Đa dạng hóa các môi trường sản xuất Becterial cellulose từ vi khuẩn

1
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cuộc sống ngày càng hiện đại, số lượng người bị các chứng béo phì và các
bệnh về tiêu hóa cũng ngày một nhiều hơn. Đó là hậu quả của việc sử dụng “fast food”
- thức ăn nhanh và những loại thực phẩm quá nhiều chất béo. Do đó, vấn đề đặt ra là
cần phải có một loại thực phẩm năng lượng thấp, không lipid, lại giúp kích thích sự
tiết thực để hạn chế phần nào các nguy cơ bệnh trên, mà vẫn phải thơm ngon, hấp dẫn
đối với người tiêu dùng. Thạch dừa – Nata de Coco là một ví dụ.
Thạch dừa thực chất là sinh khối của vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi trên
môi trường nước dừa già, có thành phần chủ yếu là cellulose nên được gọi là cellulose
vi khuẩn (bacterial cellulose - BC).
Thuận lợi của việc sản xuất thạch dừa theo phương pháp lên men truyền thống
chính là ưu điểm của công nghệ sản xuất vi sinh: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị
đơn giản, ít tốn mặt bằng và nhân công, tương ứng giá thành rẻ… Tuy nhiên, điểm hạn
chế của nó lại là phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, dẫn đến khó ứng dụng sản xuất ở
quy mô công nghiệp. Môi trường nước dừa già là nguyên liệu thường dùng để sản xuất
thạch dừa nhưng chỉ có sẵn ở một số vùng (mang tính địa phương), còn những vùng
khác lại rất khan hiếm do các yếu tố địa lí. Công tác vận chuyển nước dừa đến các
vùng này cũng gặp rất nhiều khó khăn.
Do đó, vấn đề đặt ra cần phải giải quyết là môi trường lên men phải xuất phát
từ những nguồn nguyên liệu sẵn có, đa dạng, rẻ, có số lượng lớn, dễ vận chuyển và
mang quy mô công nghiệp, không mang tính cục bộ, điạ phương, có thể tận dụng được
phế phụ liệu từ các quá trình sản xuất thực phẩm khác.
Xuất phát từ những yêu cầu trên, tôi thực hiện đề tài “Đa dạng hóa các môi
trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum”.

2
1.2 Mục đích của đề tài

- Tìm môi trường thay thế môi trường nước dừa già truyền thống để nuôi cấy vi
khuẩn Acetobacter xylinum
- Tìm được công thức tối ưu nhất để sản xuất bacterial cellulose trên các môi
trường thay thế.

1.3 Yêu cầu

- Thuần khiết giống và giữ giống Acetobacter xylinum
- Khảo sát và đánh giá sinh khối cellulose thô trên các môi trường:
Nước dừa già (đối chứng)
Nước ép dứa
Nước cốt dừa
- Khảo sát và đánh giá khả năng phát triển của Acetobacter xylinum khi thay đổi
các thành phần bổ sung.

3
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về thạch dừa

Thạch dừa (Nata de Coco) là một loại thức ăn tráng miệng phổ biến, có nguồn
gốc từ Philippin, được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn Acetobacter
xylinum, và là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ
bacterial cellulose (BC).
“Nata” là một từ Tây Ban Nha, xuất phát từ một từ Latin “Nata” có nghĩa là
“nổi trôi” [Africa,1944].
Theo từ điển Bách khoa toàn thư mô tả thì Nata là “một khối cơ chất dày nổi
trên bề mặt các loại môi trường”.
Nata đã được nghiên cứu và mô tả bởi rất nhiều nhà khoa học từ năm 1949 –
1987. Trong số đó, định nghĩa của Sanger là rõ ràng và chính xác nhất: “Cellulosic có
màu trắng đến vàng kem là cơ chất được hình thành bởi Aceti sp. xylinum trên bề mặt
các loại môi trường có chứa đường như nước dừa, nước cốt dừa, dịch chiết thực vật,
nước ép trái cây và các vật liệu phế phẩm khác” [Sanger, 1987].

