Xây dựng phương pháp xác định nhanh các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR

bộ giáo dục và đào tạo
trường đại học bách khoa hà nội

-------&-------

luận văn thạc sỹ khoa học

Ngành : công nghệ sinh học

Xây dựng phương pháp Xác định nhanh các chủng nÊm
mèc sinh ®éc tè aflaToxin b»ng kü tht PCR

Ng­êi h­íng dẫn : TS. Lê Quang Hoà
Học viên CH :

Đào Thị Thanh Xuân

hà nội 2006

1

Đào Thị Thanh Xuân


Lời Cam Đoan
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi.
Các số liệu sử dụng trong luận văn chưa từng được công bố ở nghiên
cứu nào.

Học viên cao học
Đào Thị Thanh Xuân

2

Đào Thị Thanh Xuân


Mục lục
Mở đầu ....................................................................................................... 6
Phần I .......................................................................................................... 7
Tổng quan ................................................................................................ 7
1.1. Định nghĩa Aflatoxin ......................................................................... 7
1.2. Tính chất hóa lý ................................................................................. 7
1.3. Nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin .............................................. 10
1.3.1. Các loại nấm sinh aflatoxin ........................................................ 10
1.3.2.Đặc điểm hình thái ...................................................................... 12
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và khả năng sinh độc tố 15
1.3.4. Điều kiện sinh độc tố .................................................................. 16
1.4.Tình trạng nhiễm aflatoxin trong lương thực và thực phẩm .......... 17
1.5.Cơ chế tác động của aflatoxin trong cơ thê ..................................... 20
1.6. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin ........................................................ 21
1.6.1. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin .................................................... 21
1.6.2. Cấu trúc và chức năng của một số gen trong cụm gen sinh tổng
hợp aflatoxin............................................................................................ 24
1.7. Các phương pháp kiểm soát aflatoxin ............................................ 31
1.7.1. Biện pháp canh tác nông nghiệp và bảo quản ............................. 31
1.7.2. Biện pháp chọn tạo giống có khả năng kháng aflatoxin ............... 32
1.7.3. ứng dụng phương pháp PCR để xác định các nấm sinh aflatoxin
trong thực phẩm.................................................................................... 33
Phần II ....................................................................................................... 38
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu......................................... 38

2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 38

3

Đào Thị Thanh Xuân


2.2. Các môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu .................... 38
2.3. Phương pháp tách chiết aflatoxin ................................................... 39
2.4. Phương pháp tách chiết ADN từ nấm mốc ..................................... 40
2.5. Phương pháp PCR ........................................................................... 41
Phần III .................................................................................................... 43
Kết quả thảo ln ........................................................................... 43
3.1. T¸ch chiÕt ADN tỉng sè ................................................................... 43
3.3. Kiểm tra sự biểu hiện gen aflJ trên các chủng nÊm mèc ............... 46
3.4. KiĨm tra sù biĨu hiƯn gen avfA trên các chủng nấm mốc ............. 47
3.5. Khảo sát sự biểu hiện gen NorA-CypB trên các chủng nấm mốc . 48
3.6. Khảo sát sự biểu hiện gen ordB trên các chủng nấm mốc ............. 49
3.7. Khảo sát sự biểu hiện gen aflRstop trên các chủng nấm mốc ....... 50
3.8. Khảo sát sự biểu hiện gen adhA của các chủng nấm mốc ............. 52
3.9. Khảo sát sự biểu hiện gen estAcủa các chủng nấm mốc ................ 52
3.10. Khảo sát sự biĨu hiƯn gen ver1cđa c¸c chđng nÊm mèc .............. 53
3.11. Khảo sát sự biểu hiện gen verA của các chủng nấm mốc ............ 54
3.12.Khảo sát sự biểu hiện gen verB của trên chủng nấm mốc ............ 55
3.13. Khảo sát sự biểu hiện gen avnA trên các chủng nấm mốc .......... 56
3.14. Khảo sát sự biểu hiện gen omtA trên các chủng nấm mốc .......... 57
3.15. Khảo sát sự biểu hiện gen omtB trên các chủng nấm mốc .......... 58
3.16. Khảo sát sự biểu hiện gen ordA trên các chủng nấm mốc ........... 59
3.17. Khảo sát sự biểu hiện gen pksA cũ trên các chủng nấm mốc ...... 60
3.18. Sàng lọc chủng sinh aflatoxin với mồi........................................... 61

3.19. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin bằng Sắc ký bản mỏng TLC .. 61
Phần IV ..................................................................................................... 65
Kết luận .................................................................................................. 65

4

Đào Thị Thanh Xuân


Tài liệu tham khảo ............................................................................ 66

5

Đào Thị Thanh Xuân


Mở đầu
Aflatoxin là độc tố gây hại cho sức khỏe của người và vật nuôi khi tiêu thụ
các thức ăn có nhiễm độc tố này. Nhưng độc tố thường chỉ được tạo ra khi có
sự phát tiển của nấm mốc, đặc biệt là 2 chủng A.parasiticus và A.flavus là hai
loài chủ yếu sinh aflatoxin. Để khảo sát khả năng sinh độc tố, thường người ta
nuôi cây các chủng phân lập được trên môi trường tự nhiên hoặc môi trờng
nhân tạo cho nấm mốc phát triển và sinh độc tố (nếu có), sau đó sẽ đo lượng
afltoxin tiết ra qua chiết xuất từ môi trường nuôi cấy trên bằng sắc ký bản
mỏng TLC, Sắc ký lỏng cao áp, kỹ thuật ELIZA §iỊu nµy tèn thêi gian tõ
7-14 ngµy vµ tèn kÐm chi phí phân tích aflatoxin.Với đề tài này chúng tôi sử
dụng kỹ thuật PCR dựa trên tập hợp gen sinh tổng hợp aflatoxin thiết kế các
cặp mồi thích hợp để xây dựng phương pháp xác định nhanh sự có mặt của
các loại nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp aflatoxin.
Nội dung nghiên cứu:

- Thiết kế mồi cho các gen trong cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin
- Khảo sát sự biểu hiện các gen trong cụm gen aflatoxin trên các chủng
nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus
- Kiểm tra lại khả năng sinh độc tố của các chủng nấm mốc bằng phương
pháp sắc ký bản mỏng TLC.
- Xây dựng phương pháp xác định nhanh các chủng nấm mốc sinh
aflatoxin bằng phương pháp PCR.

6

Đào Thị Thanh Xuân


Phần I
Tổng quan
1.1. Định nghĩa Aflatoxin
Afltoxin là nhóm các hợp chất có nhân diuranocumarin, là sản phẩm trao
đổi chất bởi nấm A.parasiticus và A.flavus.
Người ta đà phát hiện và xác định có 17 loại aflatoxin khác nhau, trong đó
aftoxin B 1 có độc tính mạnh nhất, còn các loại khác chính là sản phẩm
chuyển hoá của AFB 1 , AFB 2 , AFG 1 , AFG 2 , AFM 1 , AFM 2 , …[1, 4]
1.2. TÝnh chÊt hãa lý
C¸c aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật. Trong các loại
aflatoxin, aflatoxin B 1 được tìm thấy ở nồng ®é cao nhÊt, tiÕp theo lµ G 1 trong
khi ®ã B 2 và G 2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn.
Người ta đà phát hiện và xác định cấu trúc 16 hợp chất này, kể cả những chất
đà biến đổi trong cơ thể động vật.

O
O

R2
R1 O

R5
X

R3
OR4

O

Hình1. 1: Công thức cấu tạo chung của aflatoxin

7

Đào Thị Thanh Xuân


Bảng 1.2 : Các nhóm chức của các aflatoxin
Aflatoxin

R1

R2

R3

R4

R5

X

B1

H

H

H

CH 3

O

H2

G1

H

H

H

CH 3

O

-OCH 2

B2

H2

H2

H

CH 3

O

H2

G2

H2

H2

H

CH 3

O

-OCH 2

B2a

OH

H2

H

CH 3

O

H2

G2 a

OH

H2

H

CH 3

O

-OCH 2

1-methoxy B 1

OCH 3

H2

H

CH 3

O

H2

2-methoxy B 1

H2

OCH 3

H

CH 3

O

H2

2-methoxy B 1

H2

OCH 2 CH 3

H

CH 3

O

H2

2-methoxy B 1

H2

OCH 2 CH 3

H

CH 3

O

-OCH 2

Aflatoxincol (R o )

H

H

H

H

O

H2

P1

H

H

OH

CH 3

O

H2

M1

H

H

OH

CH 3

O

H2

M2

H2

H2

OH

CH 3

O

H2

BGM 1

H

H

OH

CH 3

O

-OCH 2

BGM 2

H2

H2

OH

CH 3

CH 3

H2

Dihydro-

H2

H2

H

CH 3

CH 3

H2

aflatoxin

Các cấu tạo của aflatoxin là các chất trao đổi có liên quan đến aflatoxin B 1
và G 1 . Afatoxin B 2 vµ G 2 lµ dẫn xuất hydro của các hợp chất mẹ. Các
aflatoxin M 1 và M 2 là các chất trao đổi hydroxylat hãa cđa B 1 vµ B 2 , theo thø
tù chúng có công thức như sau:

8

Đào Thị Thanh Xuân


Hình1.2. Công thức cấu tạo một số aflatoxin
Các afltoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài. Điều này
cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực thấp (0,5 ng hay thấp
hơn trên một vết của sắc ký bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt
thực hành cho tất cả các phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và định
lượng. Nồng độ aflatoxin M 1 0,02 mg/l có thể được phát hiện trong sữa lỏng.
Các aflatoxin hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như cloroform và
metanol, đặc biệt là trong dimetylsulfoxit (là dung môi được sử dụng như
phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thực nghiệm).
aflatoxin tan trong nước dao động trong khoảng từ 10 -20 mg/l.[2]
Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao không bị phân hủy khi đun nóng thông
thường mà chỉ bị ph©n hđy khi hÊp ë 120oC trong 30 phót. Do đó nó vẫn có
thể tồn tại trong thực phẩm mà không có sự có mặt của nấm mốc. Tuy nhiên
khi để trong không khí đặc biệt là dưới tia tử ngoại aflatoxin lại tương đối
không bền.

9

Đào Thị Thanh Xuân


Các aflatoxin trong các dung môi cloroform và benzen bền vững nếu giữ ở
điều kiện tối và ở nhiệt độ thấp.
Các aflatoxin cũng có thể bị phá hủy hoàn toàn bằng việc xử lý mạnh bằng
amoniac hoặc hypoclorit.
Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc
thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong quá trình
chế biến thực phẩm vì xử lý kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin trong các sản
phẩm thực phẩm. Tuy nhiên nếu sau quá trình xử lý kiềm nếu axit hóa sẽ làm
phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin. [4]
Các aflatoxin khá bền với các enzym tiêu hoá, aflatoxin B 1 là phân tử ái mỡ
có trong lượng phân tử thấp dễ dàng được hấp thụ sau khi ăn. Sự chuyển hoá
aflatoxin B 1 ở đường tiêu hoá chính là nhờ sự hoạt động tương tác giữa
protein ở niêm mạc ống tiêu hoá tạo ra s¶n phÈm AFB 1 – epoxie, AFB 1 –
dihydrodiol hoặc AFB 2 .
AFB 1 và các sản phẩm chuyển hóa của nó được bài tiết qua ba co đường
chính là: qua mật, nước tiểu và sữa (sản phẩm của AFB 1 qua sữa là AFM 1 ).
người ta đà xác định có sự tương quan tuyến tính giữa AFB 1 ăn vào và lượng
AFM 1 trong sữa. Lượng AFM 1 trong sữa ước tính khoảng 1% lượng AFB 1 ăn
vào. Chính vì vậy mà khi động vật ăn các sản phẩm nhiễm aflatoxin thì sữa
và các sản phẩm của chúng cũng bị nhiễm loại độc tố này.
1.3. Nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin
1.3.1. Các loại nấm sinh aflatoxin
Nấm mèc sinh ®éc tè Aflatoxin chđ u thc chi Aspergillus. Chi
Aspergillus phân bố rộng rÃi trên khắp trái đất có thể có lợi hoặc có hại tuỳ
theo cơ chất chúng sử dụng.Trong đó người ta nhận thấy A.flavus và
A.parasiticus có mối quan hệ chặt chẽ về cấu trúc gen và là hai loài có khả

năng sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất. Việc xác định các loài sinh aflatoxin

10

Đào Thị Thanh Xu©n


hiện tại dựa vào đặc điểm hình thái, loại mycotoxin sản sinh ra hoặc trình tự
AND. (Ito et all 2000).
Các chủng tạo aflatoxin của A.flavus và A.parasiticus là rất phổ biến và
thường được phân lập ở các nguyên liệu khác nhau.
Bảng 1.2. cho thấy tỷ lệ cao (từ 20-98%) các chủng phân lập của A.flavus có
khả năng tạo aflatoxin.
Bảng1.2: Các chủng tạo aflatoxin của A.parasiticus và A.flavus
phân lập được
Nguồn

Các chủng phân
lập

Phần trăm các chủng
tạo aflatoxin (%)

Lạc
Hạt bông
Gạo
Lúa mạch

100
59

127
63

98
81
20
24

Nồng độ AF cực đại
trong sản phẩm
(mg/g)
3.300
3200
1.100
3.300

(Số liệu của Schroder và Boller 1976)
Hàm ẩm của cơ chất và nhiệt độ là những yếu tố chính ảnh hưởng đến sự
phát triển của nấm mốc và sự tạo aflatoxin cho thấy rằng hàm ẩm 18.3 % trên
cơ sở trọng lượng ẩm là dưới hạn dưới đối sự phát triển của A.flavus và
A.parasiticus ở ngô bóc vỏ. Các nghiên cứu sâu hơn trong điều kiện khống
chế chính xác cho thấy hàm ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối 85% (hay hoạt
tính nước aw = 0,85) là giới hạn dưới cho sự phát triển.[
Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích và cực đại cho sự tạo aflatoxin lµ 12oC, 27oC
vµ tõ 40 – 42oC, theo thø tự. [4]
Ngoài hai loài A.parasiticus và A.flavus còn có một số loài khác cũng có khả
năng sinh một số aflatoxin tuy nhiên yếu hơn.

11

Đào Thị Thanh Xuân


Bảng 1.3: Một số loại nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin
Loµi

Nhãm Aflatoxin

A.bombycis (Varga et all
2003)
A.flavus (Samson 2001,
Varga et all 2003)
A. nomisnus (Samson 2001,
Varga et all 2003)
A.parasiticus (Samson 2001,
Varga et all 2003)

B,G
B
B,G
B,G

1.3.2.Đặc điểm hình thái
A.flavus và A.parasiticus đều thuộc họ nấm cúc có khả năng sinh độc tố
Aflatoxin trong môi trường tự nhiên và môi trường nuôi cấy.
- A.flavus
A.flavus được coi là loài phân bố ở khắp nơi trên trái đất: dưới đất, trên các
chất hữu cơ và các loài nông sản thực phẩm đặc biệt là trên các hạt lạc và các
sản phẩm từ lạc là nơi phát triển ưa thích của nó.
Ngoài ra chúng còn được thấy nhiều trên sợi bông, nhất là trên hạt bông và

khô hạt bông, thức ăn gia súc trên cỏ khô, dăm bông, dồi thịt và nhiều thức
ăn khác
Con đường xâm nhập của A.flavus là chúng xâm nhập qua các điểm tiếp hợp
nhờ những chỗ do côn trùng huỷ hoại gây ra.Tuy nhiên ở cây lạc tươi
A.flavus khó xâm nhập hơn vì vậy mà chúng xâm nhập khi củ lạc đà già nhất
là sau khi thu hoạch. A.flavus xâm nhập vào hạt lạc chứa 15-20% nước, tức
là vào thời gian đầu của việc làm khô.[1]
A.flavus có màu vàng lục hay xanh lục của đám bào tử khi chín trên mầm
của hạt, trên môi trường nuôi cấy nhân tạo (Czapeck hay thạch Sabouraud)
hình thái khuẩn lạc sau 24h nuôi cấy có màu vàng nhạt ở trung tâm rìa mép
bờ có màu trắng mịn, sau 48h hình thành miền bào tử trung tâm rìa mép bờ

12

Đào Thị Thanh Xuân


màu trắng mịn, sau 48h hình thành miền bào tử trung tâm, xuất hiện các khối
bào tử chín màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng, sau 72 96h khuẩn lạc
phát triển cực đại. tới 6-7 ngày sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, lúc này
đường kính bằng 4-5 cm, hình thành vòng tròn đồng tâm đều đặn từ các bào
tử, thường có 5-6 vòng tròn màu xanh lục trên bề mặt khuẩn lạc.
A.flavus có khả năng sinh các loại độc tố AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 và axit
cyclopizoic (CPA).

Hình 1.3: Đặc điểm hình thái A.flavus

- A.parasiticus
A.parasiticus có đặc điểm hình thái tương tự A.flavus song bào tử của
A.parasiticus thường có màu xanh đậm, có khả năng sinh AFB1, AFB2,

AFG1, AFG2 nhưng không có khả năng sinh (CPA).
Mặc dù có sự tương đồng khá lớn về đặc điểm hình thái nhưng người ta vẫn
tìm được một số khác biệt nhỏ giữa A.parasiticus và A.flavus. sự khác biệt
giữa 2 loại này có thể tóm tắt ở bảng sau đây: [2]

13

Đào Thị Thanh Xu©n


Bảng 1.4: Đặc điểm hình thái của A.flavus và A.parasiticus
Đặc điểm

A.flavus

A.parasiticus

Bề mặt

Dạng len

Dạng len, xốp nhẹ

Màu sắc

Lục vàng

Lục vàng, xanh lục

Màu mặt sau

Không màu, nâu hồng

Kem, nâu nhat

Giọt tiết

Có hoặc không

Không

- Dạng khuẩn lạc

Sắc tố hoà tan quanh Không

Không

khuẩn lạc
Đường kính (cm)

6 -8

3 -3,5

Bề mặt

Ráp hoặc nhẵn

Ráp hoặc nhẵn

Chiều dài (àm)

500 -800

300 -700

Đường kính (cm)

15 - 20

5-10

Hình dạng

Tia toả tròn, cột

cầu, tia toả tròn

Đường kính (àm)

