa luôn duy trì nhiệt độ dưới 10oC cho các bán
thành phẩm. Tại nhiệt độ này một số vi sinh vật ưa lạnh vẫn có thể phát triển
được.
Nguyên nhân do quá trình làm sạch thiết bị không tốt
Các bán thành phẩm luôn tiếp xúc với hệ thống đường ống và thùng chứa, nếu
quá trình vệ sinh trước và sau sản xuất không tốt sẽ dễ dàng làm nhiễm tạp vào
sản phẩm. Bacillus và Lactobacillus là hai loài chịu nhiệt và chịu axit tốt thường
nhiễm vào sữa từ đường ống và thùng chứa khi vệ sinh không tốt. Một số loài
như Micrococcus, Staphylococcus và Sarcina cũng hay nhiễm vào sữa từ phin lọc
vệ sinh không tốt (phụ lục 2)
Nguyên nhân do chế độ tiệt trùng không đảm bảo
Nếu chế độ tiệt trùng không đảm bảo nguy cơ sữa thành phẩm không đạt chỉ
tiêu vi sinh vật là khá cao. Quá trình rót vẫn diễn ra bình thường đến khi lấy mẫu
sản phÈm kiĨm tra ph¶i mÊt 24h míi cã kÕt qđa và như vậy lô sản phẩm không
được bảo quản lạnh đà bị hỏng. Sự cố này rất nguy hiểm vì cả lô hàng này sẽ bị
loại bỏ gây thiệt hại về kinh tế rất lớn. Hiện tượng này cũng ít xảy ra chỉ khi thiết
bị tiệt trùng có sự cố.

23


24

Trường hợp chế độ tiệt trùng vẫn đảm bảo nhưng trong bán thành phẩm có những
vi sinh vật tạo bào tử chịu nhiệt cao như Bacillus sporothermoduran thì ở sản
phẩm ci cịng vÉn cã thĨ cã vi sinh vËt. Tuy nhiên, loài này phát triển chậm,
không gây độc tố và không làm thay đổi cảm quan của sữa nên thiệt hại gây ra
bởi loài này cũng không lớn.

Nguyên nhân do quá trình rót hộp không đảm bảo vô trùng
Sau tiệt trùng sữa không còn chứa vi sinh vật nhưng trong quá trình rót hộp nếu
điều kiện vệ sinh môi trường làm việc kém, chế độ vô trùng phòng rót hộp không
đảm bảo thì sản phẩm sẽ bị tái nhiễm. Sự tái nhiễm này thường ở mật độ vi sinh
vật ban đầu thấp nên nếu lấy mẫu phân tích ngay có thể cho kết quả âm tính giả.
Sau một thời gian lưu kho sản phẩm, mật độ vi sinh vật tăng dần và làm hỏng
sữa.
2.6. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm
Trong tất cả các nhà máy về thực phẩm đều có bộ phận kiểm soát về mặt vi sinh vật.
Bộ phận này có nhiệm vụ kiểm soát vi sinh vật trong nguyên liệu xem khi nhập có
đủ chất lượng để nhập không? Trong quá trình bảo quản nguyên liệu phải kiểm soát
sao cho không bị hư hỏng. Trong quá trình chế biến bộ phận này có nhiệm vụ kiểm
soát sự nhiễm tạp trong cả dây truyền sản xuất để đảm bảo sản phẩm cuối cùng có
chất lượng đạt yêu cầu đề ra. Tiếp đến sẽ phải kiểm soát chất lượng của sản phẩm
cuối xem có đủ điều kiện xuất hàng không? điều kiện bảo quản sản phẩm trước khi
đến tay ngươì tiêu dùng.
Để kiểm soát vi sinh vật thì có rất nhiều các phương pháp. Dựa vào thời gian cho
kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp đó là phương pháp truyền
thống và phương pháp nhanh. Từ trước đến nay đa số các nhà máy về thực phẩm
thường sử dụng nhóm phương pháp truyền thống. Cùng với sự phát triển của khoa
học kỹ thuật, các thiết bị phân tích hiện đại và các phương pháp phân tích nhanh

24