Hình 2.1: Hình ảnh chung về Nata [29]


4
Bản chất của váng này là lớp màng hemicellulose bao quanh vi khuẩn, lớp
màng này dày hơn rất nhiều so với kích thước tế bào. Hemicellulose là một loại
polysaccaride được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao đổi chất trong môi
trường nuôi cấy, chúng tích tụ đáng kể trong môi trường nhưng do không hoà tan trong
nước (chỉ tan trong dung dịch kiềm - đồng amoni hydroxit) nên rất dễ tách ra khỏi môi
trường nuôi cấy [Vương Thị Việt Hoa, 2000].
Thạch dừa không có giá trị dinh dưỡng cao nhưng tạo cảm giác ngon miệng nên
là món ăn thú vị dùng tráng miệng và đặc biệt tốt đối với người đang ăn kiêng do nó
không chứa các chất hóa học, chất bảo quản, chất tăng trưởng, lại giàu chất xơ, ít
calories, không cholesterol. Ngoài ra, thạch dừa cũng rất có ích trong việc bài tiết của
cơ thể do đặc tính kích thích nhu động ruột làm cho việc điều hòa bài tiết được tốt hơn.
Vì thế, thạch dừa còn được xem như chất xơ tiết thực tối hảo. Chế phẩm từ dừa này
còn là món ăn tuyệt diệu có tác dụng phòng ngừa ung thư, ngăn nguy cơ nghẽn mạch
vành, nguy cơ tăng đột ngột lượng đường trong nước tiểu, giúp giữ làn da mịn màng,
tươi trẻ [Trần Phú Hoà,1996].

2.2 Đặc điểm của vi khuẩn acetic và vi khuẩn Acetobacter xylinum trong quá trình
lên men tạo BC

2.2.1 Vi khuẩn acetic

Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acetic, vì vậy nó còn được
gọi là vi khuẩn acetic. Đây là loại vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập
được từ dấm, rượu bia, hoa quả; từ không khí, đất, nước… Có khoảng 20 loài thuộc
giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó nhiều loài có ý nghĩa về kinh tế
[Nguyễn Lân Dũng, 1976].

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn acetic là những trực khuẩn hình que đến elip, kích thước trung bình
0,6 – 0,8 m x 1 – 3 m. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, một số xếp thành dạng chuỗi


5
dài. Một số loài đặc biệt có tế bào hình cầu, xoắn, chùy, hình chỉ hay hình bán nguyệt
tùy thuộc điều kiện pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy.
Vi khuẩn acetic không có khả năng tạo bào tử. Một số loài có thể di động nhờ
tiên mao ở một đầu – đơn mao, hay chu mao, một số không có khả năng này. Đây là vi
khuẩn hiếu khí bắt buộc, bắt màu Gram âm khi còn non, khi già có thể đổi Gram.
Trên môi trường đặc, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc tròn,
nhỏ, đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loài như A.aceti, A. xylinum có
khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn
và sẫm màu hơn các phần chung quanh. Một số loài có khuẩn lạc lớn (d = 4 – 5 mm),
bề mặt trơn bóng, không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dùng que cấy gạt
ra khỏi môi trường. Một số loài tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường nên khó lấy
ra bằng que cấy.
Trên môi trường lỏng, vi khuẩn acetic chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo
thành những lớp màng dày, mỏng khác nhau. Một số loài tạo thành lớp màng dày như
sứa, nhẵn, trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó một lớp màng
mỏng mới lại tiếp tục phát triển. Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Màng
này có chứa sợi cellulose giống như sợi bông. Loại thứ hai có màng mỏng như giấy
xelofan. Một số khác có màng không nhẵn mà nhăn nheo. Một số nữa tạo màng mỏng
dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong [Đinh Thị Kim Nhung,
1996; Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1975].