300 -500

300 -450

Chiều dài (àm)

50-300

- Giá bào tử trần

- Khối bào tử trần

- Bọng đỉnh giá
Hình dáng

Cầu, chuỳ

Hình bình

Đường kính (àm)

25 -45

20 -35

Có mặt

Có hoặc không

Không

Kích thước (àm)

5-10 ì 3,5ì 5,5

- Cuống thể bình

- Thể bình
Hình dạng

Hình bình

Hình bình

Kích thước

6,5-12ì3-6

7-9 ì3-4,5

Hình dạng

Cầu, hình trứng

Cầu

Bề mặt

Có gai

Ráp hoặc có gai

3-6

3,5 5,5

- Bào tử trần

Đường kính trục lớn(àm)

14

Đào Thị Thanh Xuân


Theo kết quả đà nghiên cứu không phải tất cả các loại A.flavus đều có khả
năng sinh độc tố aflatoxin nhưng phần lớn các A.parasiticus phân lập được
lại đều sinh tổng hợp aflatoxin. ở Pháp 25% số chủng A.flavus phân lập được
từ lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc tạo thành aflatoxin. Các chủng
của loài A.flavus tạo thành aflatoxin trên lạc chiếm 96%, ở hạt bông chiếm
78%, ở lúa mạch chiếm 49% và ở gạo chiếm 35%.[1]
Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn so với các chủng
vùng ôn đới. Một số ý kiến cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờ cũng có
đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, có thể
bình 2 lớp, cuống bào tử đính có vách, có gai, những chủng sinh độc tố có sự
phình to một phần sợi trên sợi nấm tạo thành những mắt nhỏ [1]. Tuy nhiên
chỉ dựa vào đặc điểm hình thái sẽ rất khó để xác định chính xác những chủng
sinh hay không sinh aflatoxin.
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và khả năng sinh độc tố
- Nhiệt độ:
A.flavus và A.parasiticus là loại nấm mốc ưa nhiệt có thể sinh trưởng và
phát triển ở dải nhiệt đô 20-60oC, to opt 25-35oC, dưới 12oC A.flavus không phát
triển được hoặc phát triển rất yÕu (Schroeder and Ct-1996).[1]
- §é Èm
§é Èm tèi ­u cho sù ph¸t triĨn cđa chóng W opt = 80-85%. A.parasiticus và
A.flavus phát triển tốt trên các loại cơ chất có dầu như các nông sản lạc, ngô,
gạo bông. Hàm lượng nước trong cơ chất thích hợp cho sự phát triển của
chúng từ 15-30%. ở hàm lượng nước cao hơn hoặc thấp hơn đều ức chế sự
phát triển của chúng.[1]
- pH

Loài này có thể phát triển ở khoảng pH khá rộng (pH = 2 - 8) tuỳ thuộc vào
loài. Tuy nhiên pH tối ưu cho sự phát triển của chúng là 4.5-6.5. [1]

15

Đào Thị Thanh Xuân


- Nguồn cơ chất
A.parasiticus và A.flavus có các enzyme phân giải tinh bột nhưng nguồn
hydrocacbon thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của các loại nấm
này là glucose và sacharose. Môi trường Czapeck Dox có nguồn thức ăn
là sacharose là môi trường nuôi cấy của A.parasiticus và A.flavus và cũng là
môi trường sử dụng để phân loại các loại vi nấm này.
Nguồn Nitơ: A.parasiticus và A.flavus đều có khả năng đồng hoá các loại
muối amon và nitrat. Cũng có nhiều loại vi nấm không phát triển được trên
môi trường chứa muối amôn, do khi cơ thể đồng hoá NH 4 + trong môi trường
sẽ làm tích luỹ các ion SO 4 -, HPO 4 - và Cl- làm hạ thấp pH của môi trường.
Khi cơ thể đồng hoá NO 3 - môi trường sẽ tích luỹ các cation K+, Na+ do đó
làm tăng pH môi trường.Với A.parasiticus và A.flavus cả hai loài này đều
đồng hoá tốt cả muối nitrat và amon. Ngoài ra chúng còn có khả năng sử
dụng axit glutamic, prolin, trytophan, alanin, asparagin, histidin, lysine,
methioninơ.[2]
Ngoài các nguồn cơ chất chủ yếu trên để đảm cho sự tồn tại và phát triển,
các vi nấm còn đòi hỏi một lượng cần thiết các nguyên tố đa lượng (P, K, S,
Mg, Ca), các nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni…) c¸c muèi
MgSO 4 , K 2 SO 4 , KCl, FeSO 4 …còng rÊt cần thiết cho sự phát triển của
A.flavus và A.parasiticus.[2]
1.3.4. Điều kiện sinh độc tố
Khả năng sinh độc tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đó là chủng nấm mốc,

nhiệt độ, và yếu tố môi trường.
Lượng aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi phụ thuộc vào các yếu tố này.
Một số chủng sinh aflatoxin có thể bị mất khả năng này sau nhiều lần cấy
chuyền liên tiếp trên môi trường tổng hợp nhưng cũng có thể làm tăng độc
tính của chúng nếu cấy chuyền trên các môi trường thích hợp. Khi khối

16

Đào Thị Thanh Xuân


lượng hệ sợi nấm càng nhiều thì khả năng sinh độc tố càng mạnh và ngược
lại. Môi trường có bổ sung cao nấm men hoặc pepton hoặc là các axit amin
cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH = 5-5.4, nhiệt độ 26-28oC) là
điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin.
Ngoài ra các vitamin nhóm B cũng có tác dụng kích thích sự tạo thành các
afltoxin.Tuy nhiên riboflavin và piridoxin thì không có tác dụng nhiều.
Người ta đà xác định được khi A.flavus phát triển trên hạt lúa mỳ thì hàm
lượng afltoxin tạo ra ở giai đoạn phôi mầm nhiều hơn hẳn ở giai đoạn phôi
nhũ. Việc thêm nước chiết từ mầm lúa mỳ, lipit hay các axit béo sẽ kích
thích tốt sự hình thành aflatoxin. Điều này khiến người ta nghĩ rằng các chất
này có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp aflatoxin vì sự phân huỷ
của chúng tạo thành các chất tiền sản phẩm tham gia vào vòng chuyển hoá
sinh tổng hợp aflatoxin.[1]
1.4.Tình trạng nhiễm aflatoxin trong lương thực và thực phÈm
C¸c đối tượng lương thực thực phẩm dễ bị nhiễm aflatoxin gåm:
- Lạc, ng«, vừng, đậu đỗ, gạo, bột mỳ và c¸c sản phẩm chế biến.
- C¸c loại hạt cã dầu kh¸c: hạt hướng dương, hạt dưa, bí ngơ, hạt điều vµ
các khơ dầu ép từ các hạt có dầu, đậu tương, cám gạo...
- C¸c loại sữa và c¸c sản phẩm chế biến từ sữa.

- Thức ăn gia sóc.....
NhiỊu n­íc ®· quy ®Þnh giới hạn aflatoxin ơ nhiễm trong lương thực thực
phẩm ở mức 5 - 20 mcg/kg. Tổ chức tiêu chun hoá thc phm th gii
(Codex) quy nh l 10 mcg/kg. Tại nước ta Quyết định 867/QĐ-BYT/1998
của Bộ Y t quy nh nh sau:

17

Đào Thị Thanh Xuân


Bảng 1.5: Giới hạn độc tố vi nấm (Mycotoxin) trong thực phẩm
mcg/Kg (ppb).
TT

Tên độc tố vi nấm

Sản phẩm

Giới hạn nhiễm tối đa cho
phép (ppb)

1

Aflatoxin tổng số hoặc B 1

2

Aflatoxin M 1

3

Các độc tố vi nấm khác

Thức ăn

10

Sữa

0,5

Thức ăn

35

N­íc ta n»m trong vùng nhiệt đới nóng, ẩm vì vậy mà cần phải quan tâm
đặc biệt đến vấn đề bảo đảm an toàn chất lượng cho các sản phẩm thực
phẩm.Trong đó việc kiểm soát độc tố aflatoxin là không thể thiếu vì đây là
nhóm độc tố gây độc mạnh, rất bền vững với các yếu tố môi trường, dễ nhiễm
và khó phát hiện. [4]
Theo thng kê ca c quan bo v môi trường toàn cầu tại 16 nước Úc, Áo,
Brazin, Canada, Guatemala, Đức, Nhật, Kenia, Mexico, Hà Lan, Thuỵ Điển,
Thuỵ Sỹ, Anh, M, Liên Xô c à thông báo s nhim aflatoxin trong thực
phẩm là nghiªm trọng và thường tập trung vào 2 loại sản phẩm là lạc, ng« sư
dơng cho người và gia sóc. Theo b¸o c¸o của Stoloff năm 1982 mức độ nhiễm
AF trong Lạc khi nhập vào Mỹ thường có d lng trên 25ppb.
Ti nc ta theo kho sát của Nguyễn Phùng Tiến (1992) nhận thấy tỷ lệ
nhiễm AF trên ngô b mc min Nam v min Bc kh¸ cao từ 73,3%-95,5%
với hàm lượng từ 16-100 ppb.

Năm 1990-1995 Viện Dinh Dưỡng đã kiểm tra 387 mẫu lương thực thực
phẩm nhận thấy cã 73 mẫu (19%) bị ô nhiễm AF v trong ó có19 mu

18

Đào Thị Thanh Xuân


(4,9%) cã hàm lượng AF vượt qu¸ giới hạn cho phÐp theo quy định 867/QĐBYT/1998 của Bộ Y tế.
Luco vµ céng sù (1971) kiĨm tra 139 mÉu g¹o á miỊn nam ViƯt Nam thÊy
cã 31 mÉu cã Aflatoxin. Theo b¸o cáo kiểm tra khả năng nhiễm aflatoxin
của viện dinh dưỡng Hà Nội (1994- 1995) cho thấy:
+ ở Lạc có 23% nhiễm Aflatoxin với nồng độ từ 1,6 17,4ppb/kg. riêng
lạc mèc cã 100% nhiƠm aflatoxin víi nång ®é 26,3- 175ppb/kg. [3]
+ Hạt hướng dương (Trung Quốc) 100% bị nhiễm aflatoxin với nồng độ
472ppb/kg. [3]
+ Sữa bò tươi có 50% nhiễm aflatoxin với nồng độ 0.05- 0.1 ppb/kg. bột
đậu nành trẻ em có 25% bị nhiễm từ 14,5-18,2 ppb/kg. trà uống có 27%
nhiễm aflatoxin ở mức độ vết.[3]
Ngoài ra, các số liệu gần đây trên các phương tiện thông tin cho thấy mức độ
nhiễm afltoxin trên các sản phẩm thực phẩm là rất nghiêm trọng, độ tố này
có mặt trong sữa, trong các loại sản phẩm và đồ uống lên men truyền thống
và đặc biệt nhiều trong thức ăn gia súc. Điều này thực sự nguy hiểm khi
người và động vật sử dụng các loại thực phẩm này.[4]
Bảng1.6 : Tình trạng nhiễm aflatoxin ở một số sản phẩm
TT

Loại mẫu

Số mẫu

phân tích

Số mẫu
dương
tính

Nồng độ aflatoxin
<10

10-50

>50

1

Thức ăn gia súc

83

68

58

10

0

2

Ngô

89

75

40

26

9

3

Lạc

11

10

7

1

2

4

Lúa mạch

67

58

54

4

0

5

Gạo

11

1

1

0

0

261

221

160

41

11

TS

19

Đào Thị Thanh Xuân


(Nguồn Phân viên công nghệ sau thu hoạch - HCM)

Bảng 1.7: Hàm lượng aflatoxin tối đa cho nguyên liệu thức ăn gia súc
Sản phẩm
Bắp (hạt, mảnh, bột)

aflatoxin tổng số tối đa cho phép
àg/kg
100

Tấm, cám gạo

50

Cám mì, bột mì

50

Sắn khô

50

Đậu tương (bột, khô dầu)

50

1.5.Cơ chế tác động của aflatoxin trong cơ thê
Khả năng gây ung thư của các aflatoxin đà được Wogan nghiên cứu và
được IARC đánh giá lại.
ở mức độ tế bào việc nhiễm aflatoxin vào cơ thể với liều lượng khác nhau
sẽ gây ức chế enzyme ADN và ARN polymerase ở gan do các aflatoxin liên
kết với nhân ADN trong tế bào (một phân tử aflatoxin sẽ liên kết với 600 phân
tử gam ADN). Theo đó là sự giảm sút quá trình sinh tổng hợp protein, đặc biệt
là trong điều kiện khi mà quá trình sinh tổng hợp chị ảnh hưởng mạnh sự biến
đổi ở quá trình sinh tổng hợp của ARN-thông tin. Người ta chứng minh rằng
vòng , lacton không bÃo trong phân tử aflatoxin làm cho chất này có hoạt
tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp ADN
nhân tế bào. Do đo gây rối loạn quá trình tổng hợp của tế bào.[2]
Aflatoxin gây tác động lên gan, thận, nÃo..., gây ung thư gan nguyên phát,
trong đó aflatoxin có độc tính gây ung thư mạnh nhất là aflatoxin B 1 . Ngoài
ra, aflatoxin B 1 cũng gây ra sự khác thường ở nhiễm sắc thể như các đoạn

20

Đào Thị Thanh Xu©n


nhiễm sắc thể có cầu nối ở đôi chỗ. Sự đứt đoạn nhiễm sắc tử và sự đứt đoạn
ADN ở các động vật và thực vật. [4]

Hình1.4. Cơ chế tác động của aflatoxin lên ADN
1.6. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin
1.6.1. Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin
Cho tới nay vai trò của aflatoxin sản sinh ra trong quá trình sinh trưởng
và phát triển của Aspergillus section Flavi vẫn chưa được giải thích một cách
đầy đủ, có rất nhiều suy đoán được đưa ra (Benet và Chritstensen 1983;
Ciegler 1983, killehoj 1991; Demain 2000).
+ Chúng đóng vai trò loại bỏ việc giữ lại nguồn cacbon khi nấm phát
triển trên nguồn cơ chất giàu cacbon.
+ Chúng tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm
(Cotty 1988, Kale et al 1996)
+ Chúng có thể bảo vệ mình tránh các tác nhân cạnh tranh là côn trùng và
vi sinh vật ở trong đất (Đrummond và Pinnock 1990, Dowd 1992)

21

Đào Thị Thanh Xu©n


Quá trình sinh tổng hợp aflatoxin là một quá trình phức tạp trải qua nhiều
giai đoạn và có sự tham gia của rất nhiều enzym, thể hiện ở sơ đồ sau:

22

Đào Thị Thanh Xuân


Hình1.5: Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin [14]

23

Đào Thị Thanh Xu©n


Các enzym và các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin đều
do tập hợp các gen mà hoá. Các gen này không nằm riêng lẻ mà tập hợp lại
thành một cụm gen gồm 25 gen nằm trong vùng 66 kb. Trung bình 1 gen
khoảng 2,8 kb, trong các gen này gen lơn nhất có khối lượng khoảng 5-7 kb,
như gen mà hoá quá trình sinh tổng hợp axit bÐo anpha FAS (5,8 kb), beta
FAS (5,1 kb) vµ gen mà hoá tổng hợp polyketide (PKS; 6,6 kb). Tóm lại có 3
gen lớn, kích thước trung bình cúa 22 gen còn lại khoảng 2 kb. vùng 5 cua
tập hợp gen này là đoạn xấp xỉ 2- kb DNA, đoạn này bảo vệ sự định hướng
của tập hợp gen. [19]
1.6.2. Cấu trúc và chức năng của một số gen trong cụm gen sinh tổng hợp
aflatoxin
Aflatoxin là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp theo con đường chuyển hoá:
Acetate -> Polyketide -> Anthraquinones -> Xanthones -> Aflatoxin
.
Bảng 1.8: Các gen sinh tổng hợp aflatoxin
STT Gen

intron

1

fas 2

2

enzym mà hoá hoặc sản Chức năng

phẩm
FAS alpha subunit
acetate -> polyketide

2

fas 1

3

FAS beta subunit

acetate -> polyketide

3

pksA

5

PKA

acetate -> polyketide

4

nor – 1

3

Redutase

NOR -> AVN

5

norA

1

NOR -> AVN

6

norB

0

NOR
reductase/dehydrogenase
dehydrogenase

7

avnA

2

P450 monooxygenase

AVN -> HAVN

8

adhA

0

Alcohol dehydrogenase

9

avfA

0

Oxydase

HAVN -> AVF
or AVNN
AVF -> VHA

24

NOR -> AVN

Đào Thị Thanh Xuân


10

estA

1

Esterase

VHA -> VAL

11

vbs

1

VERB synthase

VAL -> VERB

12

verB

1

Desaturase

VERB -> VERA

13

ver -1

2

dehdrogenase/ketoreductase VERA -> DMST

14

verA

1

Monooxygenase

VERA -> DMST

15

omtB

3

O-methyltranferase I or
O-methyltranferase B

DMST -> ST,
DHDMST -> DHST

16

omtA

4

O-methyltranferase A or
O-methyltranferase II

ST -> OMST,
DHST -> DHOMST

17

ordA

6

Oxydoreductase/P450
monooxygenase

18

aflR

0

Transcription activator

OMST ->
AFB 1 and

AFG 1 ,
DHOMST -> AFB 2 and
AFG 2
regulator

19

aflJ

2

Transcription enhance

regulator

20

aflT

5

Transmembrane protein

21

cypA

4

P450 monooxygenase

22

cypX

2

P450 monooxygenase

23

moxY

0

Monooxygenase

24

ordB

0

Monooxygenase/oxydase

25

hypA

2

Hypothetical protein

- Gen pksA, fas-1, fas-2: lµ 3 gen cã kÝch th­íc lín nhÊt trong cơm gen tham
gia

vµo quá trình sinh tổng hợp aflatoxin. Cả 3 gen này đều có chức năng mÃ

hoá các enzyme xúc tác quá trình chuyển hoá acetate thành polyketide trong
đó đóng vai trò quan trọng nhất là gen pksA, người ta đà chứng minh được
rằng các chủng không mang gen pksA thì nấm mốc không có khả năng sinh
tổng hợp aflatoxin.[14] [19]

25

Đào Thị Thanh Xu©n