LÝ THUYẾT PHƯƠNG PHÁP đo QUANG (THỰC tập y tế CÔNG CỘNG)

LÝ THUYẾT PP
ĐO QUANG


NỘI DUNG
1

Đại cương

2

Cơ sở lý thuyết

3

Kỹ thuật đo độ hấp thu của dd

4

Ứng dụng của pp UV-Vis

5

Thiết bị đo

6

Bài tập


1. ĐẠI CƯƠNG

1. Định nghĩa:
 PP hấp thu phân tử UV-VIS là pp hấp thu quang học
dựa trên sự tương tác chọn lọc giữa chất cần xác định
với năng lượng bức xạ thuộc vùng UV-VIS.
Hay: Chất cần xác định trong nước phản ứng với hóa chất để tạo ra màu
sản phẩm. Chất xuất hiện tạo ra màu vì nó hấp thu các bước sóng nhất
định trong vùng quang phổ của ánh sáng trắng. Máy quang phổ đo tại
bước sóng bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi mẫu màu. Máy quang phổ
đo cường độ ánh sáng tại bước sóng này trước và sau khi đi cuvette
chứa mẫu. Dữ liệu phương pháp lưu trữ trong máy tính dùng để tính tốn,
hiển thị và lập tài liệu nồng độ.


1. ĐẠI CƯƠNG
2. Đặc trưng năng lượng các miền phổ
 Ánh sáng là bức xạ điện từ có bước sóng khác nhau hay dịng
photon có năng lượng khác nhau.

E = hν = h
Trong đó:

c

λ

-

E: Năng lượng tính bằng eV, kcal/mol

-

H: hằng số Planck, h=6,62.10-34J.s

-

c: vận tốc ánh sáng trong chân khơng, c=3.108m/s

−

ν: tần số

−

λ: bước sóng


1. ĐẠI CƯƠNG
2. Đặc trưng năng lượng của các miền phổ
 Trong quang phổ học: ánh sáng khả kiến, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia Rơnghen, sóng radio... đều được gọi chung là bức xạ.

Bước sóng một số vùng phổ:
Vùng phổ

Bước sóng, nm

Tử ngoại xa

100-190

Tử ngoại

190-400

Khả kiến

400-800

Hồng ngoại gần

800-2.500

Hồng ngoại

2.500-25.000

Mắt người chỉ cảm nhận được một vùng phổ
điện từ rất nhỏ gọi là vùng nhìn thấy (khả
kiến) bao gồm các bức xạ có bước sóng từ
396–760 nm.


1. ĐẠI CƯƠNG
2. Đặc trưng năng lượng của các miền phổ
Ánh sáng nhìn thấy bao gồm tất cả dải bức xạ có bước sóng từ 396-760 nm có
màu trắng. Khi cho ánh sáng trắng chiếu qua lăng kính, nó sẽ bị phân tích
thành một số tia màu (đỏ, da cam, vàng, lục, lam, chàm, tím). Mỗi tia màu đó
ứng với một khoảng bước sóng hẹp hơn. 
Một chất hấp thụ hồn tồn tất cả các tia ánh sáng thì ta thấy chất đó có màu
đen. Nếu sự hấp thụ chỉ xảy ra ở một khoảng nào đó của vùng khả kiến thì
các bức xạ ở khoảng còn lại khi đến mắt ta sẽ gây cho ta cảm giác về một

màu nào đó.
VD: một chất hấp thụ tia màu đỏ (λ= 610–750ηm) thì ánh sáng còn lại gây
cho ta cảm giác màu lục (ta thấy chất đó có màu lục). Ngược lại, nếu chất đó
hấp thụ tia màu lục thì đối với mắt ta nó sẽ có màu đỏ. Người ta gọi màu đỏ
và màu lục là hai màu phụ nhau. 


1. ĐẠI CƯƠNG
2. Đặc trưng năng lượng của các miền phổ
Liên hệ giữa tia bị hấp thu và màu sắc của chất hấp thu
Tia bị hấp thu
λ (nm)

Màu

Tia còn lại
(Màu của chất hấp thu)

400 - 430

Tím

Vàng lục

430 - 490

Xanh (chàm)

Vàng cam

490 - 510

Lục (chàm)

Đỏ

510 - 530

Lục

Đỏ tía

530 - 560

Lục vàng

Tím

560 - 590

Vàng

Chàm

590 - 610

Da cam

Chàm lục

610 – 750

Đỏ

Lục


1. ĐẠI CƯƠNG
3. Sự tương tác giữa vật chất và bức xạ điện từ
Ở điều kiện bình thường, phân tử ở mức năng lượng thấp, gọi là trạng thái cơ
bản. Khi chiếu bức xạ điện từ vào một môi trường vật chất, sẽ xảy ra hiện
tượng các phân tử vật chất hấp thụ hoặc phát xạ năng lượng, hay được gọi là
trạng thái kích thích. Năng lượng mà phân tử phát ra hay hấp thụ vào là:

- E1, E2: năng lượng phân tử ở trạng
thái đầu và trạng thái cuối.
- ν: tần số bức xạ điện từ bị hấp thụ
hay phát xạ.
+ ∆E > 0: sự hấp thụ bức xạ điện
từ.
+ ∆E <0: sự phát xạ năng lượng.


1. ĐẠI CƯƠNG
3. Sự tương tác giữa vật chất và bức xạ điện từ
Khi phân tử hấp thụ hoặc phát xạ sẽ làm thay đổi cường độ
của bức xạ I nhưng khơng làm thay đổi năng lượng E của
nó, do:
+ I xác định bằng mật độ các hạt phơton có trong chùm tia.
+ E phụ thuộc tần số ν bức xạ.

Vì thế khi chiếu một chùm bức xạ điện từ với một tần số
duy nhất đi qua môi trường vật chất thì chỉ có I thay đổi.


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP
1. Sự hấp thu ánh sáng

-

Io: Cường độ ban đầu của nguồn sáng

-

IA: Cường độ ánh sáng bị hấp thu bởi dung dịch

-

It: Cường độ ánh sáng sau khi qua dung dịch

-

Ipx: Cường độ ánh sáng phản xạ bởi thành cuvet và dung dịch

-

Ikt: Cường độ ánh sáng khuếch tán bởi các hạt rắn ở dạng huyền
phù của dung dịch.


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP

2. Định luật Bouguer – Lambert - Beer

Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc đi qua một mơi trường
vật chất thì cường độ tia sáng ban đầu Io sẽ bị giảm còn It.
A = log

1
I
= log o = 2,303 × ε × l × C b
T
It

- A: độ hấp thu hay mật độ quang học
- T: độ truyền qua
- l: chiều dài lớp dung dịch (chiều dài cuvet), cm
- ε: hệ số hấp thu phân tử (hệ số tắt phân tử)


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP
3. Ý nghĩa và tính chất của các đại lượng
a. Hệ số hấp thu phân tử ε
-

Phụ thuộc vào bản chất của mỗi chất, dung môi, λ, nhiệt độ
và chiết suất (theo nồng độ).

− ε=103-5.104L.mol-1.cm-1
b. Mật độ quang A
-

Phụ thuộc vào λ, nồng độ chất màu và chiều dày của lớp
dd.

-

Có tính chất cộng tính: Là đại lượng khơng có đơn vị, có
i=n
tính cộngλđộ hấp thụ
quang λ
λ
λ
A = ε 1 lC1 + ε 2 lC2 + ... + ε i lCi + ... + ε n lCn = l ∑ ε i Ci
i =1


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP
3. Ý nghĩa và tính chất của các đại lượng

b. Mật độ quang A
Chất tan X có độ hấp thụ AX, dm có độ hấp thụ Adm: A = Ax + Adm
Đo chính xác Ax thì Adm = 0  λmax dm phải khác xa λmax chất tan  chọn dm
có λ hấp thu ở miền ranh giới tử ngoại chân không.


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP
3. Ý nghĩa và tính chất của các đại lượng
c. Độ truyền qua T
-

Phụ thuộc vào λ, nồng độ chất màu, chiều dày của lớp dd.

-

Khơng có tính chất cộng tính.
Io
I t ⇒ A = − log T
A = log
T=
IT
Io
Vì T tính theo %: ⇒ A = 2 − log T
-

T=100% ⇒ A=0: dd trong suốt ở bước sóng khảo sát (khơng
hấp thu ánh sáng It = I0).

-

T= 1% ⇒A=2: Độ hấp thu cực đại


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP
3. Ý nghĩa và tính chất của các đại lượng
A = log

I
1
= log o = 2,303 × ε × l × C b
T
It

Sự phụ thuộc của T vào nồng độ C

Sự phụ thuộc của A vào nồng độ C

T và A là hai đại lượng đặc trưng của phép đo UV-VIS.
Thường sử dụng A vì quan hệ A và C là tuyến tính.


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP
4. Khoảng tuân theo định luật Beer
b

K
=
A

xC

K: hằng số thực nghiệm
C: nồng độ mol/L
0C nhỏ ⇒ b=1

A phụ thuộc tuyến tính vào C khi b=1. Khi đó, đường biểu diễn sự
phụ thuộc độ hấp thu A và nồng độ C có dạng: y = ax+b


2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PP
5. Nguyên nhân gây lệch khỏi định luật Beer

- Ánh sáng không đơn sắc (phụ thuộc vào cấu trúc thiết bị đo).
- Cuvet
- Nhiệt độ
- Sai lệch nồng độ C

° Phân ly phân tử
° pH của dung dịch
° Lượng thuốc thử tạo phức
° Sự có mặt của các chất lạ, dung mơi, chất hữu cơ


3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
1. Điều kiện thực hiện phép đo
a. Chất phân tích có phổ hấp thu UV-VIS:
- Chất hữu cơ, chất vô cơ (phenol, napthalen, I 2,
KMnO4…): phải được hòa tan trong một dung mơi phù
hợp.
- Chất khí: phải chứa mẫu trong cuvet đóng kín.
b. Chất khơng có phổ hấp thu UV-VIS (ion kim loại): cho
phản ứng hóa học với thuốc thử để tạo ra sản phẩm cho
phổ hấp thu UV-VIS.


3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
1. Điều kiện thực hiện phép đo
Hợp chất phải thỏa mãn:
-

Có độ bền cao, ít phân ly. Hằng số bền K ≥ 108.

-

Ổn định theo thời gian, ít nhất 15 phút.

-

Hệ số ε càng lớn càng tốt. Có thể thực hiện phản ứng tạo
màu với các thuốc thử hữu cơ.

-

Các hợp chất là phức cần đo phải có λ max khác xa λ max
của thuốc thử trong cùng điều kiện. (∆λ=λ max(MR)- λ max(R)
≥80nm).

VD: phân tích Fe2+ bằng phương pháp O-Phenanthroline. Sau khi thêm
thuốc thử ta được phức màu vàng cam (λmax=510 ηm), trong khi đó thuốc
thử 1,10- Orthophenanthroline có λmax = 250 ηm.


3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
1. Điều kiện thực hiện phép đo
Điều kiện tối ưu để xây dựng pp phân tích với thuốc thử mới:
°

Xác định vùng phổ mà chất màu hấp thu cực đại.

°

Xác định pH tối ưu của phản ứng tạo phức.

°

Xác định lượng dư thuốc thử cần để chuyển hoàn toàn ion kim loại
thành phức.

°

Ảnh hưởng nhiệt độ lên sự tạo phức

°

Ảnh hưởng thời gian lên sự hình thành phức và độ bền của phức.

°

Xét khoảng nồng độ tuân theo định luật Beer.

°

Xét ảnh hưởng của nguyên tố cản trở.


3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
2. Nguyên tắc chung để đo độ hấp thu
a. Pha chế dung dịch chuẩn của chất cần xác định.
b. Chuyển chất phân tích trong mẫu thành dạng dung dịch
có khả năng tạo màu với thuốc thử.
c. Thực hiện phản ứng tạo màu ở những điều kiện tối ưu.
d. Đo độ hấp thu A ở λmax.

e. Tính hàm lượng của chất cần xác định theo những
phương pháp khác nhau.


3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
3. Định lượng bằng phương pháp UV-VIS
a. Phương pháp đường chuẩn
-

Pha 5-8 dung dịch chuẩn có C khác nhau khoảng 30% (tuân theo định luật
Beer).

-

Dung dịch mẫu được chuẩn bị giống như dung dịch chuẩn.

-

Đo độ hấp thu của mỗi dung dịch

-

Biểu diễn sự phụ thuộc A theo C

Điều kiện: Vùng nồng độ của dãy chuẩn phải bao gồm cả C x
Ưu điểm: ° Chính xác

° Với một đường chuẩn cho phép phân tích hàng loạt mẫu.

3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
3. Định lượng bằng phương pháp UV-VIS
Phương pháp đường chuẩn


www.themegall
ery.com

3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
3. Định lượng bằng phương pháp UV-VIS
Sau khi đo được giá trị độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn, chúng ta
có thể tiến hành xây dựng đường chuẩn và tìm ra phương trình hồi quy
tương quan:


www.themegall
ery.com

3. KỸ THUẬT ĐO ĐỘ HẤP THU CỦA DD
3. Định lượng bằng phương pháp UV-VIS
y = ax + b; y là độ hấp thụ, x là nồng độ.
Amẫu = y  tính được nồng độ của mẫu theo pt:
Khoảng nồng độ thỏa mãn định luật này khi r > 0,999
Hệ số tương quan r biến đổi trong khoảng -1≤ r ≤ 1 (R2 = 0-1)
- Khi r ≈ 1 có sự tương quan chặt chẻ giữa x và y theo tỉ lệ thuận.
- Khi r ≈ -1 có sự tương quan chặt chẻ giữa x và y theo tỉ lệ nghịch.
- Khi r ≈ 0 hai đại lượng này không còn tương quan.