Nghiên cứu động thái và khả năng di chuyển của một số kim loại nặng Cu Pb Zn trong đất lúa sử dụng nước tưới từ sông Nhuệ khu vực Thanh Trì Hà Nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--------------

NGUYỄN VIỆT PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU 7 CÂY THUỐC VIỆT NAM
CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH
Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHỆM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--------------

NGUYỄN VIỆT PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU 7 CÂY THUỐC VIỆT NAM
CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH
Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHỆM
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62420116

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. GS. VS. TSKH. Đái Duy Ban
2. PGS. TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, khách quan,
một phần đã cơng bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý, cho
phép của các đồng tác giả.
Phần cịn lại chƣa đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả

NCS. Nguyễn Việt Phƣơng

i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận án tốt nghiệp tôi đã nhận đƣợc sự
dạy dỗ tận tình của các thầy cơ, sự giúp đỡ động viên của đồng nghiệp, gia đình và
bạn bè. Với tất cả sự kính trọng và lịng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:
- GS. VS. TSKH. Đái Duy Ban và PGS. TS. Nguyễn Quang Huy là những
ngƣời Thầy hƣớng dẫn khoa học, đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm để
tơi có thể hồn thành luận án.
- PGS. TS. Hồ Bá Do - P. Chủ tịch Hội Y Dƣợc học Cổ truyền Việt Nam và PGS

TS. Nguyễn Văn Mùi - Giám đốc Trung tâm Công nghệ Hóa sinh Ứng dụng đã ln
động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt nhất để tơi có thể hồn thành đƣợc luận án.
- Khoa Sinh học - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà
Nội nơi có những thầy cơ, bạn bè, đồng nghiệp đã tận tâm hƣớng dẫn và tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành
luận án.
- Ban giám hiệu, phịng Sau đại học, Khoa Sinh học, Bộ mơn Hóa sinh và Sinh
học Phân tử - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Ban giám đốc, cán bộ, nhân viên Khoa kiểm soát dịch bệnh, HIV/AIDS Trung tâm Y tế quận Tây Hồ - Hà Nội. Xin chân thành cảm ơn BS. Đặng Thị Bích
Lan, BS. Nguyễn Thị Phƣơng, BS. Cao Thị Hoa Bằng, BS. Lê Thị Hồng Loan,
bệnh nhân, gia đình bệnh nhân đã tích cực hợp tác, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi
hồn thành luận án này.
- Xin chân thành cảm ơn các chuyên gia của Tổ chức thầy thuốc thế giới Pháp
(MDM), Tổ chức PACT Việt Nam, Tổ chức phát triển quốc tế - Mỹ (USAID) đã có
những góp ý thiết thực giúp tơi hồn thành luận án.
- Xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp ở Viện Dƣợc liệu TW, Viện Thú y
TW, Trung tâm Tiên tiến về Hóa sinh Hữu cơ - Viện Hóa sinh Biển - Viện Hàn lâm
Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam, Phịng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện
Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
Cuối cùng con xin nhớ ơn cha mẹ, vợ, hai con yêu quý, xin đƣợc cảm ơn
những ngƣời thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã ln động viên, giúp đỡ
tơi trong suốt q trình học tập vừa qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
NCS. Nguyễn Việt Phƣơng

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ ix
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... xii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH MIỄN DỊCH ...................................................... 4
1.1.1. Suy giảm miễn dịch bẩm sinh ................................................................. 4
1.1.2. Suy giảm miễn dịch mắc phải ................................................................. 5
1.2. HỆ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT ............................................................... 6
1.2.1. Các cơ quan lympho tham gia đáp ứng miễn dịch .................................. 6
1.2.2. Đáp ứng miễn dịch ở gia cầm ................................................................. 8
1.2.3. Giới thiệu bệnh do virus Gumboro ......................................................... 9
1.2.4. Giới thiệu Hội chứng rồi loạn sinh sản và hô hấp do virus ở lợn ......... 11
1.3. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .............. 12
1.4. MỘT SỐ HỢP CHẤT THỰC VẬT THỨ SINH HỖ TRỢ MIỄN DỊCH
ĐƢỢC BIẾT ĐẾN .......................................................................................... 12
1.4.1. Các Alkaloids ........................................................................................ 12
1.4.2. Các Flavonoids ...................................................................................... 13
1.4.3. Các hợp chất Phenol và Tanin .............................................................. 13
1.4.4. Glycoside............................................................................................... 14
1.4.5. Saponins ................................................................................................ 15
1.4.6. Adenosine và cordycepin ...................................................................... 16
1.5. Các cây thuốc đƣợc nghiên cứu ............................................................... 16
1.5.1. Gấc ........................................................................................................ 17
1.5.2. Tam thất ................................................................................................ 18
1.5.3. Đẳng sâm .............................................................................................. 19
1.5.4. Trinh nữ hoàng cung ............................................................................ 19
1.5.5. Linh chi ................................................................................................. 20
iii

1.5.6. Diệp hạ châu ......................................................................................... 21
1.5.7. Đông trùng hạ thảo .............................................................................. 23
1.6. TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC MỚI TỪ NHIỀU CÂY THUỐC VIỆT
NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỰC
NGHIỆM. ........................................................................................................ 25
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 26
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 26
2.1.1. Động vật thực nghiệm ........................................................................... 26
2.1.2. Tiêu chuẩn chọn thỏ làm thí nghiệm ..................................................... 26
2.1.3. Tiêu chuẩn chọn chuột làm thí nghiệm ................................................. 27
2.1.4. Virus cƣờng độc Gumboro .................................................................... 27
2.2. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................. 28
2.2.1. Các cây thuốc đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ..................................... 28
2.2.2. Phân loại mẫu ........................................................................................ 29
2.3. THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 30
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 31
2.4.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu cây thuốc .................................................. 31
2.4.2. Phƣơng pháp xác định một số hoạt chất trong 7 cây thuốc .................. 31
2.4.2.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng carbohydrate ............................... 31
2.4.2.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng phenolic tổng .............................. 33
2.4.2.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polisaccharide ............................. 34
2.4.2.4. Phƣơng pháp định lƣợng saponin toàn phần ...................................... 34
2.4.2.5. Phƣơng pháp xác định adenosin tổng số ............................................ 35
2.4.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng cordycepin................................... 36
2.4.2.7. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng flavonoid ..................................... 36
2.4.2.8. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng Rg1 và Rg2 tồn phần ................ 37
2.4.2.9. Phƣơng pháp định tính nhóm hợp chất phytosterol ........................... 38
2.4.2.10. Phƣơng pháp thử hoạt tính DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) ... 38

2.4.2.11. Phƣơng pháp xác định kim loại nặng (Pb) ………………………...39
2.4.3. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 40
2.4.4. Phƣơng pháp xử lý và phân tích số liệu ................................................ 47

iv


2.4.5. Phƣơng pháp kiểm soát kết quả các xét nghiệm ................................... 47
2.4.6. Đạo đức trong nghiên cứu ..................................................................... 49
2.4.7. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 50
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 51
3.1. LỰA CHỌN 7 CÂY THUỐC THÔNG QUA ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ
HOẠT CHẤT SINH HỌC .............................................................................. 51
3.1.1. Đánh giá về hàm lƣợng adenosin và cordycepin của đông trùng hạ thảo
Isaria cerambycidae Lưu et. Đái 2009. .......................................................... 51
3.1.2. Hàm lƣợng phenolic tổng của trinh nữ hoàng cung.............................. 52
3.1.3. Đánh giá về hàm lƣợng cacbohydrate tổng số có trong linh chi. ......... 53
3.1.4. Đánh giá hàm lƣợng Phenolic tổng số có trong diệp hạ châu .............. 55
3.1.5. Hàm lƣợng -spinasterol 3-O--D-glycopylannosid và polisaccharid
tổng có trong đẳng sâm. .................................................................................. 56
3.1.6. Đánh giá về hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Rg2 toàn phần của tam thất. 58
3.1.7. Đánh giá về hàm lƣợng lycopen và β-Caoroten của Gấc ..................... 59
3.2. BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG CÓ TỶ LỆ PHÙ HỢP TỪ 7
CÂY THUỐC VIỆT NAM ............................................................................. 62
3.2.1. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đẳng sâm (ĐS) có trong Viên tăng sức đề
kháng. .............................................................................................................. 63
3.2.2. Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ diệp hạ châu có trong Viên tăng sức đề kháng
......................................................................................................................... 66
3.2.3. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ linh chi có trong Viên tăng sức đề kháng ...... 68
3.2.4. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ gấc có trong Viên tăng sức đề kháng ............ 69

3.2.5. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ trinh nữ hồng cung có trong Viên tăng sức đề kháng
......................................................................................................................... 71
3.2.6. Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ của tam thất có trong Viên tăng sức đề kháng
......................................................................................................................... 72
3.2.7. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đông trùng hạ thảo có trong Viên tăng sức đề kháng.
......................................................................................................................... 75
3.3. QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG TỪ 7 CÂY
THUỐC ĐƢỢC CHỌN .................................................................................. 76
v


3.3.1. Phƣơng pháp bào chế 1 ......................................................................... 77
3.3.2. Phƣơng pháp bào chế 2 ......................................................................... 79
3.3.3. Kết quả phân tích và kiểm nghiệm Viên tăng đề kháng đƣợc chế tạo.. 82
3.4. NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA VIÊN
TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG ............................................................................... 84
3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp ....................................................................... 84
3.4.2. Nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn ................................................... 86
3.5. Nghiên cứu mơ hình gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở gà Lƣơng
Phƣợng bằng virus Gumboro và thử tác dụng của Viên tăng sức đề kháng ... 91
3.5.1. Các triệu chứng lâm sàng ở gà khi ăn Viên tăng sức đề kháng. ....... 92
3.5.2. Nghiên cứu tổn thƣơng đại thể ở gà. ..................................................... 92
3.5.3. Xét nghiệm giải phẫu bệnh lý vi thể tuyến Fabricius các lô gà ........ 94
3.5.4. Đo hiệu giá kháng thể Gumboro qua phản ứng trung hoà huyết thanh
và theo dõi biểu hiện ở các lô gà. .................................................................... 94
3.6. Nghiên cứu tác động của Viên tăng sức đề kháng lên gà bị gây suy giảm
miễn dịch bằng virus Gumboro thông qua những chỉ số hóa sinh, huyết học.
......................................................................................................................... 97
3.7. Đánh giá biểu hiện của virus PRRS (gây bệnh tai xanh ở lợn) ở cấp độ tế
bào khi thử nghiệm với Viên tăng sức đề kháng. ......................................... 103

3.8. Đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng đối với chức năng, hình
thái gan và thận trên thỏ thực nghiệm. .......................................................... 106
KẾT LUẬN .................................................................................................. 114
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 115
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CÓ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.................................................................... 116
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 117

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách và số lƣợng các mẫu cây thuốc thu nhận cho thí nghiệm
......................................................................................................................... 29
Bảng 2.2. Kết quả phân loại các nhóm cây thuốc đƣợc thử nghiệm .............. 30
Bảng 2.3. Dãy nồng độ xây dựng đƣờng chuẩn Glucose ............................... 32
Bảng 2.4. Dãy nồng độ xây dựng đƣờng chuẩn axit Galic ............................ 33
Bảng 2.5. Giá trị bình thƣờng của hoạt độ amylase trong máu và nƣớc tiểu . 41
Bảng 2.6. Trị số bình thƣờng AST, ALT huyết thanh của một số hãng phân
tích ................................................................................................................... 41
Bảng 3.1. Hàm lƣợng adenosin và cordycepin của đông trùng hạ thảo tại các
vùng ................................................................................................................. 51
Bảng 3.2. Hàm lƣợng phenolic tổng số có trong các mẫu trinh nữ hoàng cung
......................................................................................................................... 52
Bảng 3.3. Hàm lƣợng cacbohydrat tồn phần có trong linh chi ..................... 54
Bảng 3.4. Hàm lƣợng phenolic tổng số của diệp hạ châu trong các mẫu ...... 55
Bảng 3.3.5. Hàm lƣợng -spinasterols-O--D-glycopylannoside và
polysaccharide tổng trong các mẫu đẳng sâm. ................................................ 57
Bảng 3.6. Hàm lƣợng toàn phần ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Rg2............ 58
của tam thất trong các mẫu thu nhận............................................................... 58

Bảng 3.7. Thành phần lycopen và β-Caoroten tổng số trong các mẫu gấc .... 60
Bảng 3.8. Bảng tổng kết 7 cây thuốc đƣợc lựa chọn nghiên cứu. .................. 61
Bảng 3.11. Các chỉ tiêu phân tích ở các lô gà ăn và không ăn bổ sung linh chi.
......................................................................................................................... 68
Bảng 3.12. Các chỉ số phân tích ở các lô gà ăn và không ăn bổ sung gấc. .... 69
Bảng 3.13. Chỉ số phân tích ở các lơ gà ăn và khơng ăn bổ sung trinh nữ
hồng cung. ..................................................................................................... 71
Bảng 3.14. Các chỉ số phân tích ở các lơ gà ăn và không ăn bổ sung tam thất.
......................................................................................................................... 73
Bảng 3.15. Các chỉ số phân tích khi cho gà ăn thức ăn có và khơng có thành
phần đơng trùng hạ thảo. ................................................................................. 75

vii


Bảng 3.16. Khả năng kháng vi sinh vật của Viên tăng sức đề kháng đƣợc bào
chế theo phƣơng pháp 1 .................................................................................. 79
Bảng 3.17. Khả năng thử hoạt tính chống ơ xi hóa của Viên tăng sức đề
kháng đƣợc bào chế theo phƣơng pháp 1....................................................... 79
Bảng 3.18. Khả năng kháng vi sinh vật của Viên tăng sức đề kháng bào chế
theo phƣơng pháp 2. ........................................................................................ 81
Bảng 3.19. Khả năng thử hoạt tính chống ơ xi hóa của Viên tăng đề kháng
đƣợc bào chế theo phƣơng pháp 2 .................................................................. 81
Bảng 3.20. Thành phần các hoạt chất sinh học có trong Viên tăng sức đề
kháng ............................................................................................................... 83
Bảng 3.21. Liều độc LD50 của chuột uống bột Viên tăng sức đề kháng ........ 84
Bảng 3.22. Chuột uống dung dịch hồ tinh bột (2%) × 3lần/ngày (đối chứng)
......................................................................................................................... 85
Bảng 3.23. Tác động của Viên tăng sức đề kháng đến phát triển trọng lƣợng
chuột ................................................................................................................ 87

Bảng 3.24. Tác động Viên tăng sức đề kháng đến các chỉ số huyết học của
chuột ................................................................................................................ 88
Bảng 3.25. Tác động của Viên Tăng sức đề kháng đến những chỉ số hóa sinh
thăm dị chức năng gan, thận chuột thí nghiệm .............................................. 88
Bảng 3.26. Kết quả theo dõi các triệu chứng ở 6 lô gà trong thời gian 3 ngày.
......................................................................................................................... 92
Bảng 3.27. Kết quả mổ khám đại thể của 6 lô gà ........................................... 93
Bảng 3.28. Kết quả xét nghiệm giải phẫu bệnh lý vi thể tuyến Fabricius ở
các gà .............................................................................................................. 94
Bảng 3.29. Đo lƣờng hiệu giá kháng thể Gumboro qua phản ứng trung hoà
huyết thanh và biểu hiện lâm sàng gà. ............................................................ 94
Bảng 3.30. Kết quả thử nghiệm ở 6 lô gà (mỗ lô 30 gà) ............................. 95
Bảng 3.31. So sánh giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến hồng cầu lô gà A và
B ...................................................................................................................... 97
Bảng 3.32. Giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến hồng cầu ở lô gà C và
D ...................................................................................................................... 98
viii


Bảng 3.33. Giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến bạch cầu ở lô gà A và B
....................................................................................................................... 100
Bảng 3.34. Giá trị trung bình các chỉ số liên quan đến bạch cầu ở lô gà C và D
....................................................................................................................... 100
Bảng 3.35. Nồng độ protein trung bình trong huyết thanh ở lô gà A và B .. 101
Bảng 3.36. Tác động của Viên tăng sức đề kháng thông qua chỉ số cân nặng
thỏ .................................................................................................................. 107
Bảng 3.37. Tác động của Viên tăng sức đề kháng đến chỉ số AST trong máu
thỏ .................................................................................................................. 107
Bảng 3.38. Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số ALT máu thỏ 108
Bảng 3.39. Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Bilirubin toàn

phần ............................................................................................................... 108
Bảng 3.40. Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Protein toàn
phần ............................................................................................................... 108
Bảng 3.41. Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Ure trong máu
....................................................................................................................... 109
Bảng 3.42. Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số Creatinin trong
máu. ............................................................................................................... 109
Bảng 3.43. Tác động của Viên tăng sức đề kháng tới chỉ số hồng cầu ........ 109
trong máu thỏ ................................................................................................ 109
Bảng 3.44. Tác động của Viên tăng sức đề kháng qua chỉ số bạch cầu ....... 110
trong máu thỏ ................................................................................................ 110
Bảng 3.45. Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học gan thỏ ............................. 111
Bảng 3.46. Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học thận thỏ ............................ 111
Bảng 3.47. Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học lách thỏ ............................ 111

ix


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sơ đồ biệt hóa và vị trí tổn thƣơng các tế bào miễn dịch ................. 4
Hình 1.2. Phát triển Lympho B và T ở gà. ....................................................... 8
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc virus Gumboro........................................................ 10
Hình 1.4. Cấu trúc một số flavonoids có hoạt tính từ thực vật ...................... 13
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của tanin. .......................................................... 14
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo chung của glycoside. ........................................ 15
Hình 1.7. Cấu trúc của các terpenoids có hoạt tính ........................................ 15
Hình 1.8. Đơng trùng hạ thảo. ........................................................................ 25
Hình 2.1. Hỉnh ảnh mẫu đẳng sâm Việt Nam và diệp hạ châu ...................... 29
Hình 2.2. Hỉnh ảnh linh chi và trinh nữ hồng cung ...................................... 29

Hình 2.3. Hỉnh ảnh gấc và tam thất nam ........................................................ 29
Hình 2.4. Đƣờng chuẩn tính theo giá trị của glucose ..................................... 32
Hình 2.5. Đƣờng chuẩn axit galic (GA) ......................................................... 33
Hình 2.6. Đồ thị tƣơng quan giữa mật độ quang học và nồng độ DPPH ....... 39
Hình 2.7. Kết quả chạy QC theo khuyến cáo của nhà sản xuất ..................... 48
Hình 2.8. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu của luận án. ........................................... 50
Hình 3.1. Mẫu trinh nữ hồng cung số 1. ....................................................... 53
Hình 3.2. Mẫu Linh chi số 2 trong nghiên cứu .............................................. 55
Hình 3.3. Mẫu diệp hạ châu số 3 đƣợc tuyển chọn ........................................ 56
Hình 3.4. Mẫu đẳng sâm số 1 đƣợc tuyển chọn và cơng thức hóa học của ... 57
C35H5806 (-spinasterols3-O--D-glycopylannoside). .................................... 57
Hình 3.5. Mẫu Tam thất số 1 đƣợc tuyển chọn làm nguyên liệu ................... 59
Hình 3.6. Mẫu gấc 1 đƣợc lựa chọn làm nguyên liệu. ................................... 60
Hình 3.7. Tỷ lệ các thành phần của 7 cây thuốc trong Viên tăng sức đề kháng
......................................................................................................................... 77
Hình 3.8. Sơ đồ tạo Viên tăng sức đề kháng theo phƣơng pháp 1 ................. 78
Hình 3.9. Sơ đồ bào chế Viên tăng sức đề kháng theo phƣơng pháp 2 ......... 80
Hình 3.10. Thử nghiệm độc tính cấp và độc tính trƣờng của......................... 86
Hình 3.11. Giải phẫu mơ bệnh học thận của các lơ chuột thí nghiệm. .......... 89

x


Hình 3.12. Tuyến Fibricius sƣng tấy, phù nề sau khi bị gây SGMDMP ....... 95
Hình 3.13. Tuyến Fibricius bình thƣờng sau khi dùng chế phẩm .................. 96
Hình 3.14. Mổ khám bệnh tích ở đùi, lƣờn của gà lơ 2 và lơ 5 (lơ đƣợc ăn chế
phẩm) ............................................................................................................. 103
Hình 3.15. Mẫu đối chứng trƣớc khi xử lý Viên tăng sức đề kháng ........... 103
Hình 3.16. Đánh giá tác động Viên tăng đề kháng sau 6 giờ ....................... 104
Hình 3.17. Đánh giá tác động Viên tăng đề kháng sau 28 giờ ..................... 104

Hình 3.18. Đánh giá tác động của Viên tăng đề kháng sau 40 giờ .............. 105
Hình 3.19. Đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng sau 56 giờ ........ 105
Hình 3.20. Thử tác động của Viên tăng sức đề kháng trên thỏ thí nghiệm .. 110
Hình 3.21. Đại thể và vi thể gan thỏ sau khi uống Viên tăng sức đề kháng 112

xi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(Acquired Immune Deficiency Syndrome)

BC

Bạch cầu

BN
BT

Bệnh nhân
Bình thƣờng

CD

Cụm biệt hoá (Cluster of Differentiation)

ĐTB

Đại thực bào

ĐUMD
Env
G/l

Đáp ứng miễn dịch
Vỏ, màng bao
Gigas/liter = 109/lít

HC
HIV
Ig
KN

Hồng cầu
Virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
ở ngƣời (Human Immuno Deficiency Virus)
Globulin miễn dịch (Immunoglobulin)
Kháng nguyên

KT
Lym

Kháng thể
Tế bào Lympho (Lymphocyte)

μL
MDDT
MDTB

NK
SD
SGMD
SLTB
T/L

Microlít
Miễn dịch Dịch thể
Miễn dịch Tế bào
Tế bào giết tự nhiên (Natural Killer Cell)
Độ lệch chuẩn
Suy giảm miễn dịch
Số lƣợng trung bình
Terase/liter = 1012/lít

TB
TC

Tế bào
Tiểu cầu

xii


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Việt Nam là nƣớc nhiệt đới có đặc điểm thổ nhƣỡng, khí hậu địa lý với nhiều
đặc trƣng khác nhau, có hệ thực vật nhiệt đới vô cùng phong phú và đa dạng trong
đó gồm rất nhiều lồi cây thuốc chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao [10].
Từ ngàn xƣa, cộng đồng các dân tộc trên đất nƣớc ta cũng có truyền thống sử dụng

cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe. Trên thế giới, Việt Nam đƣợc đánh giá là
nƣớc có nền y học cổ truyền, lâu đời và ngƣời dân biết cách áp dụng nhiều loại cây
thuốc để bồi bổ, nâng cao thể trạng cơ thể, hỗ trợ và điều trị bệnh ở vật nuôi cũng nhƣ
hỗ trợ sức khỏe ở ngƣời [3, 5]. Tại Việt Nam các cơng trình nghiên cứu về nhiều cây
thuốc để bào chế ra một chế phẩm mới có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng, hỗ trợ
miễn dịch, đƣợc kiểm chứng thơng qua đánh giá một vài chỉ số hố sinh, huyết học,
miễn dịch, tế bào, giải phẫu bệnh và mô tả khả năng kích thích miễn dịch ở động vật
thực nghiệm cũng nhƣ trên ngƣời cịn rất ít, tản mạn bởi nhiều lý do khách quan
cũng nhƣ chủ quan [11, 25, 33].
Có nhiều mơ hình gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở động vật thực nghiệm
đƣợc sử dụng tại Việt Nam và các nƣớc trên thế giới. Tuy nhiên, thƣờng sử dụng gà
bị gây nhiễm virus là mơ hình phổ biến, trong đó virus Gumboro là virus gây bệnh
mạnh nhất. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (bệnh lợn tai
xanh) thƣờng đƣợc nhắc tới trong những nghiên cứu về suy giảm miễn dịch mắc
phải ở lợn [32]. Gà nhiễm virus Gumboro (còn gọi bệnh Sida gà) là một bệnh
truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra ở gia cầm, chủ yếu ở gà. Bệnh có đặc điểm là
gây viêm túi Fabricius, xuất huyết cơ ngực, cơ đùi, làm hoại tử thận và đặc biệt làm
suy giảm hệ thống miễn dịch hoặc mất khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin
phòng các bệnh, gà bệnh dễ bị nhiễm các bệnh truyền nhiễm khác. Bệnh thƣờng xảy
ra khi gà ở giai đoạn từ 3 - 6 tuần tuổi, tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên đến 100% và tỷ
lệ chết từ 20 - 50%. Tại Việt Nam hiện nay chƣa có một sản phẩm nào đƣợc bào
chế từ cây thuốc đƣợc thử nghiệm, ứng dụng phòng, điều trị Gumboro hiệu quả [6,
31]. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRS (Porcine Reproductive &
Respiratory Syndrome) còn gọi là bệnh Tai xanh là một bệnh truyền nhiễm cấp tính
do virus gây nên, bệnh có tính chất lây lan nhanh, tăng nguy cơ chết nhiều lợn, phát
bệnh đồng thời với những bệnh khác. Đặc điểm của bệnh là gây sảy thai, thai chết
lƣu ở lợn. Lợn ốm có triệu chứng điển hình sốt cao trên 40°C, viêm phổi nặng, đặc

1

biệt là gặp nhiều ở lợn con cai sữa. Khi bệnh xảy ra thƣờng gây thiệt hại kinh tế lớn
cho ngƣời chăn nuôi [18, 28].
Các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời đƣợc cả thế
giới nghiên cứu, quan tâm hiện này là hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở
ngƣời - AIDS, do virus HIV gây ra. Trên thế giới, theo báo cáo của chƣơng trình
phối hợp liên hợp quốc về HIV/AIDS, đến cuối năm 2015 thế giới đã có 35 triệu
ngƣời nhiễm HIV, 1,5 triệu ngƣời chết do AIDS và 119 quốc gia đã báo cáo kết quả
có ngƣời nhiễm HIV, thực tế con số này có thể cao hơn [12, 20]. Tại Việt Nam, đến
hết năm 2015 đã phát hiện 10.195 trƣờng hợp nhiễm mới HIV, số bệnh nhân
chuyển sang AIDS là 6130, tử vong do AIDS 2130 trƣờng hợp. Tính đến cuối năm
2015 cả nƣớc hiện có 227.154 trƣờng hợp nhiễm HIV cịn sống và ƣớc tính hiện có
khoảng 254.000 ngƣời nhiễm HIV trong cộng đồng [9].
Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn đã nêu trên, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn
dịch ở động vật thực nghiệm”.
2. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN
- Bào chế đƣợc Viên tăng sức đề kháng cơ thể từ 7 cây thuốc Việt Nam.
- Mô tả tác động của Viên tăng sức đề kháng trên động vật thực nghiệm.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN
- Khảo sát, chọn lọc thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học từ 7 cây
thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam
thất và diệp hạ châu ở Việt Nam tại những vùng chuyên canh cây thuốc.
- Lựa chọn tỷ lệ phối trộn phù hợp từ 7 cây thuốc Việt Nam để bào chế Viên
tăng sức đề kháng có hoạt chất sinh học, an toàn trong sử dụng.
- Đánh giá mức độ an toàn của Viên tăng sức đề kháng là thực phẩm chức
năng đƣợc Bộ Y tế cấp phép.
- Nghiên cứu, đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng trên các đối
tƣợng động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải.
4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đây là cơng trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam bào chế đƣợc chế phẩm
mới là Viên tăng sức đề kháng từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo,
đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu đạt tiêu chuẩn chất
lƣợng thực phẩm chức năng, đƣợc cấp phép của Bộ Y tế.

2


- Đây là cơng trình nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác động hỗ trợ miễn dịch
của Viên tăng sức đề kháng trên một số nhóm động vật thực nghiệm bị gây suy
giảm miễn dịch mắc phải.
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
Về khoa học
Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo đƣợc Viên tăng sức đề kháng có nguồn gốc từ 7
cây thuốc gồm: Linh chi, đơng trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hồng cung,
tam thất và diệp hạ châu từ những vùng cây thuốc của Việt Nam.
Đánh giá đƣợc tác động hỗ trợ miễn dịch sau khi sử dụng chế phẩm trên gà bị
gây suy giảm miễn dịch mắc phải bằng virus Gumboro, tác động ở cấp độ tế bào lên
virus gây bệnh tai xanh ở lợn. Thử nghiệm an toàn trên chuột, thỏ đƣợc Bộ Y Tế
cấp phép là thực phẩm chức năng.
Về ý nghĩa thực tiễn
Ứng dụng Viên tăng sức đề kháng trong phòng, điều trị, hỗ trợ điều trị bệnh
suy giảm miễn dịch mắc phải ở gia cầm, lợn.
Ứng dụng Viên tăng sức đề kháng hỗ trợ điều trị, tăng cƣờng sức khỏe cho
bệnh nhân HIV/AIDS cũng nhƣ phòng, hỗ trợ sức khỏe cho ngƣời già, ngƣời cao
tuổi không bị nhiễm HIV/AIDS, ngƣời có thể trạng yếu.
6. LUẬN ÁN ĐƢỢC THỰC HIỆN TẠI
Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội;
Trung tâm Công nghệ Hóa sinh Ứng dụng; Trung tâm Chăm sóc Ban ngày (nay là
Khoa kiểm soát dịch bệnh, HIV/AIDS) - Trung tâm Y tế quận Tây Hồ - TP. Hà Nội;

Viện Thú y Trung ƣơng; Viện Dƣợc liệu Trung ƣơng; Viện Hàn lâm Khoa học &
Công nghệ Việt Nam; Bệnh viện Nhiệt đới Trung ƣơng; Trung tâm Xét nghiệm - 35
Nguyễn Ngọc Vũ, phƣờng Trung Hòa, quận Cầu Giấy, TP. Hà Nội.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH MIỄN DỊCH
Miễn dịch (hay miễn nhiễm) là tập hợp các cơ chế sinh học giúp cho một cơ
thể đa bào giữ đƣợc sự liên kết giữa các tế bào và các mơ, đảm bảo sự tồn vẹn của
cơ thể bằng cách loại bỏ những thành phần bị hƣ hỏng cũng nhƣ các chất và sinh
vật xâm hại. Đáp ứng miễn dịch là một hiện tƣợng phức tạp nhƣng là một trong
những cách giúp cơ thể ngƣời và động vật tránh các tác nhân gây bệnh trong và
ngoài cơ thể. Bệnh do suy giảm miễn dịch mắc phải gồm 2 loại: suy giảm miễn dịch
bẩm sinh và suy giảm miễn dịch mắc phải [29, 51].
1.1.1. Suy giảm miễn dịch bẩm sinh
Suy giảm miễn dịch bẩm sinh là do những bất thƣờng của vật chất di truyền.
Dựa vào nguồn gốc và vị trí tổn thƣơng của các tế bào miễn dịch ngƣời ta phân loại
suy giảm miễn dịch (hình 1.1).

Hình 1.1. Sơ đồ biệt hóa và vị trí tổn thƣơng các tế bào miễn dịch [123]
(1) Suy giảm miễn dịch ngay từ các tế bào gốc chung cho cả 2 dòng tế bào B và T
nên đƣợc gọi là suy giảm miễn dịch nặng phối hợp.
(2) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T gồm 2 loại: Tổn thƣơng tế bào T và rối
loạn hoạt hóa của các tế bào T đã trƣởng thành.
(3) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B gồm 2 loại: Tổn thƣơng tế bào B và rối
loạn q trình biệt hóa của tế bào B để sản xuất kháng thể dịch thể.

4

- Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng tế bào thực bào (liên quan đến cả sự trình
diện kháng nguyên) và sản xuất bổ thể [29, 123].
1.1.2. Suy giảm miễn dịch mắc phải
Dựa vào nguyên nhân gây ra tình trạng suy giảm miễn dịch ngƣời ta chia ra
một số nhóm chính sau: Suy giảm miễn dịch do suy dinh dƣỡng, do nhiễm vi sinh
vật: Nhiễm vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng, vi rút; Do bệnh lý: Gồm các bệnh mạn tính
kéo dài, đặc biệt là bệnh ung thƣ. Suy giảm miễn dịch do phóng xạ; Do thuốc hoặc
hóa chất, cũng có thể do tuổi già, chấn thƣơng [37].
- Đặc biệt suy giảm miễn dịch do nhiễm virus HIV ở ngƣời [44], nhiễm virus
Gumboro ở gà hay hội chứng dịch bệnh tai xanh (ở lợn) [58]. Đây cũng là mơ hình
suy giảm miễn dịch ở động vật và ngƣời thƣờng đƣợc nghiên cứu với các loại thuốc
điều trị khác nhau.
Để đáp ứng lại việc suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời và động vật có các
cơ chế đáp ứng lại với sự tham gia của các tế bào khác nhau gồm:
Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào
Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là đáp ứng chống các kháng
nguyên gắn trên bề mặt tế bào hoặc là thành phần của tế bào, đó là những tế bào
nhiễm virus hoặc tế bào ung thƣ có 2 loại: Miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch
không đặc hiệu. Cả hai loại đáp ứng này đều cần có sự tham gia của nhiều loại tế
bào khác nhau và các tế bào cũng hỗ trợ lẫn nhau trong việc đáp ứng lại các tác
nhân gây bệnh [92, 95].
Tế bào giết tự nhiên (natural killer cell)
Nghiên cứu in vitro ngƣời ta thấy trong cơ thể ngƣời và động vật có các tế bào
có khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ. Nghiên cứu nuôi cấy các tế bào này cho thấy
chúng tiết ra chất perforin chọc thủng màng tế bào đích và tiêu diệt vi khuẩn [53,
133]. Hoạt tính của các tế bào giết tự nhiên mạnh đối với tế bào có liên quan đến
phức hệ phù hợp tổ chức nhƣ tế bào u hoặc các tế bào bị nhiễm virus. Khả năng tiêu
diệt các tế bào u và các tế bào ung thƣ của tế bào giết tự nhiên đƣợc tăng cƣờng bởi

một số cytokine do tế bào lympho và đại thực bào tiết ra nhƣ IL-2, TNF, nghiên cứu
trên giống chuột nude cho thấy mặc dù các chuột này có suy giảm miễn dịch bẩm sinh
nhƣng có thể do chúng lại có số lƣợng tế bào giết tự nhiên bình thƣờng hay tăng nên tỷ
lệ ung thƣ tự phát không cao hơn chuột bình thƣờng khác [43, 138].

5


Tế bào LAK (lymphokine activating killer cell)
Các tế bào LAK tăng khi tế bào lympho đƣợc cytokin kích thích, trong đó có
IL-2, cũng là loại có khả năng ly giải một số tế bào ung thƣ gấp nhiều lần so với tế
bào giết tự nhiên [45].
Đại thực bào: Khi đƣợc hoạt hố bởi những chất kích thích nhƣ cytokine hay
các chất từ vi khuẩn (LPS, MDP) thì có thể ly giải các tế bào ung thƣ trên in vitro.
Cơ chế của phản ứng này chƣa đƣợc làm sáng tỏ, tuy nhiên có nhiều giả thiết khác
nhau: Có thể là tế bào ung thƣ đã có kháng thể đặc hiệu gắn vào tạo nên phức hợp
miễn dịch, là đối tƣợng để đại thực bào thực bào (giải phóng các enzyme lysosome,
sản xuất các superoxyde mà tế bào ung thƣ thƣờng lại ít có enzym superoxyde
dismutase chống lại) [132].
Quan trọng nhất là các cytokin của đại thực bào tiết ra TNFα. Cơ chế tác dụng
có lẽ đã gây ra một hiện tƣợng Shwartman tại chỗ làm cho khối u khơng có máu tới
nuôi dƣỡng (hiện tƣợng shwatzman). Khi tiêm LPS cho chuột tại chỗ gây tắc mạch,
hoại tử). Hoặc nếu kháng thể gắn lên kháng nguyên ở tế bào ung thƣ thuộc lớp IgG
thì q trình hoạt hố gây ra và làm ly giải các tế bào mang kháng nguyên (tế bào
ung thƣ) [23, 93].
Bạch cầu toan tính: Khi đƣợc hoạt hố bởi cytokine mà mạnh nhất là IL-5
cũng có thể giết nhiều loại ký sinh trùng và cả tế bào ung thƣ.
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải đƣợc gọi tắt là AIDS do HIV gây
ra. HIV phá hủy các tế bào của hệ miễn dịch khiến cơ thể không có khả năng chống
lại các tác nhân gây bệnh do đó bệnh nhân dễ mắc một số loại bệnh thơng thƣờng

nhƣ nhiễm trùng cơ hội hay ung thƣ [51, 97].
Virus HIV có hai type khác nhau về cách thức truyền bệnh. Type 1 là virus
hƣớng đến tế bào lympho T ở ngƣời còn type 2 là virus gốc của HIV type 1. Trong
khi HIV type 1 phổ biến ở ngƣời thì Type 2 bắt gặp chủ yếu ở các bệnh nhân ở châu
Phi [119, 160].
1.2. HỆ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT
Hệ miễn dịch gia cầm có liên quan đến nhiều cơ quan và nhiều loại tế bào
nằm rải rác trong cơ thể, chúng hợp tác để nhận diện kháng nguyên và phản ứng với
kháng nguyên tạo đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh.
1.2.1. Các cơ quan lympho tham gia đáp ứng miễn dịch
Các cơ quan lympho trung ương:

6


Hệ thống cơ quan lympho trung ƣơng tham gia vào q trình đáp ứng miễn
dịch gồm có tủy xƣơng, tuyến ức, túi Fabricius.
- Tủy xương: Là nơi sản sinh ra các tế bào mầm, nguồn gốc của tế bào máu,
các tế bào bạch cầu và các tế bào của hệ miễn dịch. Tủy xƣơng cung cấp các tiền
lympho T và B cho tuyến ức và túi Fabricius làm nhiệm vụ biệt hoá thành tế bào
chuyên biệt.
- Tuyến ức: Là hai chuỗi hạch nằm ở dƣới hai bên cổ, kích thƣớc từ 8 - 15
mm. Tuyến ức là cơ quan lympho - biểu mô, gồm các tế bào lympho và tế bào biểu
mô. Trong thời kỳ bào thai, tuyến ức là cơ quan lympho xuất hiện sớm, lớn và quan
trọng nhất, sự phát triển về kích thƣớc tăng dần và đạt đến tối đa lúc trƣởng thành,
sau đó sẽ thối hố, teo dần [61].
- Túi Fabricius: Túi có dạng hình cầu hoặc trái lê nằm phía trên, mặt ngồi
túi láng, mặt trong có nhiều nếp gấp thay đổi tuỳ theo tuổi và sinh lý gia cầm, túi có
kích thƣớc lớn nhất khi gà 1 - 2 tuần tuổi và qua quá trình cuộn xoắn từ từ, khoảng
tháng thứ tƣ túi bắt đầu teo đến tháng thứ 11 - 12 thì mất hẳn. Túi Fabricius là nơi

phát triển và biệt hóa tế bào lympho B, ngồi ra nó cịn tiết ra một số hormone, quan
trọng nhất là Bursin, đó là tripeptide có vai trị hoạt hóa tế bào lympho B nhƣng
khơng hoạt hóa tế bào lympho T, túi Fabricius chỉ có ở gia cầm khơng có ở động
vật có vú và ở ngƣời [61, 70].
Các cơ quan lympho ngoại vi:
Bao gồm lách, hạch hạnh nhân, manh tràng, tuyến Harder, mô bạch huyết.
- Lách: Giống nhƣ một cơ quan lympho lọc kháng nguyên từ tổ chức bạch
huyết và là nơi lƣu trữ hồng cầu, tiểu cầu, đồng thời là nơi sản sinh ra tế bào hồng
cầu. Tủy trắng là nơi xảy ra đáp ứng miễn dịch tế bào [29, 137].
- Hạch hạnh nhân manh tràng: Là cơ quan lympho địa phƣơng ở manh
tràng. Các hạch tập trung thành từng đám có cấu trúc giống nhƣ hạch lympho, trong
hạch có các nang chứa lympho B và T, các nang này đều có tâm điểm mầm, nơi xảy
ra các đáp ứng miễn dịch mạnh [79, 137].
- Tuyến Harder: Là hạnh lympho có hình trịn hoặc bầu dục, tập trung thành
từng đám, trong hạch chứa đầy đủ các tế bào lympho B và T trƣởng thành đƣợc
phân bố thành hai vùng. Vùng vỏ cạn có các nang lympho chứa chủ yếu các tế bào
lympho B. Vùng vỏ sâu chứa chủ yếu các tế bào lympho T. Tuyến Harder là địa
điểm chính cho tế bào kháng thể IgA [137].

7


Tủy xƣơng

Tế bào mầm
đa năng

Dòng tế bào tủy
và hồng cầu

Tế bào mầm
lympho

Tế bào diệt tự
nhiên

Túi Fabricius

Tuyến ức

Lympho B

Lympho B nhỏ

Tƣơng bào

Lympho T

Lympho T
gây độc

Lympho T
trợ giúp

Lympho
T nhớ

Hình 1.2. Phát triển Lympho B và T ở gà [137].
- Mô bạch huyết: Tổ chức bạch huyết là những hạt lympho nằm dọc theo hệ
thống bạch huyết phân tán khắp các cơ quan trong cơ thể nhƣ: Tim, tuyến nội tiết,

gan, thận, tụy và cơ. Các tổ chức bạch huyết hình hạt đậu có hệ thống mạng lƣới
chứa các tế bào lympho, đại thực bào, tế bào tua [137].
1.2.2. Đáp ứng miễn dịch ở gia cầm
Hệ miễn dịch gia cầm cũng giống nhƣ các động vật có vú, chia làm hai loại,
miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu.
Miễn dịch không đặc hiệu:
Gia cầm có hệ miễn dịch khơng đặc hiệu khá phát triển, bao gồm các tính
chất bẩm sinh và di truyền, nhờ đó mà gia cầm chống lại các tác nhân có hại một
cách chọn lọc, giúp duy trì sức khỏe gia cầm. Miễn dịch không đặc hiệu bao gồm
các yếu tố sau:
- Yếu tố di truyền: Một số nhóm gia cầm khơng có vị trí tiếp nhận (receptor)
cho phép nhiều tác nhân gây bệnh bám và tấn công vào cơ thể gây bệnh. Ví dụ: Một

8


số giống gà có gen kháng virus máu trắng và bệnh Marek’s. Gà tây không mẫn cảm
với virus viêm phế quản. Do quan điểm chọn lọc để cải thiện tính năng, một số khả
năng kháng bệnh ở gà dần dần bị mất đi [70, 73].
- Cấu tạo giải phẫu học: Dịch niêm mạc có tác dụng ngăn chặn các tác nhân
gây hại xâm nhập vào cơ thể gây bệnh.
- Hệ vi sinh vật bình thường: Trên bề mặt da và niêm mạc đƣờng tiêu hóa,
đƣờng hơ hấp trên thƣờng có một số quần thể vi sinh vật, có tác dụng bảo vệ cơ thể
ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh bằng cách không cho khu trú và phát triển.
- Lông rung đường hô hấp: Bề mặt đƣờng hô hấp trên đƣợc bao phủ bởi lớp
lơng rung, có tác dụng đẩy tác nhân gây bệnh ra khỏi cơ thể [80].
Miễn dịch đặc hiệu:
Gồm miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào:
- Miễn dịch thể dịch: Kháng nguyên hay vật lạ xâm nhập vào cơ thể gây
bệnh, sẽ đƣợc tế bào T và B hợp tác để hình thành kháng thể, về cấu trúc kháng thể

gia cầm giống kháng thể lồi hữu nhữ nhƣng khác về đặc tính, ở gà chỉ có 3 lớp
kháng thể chính là IgG, IgM, IgA khơng có IgE, IgD. Kháng thể IgM xuất hiện
trƣớc tiên và sớm nhất trong máu khoảng 4 ngày sau khi tiếp xúc mầm bệnh, nhanh
chóng mất vào ngày 10 - 12.
- Miễn dịch qua trung gian tế bào: Quá trình đáp ứng miễn dịch do quần thể
lympho T đảm nhận. Khi kháng nguyên xâm nhập sẽ kích thích sự biệt hóa của
dịng tế bào lympho tăng sinh nhanh chóng tạo ra một lƣợng lớn lympho T sẵn sàng
tiêu diệt kháng nguyên. Các tế bào lympho T phân bào và biệt hóa sớm, nên đáp
ứng miễn dịch tế bào đƣợc hình thành sau 2 - 3 ngày tiêm chủng vắc xin. Trên gia
cầm miễn dịch trung gian tế bào có vai trò rất quan trọng.
1.2.3. Giới thiệu bệnh do virus Gumboro
Ở gà bệnh Gumboro (còn gọi là bệnh Sida gà) là một bệnh truyền nhiễm cấp
tính do virus gây ra ở gia cầm, chủ yếu ở gà. Virus Gumboro hay còn gọi là
Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) là virus ARN sợi đôi, gây viêm túi Fabricius,
xuất huyết cơ, hƣ hại thận thể cấp ở gà [70, 73, 113].
Virus có khả năng đề kháng cao ngồi mơi trƣờng nên các biện pháp sát
trùng thông thƣờng không thể tiêu diệt hết mầm bệnh ngồi mơi trƣờng. Sử dụng
thuốc sát trùng Cloramin cho hiệu quả cao nhất. Khi virus tồn tại ngồi mơi trƣờng
nó tăng độc lực qua mỗi lần cảm nhiễm nên cần có biện pháp để sát trùng chuồng

9


trại sau mỗi lứa nuôi. Làm chậm tăng trƣởng, gây suy giảm miễn dịch, tạo tỷ lệ chết
khoảng 5 - 20% (nhiều thống kê cho rằng lên đến 60 - 100% đàn gà nuôi) [31, 58].
Virus lây lan rất nhanh qua nhiều đƣờng. Bệnh thƣờng xảy ra khi gà ở giai
đoạn từ 3 - 6 tuần tuổi, tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên đến 100% và tỷ lệ chết có thể từ
20 - 50%. Việc kiểm sốt và phịng bệnh là rất khó khăn, đặc biệt khi các chủng mới
của IBDV xuất hiện làm cho vắc xin phòng bệnh trở nên kém hiệu quả [31].

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc virus Gumboro
Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng bên cạnh chủng virus IBDV có tính độc lực
cao, chủng cũng xuất hiện nhiều chủng có hoạt tính mới ở châu Âu và tình hình
bệnh do đó dƣờng nhƣ đang phát triển phức tạp. Những thay đổi trong tính kháng
nguyên và độc lực đã làm cho việc kiểm soát IBDV bằng cách tiêm vắc xin trở nên
khó khăn thách thức nhiều hơn.
Trong miễn dịch gia cầm hệ thống túi Bursa của Fabricius là một biểu mô và
cơ quan bạch huyết nơi tế bào gốc lymphocyte thu nhận và bị tác động bởi những
nguyên nhân gây bệnh của virus từ bên ngoài. Mức độ các thƣơng tổn này tùy thuộc
vào sự phát triển của Bursa, gà dễ bị IBDV nhất trong những tuần đầu tiên sau khi
nở và khả năng miễn nhiễm với virus đƣợc gây ra sớm sau khi nở. Tuy nhiên, trong
giai đoạn mang thai các kháng thể đặc hiệu IBDV phát ra con cái qua trứng tới phơi
có thể can thiệp bằng cách tiêm chủng sớm. Trong khi cơ chế miễn dịch tự nhiên là
cơ chế phản ứng miễn dịch thích ứng tối ƣu phát triển sau những tuần đầu tiên sau
khi gà nở và chuyển giao kháng thể mẹ. Điều này giúp bảo vệ con cái cho đến khi
phản ứng miễn dịch thích ứng trở nên tồn vẹn, đầy đủ và có hiệu lực [58].
Việc tìm những cây thuốc quý của Việt Nam dùng cho gia cầm đƣợc coi nhƣ
là một kháng thể chống bệnh do virus Gumbro, viêm phế quản truyền nhiễm, cúm
gia cầm và các kháng thể không đặc hiệu khác là một yêu cầu cấp thiết hiện nay.

10


1.2.4. Giới thiệu Hội chứng rồi loạn sinh sản và hô hấp do virus ở lợn
Bệnh dịch tai xanh ở lợn hay còn gọi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp
trên heo, gọi tắt là bệnh PRRS (Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome) là
một bệnh nguy hiểm xảy ra trên lợn do virus gây ra khi cơ thể lợn bị suy giảm miễn
dịch. PRRS xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 và phải đến năm 1992 thì mới đƣợc
Tổ chức Thú y Thế giới OIE công nhận. Còn ở Việt Nam, PRRS đƣợc phát hiện
năm 1997 từ các đàn lợn nhập ngoại [26, 28].

Virus PRRS sau khi xâm nhập vào cơ thể lợn thì đích tấn cơng của chúng
chính là tế bào đại thực bào phế nang (PAMs). Chúng khơng tạo ra sự suy giảm
miễn dịch tồn diện nhƣng nó làm cho các cơ chế phịng vệ của phổi bị tổn thƣơng.
Khi đó, các mầm bệnh hơ hấp, phụ nhiễm dễ dàng xâm nhập vào phổi. Virus PRRS
sinh sản trong tế bào đại thực bào phế nang PAMs. Virus lƣu hành lâu trong máu (~
3 tuần), tồn nhiễm ~ 157 ngày). Khả năng, mức độ lây nhiễm của virus PRRS rất
cao (một lƣợng nhỏ virus trong môi trƣờng đã có thể gây bệnh) tuy vậy mức độ độ
lan truyền của virus này thƣờng khá chậm. Ban đầu khơng biểu hiện dấu hiện lâm
sàng. Virus PRRS có cấu trúc là một ARN có vỏ bọc, thuộc họ Arteriviridae, chi
Arterivirus, trong bộ Nidovirals [26, 121].
Virus PRRS là một loại virus đặc biệt và vơ cùng nguy hiểm vì liên tục biến
đổi. Theo nghiên cứu của Paolo Martelli trình bày tại Hội nghị APVS 2013 về sự
đa dạng gen của PRRS cho thấy các virus PRRS gây bệnh tai xanh khá đa dạng về
gen do:
Đột biến ngẫu nhiên: Virus PRRS vẫn tiếp tục đột biến khi nhân lên trong
vật chủ và biến chủng khác biệt trên từng lợn. Đây là hậu quả của sự tích lũy đột
biến ngẫu nhiên [38].
Tái tổ hợp: Trong thực nghiệm, tái tổ hợp xảy ra khi tế bào MA-104 đƣợc
gây đồng nhiễm 2 chủng virus PRRS khác nhau, nhƣng chƣa thấy trong cơ thể lợn
thí nghiệm, điều này phần nào giải thích tại sao tái tổ hợp có thể khơng phổ biến
trong thực địa.
Đa dạng gen PRRS rất nguy hiểm do nó liên quan đến kỹ thuật xét
nghiệm bệnh tai xanh và sự đáp ứng miễn dịch của PRRS, sự khác biệt của độc lực
virus PRRS có thể biểu hiện triệu trứng khơng tƣơng ứng do vậy khó khăn trong
chẩn đốn và điều trị đàn lợn bị bệnh tai xanh. Do đó cần có những nghiên cứu về
tác dụng tăng cƣờng miễn dịch, ức chế virus PRRS ở cấp độ tế bào, kiểm chứng

11