Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương Glycine max thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------

Đỗ Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY
ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA
VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------

Đỗ Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY
ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA
VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

TS. Lê Hồng Điệp

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn
Đồng – người thầy ln kiên nhẫn và hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt
q trình tơi thực hiện luận văn.
Tơi xin gửi tới TS. Lê Hồng Điệp lời cảm ơn chân thành, người đã luôn hỗ
trợ và giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn.
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình, những
ý kiến đóng góp q báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS. Nguyễn Anh Vũ
trong suốt q trình tơi thực hiện và hồn thành luận văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Kỹ sư Lương Thanh Quang cùng tập thể cán bộ
Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nơng
Nghiệp về sự nhiệt tình giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tơi có thể thực
hiện được đề tài này một cách suôn sẻ và thuận lợi.
Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân cùng bạn bè lời cảm ơn
thân thương nhất - những người đã luôn sát cánh, quan tâm và dành cho tơi tình
cảm chân thành trong suốt thời gian tơi học tập và hồn thành luận văn này cũng
như đã luôn luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Học viên cao học

Đỗ Thị Như Quỳnh


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1. Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương ........................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương .......................... 3
1.1.2. Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người .......................... 6
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới và Việt Nam ............................ 7
1.2. Cơ chế chống chịu các yếu tố phi sinh học của thực vật............................... 10
1.3. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu
tương.................................................................................................................. 12
1.3.1. Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương ............................................................ 12
1.3.2. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương ....................... 13
1.4. Gen GmGLP1 .............................................................................................. 14
1.5. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật .................................................. 15
1.5.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .................... 15
1.5.2. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen................................................... 18
1.5.3. Phương pháp chuyển gen bằng xung điện ................................................. 18
1.5.4. Phương pháp chuyển gen qua ống phấn .................................................... 19
1.6. Nguồn gốc và đặc tính sinh học của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26
và DT84 ............................................................................................................. 20
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................... 22
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 22
2.2. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 22
2.2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 22
2.2.2. Hóa chất và mơi trường ........................................................................... 23
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 23
2.2.4. Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu ................ 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 24

2.3.1. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .................. 24
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá ....................................... 26
2.3.3. Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR ......................... 27
2.3.4. Phương pháp thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR .................................... 28
2.3.5. Phương pháp lai Southern blot .................................................................. 29
2.4. Các tiêu chí đánh giá ................................................................................... 31
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 32
3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của 4 giống đậu tương
ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 ............................................................................ 32
3.1.1. Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu ............................................................. 32
3.1.2. Khả năng tái sinh tạo đa chồi .................................................................... 33
3.1.3. Khả năng tái sinh rễ tạo cây hồn chỉnh .................................................... 35
3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR ...... 38
3.3. Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1 .......................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 49
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 50
PHỤ LỤC.............................................................................................................. 60


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới trong những năm gần đây . 7
Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên Thế giới ....... 8
trong những năm gần đây .................................................................................. 8
Bảng 3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây ... 9
Bảng 4. Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm ........................................ 24
Bảng5. Thành phần phản ứng PCR ................................................................. 28
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ..................................................... 28
Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bằng enzyme Bam HI ................... 30

Bảng8. Kết quả khảo sát tỷ lệ này mầm của 4 giống đậu tương ....................... 33
ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84 ............................................................................ 33
Bảng 9. Khả năng phát sinh chồi của 4 giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày
....................................................................................................................... 34
Bảng 10. Khả năng sống sót sau chọn lọc và khả năng kéo dài chồi của 4 giống
đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 ........................................................ 35
Bảng 11. Sự phát sinh rễ tái sinh cây hoàn chỉnh............................................. 36
Bảng 12. Cây tái sinh hồn chỉnh sống sót và phát triển ở mơi trường ngồi ... 36
Bảng 13. Tỷ lệ cây sống sót sau khi phun basta ............................................... 38
Bảng 14. Thống kê số cây T0 sinh trưởng và phát triển tốt sau khi phun basta và
đã dương tính với PCR.................................................................................... 41
Bảng 15. Phân tích cây T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 và 15:1......... 43
Bảng 16. Kết quả phân tích cây chuyển gen T1 ............................................... 47


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cơ chế chống chịu của thực vật với stress ................................................ 12
Hình 2. Hạt đậu tương của 4 giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 được sử dụng
trong thí nghiệm .................................................................................................... 22
Hình 3. Cấu trúc vector biểu hiện gen GmGLP1 trong vector pZY101Asc ............ 23
Hình 4. Quy trình chuyển gen đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ........ 37
Hình 5. Cây phản ứng với Basta sau 5 ngày phun .................................................. 37
Hình 6a. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số cây T0 giống ĐT22 ......... 38
Hình 6b. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số cây T0 giống đậu tương
ĐT26 và DT84 ...................................................................................................... 39
Hình 6. Ảnh điện di DNA tổng số cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế
hệ T0 ...................................................................................................................... 39
Hình 7a. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22 được
chuyển gen thế hệ T0 ............................................................................................. 40
Hình 7b. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT26 và

DT84 được chuyển gen thế hệ T0........................................................................... 40
Hình 7. Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22, ĐT26
và DT84 được chuyển gen thế hệ T0 ...................................................................... 40
Hình 8. Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 ở thế hệ T0 . 42
Hình 9. Hạt cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế hệ T0 ............................ 42
Hình 10. Phản ứng của cây chuyển gen ở thế hệ T1 với Basta ............................... 43
Hình 11. DNA tổng số cây T1sống sót sau khi phun Basta .................................... 44
Hình 12. PCR kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong cây T1 .......................... 45
Hình 13. Kết quả lai Southern Blot ....................................................................... 46


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

ADN

Axit deoxyribonucleic

AS

Acetosyringone

BAP

6 – benzylaminopurine

Bar

Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase

Bp

Base pair

CCM

Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy

Cs

Cộng sự

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ĐT22

Giống đậu tương ĐT22

ĐT26

Giống đậu tương ĐT26

DT84

Giống đậu tương DT84

ĐVN9

Giống đậu tương ĐVN9

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetic

GA3

Gibberelic acid

GM

Germination medium – môi trường nảy mầm hạt

GmGLP1

Glycine max Germin – like protein 1

IBA

Indole-3-butyric acid

Kb

Kilo base

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase

RM

Rooting medium – môi trường ra rễ

SDS

Sodium dodecysulfat

SEM

Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi

SIM

Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi

T0

Cây chuyển gen

T1

Cây chuyển gen thế thệ thứ nhất

TAE

Tris – acetate – EDTA

v/p

vòng/phút

YEP

Yeast extract peptone


MