Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen ở bèo tấm lemna aequinoctialis

Vũ văn tiến

bộ giáo dục và đào tạo
trường đại học bách khoa hà nội
---------------------------------------

luận văn thạc sĩ khoa học

công nghệ sinh học

ngành : công nghệ sinh học

Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh
Và chuyển gen ở bèo tấm
lemna aequinoctialis

Vũ văn tiến

2005 - 2007
Hà Nội
2007

Hà Nội 2007


1

Lời cảm ơn
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS Lê Huy
Hàm, PGS.TS Đỗ Năng Vịnh đà tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, đóng góp nhiều ý
kiến quý báu trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi tới lÃnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp và tập thể cán bộ
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, đặc biệt là TS. Phạm
Lý Thu, CN. Phùng Thị Thu Hà, KS. Nguyễn Hải Anh, lời cảm ơn về sự giúp
đỡ nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Khánh Vân, đà tận tình giúp đỡ
và đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thày, Cô giáo Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ thực phẩm, các cán bộ Trung tâm Đào tạo Sau Đại học và Ban Giám
hiệu Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đà nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành báo cáo luận
văn.
Tôi cũng xin cảm ơn GS. Landolt Elias thuộc Viện Địa thực vật học, Học
viện Liên bang Thuỵ Sỹ đà giúp đỡ chúng tôi phân loại và xác định đúng tên các
loài bèo.
Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với GS. Peter Stamp và
chương trình nhiệm vụ hợp nghiên cứu theo Nghị định thư với Cộng hoà Liên
bang Đức đà tài trợ kinh phí cho việc thực hiện đề tài của luận văn.
Tôi xin cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đà động viên và tạo
mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận
văn.
Hà Nội, ngày 05 tháng 10 năm 2007

Vũ Văn Tiến


2

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, những
số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực.

Kết quả nghiên cứu này là do tôi thực hiện dưới sự chỉ bảo của các thầy
hướng dẫn và sự giúp đỡ của bạn bè, đồng nghiệp. Mọi sự giúp đỡ cho thực hiện
luận văn đà được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đuợc ghi rõ
địa chỉ và nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Vũ Văn TiÕn


3

Mục lục

Trang
1
2
3
5
6
8

Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình và biểu đồ
Mở đầu

10

Chương 1 Tổng quan tài liệu

12

1.1. Tổng quan về bèo tấm
1.1.1. Cây phân loại bèo tấm
1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm LA
1.1.3. Hình thức sinh sản của bèo tấm
1.1.4. Phân bố của bèo tấm
1.1.5 Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm

12
12
12
13
15
15
16

1.2. Nuôi cấy mô tế bào
1.2.1. Tính toàn năng của tế bào
1.2.2. Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật
1.2.3. Môi trường nuôi cấy
1.3. chuyển gen thực vật
3.1. Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens
3.2.Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
1.4.

chuyển

gen

thông

qua

Agrobacterium

tumefaciens
1.4.1. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
1.4.2. Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA
1.4.3. Cơ chế phân tử của quá trình chuyển gen thông qua
Agrobacterium tumefaciens

17
17
18
21
21
23
26
26
27
27


4

1.4.5. Hệ thống vectơ chuyển nạp
1.5. Tình hình nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh

29
32

và hệ thống chuyển gen ở bèo tấm
1.5.1. Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh
1.5.2. Các nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên

32
33
35

cứu
2.1. Nội dung nghiên cứu
2.2. Vật liệu nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 Kết quả và thảo luận
3.1. Xây dựng hệ thống tái sinh
3.1.1. Tạo vật liệu vô trùng
3.1.2. Tối ưu hoá môi trường nhân cây bèo
3.1.3. Tối ưu hoá môi trường tạo callus
3.1.4. Nhân sinh khối callus dạng I
3.1.5. Tái sinh cây từ callus
3.2. Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây
3.2.1. Kết quả sàng lọc chủng vi khuẩn

3.2.2. So sánh hai kỹ thuật tăng cường tiếp xúc: ly tâm và hút chân
không

35
35
37
46
46
46
47
53
62
64
70
70
71

3.2.3. ảnh hưởng của thời gian hút chân không

73

3.2.4. ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn

74

3.2.5. ảnh hưởng của AS

75

3.2.6. ảnh hưởng của kanamycine và hygromycine tới hệ số nhân và

sức sống bèo LA

76

Kết luận và đề nghị

81

Tài liệu tham kh¶o

83


5

Danh mục các chữ viết tắt
2,4-D: 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid
2iP: 6-(,-Dimethylallylamino) Purin
AS: Acetosyringone
BAP: 6-Benzyl Amino Purin
CH: Casein Hydrolysate
cs: céng sù
DNA: Deoxy ribo-Nucleic Acid
§C: §èi chøng
GUS: β-glucuronidase
IAA: Indol-3-Acetic Acid
IBA: Indol -3-Butyric Acid
KTST: KÝch thÝch sinh tr­ëng
LA: Lemna aequinoctialis
MCS: Multi-Cloning Site

MS: Murashige and Skoog, 1962
NAA: α-Naphthalenacetic Acid
NOS: Nopaline Synthetase
OD 600 : MËt ®é vi khn ®o ë b­íc sãng 600nm b»ng quang phỉ kÕ DUR800
Spectrophotometer cña h·ng Beckman Coulter
PCA: p-Chlorophenoxyacetic acid
T-complex: transferring- complex (phøc hỵp chun)
T-DNA: transferred-DNA
TDZ: Thidiazuron
vir: virulence
X-Gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid


6

Danh mục các bảng
Thứ tự bảng
Bảng 1.1. Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh

Trang
16

bèo
Bảng 3.1. Hiệu quả khử trùng của các loại hoá chất khác nhau

46

Bảng 3.2. ảnh hưởng của hàm lượng khoáng Hutner tới số cánh bèo

48

nhân sau mỗi ngày nuôi cấy
Bảng 3.3. ảnh hưởng của pH môi trường nuôi tới số cánh bèo nhân

50

sau mỗi ngày nuôi cấy
Bảng 3.4. ảnh hưởng của sucrose tới số cánh bèo nhân sau mỗi ngày

52

nuôi cấy
Bảng 3.5. ảnh hưởng của các nền khoáng và chất điều hoà sinh trưởng

54

khác nhau sử dụng cho tạo callus
Bảng 3.6. ảnh hưởng của tỷ lệ khoáng trong môi trường N6 đến hiệu

56

quả tạo callus
Bảng 3.7. ảnh hưởng của 2,4D và BAP đến hiệu quả tạo callus (%)

57

Bảng 3.8. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến tỷ lệ tạo callus

58

Bảng 3.9. ảnh hưởng của hàm lượng CH đến sự hình thành callus

50

Bảng 3.10. Kết quả tạo callus trên các môi trường có pH khác nhau

60

Bảng 3.11. Kết quả tạo callus dạng I từ dạng II trên các nền khoáng và

61

KTST khác nhau
Bảng 3.12. ảnh hưởng của các kết hợp chất điều hoà sinh trưởng đến

63

chất lượng callus
Bảng 3.13. Kết quả tái sinh callus d¹ng II

64


7

Bảng 3.14. Hiệu quả tái sinh ở các công thức có hàm lượng BAP khác

66

nhau

Bảng 3.15. ảnh hưởng của IAA và kinetin tới khả năng tái sinh cánh

68

bèo
Bảng 3.16. ảnh hưởng của CH tới khả năng tái sinh cây bèo từ callus

69

Bảng 3.17. Biểu hiện tạm thời của gen GUS trên cánh bèo với các

70

chủng vi khuẩn khác nhau
Bảng 3.18. Tỷ lệ biểu hiện tạm thời của các biện pháp tăng cường tiếp

72

xúc (%)
Bảng 3.19. ảnh hưởng của thời gian hút chân không tới biểu hiện tạm

73

thời
Bảng 3.20. ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới biểu hiện tạm thời

74

Bảng 3.21. ¶nh h­ëng cđa AS tíi tû lƯ biĨu hiƯn tạm thời của gen GUS

75

trên cánh bèo
Bảng 3.22. ảnh hưởng của kanamycine tới hệ số nhân và sức sống bèo

76

tấm LA
Bảng 3.23. ảnh hưởng của hygromycine tới hệ số nhân vµ søc sèng bÌo
tÊm LA

78


8

Danh mục các hình và biểu đồ
Danh mục các hình
Thứ tự hình

Trang

Hình 1.1. Vòng sinh sản vô tính của L. aequinoctialis

13

H×nh 1.2. Hoa cđa L.aequinoctialis

14

H×nh 1.3. CÊu tróc Ti plasmid dạng octopine

27

Hình 1.4. Cơ chế lây nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật

29

Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc hệ vector nhị thể

30

Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp

31

Hình 2.1. Bèo tấm Lemna aequinoctialis

36

Hình 2.2. Cấu trúc đoạn T-DNA của vector nhị phân trong chủng AA5

36

Hình 2.3. Vector nhị phân pCAMBIA1301

37

Hình 3.1. Một số hình ảnh bèo tấm LA tái sinh sau khử trùng

47

Hình 3.2. Bèo nhân trên môi trường H/5+1,5% sucrose, pH=6,0

53

Hình 3.3. Callus tạo được trên nền N6/2 với kết hợp 2,4D +BAP

54

Hình 3.4. Mô callus dạng II

55

Hình 3.5. Callus dạng I tạo ra từ callus dạng II

62

Hình 3.6. Nhân callus dạng I trên môi trường chứa 2,0mg/l 2,4D +

63

6,0mg/l BAP
Hình 3.7. Tái sinh cây từ callus dạng II

65

Hình 3.8. Bèo tái sinh từ callus dạng I trên môi trường không có KTST

66

Hình 3.9. Tái sinh bèo từ callus dạng I

70

Hình 3.10. Biểu hiện tạm tới của gen GUS trên bèo tấm với các chủng

71


9

khác nhau
Hình 3.11. ảnh hưởng của kanamycine tới bèo LA

78

Hình 3.12. ảnh hưởng của hygromycine tới bèo LA

79

Danh mục các biểu đồ
Thứ tự biểu đồ
Biểu đồ 3.1: ảnh hưởng của hàm lượng khoáng Hutner đến hệ số nhân

Trang
47

bèo LA
Biểu đồ 3.2: ảnh hưởng của pH lên hệ số nhân bèo tấm

50

Biểu đồ 3.3. ảnh hưởng của sucrose lên hệ số nhân của bèo tấm LA

52

Biểu đồ 3.4. ảnh hưởng của kanamycine tới hệ số nhân và sức sống bèo

77

LA
Biểu đồ 3.5. ảnh hưởng của hygromycine tới hệ số nhân và søc sèng
bÌo LA

79


10

Mở đầu
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Bèo tấm thuộc họ 1 lá mầm, là loài thực vật hạt kín nhỏ nhất đà được biết
đến từ trước tới nay. Chúng là loài thực vật thuỷ sinh sống trôi nổi, tự do trên các
bề mặt nước ngọt (Landolt, 1986).
Bèo tấm có một số đặc tính ưu việt như nhân vô tính nhanh, tạo ra các cây
bèo đồng nhất, có hàm lượng và năng suất protein cao nên có thể được sử dụng
làm thức ăn (Landolt, 1986; Appenroth và Augsten, 1996). Ngoài ra, bèo tấm
cũng được sử dụng để loại bỏ khoáng chất và chất dinh dưỡng khỏi nước thải
(Landolt, 1986; Fujita vµ cs, 1999; Appenroth vµ Augsten, 1996; Bergman vµ cs,

2000). Bèo tấm có thể tiết ra môi trường những protein đích. Chúng không là chủ
thể hay sinh vật trung gian của các loại virus gây bệnh cho người và động vật
(Gasdasca và cs, 2003). Đó là những ưu điểm vượt trội của bèo tấm so với các
loài thực vật khác nên chúng coi là chủ thể khá lý tưởng để sản xuất protein tái tổ
hợp.
Lemna aequinoctialis là một trong những loài bèo có tốc độ sinh sản vô
tính nhanh nhất. Thời gian nhân đôi của chúng trong vòng 24-36 giờ. Cơ thể bèo
Lemna aequinoctialis gồm có phần cánh hình ô-van và 1 rễ duy nhất ở mỗi cánh.
Kích thước cánh trưởng thành dao động trong khoảng 2,0-3,1mm x 3,1-4,0 mm
(Landolt, 1986). Bèo Lemna aequinoctialis dễ nuôi trồng với các thiết bị và thao
tác đơn giản, môi trường dinh dưỡng không phức tạp, hệ số nhân sinh khối lớn
trong thời gian ngắn, hàm lượng protein cao, thành phần acid amin phong phú
(Landolt và Kandeler, 1987; Landolt, 1987).
Cần phải có một hệ thống chuyển gen và đi kèm theo nó là một hệ thống
tái sinh tốt để có thể tạo cây bèo chuyển gen bền vững và sử dụng chúng cho mục


11

đích sản xuất protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, cho tới nay các công bố về cả hai hệ
thống tái sinh và chuyển gen vào bèo tấm đều rất ít. Đặc biệt là không có một
công bố nào mang tính hệ thống và chi tiết về hệ thống tái sinh và chuyển gen ở
bèo L. aequinoctialis
Trên cơ sở những phân tích đó chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu
xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen vào bèo tấm Lemna aequinoctialis
1.2. Mục đích của đề tài
- Xây dựng thành công hệ thống tái sinh cây bèo tấm Lemna
aequinoctialis thông qua callus với tỷ lệ tái sinh cao.
- Xây dựng quy trình chuyển gen nguyên cây vào bèo tấm Lemna
aequinoctialis thông qua Agrobacterium tumefacines với hiệu quả cao.

1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
*ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tái
sinh, khả năng tiÕp nhËn gen tõ Agrobacterium tumefacines ë loµi bÌo tÊm
Lemna aequinoctialis
* ý nghĩa thực tiễn
Là cơ sở để áp dụng cho chuyển gen quan tâm vào bèo tấm Lemna
aequinoctialis nhằm sản xuất protein tái tổ hợp.


12

Chương 1

Tổng quan tài liệu
1.1. Tổng quan về bèo tấm
1.1.1. Cây phân loại bèo tấm
Theo Landolt (1986), bèo tấm thuộc giíi thùc vËt, ngµnh Magnoliophyta,
líp Liliopsida, bé Arales, hä Lemnaceae, chi Lemna, Spirodela, Wolffia,
Wolffiella với trên 40 loài khác nhau.
Les và cộng sự, 2002 đà dựa trên đặc điểm về hình thái, nhiễm sắc thể và
vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm
gồm có 5 chi tức là thêm một chi mới là Landoltia (Les và cs, 2002).
Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, 2004 dựa trên sự so
sánh trình tự đoạn intron nằm giữa locus trnL và trnF của bộ gen lục lạp đà xác
định rằng họ Lemnaceae và Pistia cùng thuộc họ ráy Araceae (Rothwell và cs,
2004).
1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm LA
1.1.2.1. Khái niệm cơ bản về cánh bèo
Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là frond (cánh

bèo), là một tập hợp của các mô có sự biệt hoá hạn chế. Mức độ tổ chức của mô
cánh bÌo trong hä Lemnaceae gi¶m tõ Spirodela tíi Lemna, Wolffiella và Wolffia
(Landolt, 1986).
1.1.2.2. Hình dạng và kích thước cánh bèo
Đa sè bÌo tÊm cã c¸nh máng gièng l¸. Mét sè loài có cánh không dẹt do
có xoang khí lớn. Cánh bèo có hình ovan (hay tròn) dài tới 1,5 cm vµ réng tíi 1


13

cm (S. polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh ®¹t kÝch th­íc 3 mm ë ®iỊu
kiƯn tèi ­u. ë ®iỊu kiƯn th­êng cã thĨ nhá h¬n 1 mm.
KÝch th­íc và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện
bên ngoài và kiểu gen của chúng. Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng,
hàm lượng đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ...
(Landolt, 1986).
1.1.3. Hình thức sinh sản của bèo tấm
Bèo tấm có hai hình thức sinh sản chính: sinh sản vô tính và sinh sản hữu
tính. Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình thức sinh sản
hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất thuận để bảo tồn nòi
giống (Landolt, 1986; Landolt và Kandeler, 1987).
1.1.3.1 Sinh sản vô tính

Hình 1.1. Vòng sinh sản vô tính của L. Aequinoctialis (Landolt, 1986)
Fo cánh mẹ

a cánh con đầu tiên

F1 cánh con thế hƯ thø nhÊt

b c¸nh con thø hai

F2 c¸nh con thÕ hệ thứ 2

+ cạnh dương của cánh

F 2+a (1-a) cánh con đầu tiên của cạnh dương của thế hệ thứ hai phát sinh - cạnh âm của cánh
từ cánh đầu tiên ở cạnh âm của thế hệ đầu tiên


14

Các loài bèo sinh trưởng bằng phương thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân
sinh nằm trong xoang ở vùng gốc cánh. ở điều kiện tối ưu tốc độ sinh sản vô tính
của bèo tấm gần đạt mức tăng theo hàm số mũ. Lượng cánh có thể tăng lên gấp
đôi chỉ sau 24 giờ nuôi cấy ở các loài sinh trưởng nhanh như L. aequinoctialis,
W.microscopica (xem hình 1.1).
+ Vòng đời của cánh bèo
Với hình thức sinh sản vô tính, thời gian một vòng đời của cánh bèo chỉ vài
tuần. Theo nhiều tác giả cho biết vòng đời của một cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt
độ nuôi, ở 30oC, vòng đời giảm còn một nửa so với ở 20oC. Trong giai đoạn ngủ
nghỉ và ở nhiệt độ thấp, cánh bèo có thể tồn tại trong vài tháng. Điều kiện dinh
dưỡng cũng có thể ảnh hưởng tới vòng đời. Lượng dinh dưỡng không đủ có thể
làm cánh bèo già hoá nhanh và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần. Nói chung, vòng đời
của một cánh bèo sẽ dài hơn nếu tốc độ nhân cánh thấp hơn. Khi nồng độ dinh
dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu thì cánh bèo bị tổn thương và chết nhanh hơn
bình thường (Landolt, 1986).
1.1.3.2 Sinh sản hữu tính
+Ra hoa
Các cơ quan ra hoa ở bèo tấm LA gồm các

thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị, 1 nhuỵ, hiếm khi có 3 nhị
(xem hình 1.2). ở Spirodela và Lemna, các cơ quan
của hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con. ở
Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh trong 1 xoang ở bề
mặt trên của cánh và không ở cùng xoang phát sinh
cánh con. Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường trung
tâm cánh. Hoa của Wolffiella nằm ở cạnh đường trung
tâm của cánh (Landolt, 1986).

