Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ fallopia multiflora (thunberg) haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------------------

NGUYỄN THỊ THOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH,
ĐỊNH LƯỢNG HOẠT CHẤT TRONG DƯỢC LIỆU HÀ THỦ Ô ĐỎ
FALLOPIA MULTIFLORA (THUNBERG) HARALDSON
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chun ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 9.44.01.14

TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2021


2
Cơng trình được hồn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Nguyễn Tiến Đạt
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Hải Đăng

Phản biện 1: ...................................................................................................................

Phản biện 2: ...................................................................................................................
Phản biện 3: ...................................................................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp tại Học viện Khoa học và
Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày …
tháng … năm 2021.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia


3
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Ngày nay, việc sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên đang có xu hướng tăng mạnh, do đó
cần có biện pháp quản lý chất lượng dược liệu từ khâu nguyên liệu đến sản phẩm. Chất lượng dược liệu
phần lớn phụ thuộc vào thành phần hoạt chất, những chất hố học có hoạt tính sinh học đóng góp vào tác
dụng dược lý của dược liệu đó. Có nhiều nguyên nhân có thể ảnh hưởng đến thành phần hoạt chất trong
dược liệu bao gồm nguồn gốc ngun liệu khơng đảm bảo; địa hình địa lí trồng trọt, thu hoạch và bảo quản
dược liệu. Cũng có thể do q trình chế biến dược liệu không đúng kỹ thuật dẫn đến mất hoạt chất hoặc
biến đổi hoạt chất, từ hoạt chất có lợi thành chất gây hại cho con người. Ngồi ra, hố chất độc hại cũng có
thể được sử dụng trong bảo quản dược liệu. Thậm chí, một số dược liệu có thành phần hoạt chất thấp hoặc
dược liệu giả mạo cũng được bán trên thị trường với danh nghĩa là dược liệu quý... Do vậy dược liệu nói
chung cần được kiểm tra chất lượng sản phẩm đặc biệt là hàm lượng các hoạt chất có trong thành phần
dược liệu nhằm đảm bảo quyền lợi người tiêu dùng, bảo vệ sức khỏe con người.
Hà thủ ô đỏ là một loại dược liệu phổ biến sử dụng trong chế biến thuốc đông dược. Dược liệu này
được sử dụng trong các sản phẩm đông dược dùng làm thuốc bổ, nhuận tràng, trị thần kinh suy nhược, các
bệnh về thần kinh, bổ máu, làm đen râu tóc... Ở Việt Nam, hà thủ ô đỏ được coi là một vị thuốc quý và an
toàn do quan niệm dân gian và có nguồn gốc tự nhiên. Ngày nay, hà thủ ô đỏ đã được chế ở rất nhiều dạng

khác nhau như: dược liệu miếng hà thủ ô chế, bột hà thủ ô, trà hà thủ ô, viên thuốc hà thủ ô đỏ... Các sản
phẩm này được bày bán tại các hiệu thuốc tây y, hiệu thuốc đông y và có thể mua một cách dễ dàng. Điều
này khẳng định dược liệu hà thủ ô đỏ đỏ được coi là sản phẩm an toàn. Tuy nhiên, trên sản phẩm, hàm
lượng các hoạt chất của dược liệu được công bố không chi tiết và khơng có cảnh báo dùng trong bao lâu.
Do vậy có thể dẫn đến hàm lượng hoạt chất khơng đủ để cải thiện trình trạng bệnh, hoặc tác dụng tích cực
là khơng đáng kể.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính, quy trình phân tích định
tính định lượng các hoạt chất của hà thủ ô đỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu khoa học về hà thủ ơ
đỏ cịn khá khiêm tốn. Một số nghiên cứu được tiến hành trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, song kết
quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở phân tích định tính và định lượng một số ít hoạt chất chính của hà thủ ơ
đỏ.
Để đánh giá đúng chất lượng của hà thủ ô đỏ, cần thiết phải xác định thành phần hóa học và thực
hiện q trình phân tích định lượng nhiều hoạt chất trong loại dược liệu này. Tuy nhiên, ở Việt Nam đến
nay vẫn chưa có nhiều cơng trình cơng bố quy trình định lượng đồng thời nhiều hợp chất trong dược liệu và
các sản phẩm từ dược liệu hà thủ ô đỏ. Dược điển Việt Nam V chưa đưa quy trình định lượng đồng thời
nhiều hoạt chất trong hà thủ ô đỏ. Sự hạn chế này một phần là do chúng ta còn thiếu các chất sạch làm chỉ
thị phân tích trong khi ở một số nước khác có các ngân hàng chất sạch, có thể cung cấp phục vụ rộng rãi
cho các nghiên cứu.
Mặt khác, gần đây đã và đang có một số báo cáo khoa học công bố về một số tác dụng phụ có liên
quan đến hà thủ ơ đỏ. Các cơng bố này chủ yếu đưa ra các cảnh báo về các tác dụng phụ do sử dụng các
chế phẩm hà thủ ô đỏ trong thời gian dài. Tuy cơ chế gây độc chưa được làm sáng tỏ nhưng đã cảnh báo
rằng khi liều dùng không phù hợp sẽ gây lên những tác động xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Vì
vậy, nhằm sử dụng dược liệu một cách an tồn và hiệu quả cần tăng cường quản lý chất lượng thông qua
đánh giá hàm lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ơ đỏ. Để góp phần đánh giá chất lượng dược liệu hà
thủ ô đỏ trên thị trường Việt Nam, trước tiên phải xác định rõ thành phần hoá học của chúng, phân lập và


4
xác định cấu trúc của những hoạt chất chính. Từ đó thiết lập các điều kiện phân tích sắc ký lỏng hiệu năng
cao nhằm phân tích định tính và định lượng các hoạt chất của các mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ.

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng bộ dữ liệu
phân tích định tính, định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunberg)
Haraldson bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của rễ củ hà thủ ơ đỏ. Nghiên cứu xây dựng quy
trình phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất phân lập được. Ứng dụng quy trình phân
tích đã thiết lập đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ. Các kết quả
nghiên cứu đạt được làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái tại Hà Giang,
Việt Nam.
Thiết lập một số điều kiện phân tích sắc ký HPLC trên thiết bị HPLC-DAD-MS từ chất sạch phân
lập được. Lập đường chuẩn định lượng và thẩm định quy trình phân tích đã thiết lập theo tiêu chuẩn của
hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức AOAC.
Ứng dụng quy trình phân tích đã thiết lập phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt
chất trên một số mẫu dược liệu hà thủ ô đỏ đang lưu hành trên thị trường Việt Nam, so sánh và đưa ra kết
luận.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chi Fallopia
1.2. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ
1.3. Tình hình nghiên cứu hà thủ ô đỏ trên thế giới
1.3.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
1.3.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học
1.3.3. Các nghiên cứu về khả năng gây độc gan của hà thủ ơ đỏ
1.3.4. Các nghiên cứu về phân tích định tính, định lượng hoạt chất của hà thủ ơ đỏ
1.4. Tình hình nghiên cứu hà thủ ơ đỏ tại Việt Nam
1.5. Tổng quan về thẩm định phương pháp phân tích

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được thu hái tại huyện Phó Bảng, tỉnh Hà Giang vào tháng 10 năm 2014.
Kích cỡ củ tươi trong khoảng 2-5 x 15-20 cm, khoảng 3÷4 năm tuổi. Tên khoa học được xác định bởi TS.
Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam. Mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được thu hái tự nhiên hoặc được thu mua từ các thị trường dược liệu và được
mã hóa. Mẫu HG là mẫu được sử dụng để tiến hành phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học các
hợp chất trong hà thủ ô đỏ. Đồng thời các chất được phân lập từ mẫu HG được sử dụng làm chất chuẩn sử
dụng trong quá trình định lượng. Mẫu TT6 được sử dụng trong nghiên cứu xác định độ thu hồi của phương


5
pháp định lượng. Các mẫu còn lại được sử dụng nhằm định lượng các hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ
từ nhiều nguồn khác nhau trên thị trường Việt Nam.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC): sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn TLC Silica gel 60
F254 (Merck 1,05715), RP-18 F254S (Merck). Vị trí chất trên bản mỏng được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở
hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng,
sấy khơ rồi hơ nóng từ từ đến hiện màu.
Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với pha tĩnh là silica gel pha thường và pha đảo,
sephadex LH-20 hoặc nhựa trao đổi diaion HP-20 (Sigma). Bột sắc ký silica gel pha thường có cỡ hạt là
0,040-0,063 mm (Merck). Bột sắc ký silica gel pha đảo RP-C18 có cỡ hạt 12 nm.
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được là sự kết hợp giữa các
thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm:
Phương pháp phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên hệ máy
Agilent 1260 series LC-MS single quadrupole 6120 của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Phương pháp phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): phổ khối phân giải cao được đo trên
máy Mass Spectrometter LTQ Orbitrap XL tại khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy
Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Chất nội
chuẩn là TMS (tetramethyl silan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
phân lập được bao gồm:
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY và NOESY.
Điểm nóng chảy (Mp): đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Độ quay cực riêng [α]D: đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện
Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phương pháp xử lí mẫu
Mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ sau khi thu hái hoặc thu mua được thái lát mỏng, phơi khô trong bóng râm
rồi nghiền nhỏ.
Mẫu phân tích định tính, định lượng được chiết siêu âm với dung môi methanol, chiết lặp lại 3 lần
nhằm chiết tách tối ưu các hoạt chất trong mẫu. Lọc dịch chiết qua giấy lọc và chuyển vào bình định mức
và định mức đến vạch.
2.2.4. Phương pháp phân tích định tính, định lượng các hợp chất
Hàm lượng các hợp chất được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và
được thực hiện trên thiết bị HPLC-DAD-MS Agilent Technologies 1260 của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất chuẩn sử dụng khi thiết lập đường chuẩn là chất sạch được
phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang. Chất sạch sau khi phân lập được chạy kiểm tra độ tinh khiết để
đảm bảo độ sạch cho thiết bị HPLC.


6
2.3. Phân lập các hợp chất
Quá trình tiến hành thực nghiệm được mơ tả theo hình 2.2, 2.3 và 2.4:
Củ hà thủ ơ khơ (FM)
(3,5 kg)

Ngâm chiết methanol
(10 Lít x 3 lần)
Cặn chiết methanol
(430,0 g)
Hịa với 2 lít nước, chiết với 1 lít n-hexane (3 lần),
cất loại dung mơi
Cặn n-hexane
(FMH, 51,7 g)

Lớp nước
Chiết với 1 lít ethyl acetate (3 lần),
cất loại dung môi
Cặn ethyl acetate
(FME, 214,5 g)

Dịch nước
(FMW)
CC, diaion HP-20,
M/W (gradient)

M/W-0/100

M/W-25/75

M/W-100/0

FMWA

FMWB
(28,8 g)

FMWC
(62,9 g)

CC: Column chromatography
M: methanol
W: nước

Hình 2.2. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu củ hà thủ ô đỏ

FMWC
(62,9 g)
CC, silica gel
Gradient, 100%D → 100%M
FMWC2
(189,8 mg)
CC, silica gel
H/E-5/1
FM1
(90,4 mg)

FMWC6
(5,0 g)

FMWC5
(1,1 g)
CC,YMC-RP18
A/W-1/1,5

FMWC4

(1,2 g)

CC, silica gel
D/M-6/1

FMW5.1

CC, silica gel
D/M-7/1

FMW4.2.1
A: acetone
D: dichloromethane
E: ethyl acetate
H: hexane
M: methanol
W: nước
CC: column chromatography

CC, LH-20
M/W-1/1,2
FM2
(370 mg)

FMW7.1

CC,YMC-RP18
A/W-1/2

FMW4.2

CC,YMC-RP18
A/W-1/1,5

CC, silica gel
D/M-6/1

FMW6.2

CC, LH-20
M/W-1/1
FMW4.1
(1,4 mg)

FMWC7
(8,0 g)

CC,YMC-RP18
A/W-1/3

FM3
(8 mg)
FM4
(4,5 mg)

FMW6.2.A

CC, LH-20
M/W-1/1

CC, LH-20

M/W-1/1,2
FM5
(12,8 mg)

FMW7.1.A

FM6
(5,4 mg)

FMW7.1.A.1
CC, silica gel
D/M/W-5/1/0,01
FM7
(6,0 mg)

Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn FMWC mẫu củ hà thủ ô đỏ

FMW7.1.B
CC, silica gel
D/M-6/1
FM8
(6,8 mg)


7
FME
(214,5 g)
CC, silica gel
Gradient, 100%H → 100%A

FME1

FME2÷FME7

FME8
CC, silica gel
H/A-4/1

FME8A

FME8B

CC, silica gel
D/M-16/1

CC, silica gel
D/M-16/1
FME8B1

FM9
(3,4 mg)

CC: Column chromatography
A: acetone
D: dichloromethane
H: hexane
M: methanol
W: nước

CC, LH-20

M/W-1/1
FM10
(28,1 mg)

FME8B1A
CC, silica gel
H/A-1/1
FM11
(90,8 mg)

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn ethyl acetate mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ
Như vậy, tiến hành phân lập mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang thu được tổng số 11 hợp chất sạch.
Các hợp chất được kí hiệu từ FM1 đến FM11.
2.4. Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các hợp chất
2.4.1.

Hợp

chất

FM3:

6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic

acid

8-O-β-D-

glucopyranoside (chất mới)
o

Chất dạng bột màu vàng nhạt. Độ quay cực riêng [a]24
𝐷 = +23,4 (c = 0,05, CH3OH). HR-ESI-MS

m/z 433,1110 [M+Na]+. Tính tốn lí thuyết cho cơng thức C19H22NaO10, 433,1111. Cơng thức phân tử:
C19H22O10. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,30 (3H, s, 3-CH3), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,56 (1H, m,
H-5′), 3,54 (1H, m, H-3′), 3,58 (1H, m, H-2′), 3,77 (1H, dd, J = 12,5, 5,5 Hz, Hb-6′), 3,88 (3H, s, OCH3),
3,96 (1H, dd, J = 12,5, 2,5 Hz, Ha-6′), 5,12 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 7,03
(1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 7,05 (1H, m, H-4). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,8 (C-1), 123,9
(C-2), 135,5 (C-3), 120,3 (C-4), 102,5 (C-5), 160,4 (C-6), 104,4 (C-7), 157,2 (C-8), 110,3 (C-9), 139,1 (C10), 171,0 (C-11), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,1 (C-1′), 74,9 (C-2′), 78,1 (C-3′), 71,3 (C-4′), 78,8 (C5′), 62,4 (C-6′).
2.4.2. Hợp chất FM4: 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside
(chất mới)
o
Chất dạng bột màu vàng cam. Độ quay cực riêng [a]24
𝐷 = +12,6 (c = 0,05, CH3OH). HR-ESI-MS

m/z 549,1578 [M+Na]+, tính tốn lí thuyết cho cơng thức C24H30NaO13, 549,1584. Công thức phân tử:
C24H30O13. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,28 (3H, s, 3-CH3), 2,60 (3H, s, CH3CO), 3,36 (2H,
m, H-5″), 3,45 (1H, m, H-4′), 3,51 (1H, t, J = 8,5 Hz, H-3′), 3,57 (1H, m, H-2′), 3,68 (1H, m, H-5′), 3,70
(1H, m, Hb-6′), 3,80 (1H, d, J = 9,5 Hz, Hb-4″), 4,01 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2″), 4,04 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha4″), 4,12 (1H, d, J = 9,5 Hz, Ha-6′), 5,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1″), 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,72
(1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 6,91 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD),

C (ppm): 154,0 (C-1), 123,2 (C-2), 135,2 (C-3), 119,6 (C-4), 105,5 (C-5), 158,1 (C-6), 104,9 (C-7), 157,4


8
(C-8), 109,7 (C-9), 139,3 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,6 (CH3CO), 20,2 (3-CH3), 104,3 (C-1′), 74,9 (C-2′),
78,1 (C-3′), 71,5 (C-4′), 77,6 (C-5′), 68,6 (C-6′), 111,0 (C-1″), 78,1 (C-2″), 80,5 (C-3″), 75,1 (C-4″), 65,7
(C-5″).
2.4.3. Hợp chất FM1: Emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)
Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng cam. ESI-MS m/z 269,0 [M-H]-. Công thức phân tử:

C15H10O5. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,36 (3H, s, 3-CH3), 6,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2),
7,04 (2H, br s, H-4, 7), 7,37 (1H, br s, H-5). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,2 (C-1), 123,7
(C-2), 147,9 (C-3), 120,1 (C-4), 107,6 (C-5), 165,3 (C-6), 108,5 (C-7), 164,2 (C-8), 189,3 (C-9), 180,9 (C10), 134,8 (C-11), 108,6 (C-12), 113,0 (C-13), 132,5 (C-14), 21,2 (3-CH3).
2.4.4. Hợp chất FM2: 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-gluopyranoside
Chất dạng bột vơ định hình màu nâu. ESI-MS m/z 429,0 [M+Na]+. Công thức phân tử: C20H22O9.
H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 3,85-3,44 (6H, m, 6H của phân tử đường), 4,53 (1H, d, J = 8,0

1

Hz, H-1″), 6,28 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-4), 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,64 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6),
7,47 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′), 6,95 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 7,73 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α). 13C-NMR
(125 MHz, CD3OD), C (ppm): 121,6 (C-1), 137,8 (C-2), 151,9 (C-3), 103,5 (C-4), 155,8 (C-5), 108,1 (C6), 133,6 (C-α), 130,8 (C-β), 130,0 (C-1′), 129,1 (C-2′), 116,4 (C-3′), 158,2 (C-4′), 116,4 (C-5′), 129,1 (C6′), 102,7 (C-1″), 75,4 (C-2″), 77,8 (C-3″), 70,7 (C-4″), 78,1 (C-5″), 62,0 (C-6″).
2.4.5. Hợp chất FM5: Pleuropyrone A
Chất dạng bột màu vàng cam. ESI-MS m/z 419,1 [M+H]+. Công thức phân tử: C21H22O9. 1H-NMR
(500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,14 (3H, s, 2-CH3), 2,73 (3H, s, 5-CH3), 3,26 (1H, m, H-4′), 3,35 (2H,
m, H-3′, 5′), 3,50 (1H, m, H-2′), 3,54 (1H, m, Hb-6′), 3,72 (1H, d, J = 11,0 Hz, Ha-6′), 5,05 (1H, d, J = 8,0
Hz, H-1′), 6,18 (1H, s, H-2), 6,76 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 6,79 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-9), 7,26 (1H, s, H-6).
C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), C (ppm): 156,0 (C-1b), 164,0 (C-2), 111,7 (C-3), 178,6 (C-4), 116,8 (C-

13

4a), 134,7 (C-5), 124,5 (C-6), 138,1 (C-6a), 102,8 (C-7), 158,9 (C-8), 102,4 (C-9), 156,2 (C-10), 107,8 (C10a), 19,1 (2-CH3), 22,9 (5-CH3), 100,6 (C-1′), 73,6 (C-2′), 77,0 (C-3′), 69,4 (C-4′), 76,9 (C-5′), 60,5 (C6′).
2.4.6. Hợp chất FM6: Physcionin (Physcion 8-β-D-glucopyranoside)
Chất dạng bột màu vàng. ESI-MS m/z 469,1 [M+Na]+. Công thức phân tử C22H22O10. 1H-NMR
(500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,41 (3H, s, 3-CH3), 3,17 (1H, m, H-4′), 3,35 (1H, m, H-3′), 3,46 (2H, m,
H-2′, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 10,0, 5,5 Hz, Ha-6′), 3,95 (3H, s, 6-OCH3), 5,16 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′),
7,17 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, 7), 7,35 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,47 (1H, br s, H-4). 13C-NMR (125 MHz,
DMSO-d6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,2 (C-2), 147,1 (C-3), 119,3 (C-4), 106,5 (C-5), 164,7 (C-6), 107,3
(C-7), 160,6 (C-8), 186,4 (C-9), 181,8 (C-10), 136,3 (C-11), 114,4 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C-14), 21,4
(3-CH3), 56,0 (6-OCH3), 100,6 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,5 (C-3′), 69,8 (C-4′), 77,4 (C-5′), 60,7 (C-6′).

2.4.7. Hợp chất FM7: Benzyl gentiobioside
Chất dạng bột màu trắng. ESI-MS m/z 431,2 [M-H]-. Công thức phân tử: C19H28O11. 1H-NMR (500
MHz, CD3OD), H (ppm): 3,26 (2H, m, H-2′, 2″), 3,29 (1H, m, H-3′), 3,30 (2H, m, H-4″, 5″), 3,38 (1H, m,
H-3″), 3,30 (1H, m, H-4′), 3,48 (1H, m, H-5′), 3,68 (1H, m, Hb-6″), 3,83 (1H, m, Hb-6′), 3,89 (1H, m, Ha6″), 4,19 (1H, dd, J = 11,5, 1,5 Hz, Ha-6′), 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′), 4,44 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1″),
4,68 (1H, d, J = 12,0 Hz, Hb-7), 4,94 (1H, d, J = 12,0 Hz, Ha-7), 7,28 (1H, br d, H-4), 7,34 (2H, br d, H-3,
5), 7,44 (2H, br d, H-2, 6). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 138,9 (C-1), 129,3 (C-2, 6), 129,2 (C-


9
3, 5), 128,7 (C-4), 72,0 (C-7), 103,3 (C-1′), 75,0 (C-2′, 2″), 77,9 (C-3′, 3″, 5″), 71,4 (C-4′), 77,0 (C-5′), 69,7
(C-6′), 104,8 (C-1″), 71,5 (C-4″), 62,6 (C-6″).
2.4.8. Hợp chất FM8: emodin-8-β-D-glucopyranoside
Chất dạng bột màu vàng cam. ESI-MS m/z 455,0 [M+Na]+. Công thức phân tử C21H20O10. 1H-NMR
(500 MHz, DMSO-d6), H (ppm): 2,40 (3H, s, 3-CH3), 3,16 - 3,44 (4H, m, H của đơn vị đường), 3,52 (1H,
dd, J = 11,5, 5,0 Hz, Hb-6′), 3,73 (1H, dd, J = 5,0 Hz, Ha-6′), 5,04 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 7,00 (1H, d, J
= 2,0 Hz, H-2), 7,14 (1H, br s, H-7), 7,27 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5), 7,45 (1H, br s, H-4). 13C-NMR (125
MHz, DMSO-d6), C (ppm): 161,6 (C-1), 124,1 (C-2), 146,7 (C-3), 119,1 (C-4), 108,4 (C-5), 164,1 (C-6),
100,8 (C-7), 161,1 (C-8), 186,3 (C-9), 182,1 (C-10), 136,4 (C-11), 113,0 (C-12), 114,4 (C-13), 132,0 (C14), 21,3 (3-CH3), 100,8 (C-1′), 73,2 (C-2′), 76,3 (C-3′), 69,4 (C-4′), 77,2 (C-5′), 60,5 (C-6′).
2.4.9. Hợp chất FM9: Resveratrol
Chất dạng bột vơ định hình màu vàng cam. ESI-MS m/z 229,1 [M+H]+. Công thức phân tử:
C14H12O3. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4), 6,47 (2H, d, J = 2,0 Hz,
H-2, 6), 6,77 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, 5′), 6,83 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-β), 6,99 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-α),
7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, 6′). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 141,2 (C-1), 105,7 (C-2, 6),
159,6 (C-3, 5), 102,6 (C-4), 129,4 (C-α), 127,0 (C-β), 130,4 (C-1′), 128,7 (C-2′, 6′), 116,4 (C-3′, 5′), 158,3
(C-4′).
2.4.10. Hợp chất FM10: Torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside
Chất dạng kết tinh hình kim màu vàng chanh. ESI-MS m/z 431,1 [M+Na]+. Công thức phân tử:
C20H24O9. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), H (ppm): 2,29 (3H, s, 3-CH3), 2,59 (3H, s, CH3CO), 3,46 (1H, t,
J = 9,0 Hz, H-4′), 3,52 (1H, m, H-5′), 3,56 (1H, m, H-2′), 3,58 (1H, m, H-3′), 3,77 (1H, dd, J = 1,0, 12,5
Hz, Hb-6′), 3,86 (3H, s, OCH3), 3,95 (1H, d, J = 1,0 Hz, Ha-6′), 5,10 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′), 6,81 (1H, br

s, H-5), 7,00 (1H, s, H-4), 7,00 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), C (ppm): 153,6
(C-1), 123,9 (C-2), 135,4 (C-3), 120,3 (C-4), 102,4 (C-5), 160,3 (C-6), 104,3 (C-7), 157,1 (C-8), 110,2 (C9), 139,0 (C-10), 208,2 (CH3CO), 32,5 (CH3CO), 55,9 (6-OCH3), 20,2 (3-CH3), 104,2 (C-1′), 74,8 (C-2′),
78,0 (C-3′), 71,2 (C-4′), 78,7 (C-5′), 62,3 (C-6′).
2.4.11. Hợp chất FM11: (+)-Catechin
Chất dạng tinh thể màu trắng. ESI-MS m/z 289,1 [M-H]-. Công thức phân tử: C15H14O6. 1H-NMR
(CD3OD, 500 MHz), H (ppm): 4,60 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-2), 4,00 (1H, m, H-3), 2,53 (1H, dd, J = 8,5,
16,5 Hz, Ha-4), 2,87 (1H, dd, J = 5,5, 16,0 Hz, Hb-4), 5,70 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 5,96 (1H, d, J = 2,5 Hz,
H-8), 6,86 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,74 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6'). 13CNMR (CD3OD, 125 MHz), C (ppm): 82,8 (C-2), 68,8 (C-3), 28,4 (C-4), 156,9 (C-5), 95,5 (C-6), 157,5 (C7), 96,3 (C-8), 157,8 (C-9), 100,8 (C-10), 132,2 (C-1'), 115,2 (C-2'), 146,2 (C-3'), 146,1 (C-4'), 116,1 (C5'), 120,0 (C-6').
2.5. Kết quả thiết lập điều kiện phân tích cho hệ thống HPLC
Trong số 11 hợp chất sạch đã phân lập được từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang, các chất sạch đảm
bảo độ sạch và cung cấp đủ lượng chất cho quá trình định lượng được lựa chọn nhằm thiết lập quy trình
định lượng trên thiết bị HPLC. Kết quả đã lựa chọn được 7 chất sạch bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4,
FM5, FM6 và FM8. Các chất này được sử dụng là chất tham chiếu cho quá trình định lượng.
Các điều kiện HPLC được nghiên cứu bao gồm: thể tích bơm mẫu, cột sắc ký, bước sóng detector,
pha động và thành phần pha động, thời gian lưu và độ tinh khiết chất phân tích và khảo sát hệ thống
LC/MS.


10
Sau quá trình khảo sát thu được các kết quả sau:
Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại các chất tham chiếu được trình bày trong bảng 2.2:
Bảng 2.2. Bước sóng hấp thụ cực đại của các chất tham chiếu
Kí hiệu chất

FM1

FM2

FM3

FM4

FM5

FM6

FM8

Bước sóng (nm)

280

320

320

320

280

280

280

Các chất FM2, FM3 và FM4 hấp thụ cực đại tại bước sóng 320 nm; FM1, FM5, FM6 và FM8
hấp thụ cực đại tại bước sóng 280 nm. Để đảm bảo độ nhạy cho phép phân tích, lựa chọn hai bước sóng
280 nm và 320 nm để định lượng đồng thời bảy hợp chất trong mẫu rễ củ hà thủ ơ đỏ.
Điều kiện chạy sắc kí:
Cột tách sắc ký: cột XDB C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm)
Tốc độ dịng: 0,5 mL/phút

Thể tích bơm mẫu: 1 µL
Thành phần pha động: MeOH - nước (0,1% axit acetic), chạy hệ gradient như sau:
Thời gian (phút)

% MeOH

% H2O (0,1% axit acetic)

0

30

70

35

100

0

40

100

0

Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết chất tham chiếu được trình bày trong bảng 2.3:
Bảng 2.3. Kết quả thời gian lưu và độ tinh khiết các chất tham chiếu
Kí hiệu chất

Thời gian lưu (phút)

Độ tinh khiết (%)

FM2

12,7 ÷ 12,8

97,9

FM4

15,7 ÷ 15,8

96,8

FM5

16,4 ÷ 16,5

95,5

FM3

21,0 ÷ 21,1

95,2

FM8

24,3 ÷ 24,4

98,4

FM6

26,5 ÷ 26,6

96,2

FM1

35,3 ÷ 35,4

97,1

Độ sạch các chất tham chiếu đều đạt ≥ 95%. Vì vậy, các chất trên có độ sạch phù hợp làm chất
chuẩn trong phép phân tích định lượng trên thiết bị HPLC.
Pic ion giả phân tử được lựa chọn trong hệ LC/MS được trình bày trong bảng 2.4:
Bảng 2.4. Pic ion giả phân tử các chất tham chiếu trên hệ thống LC/MS
STT

Chất phân tích

Pic ion giả phân tử

1

FM1

269,0 [M-H]-

2

FM2

429,0 [M+Na]+

3

FM3

433,1 [M+Na]+

4

FM4

549,1 [M+Na]+

5

FM5

419,0 [M+H]+

6

FM6

469,1 [M+Na]+

7

FM8

455,0 [M+Na]+

Trong quá trình phân tích mẫu, hệ thống MS phát hiện các chất nhờ pic ion giả phân tử tương ứng.
Qua đó khẳng định tính chọn lọc của phương pháp phân tích.


11
2.6. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng
Sử dụng các chất sạch tham chiếu đã được kiểm tra và đạt độ tinh khiết cần thiết pha dung dịch
chuẩn. Chạy HPLC theo quy trình đã thiết lập thu được phương trình đường chuẩn định lượng cho từng
chất tham chiếu, trình bày trong bảng 2.6:
Bảng 2.6. Kết quả phương trình đường chuẩn định lượng 7 hợp chất
TT

Ký hiệu chất

Phương trình đường chuẩn

R2

1

FM1

y = 6,62295x - 35,495370

0,99990

2

FM2

y = 6,13790x + 3,965890

0,99995

3

FM3

y = 0,92796x + 2,408150

0,99991

4

FM4

y = 1,02181x + 0,786697

0,99994

5

FM5

y = 2,33173x + 6,822620

0,99995

6

FM6

y = 2,06170x + 9,318620

0,99976

7

FM8

y = 4,08608x + 21,567050

0,99991

2.7. Quy trình xử lí mẫu phân tích
Mẫu dược liệu phân tích ở các dạng khác nhau được cắt nhỏ đến kích thước ≤ 3 mm rồi phơi khơ tự
nhiên. Cân chính xác 5 gam mẫu, chiết với 25 mL MeOH trong ống falcon 50 mL, đặt trong máy siêu âm
20 phút, lọc dịch chiết bằng giấy lọc thường chuyển vào bình định mức 100 mL. Chiết lặp lại 3 lần, thu tất
cả dịch lọc chuyển vào bình định mức 100 mL, định mức bằng MeOH đến vạch.
Dùng xilanh hút dịch chiết từ bình định mức 100 mL bơm qua màng lọc mẫu kích thước 0,45 µm.
Dịch lọc được chuyển vào lọ chứa mẫu rồi đưa vào hệ thống HPLC.
2.8. Kết quả thẩm định phương pháp định tính, định lượng

2.8.1. Kết quả xác định tính chọn lọc của phương pháp
Trong sắc ký lỏng sử dụng detector DAD, có thể xác định tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh
khiết của pic sắc kí. Độ tinh khiết của pic được xác định bằng cách so sánh phổ UV của pic phát hiện trên
sắc ký đồ với pic của chất tham chiếu.
Mặt khác, hệ thống HPLC thực nghiệm được kết nối với hệ thống MS. Do vậy độ chọn lọc của
phương pháp còn được xác định thông qua việc so sánh phổ MS của chất phân tích với phổ MS của chất
tham chiếu tương ứng.
2.8.2. Kết quả xác định LOD, LOQ
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn các chất tham chiếu ở nồng độ thấp gần giá trị nồng độ nhỏ nhất
của đường chuẩn. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 10 lần, tính độ lệch chuẩn SD. Khi đó giá trị LOD và LOQ
được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn SD.
Tiến hành thí nghiệm phân tích với mẫu chuẩn các chất có nồng độ 10 µg/mL, kết quả xác định
LOD và LOQ được trình bày trong bảng 2.7:
Bảng 2.7. Kết quả xác định LOD và LOQ
Ký hiệu

Nồng độ

chất

(µg/mL)

1

FM2

10

2

FM4

3
4

TT

LOD

LOQ

(µg/mL)

(µg/mL)

0,9498

0,5106

1,5474

10

0,4211

1,3600

4,1212

FM5

10

1,0128

1,4333

4,3435

FM3

10

0,4424

1,5736

4,7684

SD


12
5

FM8

10

0,6187

0,4997

1,5143

6

FM6

10

0,4591

0,7349

2,2269

7

FM1

10

1,0240

6,6000

19,8000

Kết quả thực nghiệm cho thấy LOD và LOQ có giá trị nhỏ, giá trị LOD các chất đạt trong khong

0,4997 ữ 6,6000 àg/mL, giỏ tr LOQ trong khong 1,51143 ÷ 19,8000 µg/mL. Các giá trị LOQ đều nhỏ
hơn giá trị nồng độ nhỏ nhất của đường chuẩn chứng tỏ phương pháp định tính và định lượng đã thiết lập
có độ nhạy cao.
2.8.3. Kết quả xác định độ chụm
Độ chụm bao gồm độ lặp và độ tái lặp. Sử dụng các chất sạch tham chiếu, pha các dung dịch chuẩn
hỗn hợp 7 chất với các nồng độ khác nhau trong khoảng làm việc của đường chuẩn: 500 µg/ml; 125 µg/ml;
25 µg/ml. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần trên cùng một mẫu (mỗi lần bắt đầu từ cân mẫu chuẩn). Độ tái
lặp được thực hiện trên 3 ngày thực nghiệm, mỗi ngày cách nhau 3 ngày. Tính độ lệch chuẩn (SD) và độ
lệch chuẩn tương đối (RSD).
Kết quả thực nghiệm cho thấy: các dung dịch thử của các chất với nồng độ 25 µg/mL có giá trị
RSD nằm trong khoảng 0,5160 ÷ 3,4721%, nhỏ hơn 7,3%; các phép đo có nồng độ 125 µg/mL và 500
µg/mL có RSD trong khoảng 0,1215 ÷ 1,4881%, nhỏ hơn 5,3%. Điều này cho phép kết luận phương pháp
định tính định lượng đồng thời 7 hợp chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ có độ tái lặp tốt, phù hợp yêu cầu
của AOAC.
2.8.4. Kết quả xác định độ đúng
Để đánh giá độ đúng phương pháp phân tích đã thiết lập, tiến hành thực nghiệm xác định độ thu
hồi. Thí nghiệm xác định độ thu hồi được tiến hành trên mẫu thực, ký hiệu mẫu TT6. Cân chính xác 5,0
gam mẫu, Thêm chất chuẩn ở ba mức nồng độ là thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc.
Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu lần lượt là 25 µg/mL; 125 µg/mL và 500 µg/mL. Kết quả tính độ thu hồi
mẫu R(%) dao động trong khoảng 90,3% đến 101,6%. Theo tiêu chuẩn AOAC, khi nồng độ các chất đạt
khoảng 100 µg/mL, độ thu hồi yêu cầu trong khoảng 90% ÷ 107%; khoảng 80% ÷ 110% khi nồng độ chất
thử đạt cỡ 10 µg/mL. Đối chiếu tiêu chuẩn của AOAC, độ thu hồi của các chất đều nằm trong khoảng cho
phép.
2.9. Kết quả phân tích mẫu
Mẫu sau khi được xử lí được đưa vào hệ thống HPLC-DAD-MS. Chạy HPLC mẫu theo quy trình
đã thiết lập thu được các giá trị diện tích pic ứng với mẫu tương ứng. Nồng độ của các hoạt chất trong mẫu
phân tích được tính dựa vào phương trình đường chuẩn và diện tích pic ứng với mỗi chất trong sắc ký đồ
của từng mẫu. Nồng độ chất tham chiếu trong mẫu được tính theo cơng thức:
C (mg⁄g) =
Trong đó:

C1 .V.10−3 100
. Q
G

(2.7)

C1 là nồng độ chất tham chiếu tính theo đường chuẩn (µg/mL)
G là khối lượng mẫu (g);
V là thể tích mẫu, V = 100 mL;
Q là độ sạch các chất tham chiếu (Bảng 2.3) .

Các mẫu được tiến hành phân tích lặp lại 3 lần. Tiến hành đo mẫu ở các bước sóng hấp thụ cực đại
thu được các giá trị diện tích pic tương ứng với các hợp chất định lượng. Từ phương trình đường chuẩn,
tính được giá trị nồng độ chất tham chiếu. Kết quả hàm lượng các hợp chất có sự khác biệt giữa các mẫu
trong đó mẫu thu hái tự nhiên thường cao hơn nhóm mẫu cịn lại.


13

CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ hà thủ ô đỏ
Từ rễ hà thủ ô đỏ Hà Giang đã phân lập và xác định được cấu trúc của 11 hợp chất bao gồm 3 hợp
chất anthraquinone (FM1, FM6, FM8); 4 hợp chất phenolic (FM2, FM7, FM9, FM11) và 4 hợp chất
glycoside (FM3, FM4, FM5, FM10).
Hợp

chất

FM3:

6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic

acid

8-O-β-D-

glucopyranoside (chất mới)
Hợp chất FM3 thu được dưới dạng chất bột màu vàng nhạt. Dựa trên phổ HR-ESI-MS với sự xuất
hiện pic ion giả phân tử tại m/z 433,1110 [M+Na]+ (tính tốn lí thuyết cho cơng thức C19H22NaO10:
433,1111). Kết hợp với phổ 13C-NMR xác định được công thức phân tử của hợp chất FM3 là C19H22O10,
khối lượng phân tử M = 410.
Phổ 1H-NMR của FM3 xuất hiện 3 tín hiệu proton vịng thơm trong đó có một proton tại [H 7,05
(1H, s, H-4)], hai proton ghép cặp meta tại [δH 6,84 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5) và 7,03 (2H, d, J = 2,0 Hz, H7)]. Cũng trên phổ 1H-NMR, tại vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu một nhóm methyl tại [δH 2,28 (3H, s,
3-CH3)], tín hiệu cao hơn các nhóm methyl thơng thường nên dự đốn nhóm methyl này gắn trực tiếp với
vịng thơm. Tín hiệu phổ proton của một nhóm methoxy tại [δH 3,88 (3H, s, 6-OCH3)], tín hiệu cao hơn các
nhóm methoxy thơng thường nên dự đốn nhóm methyl này gắn trực tiếp với vịng thơm. Ngồi ra, trên
phổ 1H-NMR cịn quan sát thấy tín hiệu của các proton thuộc vùng đường ở δH 3,44 ÷ 4,85 và tín hiệu của 1
proton anome tại [δH 5,12 (1H, d, H-1′]. Đơn vị đường glucose có cấu trúc β do giá trị hằng số tương tác
lớn (J1,2 = 7,5 Hz).
Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của FM3 cho thấy sự có mặt của 19 nguyên tử carbon, bao gồm một
nhóm methoxy tại C 55,2; một nhóm methyl tại C 19,4; một nhóm methylene tại C 62,4; 4 nhóm methine
tại C 71,3 74,9, 78,1, 78,8; và 8 nhóm carbon khơng chứa hydro tại C 110,3, 123,9, 135,5, 139,1, 153,8,
157,2, 160,4, 171,0.
Phân tích dữ liệu phổ 1H- và

13

C-NMR của hợp chất FM3, đồng thời so sánh dữ liệu phổ với

torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside cho thấy so với hợp chất tham khảo là torachrysone 8-O-β-Dglucopyranoside có sự tương đồng về cấu trúc ngoại trừ sự thay thế nhóm acetyl bằng nhóm cacboxylic (δC
171,0). Giá trị trên phổ 13C-NMR của C-11 là C 171,0, trong khi C 204,3 là giá trị phổ trong hợp chất
torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside.
Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu của proton liên kết trực tiếp với
carbon. Cấu tạo của FM3 được làm sáng tỏ thêm bằng các phân tích trên phổ COSY. Trên phổ COSY,
khung naphtalene được khẳng định bởi tương tác của proton H-4 (δH 7,05) và H-7 (δH 7,03) với H-5 (δH
6,84). Các tương tác trên phổ COSY giữa proton H-1′ (δH 5,12) với H-2′ (δH 3,58); H-2′ (δH 3,58) với H-3′
(δH 3,54); H-3′ (δH 3,54) với H-4′ (δH 3,45); H-4′ (δH 3,45) với H-5′ (δH 3,56); H-5′ (δH 3,56) với H-6′ (δH
3,77; 3,96) khẳng định sự có mặt của một đơn vị đường β-D-glucopyranoside.
Tương tác HMBC giữa proton thuộc nhóm methyl (δH 2,30) và C-2 (δC 123,9)/C-3 (δC 135,5)/C-4
(δC 120,3) chứng minh vị trí của nhóm methyl này tại C-3. Tương tự, tương tác HMBC giữa nguyên tử H


14
trong nhóm methoxy (δH 3,88) với C-6 (δC 160,4) khẳng định vị trí nhóm methoxy tại C-6. Mặt khác, tương
tác HMBC giữa H-1′ (δH 5,12) với C-8 (δC 157,2) khẳng định vị trí của đơn vị đường glucose tại C-8.

Hình 3.7. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM3

Hình 3.8. Phổ HMBC của hợp chất FM3
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM3 và hợp chất tham khảo
C

*

δCd,b

δCa,b

δHa,c (độ bội, J, Hz)

1

150,9

153,8

-

2

123,0

123,9

-

3

136,8

135,5

-

4

118,8

120,3

7,05 s

5

102,7

102,5

6,84 d (2,0)

6

158,2

160,4

-

7

103,0

104,4

7,03 d (2,0)

8

155,3

157,2

-

9

108,5

110,3

-

10

133,6

139,1

-

11

204,3

171,0

-

6-OCH3

55,2

55,9

3,88 s

3-CH3

19,4

20,2

2,30 s

1′

101,1

104,1

5,12 d (7,5)

2′

73,3

74,9

3,58 m

3′

76,1

78,1

3,54 m

4′

69,8

71,3

3,45 m

5′

77,7

78,8

3,56 m

6′

60,5

62,4

3,77 dd (12,5, 5,5)


15
3,96 dd (12,5, 2,5)
a

đo trong CD3OD, b 125MHz, c 500MHz, d đo trong DMSO-d6, *δ dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất
torachrysone 8-O-β-D-glucopyranoside
Mặt khác, để khẳng định cấu hình tuyệt đối của hợp chất FM3, sử dụng phương pháp thủy phân

axit. Hợp chất FM3 được lấy 1 mg, hòa tan trong 1 ml dioxan / HCl 1 N (1: 1 v/v) và đun nóng ở 80°C
trong 3 giờ. Dung dịch axit được trung hòa bằng bạc cacbonat và chiết bằng CH2Cl2, tách loại dung môi.
Lớp nước được cô đặc đến khơ bằng khí nitơ. Sau đó, hịa tan trong 0,1 mL pyridin, tiếp theo thêm 0,1 mL
L-cystein metyl este hydroclorid 0,06 M trong pyridin. Sau khi đun nóng ở 60°C trong 2 giờ, thêm vào
dung dịch 0,1 mL trimethylsilylimidazole, đun nóng ở 60°C trong 1,5 giờ nữa. Sản phẩm khơ được hòa tan
đồng thời bằng n-hexan và nước (mỗi loại 0,1 mL). Sử dụng lớp hữu cơ phân tích GC trên hệ thống GC
Agilent 7890B sử dụng cột SPB-1 (0,25 mm × 30 m), máy dị FID, nhiệt độ cột 210°C, nhiệt độ kim phun
270°C, nhiệt độ detector 300°C, sử dụng khí mang He. D-glucose được phát hiện ở 14,15 phút.
Từ những phân tích trên kết luận được hợp chất FM3 là 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside, một chất mới lần đầu tiên được công bố.
Hợp chất FM4: 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (chất
mới)
Hợp chất FM4 thu được dưới dạng chất bột màu vàng cam. Trên phổ khối phân giải cao HR-ESIMS xuất hiện pic ion giả phân tử m/z 549,1578 [M+Na]+ (tính tốn lí thuyết cho công thức C24H30NaO13:
549,1584). Kết hợp với phổ 13C-NMR, công thức phân tử của hợp chất FM4 được xác định là C24H30O13,
khối lượng phân tử M = 526.
Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất FM4 gợi ý đây là một phenolic glycoside, bao gồm hai
proton ghép cặp meta, 1 nhóm methyl và một nhóm acetyl. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của FM4 và 6hydroxymusizin 8-O-β-D-glucoside, cho thấy chúng tương tự nhau. Sự khác nhau giữa hai chất này là FM4
có thêm một đơn vị đường apiose. Ngồi ra phổ 1H-NMR của hợp chất FM4 cịn xuất hiện tín hiệu hai
proton anome tại δH 5,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1″) và 5,07 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′) gợi ý cho hai đơn vị

đường apiosyl và glucosyl tương ứng. Đơn vị đường glucose có cấu hình β do giá trị hằng số tương tác lớn
(J1,2 = 7,5 Hz), và đơn vị đường apiose được xác định cấu hình α (J1,2 = 2,5 Hz).
Phổ 13C-NMR và DEPT của FM4 cho thấy sự có mặt của 24 carbon, bao gồm một nhóm methyl tại

C 20,2; một nhóm methyl của nhóm acetyl tại C 32,6; 3 nhóm methylene tại C 65,7, 68,6, 75,1; 10 nhóm
methine tại C 71,5, 74,9, 77,6, 78,1, 78,1, 104,3, 104,9, 105,5, 119,6, 111,0; và 9 nguyên tử carbon không
liên kết với hyđro tại C 80,5, 109,7, 123,2, 135,2, 139,3, 154,0, 157,4, 158,1, 208,2.
Phân tích các tương tác trên phổ HSQC cho phép ta gán tín hiệu của proton liên kết trực tiếp với
carbon. Các tương tác HMBC giữa H-1″ (δH 5,05) và C-6′ (δC 68,6), H-1′ (δH 5,07) và C-8 (δC 157,4) khẳng
định đơn vị đường apiose được gắn vào vị trí C-6′ của đơn vị đường glucose và C-1′ của đơn vị đường gắn
tại vị trí C-8 của khung naphtalene. Ngồi ra, tương tác HMBC giữa proton trong nhóm acetyl (δH 2,60) và
C-2 (δC 123,2) chứng minh vị trí của nhóm acetyl tại C-2. Tương tác HMBC giữa proton trong nhóm
methyl (δH 2,28) và C-3 (δC 135,2)/C-2 (δC 123,2)/C-4 (δC 119,6) chứng minh vị trí của nhóm methyl tại C3.


16

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất FM4

Hình 3.15. Phổ HMBC của hợp chất FM4
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM4 và hợp chất tham khảo
C

*

δCd,b

δCa,b

δHa,c (độ bội, J, Hz)

1

151,1

154,0

-

2

123,2

123,2

-

3

136,9

135,2

-

4

118,6

119,6

6,91 s

5

102,4

105,5

6,72 d (2,0)

6

158,2

158,1

-

7

103,3

104,9

7,00 d (2,0)

8

155,1

157,4

-

9

108,7

109,7

-

10

133,6

139,3

-

CH3CO

204,3

208,2

-

CH3CO

32,2

32,6

2,60 s

3-CH3

19,4

20,2

2,28 s

8-O-β-D-glucopyranoside
1′

101,2

104,3

5,07 d (7,5)

2′

72,2

74,9

3,57 m

3′

75,8

78,1

3,51 t (8,5)

4′

69,9

71,5

3,45 m

5′

74,4

77,6

3,68 m

6′

63,3

68,6

4,12 d (9,5)


17
3,70 m
6′-O-β-D-apiofuranoside
1″

-

111,0

5,05 d (2,5)

2″

-

78,1

4,01 d (2,5)

3″

-

80,5

-

4″

-

75,1

5″
a

-

4,04 d (9,5)
3,80 d (9,5)

65,7

3,36 s

đo trong CD3OD, 125MHz, 500MHz, đo trong DMSO-d6, δ dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất 6b

c

d

*

hydroxymusizin 8-O-β-D-glucoside
Mặt khác, để khẳng định cấu hình tuyệt đối của hợp chất FM4, sử dụng phương pháp thủy phân

axit tương tự đối với FM3. Kết quả, pic tín hiệu của D-glucose và D-apiose được phát hiện lần lượt ở 14,15
phút và 4,61 phút.
Từ những phân tích trên kết luận được hợp chất FM4 là 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside, một hợp chất mới lần đầu tiên được cơng bố.
3.2. Thiết lập quy trình định tính, định lượng hoạt chất trong hà thủ ô đỏ
Các hợp chất trong thành phần hóa học dược liệu hà thủ ơ đỏ được phân tích định tính và định
lượng đồng thời trên hệ thống HPLC-MS. Bảy hợp chất trong mẫu được lựa chọn phân tích bao gồm:
emodin (FM1), 2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-gluopyranoside (FM2), 6-methoxy-3-methyl-1,6,8trihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside (FM3), 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside (FM4), pleuropyrone A (FM5), physcionin (FM6) và emodin 8-O-β-Dglucopyranoside (FM8).
Hoạt chất THSG (FM2) là hoạt chất có nhiều hoạt tính có giá trị của hà thủ ô đỏ. Theo kết quả
nghiên cứu, các hợp chất khác được phân lập từ hà thủ ô đỏ cũng có hoạt tính có giá trị. Kết quả đánh giá
hoạt tính cho thấy các hợp chất FM1 và FM6 có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh trên các dòng ung
thư phổi ở người (H1299) và ung thư gan ở người (Hep3B). Hợp chất FM1 cịn có tác dụng mạnh trên
dòng tế bào ung thư phổi (A549). Như vậy, đánh giá đồng thời nhiều hợp chất trong thành phần hóa học
của hà thủ ơ đỏ là cần thiết. Phân tích đồng thời nhiều hoạt chất sẽ góp phần đánh giá toàn diện về thành
phần và chất lượng dược liệu trong cùng một quy trình định lượng. Đồng thời tiết kiệm chi phí cũng như
thời gian phân tích. Vì vậy, xây dựng quy trình định lượng đồng thời và tiêu chuẩn dược liệu trong Dược
điển đối với các hoạt chất này là rất cần thiết. Qua đó, căn cứ vào tiêu chuẩn và phương pháp trong Dược
điển, các mẫu dược liệu sẽ được kiểm soát và đánh giá chất lượng.
Căn cứ trên lượng chất sạch phân lập được từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang cũng như sự phù hợp
về điều kiện phân tích HPLC 7 hợp chất đã được lựa chọn phân tích định tính và định lượng đồng thời. Các
hợp chất định lượng bao gồm: FM2, FM4, FM5, FM3, FM8, FM6 và FM1. Các hợp chất trong mẫu được
phân tích định tính dựa trên các thông số: thời gian lưu, phổ DAD và giá trị phổ MS trong hệ thống kết nối
LC-MS. Đồng thời bảy hoạt chất này cũng được định lượng đồng thời dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa
nồng độ và diện tích pic thu được.
Kết quả phương pháp định tính và định lượng đồng thời các hoạt chất trong mẫu dược liệu hà thủ ô
đỏ đã được thiết lập. Các chất tham chiếu sử dụng làm chất chuẩn được phân lập từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ
Hà Giang. Do đó, chủ động được nguồn chất chuẩn sử dụng trong phân tích, khắc phục được những hạn
chế trong việc tìm chất chuẩn sử dụng trong phân tích định lượng các hợp chất hữu cơ. Chất chuẩn sau khi


18

phân lập được xác định độ sạch bằng phân tích HPLC. Độ tinh khiết của các chất tham chiếu được sử dụng
trong q trình tính hàm lượng các hoạt chất trong mẫu nhằm đảm bảo tính chính xác các kết quả phân tích.
Thời gian phân tích một mẫu tiến hành trong 40 phút, là khoảng thời gian phù hợp, tiết kiệm chi
phí so với một số cơng bố trước đây. So sánh với phương pháp định lượng đã công bố của Y. Tao (thời
gian phân tích là 55 phút) hay D.Q Han (thời gian phân tích là 45 phút), thời gian phân tích mẫu đã được
rút ngắn. Do vậy thực hiện quy trình phân tích đã thiết lập giúp tiết kiệm thời gian và dung mơi. Mặt khác,
quy trình phân tích được thực hiện trên cột sắc ký pha đảo XDB C18 kích thước 150 x 4,6 mm, kích thước
hạt 5 µm là loại cột khá phổ biến cho quá trình thực nghiệm. Hệ dung mơi lựa chọn cơ bản dễ tìm MeOH nước (0,1% axit acetic), chạy hệ gradient đảm bảo q trình phân tách chất. Tín hiệu chất trong q trình
định tính và định lượng được đo trên detector DAD ở bước sóng hấp thụ cực đại của mỗi chất, do đó đảm
bảo độ nhạy cho phép phân tích.
Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao nhằm kiểm sốt chất lượng dược liệu hà
thủ ơ đỏ đã được nêu trong Dược điển Trung Quốc, Dược điển Hồng Kông và Dược điển Mỹ. Trong Dược
điển Trung Quốc hàm lượng các hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ cũng được định lượng bằng phương
pháp sắc ký lỏng liệu năng cao. Trong đó, tiêu chuẩn đối với dược liệu được đưa ra là hàm lượng
anthraquinone kết hợp không dưới 0,1% và hàm lượng THSG không dưới 1% tính theo dược liệu khơ.
Dược điển Hồng Kơng chỉ đề cập đến tiêu chuẩn đối với THSG (FM2), dược liệu đạt tiêu chuẩn khi hàm
lượng hoạt chất này ≥ 2,2% tính theo dược liệu khơ.
Trong Dược điển Mỹ, dược liệu đạt tiêu chuẩn khi được xác định hàm lượng anthraquinone kết hợp
và hoạt chất THSG (FM2). Hai thành phần này được định lượng riêng bằng phương pháp HPLC với hệ
dung môi: nước 0,1% axit formic và acetonitrile. Theo tiêu chuẩn này, hàm lượng hoạt chất THSG không
nhỏ hơn 1,5% tính trên dược liệu khơ.
Như vậy các chun luận Dược điển đề cập trên đều quan tâm đến hàm lượng hoạt chất THSG
trong dược liêu hà thủ ô đỏ. Trong khi đó chuyên luận Dược điển Việt Nam IV vẫn chưa có quy trình định
lượng hoạt chất này. Quy trình định lượng hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ lần đầu tiên được đưa vào
Dược điển Việt Nam V. Trong đó, hoạt chất định lượng là anthraquinone kết hợp gồm emodin và physcion
với hệ dung môi là methanol - dung dịch axit phosphoric 0,1% (80:20), khơng có quy trình phân tích
THSG. Theo chuẩn Dược điển Việt Nam V, hàm lượng anthraquinone kết hợp khơng dưới 0,1% tính theo
dược liệu khơ.
3.3. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng
Thẩm định phương pháp phân tích là một phần khơng thể thiếu để kết quả phân tích đáng tin cậy.

Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng
minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Kết quả của thẩm định phương pháp có thể
được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Phương pháp phân tích định tính
định lượng đồng thời bảy hoạt chất trong loài hà thủ ô đỏ được thiết lập thuộc nhóm phương pháp không
tiêu chuẩn. Vì vậy, thẩm định phương pháp đã xây dựng là cần thiết. Các tiêu chí đã thẩm định bao gồm:
tính chọn lọc; LOD và LOQ; độ chụm (độ lặp và độ tái lặp) và độ đúng. Các kết quả thẩm định là tin cậy và
thuộc giới hạn cho phép theo tiêu chuẩn AOAC.
Trong q trình phân tích, các chất được định tính bằng phổ UV, thời gian lưu và phổ khối lượng
MS. Phổ UV của các chất trong mẫu có độ trùng khít cao so với các chất chuẩn tham chiếu. Trên hệ thống
LC, pic sắc ký của các chất được phát hiện một cách ổn định tại thời gian lưu: FM2 (12,7 - 12,8) phút;
FM4 (15,7 - 15,8) phút; FM5 (16,4 - 16,5) phút; FM3 (21,0 - 21,1) phút; FM8 (24,3 - 24,4) phút; FM6


19
(26,5 - 26,6) phút; FM1 (35,3 - 35,4) phút. Mặt khác, trong q trình phân tích mẫu, sự có mặt của các chất
cịn được khẳng định qua thơng tin trên phổ MS. Hệ thống MS phát hiện được pic ion giả phân tử của các
chất tại thời điểm tương ứng. Điều này khẳng định phương pháp phân tích đã thiết lập có độ chọn lọc cao.
Bảy hợp chất định tính và định lượng trong hà thủ ơ đỏ có giá trị LOD và LOQ nhỏ: giá trị LOD
dao động trong khong 0,4997 ữ 6,6000 àg/mL; giỏ tr LOQ dao ng t 1,5143 ữ 19,8000 àg/mL. c
xỏc nh bng thớ nghim trên mẫu chuẩn có nồng độ nhỏ lặp lại 10 lần, các giá trị LOQ đều nhỏ hơn giá trị
nhỏ nhất của đường chuẩn. Do đó khẳng định thêm độ tin cậy đối với đường chuẩn đã xây dựng. Sử dụng
phương pháp phân tích đã thiết lập giúp định tính định lượng đồng thời bảy hoạt chất đạt độ nhạy cao.
Độ chụm của phương pháp bao gồm độ lặp và độ tái lặp cũng đã được thẩm định. Kết quả thẩm
định dựa trên các phép xác định trên chất tham chiếu với 5 lần lặp. Qua đó xử lí số liệu, tính độ lệch chuẩn
tương đối (RSD), từ đó đối chiếu với tiêu chuẩn AOAC nhằm đánh giá độ chụm của phương pháp. Kết quả
thực nghiệm cho thấy, khi xác định độ lặp, giá trị RSD của các chất đạt 0,0671 ÷ 3,4528 %. Khi xác định
độ tái lặp, giá trị RSD của các chất đạt 0,1215 ÷ 3,4721 %. So sánh với tiêu chuẩn AOAC, giá trị RSD của
các chất đều thuộc giới hạn cho phép. Do vậy phương pháp định tính, định lượng đã thiết lập có độ chụm
cao.
Mặt khác phương pháp còn được thẩm định về độ đúng thông qua độ thu hồi. Độ thu hồi được xác

định trên mẫu thực thêm chuẩn và được tiến hành lặp 6 lần. Kết quả thực nghiệm cho thấy giá trị thu hồi
các chất đạt khoảng 90,3% đến 101,6%. So sánh với tiêu chuẩn AOAC ở các mức nồng độ tương ứng, giá
trị độ thu hồi xác định được nằm trong giới hạn cho phép. Do đó khẳng định phương pháp định tính định
lượng bảy hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ đạt yêu cầu về độ đúng.
Như vậy, phương pháp định tính, định lượng đồng thời bảy hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô đỏ đã
được thẩm định các thơng số: tính chọn lọc; LOD và LOQ; độ chụm (độ lặp và độ tái lặp) và độ đúng. Các
thông số được thẩm định đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC. Qua đó khẳng định phương pháp đã xây
dựng có độ tin cậy, có thể áp dụng phân tích mẫu nhằm định lượng các hoạt chất trong dược liệu hà thủ ô
đỏ.
3.4. Hàm lượng hoạt chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ
Các mẫu phân tích được tiến hành xử lí mẫu tương tự nhau bao gồm gia công, chiết siêu âm, thời
gian và số lần chiết như nhau bằng methanol rồi định mức thành 100 mL thu được dung dịch mẫu phân
tích. Phân tích lần lượt các mẫu trên thiết bị HPLC theo quy trình đã xây dựng thu được sắc ký đồ và giá trị
diện tích pic tương ứng. Dựa vào đường chuẩn đã lập và cơng thức tính, từ đó tính được hàm lượng (mg/g)
các hợp chất trong mẫu. Kết quả hàm lượng hoạt chất trong mẫu được trình bày trong bảng 3.12:
Bảng 3.12. Hàm lượng các hoạt chất trong 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ (mg/g)
Hàm lượng chất phân tích (mg/g)

Chất
phân tích

HG

CU

CE

TT1

TT2

TT3

TT4

TT5

FM2

55,010±0,505

1,170±0,025

2,160±0,058

0,507±0,038

2,285±0,024

3,285±0,020

1,698±0,021

2,418±0,029

FM4

0,173±0,014

0,020±0,001

0,025±0,001

+

0,043±0,003

0,038±0,001

0,035±0,001

0,039±0,001

FM5

0,117±0,004

+

+

-

-

+

+

-

FM3

0,398±0,006

+

+

-

-

-

-

-

FM8

3,183±0,020

-

+

+

+

+

+

+

FM6

1,404±0,028

+

-

+

+

+

+

+

FM1

0,438±0,027

+

+

-

+

+

0,547±0,031

+

(+): Có phát hiện nhưng khơng định lượng được

(-): Không phát hiện


20
Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng các hoạt chất có sự chênh lệch giữa mẫu thu hái tự nhiên và
nhóm các mẫu lưu hành trên thị trường. Hầu hết các hợp chất trong mẫu thu hái tự nhiên đều cao hơn các
mẫu còn lại kể cả mẫu hà thủ ô đỏ dạng củ bán trên thị trường. Điển hình với FM2, một hoạt chất quan
trọng với nhiều hoạt tính có giá trị của hà thủ ơ đỏ, độ chênh lệch lên tới 110 lần. Một số thành phần khác
như FM3, FM5, FM6 và FM8 chỉ định lượng được đối với mẫu Hà Giang, khơng định lượng được với
nhóm các mẫu còn lại. FM3 là chất mới lần đầu tiên được phân lập từ hà thủ ô đỏ. Điều này gợi ý có thể sử
dụng FM3 làm chất chỉ thị đặc trưng cho loại dược liệu này. Căn cứ vào tiêu chuẩn dược liệu trong các
chuyên luận dược điển, các mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ được đánh giá như sau (Bảng 3.13):

Bảng 3.13. Hàm lượng (%) THSG và anthraquinone kết hợp trong 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ
Hàm lượng (%)

Chất
THSG

Đánh giá

Anthraquinone

Dược điển

Dược điển

kết hợp (FM1 +

Trung

Hồng

FM6 + FM8)

Quốc

Kông

Mẫu

Dược điển
Mỹ

Dược điển

Việt Nam
V

HG

5,50

0,50

Đạt

Đạt

Đạt

Đạt

CU

0,12

-

KĐ

KĐ

KĐ

KĐ

CE

0,22

-

KĐ

KĐ

KĐ

KĐ

TT1

0,05

-

KĐ

KĐ

KĐ

KĐ

TT2

0,23

-

KĐ

KĐ

KĐ

KĐ

TT3

0,33

-

KĐ

KĐ

KĐ

KĐ

TT4

0,17

0,05

KĐ

KĐ

KĐ

KĐ

TT5

0,24

-

KĐ

KĐ

KĐ

KĐ

(-): Không xác định

KĐ: Không đạt

Đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ theo chuẩn Dược điển cho thấy hầu hết các mẫu dược

liệu không đạt tiêu chuẩn theo chuẩn Dược điển Việt Nam cũng như chuẩn dược điển Trung Quốc, Hồng
Kông và dược điển Mỹ. Chỉ duy nhất mẫu HG, hàm lượng các hợp chất trong dược liệu đảm bảo đạt chuẩn
theo các chuẩn dược điển.
Như vậy, có thể nhận định mẫu rễ củ hà thủ ơ đỏ tự nhiên có chất lượng tốt hơn các mẫu dược liệu
khác trên thị trường Việt Nam. Điều này có thể do vùng đất Hà giang có đặc điểm địa hình, địa chất và khí
hậu phù hợp với loại cây này. Nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới ẩm nhưng do địa hình cao nên khí hậu
Hà Giang mang nhiều sắc thái ơn đới. Địa hình và khí hậu vùng này thích hợp cho trồng các loại cây dược
liệu trong đó có hà thủ ô đỏ.
Theo kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Hà Ly, hàm lượng các hợp chất THSG,
emodin và physcion trên một số mẫu thuộc tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Hà Nội và Hưng Yên là rất khác nhau.
Qua đó khẳng định các vùng trồng khác nhau có hàm lượng các hợp chất khác nhau, đặc biệt các mẫu trồng
ở vùng núi cao có hàm lượng THSG cao hơn vùng đồng bằng.
Mặt khác, theo kết quả phân tích, các mẫu rễ củ hà thủ ơ đỏ chế có hàm lượng các hoạt chất thấp
hơn mẫu Hà Giang thậm chí thấp hơn các mẫu thị trường. Hoạt chất FM2 và FM4 được định lượng trên
mẫu này có hàm lượng thấp, cịn lại các hoạt chất khác thì chỉ phát hiện được nhưng không định lượng


21
được. Điều này cho phép nhận định mẫu rễ củ hà thủ ơ đỏ chế này có chất lượng thấp. Ngun nhân có thể
do quy trình chế biến mẫu chưa hợp lí, hàm lượng các hoạt chất có thể bị mất hoặc bị biến đổi trong q
trình chế biến.
Ngồi ra cũng có thể do thời gian trồng dược liệu chưa đủ, thời điểm thu hái chưa phù hợp hoặc
trồng ở vùng đất và khí hậu khơng thích hợp. Về mặt này, nhóm tác giả Nguyễn Thị Hà Ly cho rằng nên
thu hoạch dược liệu sau khi trồng ít nhất 2 năm. Ở thời điểm này, rễ củ hà thủ ô đỏ đảm bảo hàm lượng các
hợp chất đạt chuẩn dược điển Việt Nam. Nhóm nghiên cứu cịn khẳng định một số sản phẩm chế biến từ hà
thủ ô đỏ như thuốc hay trà khơng chứa emodin và physcion thậm chí khơng chứa cả THSG hoặc có hàm
lượng thấp hơn mẫu dược liệu. Qua đó có thể nhận định rằng một số loại dược liệu có hàm lượng hoạt chất
thấp thậm chí là dược liệu giả hoặc dược liệu đã bị chiết rút lấy hoạt chất có giá trị trước khi bán trên thị
trường.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận
Đây là cơng trình nghiên cứu về xây dựng bộ dữ liệu phân tích định tính, định lượng hoạt chất
trong dược liệu hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Bộ dữ liệu bao gồm: xác
định thành phần hố học và thiết lập quy trình phân tích định tính, định lượng đồng thời một số hoạt chất
trong dược liệu hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora).
1.1. Nghiên cứu về hóa học
Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, đã phân lập được 11 hợp chất từ loài hà thủ ơ đỏ. Trong số
11 hợp chất có 4 hợp chất naphtolic glycoside (FM3, FM4, FM5, FM10); 3 hợp chất anthraquinone (FM1,
FM6, FM8); 2 hợp chất stilbene (FM2, FM9); 1 hợp chất benzyl glycoside (FM7) và 1 hợp chất flavonoid
(FM11), bao gồm:
- 2 hợp chất mới: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8-O-β-D-glucopyranoside
(FM3), 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (FM4).
- 9 hợp chất đã biết: emodin (FM1), 2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene 2-O-β-D-glucopyranoside
(FM2), pleuropyrone A (FM5), physcionin (FM6), benzyl gentiobioside (FM7), emodin 8-β-Dglucopyranoside (FM8), resveratrol (FM9), glycoside A (FM10) và (+)-catechin (FM11).
1.2. Nghiên cứu về phương pháp phân tích định tính, định lượng
Phân lập và sử dụng chất sạch phân lập được từ mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ thu hái tại Hà Giang làm
chất chuẩn trong thiết lập quy trình phân tích định tính và định lượng.
Đã tiến hành thiết lập quy trình định tính định lượng đồng thời 7 hợp chất trong mẫu rễ củ hà thủ ô
đỏ, bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4, FM5, FM6, FM8 trong đó có hai chất mới lần đầu tiên phân lập
được là FM3 và FM4.
Đã tiến hành xây dựng đường chuẩn định lượng 7 hợp chất với độ tuyến tính cao, hệ số tương quan
R ≥ 0,995, thỏa mãn tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức AOAC.
2

Đã tiến hành thực nghiệm thẩm định phương pháp phân tích. Kết quả cho thấy, phương pháp phân
tích đã thiết lập có độ chọn lọc cao; giá trị LOD, LOQ nhỏ và phù hợp với đường chuẩn; độ chụm và độ thu
hồi nằm trong tiêu chuẩn cho phép của AOAC.
Đã tiến hành thực nghiệm phân tích hàm lượng 7 hoạt chất trên 8 mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ bao gồm:
mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang và một số mẫu đang lưu hành trên thị trường. Kết quả cho thấy mẫu rễ củ
hà thủ ô đỏ thu hái tự nhiên tại Hà Giang có hàm lượng các hợp chất cao hơn mẫu thị trường và là mẫu duy

22
nhất thỏa mãn các tiêu chuẩn của một số chuẩn dược điển về hà thủ ô đỏ. Phương pháp phân tích có khả
năng áp dụng nhằm đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ tại thị trường Việt Nam.
2. Kiến nghị
Đây là cơng trình nghiên cứu về thành phần hóa học, thiết lập quy trình định tính và định lượng
đồng thời các hợp chất trong hà thủ ô đỏ tại Việt Nam. Các hoạt chất đã được phân lập khá đa dạng và
được sử dụng làm chất chuẩn trong phương pháp phân tích định tính định lượng đồng thời bảy hoạt chất
trong mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ. Phương pháp phân tích đã thiết lập đảm bảo độ tin cậy và độ chính xác cao. Vì
vậy, từ cơng trình nghiên cứu này tác giả có đề xuất kiến nghị như sau:
Cần có những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập đối với lồi hà thủ ơ
đỏ Hà Giang. Nghiên cứu các mẫu rễ củ hà thủ ô đỏ từ các vùng miền khí hậu Việt Nam, tìm ra đặc điểm
vùng miền thích hợp cho lồi cây này. Đặc biệt cần nghiên cứu hoạt tính sinh học của hai hợp mới chất lần
đầu tiên được công bố gồm FM3 và FM4 nhằm phát hiện thêm các tác dụng tích cực của hà thủ ơ đỏ Việt
Nam.
Quy trình phân tích định tính và định lượng đã thiết lập cần được một tổ chức thẩm định có thẩm
quyền thẩm định khách quan. Nghĩa là cần có thêm đơn vị phân tích đối chứng nhằm khẳng định độ tin cậy
và tính chính xác của phương pháp phân tích đã thiết lập. Từ kết quả đó, đề xuất đưa phương pháp định
lượng đã thiết lập vào Dược điển Việt Nam góp phần kiểm sốt chất lượng dược liệu hà thủ đỏ tại Việt
Nam.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Từ rễ củ hà thủ ô đỏ Hà Giang đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 11 hợp chất khác
nhau.
1. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy: 11 hợp chất được phân lập và xác định cấu
trúc hóa học trong đó có 2 hợp chất mới, bao gồm: 6-methoxy-3-methyl-1,8-đihydroxy-2-naphthoic acid 8O-β-D-glucopyranoside (FM3) và 6-hydroxymusizin 8-O-α-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside
(FM4).
2. Kết quả nghiên cứu về phương pháp phân tích định tính, định lượng
Lần đầu tiên quy trình định tính định lượng đồng thời 7 hợp chất trong mẫu hà thủ ô đỏ được xây
dựng, bao gồm FM1, FM2, FM3, FM4, FM5, FM6, FM8 trong đó có hai chất mới lần đầu tiên phân lập

là FM3 và FM4.
Các đường chuẩn định lượng đồng thời 7 hợp chất được xây dựng với độ tuyến tính cao, hệ số
tương quan R2 ≥ 0,99, thỏa mãn tiêu chuẩn của hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức AOAC.
Phương pháp phân tích đã thiết lập được thẩm định tính chọn lọc; giá trị LOD, LOQ; xác định độ
chụm; độ thu hồi. Kết quả cho thấy, phương pháp phân tích đã thiết lập có tính chọn lọc cao; giá trị LOD,
LOQ nhỏ và phù hợp với đường chuẩn; độ chụm và độ thu hồi nằm trong tiêu chuẩn cho phép của AOAC.
Áp dụng quy trình phân tích nhằm định lượng 7 đồng thời hợp chất trên 8 mẫu thực bao gồm: mẫu
hà thủ ô đỏ Hà Giang và một số mẫu đang lưu hành trên thị trường. Kết quả cho thấy mẫu hà thủ ô đỏ thu
hái tự nhiên có hàm lượng các hợp chất cao hơn mẫu thị trường. Phương pháp phân tích có khả năng áp
dụng nhằm đánh giá chất lượng dược liệu hà thủ ô đỏ tại thị trường Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ


23
1. Nguyen Thi Thoa, Pham Thanh Binh, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Hai Đang, Nguyen Van
Hung, Phạm Van Cuong, Chau Van Minh, Tran Quang Hai, Nguyen Tien Đat, Phenolic Constituents from
Fallopia multiflora (Thunberg) Haraldson, 2018, Journal of Chemistry, Volume 2018, Article ID 4851439,
5 pages. (SCIE)
2. Nguyen Thi Thoa, Nguyen Hai Dang, Do Hoang Giang, Nguyen Thi Thu Minh, Nguyen Tien
Dat, Metabolomics approach for discrimination and quality control of natural and commercial Fallopia
multiflora products in Vietnam, 2020, International Journal of Analytical Chemistry, Volume 2020, Article
ID 8873614, 5 pages. (SCIE).
3. Nguyễn Thị Thoa, Phạm Thanh Bình, Nguyễn Văn Hùng, Phạm Văn Cường, Nguyễn Hải
Đăng, Nguyễn Tiến Đạt, Phân lập, xác định cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất
anthraquinone từ rễ hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora), 2018, Tạp chí hóa học 56(6E1) 239-242.
4. Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Tiến Đạt, Phân lập và xác định cấu trúc thành
phần hóa học của lồi hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum), 2019, Tạp chí Khoa học và Công nghệ
(Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội), số 52, 101-103.