Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neuro inin 1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG
TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN
THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG
TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM
Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số

: 9420101.21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. Đinh Đoàn Long
2. PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung
XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ
CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN
Chủ tịch hội đồng đánh giá
Thay mặt tập thể cán bộ hướng dẫn
Luận án Tiến sĩ

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

PGS.TS. Đinh Đoàn Long

Hà Nội - 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Đinh Đoàn Long và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung. Các
kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được cơng bố
trong các tạp chí Khoa học - Công nghệ và các báo cáo hội nghị khoa học,
phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác. Mọi
trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, tháng 08 năm 2020
TÁC GIẢ

Phạm Thị Hồng Nhung

LỜI CẢM ƠN
Trong q trình nghiên cứu và hồn thành bản luận án này, tôi nhận
được rất nhiều sự ủng hộ, giúp đỡ q báu của các thầy cơ giáo, các nhà khoa
học thuộc nhiều lĩnh vực, cùng bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh Đồn
Long và PGS.TS. Hồng Thị Mỹ Nhung đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo
trong suốt q trình tơi nghiên cứu và thực hiện luận án.
Nghiên cứu này nhận được sự hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu sản xuất
một số thụ thể ứng dụng trong sàng lọc và phát triển thuốc từ nguồn dược
liệu Việt Nam”, mã số ĐT-PTNTĐ2011-G/04 do PGS.TS. Đinh Đồn Long
chủ trì. Nếu khơng có sự hỗ trợ tài chính từ đề tài và sự hỗ trợ chuyên mơn từ
các nhóm nghiên cứu, tơi khó có thể hồn thành các nội dung nghiên cứu của
luận án. Tôi cũng xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các nhóm nghiên
cứu do PGS.TS. Võ Thị Thương Lan, PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, TS.
Trịnh Tất Cường, PGS.TS. Nguyễn Lai Thành, ThS. Bùi Thị Vân Khánh
phụ trách. Các thầy cô và các bạn trong các nhóm nghiên cứu này đã tận tình
giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực hiện nghiên cứu của mình.
Tơi chân thành cảm ơn các thầy cơ và cán bộ Phịng thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ Enzym và Protein - Đại học Quốc gia Hà Nội đã ln ủng
hộ và nhiệt tình giúp đỡ cho tơi có điều kiện tốt nhất khi tiến hành các thí
nghiệm tại đây.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Bộ môn Di truyền
học - Khoa Sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu
và hoàn thành luận án; đóng góp nhiều ý kiến q báu cho tơi trong các buổi
seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án.
Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu, tôi cũng luôn nhận được sự
ủng hộ, động viên, tạo điều kiện thuận lợi của Ban lãnh đạo Khoa Y Dược -


Đại học Quốc gia Hà Nội cùng sự giúp đỡ của các đồng nghiệp tại Bộ môn Y

Dược học cơ sở - Khoa Y Dược. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu
sắc cho sự ủng hộ và giúp đỡ đó.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình tơi, chồng
tơi đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình
học tập, nghiên cứu và hồn thành bản luận án này.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý
báu đó!
Hà Nội, tháng 08 năm 2020
TÁC GIẢ LUẬN ÁN
Phạm Thị Hồng Nhung


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC......................................................................................................... 1
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ....................................... 5
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................... 8
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ 9
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 12
1. ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................... 12
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................... 14
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................... 14
4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ...................................... 15
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN ... 15
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 17
1.1. THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN................................................. 17
1.1.1. Các dạng thụ thể và phối tử ................................................................. 17
1.1.2. Cấu trúc của GPCR .............................................................................. 19
1.1.3. Cơ chế hoạt động của GPCR ............................................................... 21

1.1.4. Các phương pháp phân tích GPCR ..................................................... 23
1.2. TACHIKININ VÀ CÁC THỤ THỂ NEUROKININ ....................... 26
1.2.1. Các phối tử tachykinin ......................................................................... 26
1.2.2. Các dạng thụ thể neurokinin ................................................................ 28
1.3. SỰ BIỂU HIỆN CỦA NK1R TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO ........... 32
1.3.1. Các dạng thụ thể neurokinin-1 ở người............................................... 32
1.3.2. Đáp ứng tế bào được kích hoạt bởi phối tử SP thơng qua NK1R ..... 35
1.3.3. Ứng dụng của các chất đối kháng NK1R ........................................... 38

1


1.3.4. Phân tích chức năng thụ thể dựa vào thay đổi nồng độ Ca2+ nội bào ..40
1.4. CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN THỤ THỂ TÁI TỔ HỢP .............. 44
1.4.1. Hệ thống dịch mã phi tế bào ................................................................ 44
1.4.2. Hệ thống biểu hiện ở tế bào nhân sơ ................................................... 45
1.4.3. Hệ thống biểu hiện ở nấm men............................................................ 45
1.4.4. Hệ thống biểu hiện ở các tế bào côn trùng.......................................... 46
1.4.5. Hệ thống biểu hiện ở tế bào động vật có vú........................................ 47
1.5. SƠ LƯỢC VỀ CÁC CÂY THUỐC VÀ HOẠT CHẤT ĐƯỢC
THỬ NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU............................................... 50
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 55
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................. 55
2.1.1. Các vector nhân dòng và biểu hiện ..................................................... 55
2.1.2. Các mồi và đoạn oligonucleotide dùng trong nghiên cứu ................. 55
2.1.3. Các dịng tế bào và mơi trường ni cấy ............................................ 56
2.1.4. Tinh chất và dịch chiết methanol thực vật .......................................... 56
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............... 59
2.2.1. Hóa chất nghiên cứu chính .................................................................. 59
2.2.2. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 60

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................... 60
2.3.1. Phát triển hệ thống vector SFV biểu hiện NK1R ............................... 62
2.3.2. Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ ....................... 67
2.3.3. Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R của người ..................................... 68
2.3.4. Biểu hiện NK1R tái tổ hợp thông qua lây nhiễm SFV ...................... 69
2.3.5. Đánh giá mức độ biểu hiện và hoạt tính NK1R ................................. 70
2.3.6. Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của một
số dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp ............................................... 72
2.3.7. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu........................................... 74

2


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 76
3.1. THIẾT KẾ HỆ VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP
CỦA NGƯỜI ............................................................................................... 76
3.1.1. Thiết kế cặp mồi khuếch đại gen trong PCR ...................................... 76
3.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pSFV-KLEPT1.2 ....................................... 78
3.1.3. Tạo vector tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 .................................... 80
3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1 ............................................ 83
3.1.5. Nhân dòng, tách chiết và bảo quản các vector.................................... 85
3.2. TẠO HẠT SFV MANG TRÌNH TỰ NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA
NGƯỜI......................................................................................................... 87
3.2.1. Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ ....................... 87
3.2.2. Tạo hạt SFV tái tổ hợp từ tế bào BHK-21 ......................................... 88
3.3. ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO
ĐỘNG VẬT ................................................................................................. 90
3.4. ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP TRÊN TẾ BÀO
BUỒNG TRỨNG CHUỘT HAMSTER TRUNG QUỐC (CHO) ......... 91
3.4.1. Đánh giá động học biểu hiện protein .................................................. 91

3.4.2. Kiểm tra biểu hiện NK1R trên tế bào CHO qua lai Western ............ 92
3.4.3. Phép thử chức năng thụ thể bằng Fura-2AM ..................................... 94
3.5. NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO DỊCH CHIẾT METHANOL
VÀ TINH CHẤT CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VIỆT NAM TRÊN NK1R
TÁI TỔ HỢP................................................................................................ 95
3.5.1. Xác định các thông số dược lực học của chất chủ vận và chất đối
kháng đặc hiệu NK1R .................................................................................... 95
3.5.2. Đánh giá tương tác giữa thụ thể NK1R tái tổ hợp với dịch chiết
methanol và tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam ............................ 97

3


CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................ 104
4.1. PHÁT TRIỂN VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R CỦA NGƯỜI
TRÊN TẾ BÀO CHO ............................................................................... 104
4.2. NGHIÊN CỨU CÁC DẠNG BIẾN THỂ CỦA THỤ THỂ ........... 113
4.3. NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO CÁC HOẠT CHẤT
HƯỚNG ĐÍCH THỤ THỂ NK1R TÁI TỔ HỢP.................................. 118
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 125
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................... 127
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 129
PHỤ LỤC

4


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
2D/3D

Cấu trúc không gian 2 chiều/3 chiều

AA

Aarachidonic acid

AC

Adenylate cyclase

AM

Gốc este của acetoxymethyl

AP

Aprepitant (chất đối kháng đặc hiệu của NK1R)

BHK

Dòng tế bào thận chuột Hamster Baby (Baby Hamster Kidney)

BSA

Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin)

cAMP

AMP vòng (cyclic adenosine monophosphate)

cDNA

DNA bổ sung với mRNA được tạo ra từ phản ứng phiên mã
ngược (complementary DNA)

CHO

Dòng tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc
(Chinese Hamster Ovary)

CHO-NK1R

Dòng tế bào CHO biểu hiện thụ thể NK1R tái tổ hợp

COS

Dịng tế bào ngun bào sợi thận khỉ

DMEM

Mơi trường Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM Medium)

DMSO

Dimethylsulfoxide

DNA

Deoxyribose nucleic acid

EC50

Nồng độ hiệu lực 50% (Median effective concentration)

EC80

Nồng độ hiệu lực 80% (so với hiệu lực tối đa - 100%)

E. coli

Chủng vi khuẩn Escherichia coli

eGFP

Protein huỳnh quang lục mạnh (Enhanced Green Fluorescent
Protein)

EGFR

Thụ thể thúc đẩy tăng trưởng biểu mô (epidermal growth
factor receptor)

ER

Mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum)

5

ERK

Các kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (extracellular signal
regulated kinases)

FBS

Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum)

FDA

Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug
Agency)

Fura-2

Amino acidopolycarboxylic

Fura-2AM

Fura-2 acetoxymethyl este

GPCR

Thụ thể kết cặp G-protein (G-protein coupled receptor)

HEK

Dòng tế bào thận phơi người (Human Embryonic Kidney
Cells)

HeLa

Dịng tế bào ung thư cổ tử cung người

IC50

Nồng độ ức chế 50% (Median inhibitory concentration)

IC50TB

Nồng độ ức chế 50% trung bình

IL

interleukin

IP3

Inositol triphosphate

JAK

Janus kinase

Kd

Hằng số phân ly (Dissociation coefficient)

Ki

Hằng số ức chế (Inhibitory coefficient)

LB

Môi trường Luria-Bertani (LB medium)

LD50

Liều gây chết 50% (50% lethal dose)

LX

Leukotrienes

MAPK

Protein kinase hoạt hóa phân bào (mitogen-activated protein
kinases)

MCS

Vị trí nhân dịng đa điểm (Multicloning site)

MLC

Chuỗi nhẹ của myosin (myosin regulatory light chain)

NCBI

Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Hoa Kỳ
(National Centre for Biotechnology Information)

6


NHS

Dịch vụ y tế quốc gia của Anh (National Health Service)

NK1R

Thụ thể neurokinin 1 (neurokinin-1 receptor)

NK1R

Trình tự mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

OD

Mật độ hấp thụ quang (Optical Density)

PBS

Đệm PBS (Phosphate buffered saline)

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase (Polymerase Chain
Reaction)

PI3K

Phosphoinositide 3-kinase

PK

Protein kinase

PLA2

Phospholipase A2

PLC

Phospholipase C

pSFV-NK1R

Vector pSFV mang trình tự NK1R

RNA

Ribose nucleic acid

RFU

Đơn vị huỳnh quang tương đối (Relative fluorescence unit)

STAT

Protein dẫn truyền tín hiệu và kích hoạt phiên mã (Signal
Transducer and Activator of Transcription Protein)

SFV

Semliki Forest Virus

SP

Substance P (chất chủ vận đặc hiệu của NK1R)

TXA2

Thromboxane A2

U937

Dòng tế bào ung thư bạch cầu đơn nhân người

7


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Cấu trúc các tachikinin của người ........................................................27
Bảng 1.2. Công dụng của các cây thuốc dùng trong nghiên cứu .........................50
Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................55
Bảng 2.2. Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu ......................56
Bảng 2.3. Danh mục cây thuốc trong nghiên cứu và vị trí thu mẫu.....................67

Bảng 2.4. Điều kiện và thành phần của phản ứng nối và tạo DNA đầu bằng nhờ
enzyme phân đoạn Klenow ...................................................................63
Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng nối đoạn chèn vào vector pSFV 66
Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng colony PCR sàng lọc khuẩn lạc
có vector chứa đoạn chèn đúng chiều ...................................................65
Bảng 2.7. Chế độ xung điện đồng biến nạp RNA hệ SFV vào tế bào BHK-21
bằng thiết bị Gene pulser Xcell II (Biorad) ..........................................69
Bảng 3.1. Thông số của các cặp mồi tự thiết kế ....................................................76
Bảng 3.2. Kết quả tách plasmid ..............................................................................86

8


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây phát sinh chủng loại các họ GPCR người và vị trí của NK1R ..20
Hình 1.2. Cấu trúc chung của 3 họ thụ thể GPCR chính...............................21
Hình 1.3. Truyền tín hiệu từ GPCR qua thay đổi cấu trúc G-protein ...........22
Hình 1.4. Hoạt động của GPCR ....................................................................23
Hình 1.5. Cấu trúc của thụ thể neurokinin-1 .................................................32
Hình 1.6. So sánh cấu trúc và đáp ứng tế bào của thụ thể NK1R có chiều dài
đầy đủ và dạng ngắn ......................................................................34
Hình 1.7. Sự dẫn truyền tín hiệu thơng qua NK1R .......................................36
Hình 1.8. Sự giải phóng Ca2+ thơng qua inositol 1,4,5-trisphosphate ..........41
Hình 1.9. Những con đường duy trì nồng độ Ca2+ tế bào chất ở mức thấp ..42
Hình 1.10. Tế bào cơ trơn nhuộm Fura-2 và kích thích với Angiotensn II ....43
Hình 1.11. Các hệ thống vector biểu hiện xây dựng từ hệ gen SFV ...............48
Hình 1.12. Cơng thức phân tử và cấu trúc không gian 2 chiều của capsaicin,
piperine, rotundine và rutin ...........................................................52
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng qt ............................................................61

Hình 2.2. Sơ đồ tạo vector cải biến pSFV-KLEPT1.2 .................................62
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm phát triển vector pSFV-KLEPT1.2-NK1 ..........66
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm phát triển vector pSFV-EGFP-NK1 .................67
Hình 2.5. Cách bố trí phép thử chức năng NK1R trên đĩa 96 giếng .............73
Hình 3.1. Vị trí các mồi dùng nhân dịng đoạn chèn NK1R trong vector
pSFV2-EGFP-NK1 và pSFV-KLEPT1.2-NK1 ............................77
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự đoạn cải tiến trong vector pSFV-KLEPT1.2 ...79
Hình 3.3. Kết quả điện di trình tự NK1R thu được thông qua PCR trên khuôn
pJET1.2-NK1 và plasmid pSFV-KLEP1.2 ...................................80

9


Hình 3.4. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pSFVKLEPT1.2-NK1 ............................................................................81
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt mở vòng
pSFV2 và pEGFP-NK1 bằng XhoI và NotI ..................................85
Hình 3.6. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pSFV-EGFPNK1.......................................................................................................84
Hình 3.7. Kiểm tra chất lượng DNA plasmid được mở vòng và sản phẩm
RNA được phiên mã in vitro trên gel agraose 1% ........................87
Hình 3.8. Ảnh chụp từ kính hiển vi soi nổi tế bào BHK sau chuyển gen 18
giờ và 42 giờ ..................................................................................88
Hình 3.9. Biểu hiện NK1R trên một số dịng tế bào .....................................90
Hình 3.10. Ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào CHO được lây nhiễm SFV
mang trình tự mã eGFP tái tổ hợp .................................................92
Hình 3.11. Ảnh chụp từ kính hiển vi tế bào CHO không nhiễm virus và tế bào
CHO nhiễm SFV ...........................................................................93
Hình 3.12. Ảnh lai Western với kháng thể kháng beta-tubulin và kháng thể
kháng neurokinin-1 của tế bào CHO tự nhiên và tế bào CHO
nhiễm hạt SFV-NK1R ...................................................................93
Hình 3.13. Sự thay đổi Ca2+ nội bào của tế bào CHO và CHO-NK1R theo

thời gian sau khi bổ sung SP .........................................................95
Hình 3.14. Đường cong đáp ứng theo liều thể hiện hoạt tính biểu hiện chức
năng của thụ thể NK1R tái tổ hợp của người ................................96
Hình 3.15. Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R tái tổ hợp của dịch chiết methanol
Bình vơi, Hồ tiêu và Hịe ...............................................................99
Hình 3.16. Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết methanol Cỏ mần
trầu, Sâm vũ diệp và tam thất hoang, Râu mèo và Đảng sâm... 100