Hình 1.2. Hoa của L.A
St: nhị; Pi: Nhuỵ; Pe: lá bắc
(Landolt, 1986)


15

+Quả và hạt
Khoảng 2 - 5 tuần sau khi thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khô và
thường có 1 hạt. ở hầu hết các loài quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana
và L. perpusilla. Quả dài từ 0,35 mm 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình
trứng với 1 vảy đen ở đỉnh. Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có dạng hình
trứng hoặc tam giác. Kích thước hạt biến đổi trong cùng 1 loài và giữa các loài từ
0,3 - 2 mm vỊ chiỊu dµi vµ 0,2 - 0,8 mm về đường kính. Hạt có vỏ hạt ngoài và
vỏ trong, nội nhũ và phôi. Vỏ ngoài gồm 2 - 11 lớp tế bào của biểu bì ngoài, ở
đỉnh có nhiều lớp tế bào hơn ở giữa và cuối hạt (Landolt, 1986).
1.1.4. Phân bố của bèo tấm
Bèo tấm phân bố khắp thế giới trừ vùng cực bắc và cực nam quanh năm
giá lạnh. Vùng sa mạc và vùng đất rất ẩm ướt thì khá hiếm. Trong 4 chi bèo tấm
thì 3 chi ( Spirodela, Lemna, Wolffia) được phân bố khắp thế giới, Wolffiella ít có
ở châu Mĩ và châu Phi. Spirodela cã t©m ph©n bè ë Nam Mü. Chi Lemna cã tính

đa dạng cao nhất ở Bắc Mĩ và Đông Nam á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng
ven nhiệt đới của châu Mĩ và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mĩ, Đông
Nam á và châu úc.
L. aequinoctialis được phân bố rộng rÃi ở các vùng ấm áp trªn thÕ giíi.
Cïng víi nghỊ trång lóa n­íc, chóng cã mặt rộng rÃi ở nhiều vùng khác nhau
như Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mĩ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật
Bản(Landolt, 1986).
1.1.5. Thành phần dinh dưỡng của cây bèo tấm
Hàm lượng c¸c chÊt dinh d­ìng cđa bÌo tÊm rÊt cao. BÌo tấm có chứa các
vitamin A, B1, B2... và các axit amin không thay thế, trừ methionin. Bèo tấm
nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong số các loài thực vật có hàm lượng protein


16

tổng số đạt cao nhất. Hầu hết các loài bèo có hàm lượng protein đạt từ 6,8-45%
phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện nuôi cấy (Landolt và Kandeler, 1987).
Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh
sáng, nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi (đặc
biệt là nitơ). Hàm lượng protein và các thành phần hữu cơ khác có trong cánh bèo
được liệt kê ở bảng 1.1 (Landolt và Kandeler, 1987).
Bảng 1.1. Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo
Thành phần

Hàm lượng (% trọng lượng khô)

Proteins

6,8 - 45

Lipids

1,8 - 9,2

Sợi thô

5,7 - 16,2

Đường

14,1 - 43,6

Tro

12,0 - 27,6

BÌo sinh tr­ëng trong ®iỊu kiƯn tèi ưu về dinh dưỡng và các điều kiện nuôi
cấy thì hàm lượng protein có thể đạt tới 45% trọng lượng chất khô (Leng và cs,
1994). Hàm lượng protein này rất cao so với các loài thực vật khác và tương
đương với hàm lượng protein có trong đậu tương.
1.2. Nuôi cấy mô tế bào
Hầu hết các phương pháp chuyển gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen
đều đòi hỏi phải có cây hoàn chỉnh được tái sinh từ các tế bào hay mô cây đÃ
chọn lọc sau quá trình chuyển gen. Bước tạo cây tái sinh từ mô nuôi cấy thường
là bước khó nhất trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật. Tuy nhiên cũng cần
biết là tỉ lệ tái sinh cao không nhất thiết tương ứng với tỉ lệ chuyển gen cao (Đỗ
Năng Vịnh, 2005).


17

1.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, nhà thực vật học người Đức Haberlandt G. đà đề xuất học
thuyết về tính toàn năng của tế bào và cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy
mô tế bào dựa trên học thuyết này. Theo học thuyết này, tất cả các tế bào của cây
đều mang lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi
tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Ngày nay, rất
nhiều loài cây trồng đà được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi
cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số
nhân giống vô cùng lớn (Đỗ Năng Vịnh, 2005).
1.2.2. Các hướng tái sinh cây từ mô thực vật
Có hai con đường tái sinh cây được sử dụng rộng rÃi trong các nghiên cứu
chuyển gen thực vật đó là sự phát sinh phôi sô ma và sự phát sinh cơ quan.
1.2.2.1. Sự phát sinh phôi sô ma
Các phôi sô ma có thể được tạo ra trực tiếp hoặc gián tiếp từ mô sinh
dưỡng. Trong quá trình phát sinh phôi sô ma trực tiếp, phôi được tạo trực tiếp từ
một tế bào hoặc một nhóm tế bào nhỏ thường là mô phôi tâm, hạt phấn hay noÃn
mà không tạo ra từ callus trung gian. Sự phát sinh phôi sô ma trực tiếp nói chung
khá hiếm so với sự phát sinh sô ma gián tiếp (Zimmerman, 1993).
Với con đường phát sinh phôi sôma gián tiếp, callus trước tiên được tạo ra
từ mẫu cấy. Phôi sau đó có thể được tạo ra từ mô callus hoặc từ huyền phù tế bào
tạo ra từ callus đó. Sự phát sinh phôi sô ma từ cà rốt là ví dụ kinh điển của sự
hình thành phôi sô ma gián tiếp (Edwin, 1993/1996; Zimmerman, 1993).
Quá trình phát sinh phôi sôma thường được chia làm hai giai đoạn khác
nhau. Trong giai đoạn khởi đầu (tạo mô phôi hoá), nồng độ 2,4-D cao th­êng


18

được sử dụng. ở giai đoạn tạo phôi, phôi được tạo ra trong môi trường không có

hoặc hàm lượng 2,4-D rất thấp (Edwin, 1993/1996).
1.2.2.2. Sự phát sinh cơ quan
Phôi sô ma tái sinh thành cây qua một quá trình tương tự với sự nảy mầm
phôi hợp tử. Quá trình phát sinh cơ quan tạo ra các cơ quan trực tiếp từ một mẫu
hoặc từ callus. Có 3 phương pháp tái sinh cây thông qua sự phát sinh cơ quan,
tuỳ thuộc vào các cơ quan bất định mọc ra từ callus hoặc trực tiếp từ mẫu cấy.
Nói cách khác sự tạo chồi bên và sinh trưởng của chúng có thể được sử dụng để
tái tạo cây hoàn chỉnh từ một số kiểu callus.
Sự phát sinh cơ quan dựa trên tính linh động của mô thực vật và được điều
hoà bởi thành phần của môi trường nuôi cấy. Đặc biệt, tỉ lệ auxin/cytokinin của
môi trường nuôi cấy sẽ quyết định con đường phát triển nào mà mô tái sinh sẽ
hướng theo. Người ta thường kích thích sự tạo chồi bằng cách tăng tỷ lệ
cytokinin/ auxin của môi trường nuôi cấy. Những chồi được tạo ra có thể tạo rễ
khá đơn giản.
1.2.3. Môi tr­êng nu«i cÊy m« thùc vËt
Trong nu«i cÊy m« thùc vật in vitro, môi trường nuôi cấy phải cung cấp tất
cả các ion khoáng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển. Các yếu tố vật lí như
nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng, áp suất thẩm thấu cũng phải được giữ
trong giới hạn cho phép (Đỗ Năng Vịnh, 2005).
1.2.3.1. Môi trường khoáng và các chất bổ sung
Có 3 thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy gồm khoáng đa lượng và
vi lượng, nguồn các bon và nguồn cung cấp các hợp chất bổ sung hữu cơ: axit
amin, vitamin, các chất tạo gel.
+ Thành phần đa lượng ®­ỵc cung cÊp víi sè l­ỵng lín cho sù sinh trưởng
và phát triển của cây, thường ít nhất là 0,1% trọng lượng khô của cây.


19

+ Thành phần vi lượng được cung cấp vào với lượng rất ít nhưng lại có vai

trò rất quan trọng cho cây. Các thành phần vi lượng chủ yếu: Mn, I, Cu, Co, Bo,
Mo, Fe, Zn.
+ Các hợp chất hữu cơ bổ sung gồm 2 vitamin B1 và myo-inositol rất cần
cho cây. Các axit amin chủ yếu được dùng là glycine, arginine, asparagine, axit
glutamic, glutamine, proline, axit aspartic… Axit amin cung cấp nguồn nitơ khử.
Dịch chiết casein có thể được bổ sung làm nguồn axit amin hỗn hợp giá rẻ.
+ Nguồn cacbon từ các đường như: sucrose, glucose, maltose, galactose,
sorbitol
+ Tác nhân tạo gel: Môi trường nuôi cấy thực vật có thể ở dạng đặc hay
lỏng. Trường hợp môi trường đặc cần sử dụng các chất tạo gel. Agar được sản
xuất từ rong biển là dạng chất tạo gel phổ biến được sử dụng. Trong nhiều trường
hợp do yêu cầu cđa øng dơng mµ cã thĨ sư dơng mét sè loại chất tạo gel như agar
và agarose tinh khiết.
1.2.3.2. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
* Có 5 loại chñ yÕu: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene
+ Auxin
Auxin kÝch thích sự phân chia tế bào và sinh trưởng tế bào. IAA là auxin
quan trọng nhất tồn tại trong tự nhiên nhưng ít ứng dụng vì IAA không bền trong
nhiệt độ và ánh sáng. Người ta thường sử dụng các dạng IAA tổng hợp bền hơn
để bổ sung vào môi trường nuôi cấy. 2,4-Diclorophenoxy acetic axit (2,4-D) là
auxin được sử dụng phổ biến nhất và rất có hiệu quả trong hầu hết các trường
hợp. Một số hợp chất auxin khác cũng được sử dụng như: 2,4,5 T, dicamba, IKA,
MCPA, NAA, picloram.
+ Cytokinin


20

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào. Trong tự nhiên, các cytokinin là
một nhóm hợp chất có liên quan về cấu trúc (đồng phân của purine). Trong số đó

có zeatin và 2iP. Chúng ít được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật do không ổn
định và rất đắt (đặc biệt là zeatin). Dạng tổng hợp là kinetin và BAP được sử
dụng nhiều hơn. Một số cytokinin khác là thidiazuron (TDZ) và một số hợp chất
phenyl-urea khác.
+ Gibberellin
Gồm nhiều hợp chất liên quan về cấu trúc tồn tại tự nhiên, được gọi là
gibberellin. Chúng có tác dụng kéo dài tế bào và quy định chiều cao của cây và
bộ quả. GA 3 là gibberrellin được sử dụng phổ biến nhÊt.
+ Abscisic axit (ABA)
ABA øc chÕ sù ph©n chia tÕ bào. Được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật
để kích thích các con đường phát triển khác biệt như sự phân sinh phôi sô ma.
+ Ethylene
Ethylene là chất khí, tồn tại trong tự nhiên. Ethylene liên quan đến quá
trình điều khiển sự chín ở quả cây lâu niên. Nó không được sử dụng phổ biến
trong nuôi cấy mô thực vật vì gây ảnh hưởng không tốt cho mẫu mô thực vật nuôi
cấy.
Trong số các nhóm chất điều hoà sinh trưởng kể trên: auxin và cytokinin là
những điều hoà sinh trưởng thực vật được sử dụng rộng rÃi nhất trong nuôi cấy
mô thực vật và thường được sử dụng phối hợp. Tỷ lệ của auxin/cytokinin quyết
định kiểu nuôi cấy và kết quả thu được. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao nói chung
thích hợp hơn cho tạo rễ, trong khi đó tỷ lệ cytokinin/auxin cao thích hợp hơn
cho tạo chồi. Tỷ lệ trung bình giữa hai loại hợp chất này sẽ thích hợp hơn cho tạo
callus (Edwin, 1993/1996).


21

1.3. chuyển gen thực vật
Hiện nay có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật, chúng được chia
thành 2 loại chính: gián tiếp và trực tiếp. Phương pháp chuyển gen gián tiếp là

phương pháp dựa trên việc đưa 1 cấu trúc gen mang bởi 1 plasmid vào tế bào đích
bằng các vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens hay Agrobacterium rhizogenes.
Phương pháp trực tiếp là phương pháp không sử dụng tế bào vi khuẩn làm đối
tượng trung gian (Trojanowska, 2002).
1.3.1 Chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens
Số lượng các loài cây trồng được chuyển gen thông qua A. tumefaciens
tăng mạnh trong vài năm gần đây. Nhiều loài cây trồng khác nhau đà được
chuyển gen bằng việc áp dụng hai hệ thống chuyển gen:
a) HƯ thèng chun gen in vitro (sư dơng hƯ thống tế bào nuôi cấy in vitro)
b) Hệ thống chuyển gen in vivo (không sử dụng hệ thống tế bào nuôi cấy in
vitro) (Sharma và cs, 2005).
1.3.1.1 Hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium in vitro
Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải
có được sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của Agrobacterium và khả năng tái sinh
của các tế bào sau khi lây nhiễm với Agrobacterium (Birch, 1997).
Một số kỹ thuật hỗ trợ trong quá trình biến nạp đà cải thiện hiệu quả của
hệ thống chuyển gen thông qua Agrobacterium bao gồm:
* Xử lý sóng siêu âm
Xử lý mô thực vật với Agrobacterium trong điều kiện sóng siêu âm tạo ra
các tổn thương nhỏ, đồng nhất ở mô thực vật, cho phép Agrobacterium dễ dàng
xâm nhập vào tế bào thực vật. Bằng phương pháp này đà cải thiện rõ rệt hiệu quả


22

chuyển gen, biểu hiện gus tạm thời đà tăng từ 100-1400 lần ở các tế bào đậu
tương, đậu đũa, cây vân sam trắng, lúa mỳ và ngô sau khi biến nạp với
Agrobacterium theo phương pháp SAAT (Trick và Finer, 1997).
* Ly tâm tế bào
Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium kết hợp với ly tâm đÃ

được áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hoá nhận được
từ hoa chuối đực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và
Lady Finger. Tần số chuyển gen đà được cải thiện đáng kể bằng cách áp dụng
chế độ ly tâm tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn
(Khanna và cs, 2004).
1.3.1.2 HƯ thèng chun gen th«ng qua Agrobacterium in vivo
Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in
planta) và rất phổ biến đối với loài A. thaliana, một trong những loài cây mô hình
đối với các nghiên cứu về hệ gen học. Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời
gian, bỏ qua công đoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được
các biến dị soma và số lượng cây chuyển gen thu được lớn hơn. Kỹ thuật này đÃ
được mô tả ở các cây trồng khác nhau như: đậu tương, Arabidopsis, hoa hướng
dương, hoa rum và cây lạc (Rohini và Rao, 2000).
* Phương pháp chuyển gen vào hạt
Hạt Arabidopsis được lây nhiễm với Agrobacterium sau đó đem trồng và
thu được cây trưởng thành với tần số biến nạp 1%. Hạt Arabidopsis chuyển gen
đà được tạo thành từ các cụm hoa mới xuất hiện sau khi lây nhiễm
Agrobacterium tại những vùng bị tổn thương khi cắt bỏ cụm hoa (Katavic vµ cs,
1994).


23

* Phương pháp ngâm cụm hoa
Một số nghiên cứu chuyển gen đà được tiến hành ở cây Arabidopsis bằng
cách ngâm c¸c thĨ giao tư c¸i cđa hoa non, cơm hoa trong dịch vi khuẩn
Agrobacterium (Desfeux và cs, 2000). Phương pháp này cũng được áp dụng với
các cây 1 lá mầm.
* Phương pháp thấm lọc chân không
Phương pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tương tự như phương

pháp ngâm cụm hoa. Phương pháp này đà được áp dụng ở một số cây trồng, đặc
biệt là cây một lá mầm. Trong môi trường chân không, tế bào thực vật tiếp xúc
với Agrobacterium tốt hơn. Người ta đà nhận được các cây Medicago truncatula
(cây mô hình thuộc họ đậu) chuyển gen bền vững bằng phương pháp chuyển gen
này (Trieu và cs, 2000).
1.3.2. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
1.3.2.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen
Bắn gen là một kĩ thuật sử dụng các mảnh kim loại kích thước m được
bọc các DNA và được tăng tốc bắn vào các tế bào đích ở tốc độ đủ để xuyên qua
thành tế bào mà không gây tổn hại nghiêm trọng tới tế bào (Taylor và Fauquet,
2002). Theo cách đó, gen quan tâm được chuyển vào bên trong của tế bào nơi nó
được tách khỏi vỏ hạt vi đạn và được tổ hợp vào nhân hay bộ gen. Phương pháp
bắn gen được phát triển vào những năm 1980 nhằm cạnh tranh với phương pháp
chuyển gen bằng Agrobacterium. Phương pháp được áp dụng cho hầu hết các loài
cây không thuộc họ cà, cây ngũ cốc, cây họ đậu.
1.3.2.2. Chuyển gen nhờ Silicon Carbide
Nguyên lý: Các sợi Silicon Carbide được đưa vào huyền phù chứa mô thực
vật (màng tế bào, phôi non, callus) và DNA plasmid. Tất cả được trộn bằng máy


24

votex, máy lắc hoặc máy đảo. Sợi Silicon Carbide bọc DNA sẽ xuyên qua thành
tế bào do có các lỗ nhỏ tạo ra trên thành tế bào khi sợi Silicon Carbide va đập với
tế bào. Sợi Silicon Carbide hay được sử dụng là các tinh thể đơn lẻ của các
khoáng chất hữu cơ như thạch anh (silica). Silicon Carbide có hình dạng ống dài
từ 10 - 80 mm, đường kính 0,6 mm và ít bị co giÃn.
ưu điểm chính của phương pháp này là giá rẻ và có thể sử dụng cho các
loại vật liệu thực vật khác nhau. Nhược điểm chính là tỉ lệ chuyển gen không cao,
gây tổn thương tế bào dẫn đến khả năng tái sinh kém và cần phải tuân thủ qui

trình cảnh báo nghiêm ngặt khi làm trong phòng thí nghiệm, nếu hít phải sợi
Silicon Carbide, đặc biệt là sợi amiăng có thể bị bệnh nghiêm trọng.
Có một số kết quả đà đạt được của phương pháp này như thu được dạng
chuyển gen-dòng tế bào hay cây ở ngô, lúa mì, thuốc lá
1.3.2.3. Chuyển gen bằng xung điện
Xung điện vào tế bào và mô thực vật rất giống về nguyên lí với xung điện
tế bào trần. Sự khác biệt ở chỗ vật liệu thực vật sử dụng là bao phấn, hạt phấn,
mảnh lá, phôi, callus, hạt hay chồi. Để chuyển gen cả DNA plasmid và vi khuẩn
Agrobacterium đều có thể được sử dụng.
Kĩ thuật này đà được sử dụng trên nhiều loài: thuốc lá, lúa gạo và lúa mì.
Các thí nghiệm để thu cây chuyển gen (bền vững) cũng bắt đầu từ đầu những
năm 90. Kết quả tốt nhất đạt được ở ngô: 6,25 % cây chuyển gen thu được thông
qua chuyển vào phôi và 54,6% với callus ( DHalluin và cs, 1992). Các tác giả
tính toán rằng cứ 10000 tế bào thì có 1 nhận được gen chuyển. ở lúa mì, tỉ lệ thu
được cây chuyển gen chỉ đạt 0,28%. Mặc dù phương pháp này rất đơn giản và
hiệu quả trên một số loài, nó vẫn ít được sử dụng để chuyển gen thực vËt.
1.3.2.4. Kü thuËt vi tiªm