Hình 2.2: Vi khuẩn acetic [30; 35]





6
2.2.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với các nguồn carbon, nitơ và các
chất sinh trưởng rất đa dạng. Chúng sử dụng đường, rượu và các acid hữu cơ làm
nguồn carbon, dùng muối amon làm nguồn nitơ [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim
Thủy, 2003]
Vi khuẩn acetic không những oxy hoá được rượu etylic thành acid acetic mà
còn oxy hoá được rượu propylic thành acid propionic, rượu butylic thành acid butyric,
nhưng chúng không oxy hoá được rượu metylic và các rượu bậc cao khác. Trong môi
trường đủ rượu etylic (5 – 13%) thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid acetic, còn nếu
nồng độ rượu thấp hơn thì các vi khuẩn acetic oxy hoá triệt để rượu thành CO
2
và H
2
O
[Lương Đức Phẩm, 1998].
Vi khuẩn acetic có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau
nhưng không sử dụng được tinh bột. Ngoài khả năng oxy hoá etanol thành acid acetic,
một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B
1
, B
2

, oxy hoá được sorbit thành
đường sorbose – dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hoá glycerin thành
dioxyaceton, glucose thành acid gluconic. Đa số các loài Acetobacter có khả năng
đồng hoá muối amon, khả năng phân giải pepton yếu.
Trong quá trình phát triển, vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với một số acid amin
như acid pantothenic, valin, alanin, prolin …, một số chất kích thích sinh trưởng như p
– aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin… và một số chất khoáng K, Ca, Mg, Fe,
S, P … ở dạng muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ. Do đó, dịch tự phân nấm men, nước
mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của
Acetobacter [Trần Phú Hòa, 1996].
Vi khuẩn acetic rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế
bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và
phát triển, chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh
trưởng của chúng [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003].
Nhiệt độ tối thích đối với sinh trưởng của các loài vi khuẩn acetic là 20 – 30
0
C,
pH tối thích là 5,5 – 6,2. Chúng có tính chịu acid cao, một số loài vẫn phát triển được
ở pH = 3,2 [C.S. Pedeson, 1995].



7
2.2.1.3 Phân loại vi khuẩn acetic

Vi khuẩn acetic thuộc vào 2 giống chính:
Acetobacter : có chu mao hoặc không
Gluconobacter (còn gọi là Acetomonas) : đỉnh mao (đơn mao)
Acetobacter và Gluconobacter là 2 giống vi khuẩn acetic quan trọng nhất của họ
Acetobacteriaceae.

Gluconobacter không có chu trình ATC trong hoạt động tế bào nên không thể oxy
hoá acetat (nhưng có chu trình glyoxylat thay thế). Ngược lại, Acetobacter có khả
năng này [Đinh Thị Kim Nhung, 1996].
Những vi khuẩn này có nhiều điểm tương tự so với vi khuẩn thuộc giống
Pseudomonas. Chúng khác Pseudomonas ở chỗ chịu được độ acid cao hơn, khả năng
chuyển hóa pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003].
Bảng 2.1: Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter
(so sánh với Pseudomonas)

Đặc điểm Acetobacter Gluconobacter Pseudomonas
Tiên mao
Chu mao hoặc
không có
Đỉnh mao hoặc
không có
Đỉnh mao
Sinh trưởng ở pH = 4.5 + + -
Oxy hoá:
Etanol thành acid
acetic
Acid acetic thành CO
2

Lactat thành CO
2

Glucose thành
gluconat

+

-
-
+

+
-
+
+/-


-
+/-
+
+/-

Thủy phân tinh bột và
lactose
- - +/-
Phân giải gelatin - - +/-
Tạo sắc tố lục huỳnh quang - - +/-


8
Từ trước đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn
trong giống Acetobacter (Rothenbach - 1989, Beijerinch - 1899, Hoyer - 1899, Hansen
- 1911, Janke - 1916, Vissert Hoft - 1925, Henneberg - 1926, Hermann - 1931,
Vaughm - 1948) nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của J – Frateur.
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa
trên các tính chất sinh hoá cụ thể sau:
Khả năng tạo catalase

Khả năng tổng hợp các chất ceto từ những rượu bậc cao như glycerol, mannitol,
sorbitol…
Khả năng oxy hóa acetat thành CO
2
và H
2
O
Khả năng oxy hóa glucose thành acid gluconic
Khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nitơ trong môi trường Hoyer và sử
dụng rượu etylic làm nguồn carbon
Khả năng tạo sắc tố nâu
Khả năng tổng hợp cellulose
Trên cơ sở này, Frateur đã chia vi khuẩn acetic thành 4 nhóm: suboxydans,
mesoxydans, oxydans, peroxydans.
Nhóm Suboxydans gồm các loài Acetobacter suboxydaz và Acetobacter
melanogennum.
Nhóm Mesoxydans gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti và
Acetobacter mesoxydans.
Nhóm Oxydans gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất ceto:
Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens.
Nhóm Peroxydans gồm Acetobacter pezoxydans, Acetobacter paradoxum
không chứa catalase và không oxy hoá được glucose.
[Đinh Thị Kim Nhung, 1996]

9
Bảng 2.2: Những khác biệt giữa các loài Acetobacter

Đặc điểm tiên
mao
Chu mao Đỉnh mao
Giống
Acetobacter
Glucono
bacter
Loài
aceti
xylinum
mesoxy
- dans
lovani
- ensis
rances
ascen
- dens
peroxy
- dans
para
-doxum
oxydans
1. Oxy hóa tiếp
tục etanol thành
CO
2
và H

2
O
+ + + + + + + + -
2. Catalase + + + + + + - - +
3. Sinh trưởng
trên môi trường
Hoyer
+ - - + - - + - -
4. Chuyển hóa
glucose thành
acid gluconic
+ + + + + - - - +
5. Chuyển hóa
glycerol thành
dihydroxy –
aceton
+ + + - - - - - +
6. Tổng hợp
cellulose
- + - - - - - - -
7. Tạo sắc tố nâu - - - - - - - - +

[Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003]

2.2.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Quá trình lên men acetic
được coi là quá trình lên men dấm nhưng thực chất là một quá trình oxy hóa [Trần Phú
Hòa, 1996].
A. xylinum là loài vi khuẩn tạo được BC nhiều nhất trong tự nhiên. Một tế bào

A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ [Brown
và ctv, 1976].




10
Theo khóa phân loại của Bergey, Acetobacter xylinum thuộc:
Lớp : Schizomycetes
Bộ : Pseudomonadales
Bộ phụ : Pseudomonadiace
Họ : Pseudomonadaceae
Giống : Acetobacter
[Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái

Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, kích thước khoảng
2 m thay đổi tùy loài. Các tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động
hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể bị thay đổi do
tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì vậy chúng
tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí.
Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy
tạo thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric (do
phản ứng của hemicellulose) [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003].
Acetobacter xylinum có thể tích lũy 4,5% acid acetic, sinh trưởng ở pH thấp hơn
5. Acid acetic sinh ra do quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng sinh ra
quá mức giới hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng.
Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A. xylinum dễ
dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể phình to hoặc kéo dài,

đôi khi lại có dạng phân nhánh [Trần Phú Hòa, 1996].
A. xylinum có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn
lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 5 mm.
Khi nuôi cấy trong môi trường thạch, lúc còn non, A. xylinum phát triển thành
từng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt. Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng
cụm mọc theo đường cấy.


11
Trong môi trường lỏng, sau 24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt,
phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48h, hình thành một lớp trong và
ngày càng dày [Lê Thị Khánh Vân, 1985].


Hình 2.3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum [24; 31]

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hoá

Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng catalase
dương tính; có khả năng oxy hoá tiếp tục ethanol thành acid acetic CH
3
COOH, CO
2
và
H
2
O; chuyển hoá được glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton; tổng hợp
được cellulose nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer và không
tạo sắc tố nâu [Nguyễn Lân Dũng, 1978].

Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát
triển ở 37
0
C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu
để A. xylinum phát triển là 25 – 30
0
C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có
thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 35
0
C và nồng độ ethanol lên đến 10%
[Trần Thị Ánh Tuyết, 2004].
Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là
glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol,
lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose,
cellobiose, erythritol, ethanol và acetat [Julian a. Ba, 1990 - dẫn liệu của Phùng Lê
Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003].






12
2.2.2.3 Chức năng sinh lí của cellulose đối với Acetobacter xylinum

Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng
hợp các polysaccharid ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bảo vệ bao quanh tế bào, và
màng BC là một ví dụ như thế. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám
chặt trên bề mặt môi trường và làm cho tế bào thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn
so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một vài tác

giả cho rằng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể
được sử dụng khi vi sinh vật này thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose đuợc
xúc tác bởi enzyme exo – hay endo – glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này
được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum.
Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn
kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng
nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật gây bệnh. Có những ghi
nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng
23% số tế bào A. xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1giờ xử lí bằng tia cực
tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3%
[theo Ross và ctv, 1993 - dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004].

2.3 Bacterial cellulose (BC)

2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử nghiên cứu sự hình thành BC

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được nhà
bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886. Tuy nhiên đến nửa sau thế kỉ XX,
các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BC.
Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự nghiên cứu về khả năng tổng hợp BC
của vi khuẩn Acetobacter xylinum, họ chứng minh rằng A. xylinum có thể sử dụng
đường và O
2
để tạo nên cellulose.
Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng
hợp trong môi trường có đường và ATP. Càng ngày, cấu trúc của BC càng được hiểu
rõ theo tiến bộ của khoa học kĩ thuật.


13

Năm 1989, nhóm I.M. Saxena trường Đại học Texa thu nhận được enzyme
cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptid có
trọng lượng phân tử là 83 và 93kD. Trong đó, tiểu phần 83kD liên quan đến quá trình
sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng hợp
cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose).
Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấu trúc,
cơ chế tổng hợp và ứng dụng của BC [Trương Thị Anh Đào, 2004].

2.3.2 Cấu trúc của BC

BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant
cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối
- 1,4 – glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der
Waals. Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền
sợi với chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích
thước từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm.
Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm; còn theo Brown và
cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm. So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và
kích thước nhỏ hơn, BC có độ polymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến
16000 hay 20000. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000
[dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004].


Hình 2.4: Cấu trúc BC và PC [26; 27]



14
Trong tự nhiên, cellulose kết tinh phổ biến ở dạng I và II. Cellulose I có thể
chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II thì không thể chuyển ngược lại thành

cellulose I. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy mà cellulose dạng nào chiếm
ưu thế. Thông thường, dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn.
Cellulose I: dài 0,05 – 0,1 m; được tổng hợp bởi đa số thực vật và vi
khuẩn A. xylinum trong môi trường lên men tĩnh. Các chuỗi - 1,4 –
glucan xếp song song với nhau theo một trục.
Năm 1984, Atalla và V. Hart đã xác định được cấu trúc của cellulose I
và cellulose I cấu tạo bởi glucose dạng hay .
Cellulose II: được tổng hợp ở một số nấm mốc và vi khuẩn như
Sarcinaventriculi. Là dạng sợi cellulose ổn định nhất về nhiệt động lực
học, các chuỗi glucan xếp đối song nhau hay phân bố tự do. Cellulose II
thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc. Khi đó BC tạo ra ở
dạng huyền phù phân tán, các sợi cellulose thường uốn cong, đường kính
khoảng 0,1 – 0,2 m [Trương Thị Anh Đào, 2003; Fumihiro Y., 1997].

2.3.3 Đặc điểm của BC

A.J. Brown (1986), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum tạo ra
trên môi trường lên men và thấy có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những
polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính.
Một số tính chất của BC:
Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có
thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn
định về kích thước và hướng (đặc biệt là cellulose I)
Tính hút nước: có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp,
ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ
học cao).
[Trần Thị Diễm Chi, 2000]; [25]; [32]

15
2.3.4 Quá trình sinh tổng hợp BC từ vi khuẩn A. xylinum

Khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy
đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B
1
, B
2
, B
12
… và các chất kích thích sinh trưởng),
chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ
môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một
phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển
ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [Đinh Thị Kim
Nhung, 1996]
Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào
A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của
mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền
chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên
màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [J. A.
Bazon, 1984 - dẫn liệu của Đinh Thị Kim Nhung, 1996].