10


Hình 3.17. Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết methanol Canhkina
và Ba kích .................................................................................. 101
Hình 3.18. Mối tương quan giữa hàm lượng tinh chất được phân tích trong dịch
chiết methanol và hoạt độ ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết .......102
Hình 3.19. Hoạt độ ức chế thụ thể NK1R được hoạt hóa bởi SP 10-7M với các
tinh chất có trong dược liệu Việt Nam ...................................... 103
Hình 4.1. Kết quả so sánh trình tự protein suy diễn từ cDNA mã hóa NK1R
với trình tự protein cơng bố trên Ngân hàng gen NCBI ........... 114
Hình 4.2. Nghiên cứu di truyền dược lý các thuốc hướng đích GPCR ..... 117
Hình 4.3. Phương pháp sử dụng thụ thể GPCR trong sàng lọc dược chất
có nguồn gốc tự nhiên ............................................................... 123

11


MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Thụ thể neurokinin-1 (viết tắt là NK1R) nói riêng và thụ thể kết cặp với
G-protein (viết tắt là GPCR) nói chung là đích tác dụng quan trọng của rất

nhiều thuốc hiện nay. Khi NK1R tương tác với chất chủ vận nội sinh sẽ dẫn
truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về thần kinh trung ương,
gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm. Ngồi ra, NK1R
tham gia kích thích co cơ trơn và điều hịa các phản ứng miễn dịch của cơ thể.
Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của NK1R, nhiều loại
thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm
cảm, chống nôn cho các bệnh nhân ung thư… đã và đang được các hãng dược
phẩm đầu tư phát triển và thương mại hóa.
Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học hướng đích GPCR phục vụ
nghiên cứu phát triển thuốc là nhu cầu mang tính thời sự trong các nghiên cứu
dược lý học phân tử. Có một số lượng lớn các hợp chất mới có nguồn gốc tự
nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp (được gọi chung là các thuốc thử) cần xác
định đích phân tử và cơ chế dược lý tác động lên cơ thể. Hiện nay, việc sử
dụng các GPCR tự nhiên thường gặp khó khăn do các dịng tế bào GPCR tự
nhiên biểu hiện ở mức độ thấp, việc thu mẫu và phân lập từ tế bào người gặp
nhiều hạn chế về mặt đạo đức cũng như kỹ thuật. Ngoài ra, các GPCR có
nhiều dạng biến thể (subtype) khác nhau, có thể dẫn đến những nhận định
nhầm về khả năng tương tác với các thuốc thử. Tuy nhiên, những khó khăn
trên có thể khắc phục bằng cách sử dụng các tế bào biểu hiện GPCR tái tổ hợp
của người. GPCR tái tổ hợp biểu hiện ở mức độ cao và đầy đủ hoạt tính sẽ
cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào cho các thí nghiệm xác định hoạt tính
liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein. Chính vì

12


vậy, xây dựng mơ hình biểu hiện mạnh GPCR tái tổ hợp của người trên các hệ
thống tế bào động vật là nghiên cứu cấp thiết và có giá trị thực tiễn trên thế
giới cũng như ở Việt Nam.
Mặc dù nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển nhằm biểu hiện

protein ngoại lai trong tế bào nhân sơ đến nhân chuẩn, đến nay biểu hiện hiệu
suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức
lớn. Sự biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới yêu cầu biến
đổi sau dịch mã, sự cuộn gập protein, vận chuyển nội bào và khả năng gây
độc tính tế bào của thụ thể. Có một thuận lợi là các GPCR dù đa dạng về trình
tự amino acid song có cấu trúc khơng gian tương đồng lớn (đều là đơn chuỗi
peptide với 7 miền xuyên màng kị nước). Chính vì vậy, mơ hình biểu hiện
thành cơng cho một thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho rất nhiều thụ
thể khác, đặc biệt là các thụ thể cùng họ GPCR. Trong các hệ thống biểu hiện,
hệ thống biểu hiện của Semliki Forest Virus (viết tắt là SFV) được ghi nhận là
một trong những hệ thống biểu hiện protein màng tế bào động vật trong thời
gian nhanh nhất. Theo tài liệu, hệ thống này đã được một số hãng dược phẩm
(như Hoffman La Roche) ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR phục vụ cho
nghiên cứu và phát triển thuốc, nhưng các dòng tế bào tái tổ hợp khơng được
thương mại hóa trên thị trường. Trong bối cảnh đó, việc ứng dụng và làm chủ
được hệ thống biểu hiện SFV hứa hẹn cung cấp một cơng cụ sinh học hữu ích
trong nghiên cứu y sinh dược học ở Việt Nam.
Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận án:
“Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp
trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát
triển dược phẩm”.

13


2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu tổng quát
Biểu hiện được NK1R tái tổ hợp của người trên dòng tế bào tự nhiên
vốn không biểu hiện thụ thể này nhằm sàng lọc hoạt chất và dịch chiết dược
liệu hướng đích NK1R. Qua đó, tạo cơ sở xây dựng mơ hình biểu hiện cho

các GPCR tái tổ hợp khác phục vụ cho các nghiên cứu và phát triển dược
phẩm ở Việt Nam.
2.2. Mục tiêu cụ thể
Mục tiêu 1: Xây dựng được quy trình kỹ thuật biểu hiện NK1R tái tổ hợp của
người thơng qua hệ thống biểu hiện SFV trên dịng tế bào động
vật.
Mục tiêu 2: Đánh giá được hoạt động chức năng của NK1R tái tổ hợp biểu
hiện trên tế bào động vật.
Mục tiêu 3: Áp dụng được tế bào động vật biểu hiện thụ thể NK1R trong
sàng lọc một số dược liệu tiềm năng.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Phát triển hệ vector SFV biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người.
Nội dung 2: Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R tái tổ hợp của người.
Nội dung 3: Đánh giá biểu hiện NK1R trên một số dòng tế bào động vật.
Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện và chức năng của NK1R người tái tổ hợp
trên tế bào CHO.
Nội dung 5: Tạo ra một lượng lớn tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của
người với đầy đủ chức năng, ứng dụng bước đầu trong nghiên

14


cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của 10 loài
dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp.
4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Luận án là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống biểu
hiện GPCR người tái tổ hợp, từ xây dựng vector chuyển gen mã hóa NK1R
của người đến biểu hiện thụ thể tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO. Kết quả
đánh giá hoạt tính sinh học các hoạt chất hướng đích NK1R in vitro của luận
án có giá trị khoa học và thực tiễn, có tính mới trên thế giới. Dòng tế bào

động vật biểu hiện thụ thể tái tổ hợp của người là công cụ hiện đại và hiệu quả
phục vụ cho các nghiên cứu y sinh học.
Hệ thống biểu hiện SFV đã được thiết lập để tạo được dòng tế bào
CHO biểu hiện mạnh NK1R người lần đầu tiên ở Việt Nam. Đây là cơ sở biểu
hiện thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho nhiều GPCR khác.
Xây dựng được mơ hình sàng lọc in vitro các hoạt chất hướng đích
NK1R phục vụ các các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm. Đây là một công cụ
mới và hiện đại phục vụ cho các nghiên cứu dược lý, phù hợp với định hướng
phát triển các thuốc dược liệu của Việt Nam hiện nay.
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
Về mặt khoa học
Trình tự NK1R của hai bệnh nhân Việt Nam đã được biểu hiện thành
cơng trên dịng tế bào CHO, mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật biểu hiện ổn
định các thụ thể tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc phân tử,
dược lý in vitro, góp phần định hướng cho các nghiên cứu phát triển thuốc ở
các giai đoạn sau (nghiên cứu dược lý in vivo, nghiên cứu lâm sàng, nghiên
cứu dược động học, ...).

15


Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen, biểu hiện protein
tái tổ hợp với hệ thống biểu hiện SFV đã được khẳng định thông qua việc
phát triển thành cơng vector SFV mang trình tự NK1R của người và biểu hiện
hiệu quả cao trên dòng tế bào CHO.
Luận án, các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học cơng nghệ trong
nước và quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và
giảng dạy.
Về mặt thực tiễn
Tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người với đầy đủ hoạt tính có thể

ứng dụng để sàng lọc các các hoạt chất hướng đích NK1R thu từ các cây dược
liệu Việt Nam. Nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn
phát triển thuốc dược liệu, tiêu chuẩn hoá và hiện đại hố các sản phẩm có
nguồn gốc tự nhiên, góp phần phát huy thế mạnh về nguồn tài nguyên dược
liệu phong phú của Việt Nam.
Không chỉ biểu hiện hiệu quả protein thụ thể, hệ thống SFV được xây
dựng trong nghiên cứu này cịn là cơng cụ hữu ích để chuyển gen và biểu hiện
các loại protein khác nhau trên các dòng tế bào động vật. Nhiều nghiên cứu
khác nhau trên thế giới đã cho thấy đây cũng là công cụ có tiềm năng ứng
dụng trong liệu pháp gen trị liệu ung thư hay công nghệ sản xuất vắc-xin.

16


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN
1.1.1. Các dạng thụ thể và phối tử
Trong quá trình tồn tại và phát triển, tế bào liên tục tiếp nhận các tín
hiệu ngoại bào là các kích thích vật lý (ánh sáng, nhiệt độ hay áp lực) hay các
kích thích hóa học (các peptide, chất dẫn truyền thần kinh, các pheromone,
các nucleotide và các hợp chất phân tử nhỏ khác). Thụ thể là một lớp lớn các
protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào được gọi là phối tử
(ligand), truyền hóa và thúc đẩy q trình truyền tín hiệu nội bào dẫn đến đáp
ứng tế bào giúp cơ thể phản ứng kịp thời với sự thay đổi của mơi trường [9].
Chính vì vậy, thụ thể có vai trị rất quan trọng, tham gia vào nhiều cơ chế sinh
lý trong các tế bào cũng như giữa các tế bào với nhau.
Dựa vào tác động lên tế bào mà phối tử có thể chia thành 2 nhóm chính
là chất chủ vận (agonist) và chất đối kháng (antagonist) [7, 144]. Chất chủ vận
là những chất khi gắn vào thụ thể sẽ hoạt hóa thụ thể gây ra đáp ứng tế bào.
Các chất chủ vận được chia thành sáu nhóm như sau:

Nhóm 1: Chất chủ vận nội sinh (endogenous agonist): Xuất hiện tự
nhiên trong cơ thể, có khả năng liên kết và kích hoạt thụ thể.
Nhóm 2: Chất siêu chủ vận (super agonist): Có khả năng gắn kết với
thụ thể và tạo ra phản ứng tối đa, lớn hơn so với các chất chủ vận nội sinh
khác.
Nhóm 3: Chất chủ vận tồn phần (full agonist): Kích hoạt thụ thể và tạo
ra hiệu quả đầy đủ tương đương với phối tử nội sinh.

17


Nhóm 4: Chất chủ vận một phần (partial agonist): Liên kết và kích hoạt
thụ thể, nhưng chỉ gây ra đáp ứng một phần so với các chất chủ vận nội sinh.
Nhóm 5: Chất chủ vận ngược (inverse agonist): Liên kết với thụ thể và
gây ra đáp ứng tế bào đối ngược với chất chủ vận.
Nhóm 6: Chất chủ vận khơng thể đảo ngược (irreversible agonist): Liên
kết và kích hoạt các thụ thể vĩnh viễn.
Ngược lại với chất chủ vận, chất đối kháng khi gắn vào thụ thể sẽ ngăn
thụ thể liên kết với chất chủ vận, qua đó khơng gây ra đáp ứng tế bào. Chất
đối kháng chia thành 2 nhóm như sau:
Nhóm 1: Chất đối kháng cạnh tranh (competitive antagonism): Liên kết
chọn lọc và khơng gây kích hoạt thụ thể đặc hiệu, đồng thời ngăn chất chủ
vận liên kết với thụ thể (do có cùng vị trí liên kết với chất chủ vận).
Nhóm 2: Chất đối kháng khơng cạnh tranh (non - competitive
antagonism): Chặn đáp ứng bởi chất chủ vận sau khi xảy ra tương tác thụ thể
của chất chủ vận. Chất đối kháng không cạnh tranh làm gián đoạn sự liên kết
giữa thụ thể và chất gây hiệu ứng (effector, thường là những enzyme như
adenylyl cyclase, phospholipase C và A2 hoặc kênh ion).
Có bốn siêu họ thụ thể chính bao gồm thụ thể kênh ion đóng mở bởi
phối tử, thụ thể kết cặp G-protein (GPCR), thụ thể tế bào chất - nhân và thụ

thể tyrosine kinases [122]. Trong đó, GPCR là siêu họ thụ thể lớn và đa dạng
nhất ở người [105]. Theo thống kê năm 2018, 108 loại GPCR là đích tác dụng
của 475 (chiếm khoảng 34%) thuốc được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và
Thuốc Hoa Kỳ (viết tắt là FDA) phê duyệt. Tổng doanh thu của các thuốc này
trên thế giới lên đến 180 tỷ đô la Mỹ, tương ứng 27% thị phần mỗi năm [62].
Do sự liên quan đáng kể đến sinh lý bệnh của cơ thể và giá trị trong khám phá

18


dược lý, các GPCR hiện nay là đích nghiên cứu thuốc có giá trị và được quan
tâm nhiều nhất.
1.1.2. Cấu trúc của GPCR
Ở người, các GPCR được biểu hiện trên hầu hết các tế bào và ước tính
có khoảng 950 GPCR khác nhau do gần 800 gen mã hóa (tương ứng khoảng
4% gen mã hóa protein) [61]. Dựa vào sự tương đồng cấu trúc và nguồn gốc
tiến hóa, GPCR ở người chia làm 6 họ chính là họ A (họ Rhodopsin), họ B1
(họ Secretin), họ B2 (họ Adhesion), họ C (họ Glutamate), họ F (họ Frizzled)
và họ T (họ Taste 2) (xem Hình 1.1) [46, 138]. Đến nay, 46 thụ thể đã được
xác định cấu trúc nhưng chỉ có 11 thụ thể có cấu trúc ở trạng thái hoạt hóa
được xác định, gần 90% các thụ thể không liên quan khứu giác vẫn thiếu cấu
trúc tinh thể. Chính vì vậy, nhiều nghiên cứu GPCR phải sử dụng mơ hình thụ
thể xây dựng từ các chương trình tin sinh để sàng lọc in silico, tối ưu hoá
thuốc [177].
Phần lớn các GPCR đều có cấu tạo chung gồm một chuỗi polypeptide
với cấu hình khơng gian gồm 7 chuỗi xoắn  xun màng sinh chất
(transmembrance), đầu amino, đầu carboxyl, 3 vòng ngoại bào (exoloop) và 3
vòng nội bào (endoloop). Cấu tạo chung của ba họ thụ thể chính A, B và C
được mơ tả ở hình Hình 1.2. Các thụ thể khác nhau có các biến đổi sau dịch
mã khác nhau như glycosyl, hình thành cầu disulfide và palmitoyl hóa ở các

vị trí đặc biệt. Kích thước của các loại GPCR cũng rất khác nhau, từ dưới 300
amino acid như thụ thể adrenocorticotropin tới hơn 1100 amino acid như thụ
thể metabotropic glutamate. Tuy nhiên, sự giống nhau về cấu trúc cũng như
các G-protein giữa các loài sinh vật từ nấm men đến người cho thấy các thụ
thể GPCR và các G-protein có vai trò sinh lý tế bào cực kỳ quan trọng và có
thể có nguồn gốc tiến hóa chung từ rất sớm [151].

19


Hình 1.1. Cây phát sinh chủng loại các họ GPCR người và vị trí của NK1R (mũi tên đỏ).
Các nhánh được mã hoá màu dựa trên dạng phối tử, các hình trịn xám trước tên receptor chỉ ra số lượng các phối tử (trắng: 0, xám nhạt:> 100, xám:> 500 và màu đen> 1000) [138].

20