Hình 2.5: Con đƣờng dự đoán quá trình sinh tổng hợp cellulose trong tế
bào vi khuẩn Acetobacter xylinum [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các
oligo và polysaccharid nội bào, lượng oligo và polysaccharid nội bào đạt tới 60% khối
lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi

sinh vật. Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharid. Tất cả các oligo và


16
polysaccharid được tổng hợp bằng cách thêm một đơn vị monosaccharid vào chuỗi
saccharid có trước. Đơn vị monosaccharid tham gia phản ứng dưới dạng nucleotid,
monosaccharid được hoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin – diphosphat (UDP – X)
nhưng đôi khi là các nucleotid purin và pyrimidin khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản
ứng chung sau:
…X-X-X-X + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP
n nhánh (n + 1) nhánh

Trong trường hợp polysaccharid gồm 2 loại monosaccharid liên tiếp (X và Y)
thì phản ứng chung xảy ra theo 2 bước sau:
Bước 1: XYXYXYXY + UDP-X = XYXYXYXYX + UDP
Bước 2: XYXYXYXYX + UDP-Y = XYXYXYXYXY + UDP
Cơ chế của quá trình tổng hợp các loại polysaccharid phân nhánh hiện nay vẫn
còn chưa rõ. Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của
chúng vào chuỗi polysaccharid phụ thuộc vào các loại enzyme transferase [Nguyễn
Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến, 1980].

Cellulose

UDPG Glc
UGP GHK G6PD
(NAD)
G1P G6P PGA
G6PD
PGI (NADP) Chu trình
Pentose

Frc F6P phosphate

PTS FBD

F1P FDP EMP TCA

Hình 2.6: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose của A.xylinum
PGM
FHK
1PFK


17
Glc: glucose UDPG: uridin diphosphate glucose
GHK: glucose hexokinase UGP:uridin glucose pyrophosphorylase
G6PD: glucose – 6 – phosphate PGM: phosphoglucomutas
G1P: glucose – 1 – phosphate G6P: glucose – 6 – phosphate
PGI: phosphoglucose isomerase FHK: fructose hexokinase
Frc: fructose F6P: fructose – 6 – phosphate
PGA: phosphogluconic acid PTS: phosphotransfer system
F1P: fructose – 1 – phosphate 1PFK: fructose – 1 phosphate kinase
FDP:fructose – 1,6 – diphosphate dehydrogenase

2.3.5 Ứng dụng của BC

Dựa vào những đặc tính ưu việt mà BC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực:
Thực phẩm: - Thức ăn tráng miệng (thạch dừa, cocktail,
Kombucha, trà Manchurian…)
- Các loại bánh snack, kẹo có năng lượng thấp
- Chất làm đặc để bổ sung trong kem, dầu trộn salad

- Màng bao thực phẩm, màng bảo quản trái cây
- Chất ổn định thực phẩm

Y tế: - Chất thay thế da tạm thời (da nhân tạo)
- Bột cellulose ứng dụng làm tá dược trong bào
chế viên nén
- Băng gạc, băng trị phỏng

Mỹ phẩm: - Ổn định kem dưỡng da
- Chất làm se (astringent)
- Chất làm đặc và làm chắc trong thuốc sơn
móng tay

Môi trường: - Làm miếng bọt để xử lí sạch các vết dầu tràn
- Hấp thu và loại bỏ những nguyên vật liệu độc


18
Xăng dầu và than đá: - Phát hiện và thu hồi các mỏ khoáng, dầu

Công nghiệp dệt: - Sợi nhân tạo cao cấp
- Các loại lều, bạt, tã lót có thể vứt đi hay tái sử dụng

Công nghiệp giấy: - Làm giấy cao cấp (có độ dai, độ bền cao, vì vậy
ứng dụng làm giấy lưu trữ tài liệu, làm tiền, giấy
vẽ…)

Công nghiệp gỗ: - Ván mỏng nhân tạo (plywood laminate)
- Chất tạo độ dai cho giấy, container

Công nghiệp máy: - Chế tạo thân xe hơi, các thành tố cấu trúc máy
bay, tên lửa…
- Màng siêu âm thanh
- Thiết bị siêu lọc nước
- Màng thẩm thấu 2 chiều
[Trần Thị ÁnhTuyết, 2004]; [32]

2.4 Thành phần nguyên liệu sử dụng trong sản xuất BC

2.4.1 Nƣớc dừa già

Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất
thạch dừa là nước dừa. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hoá
học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa
tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần). Đường ở
đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol.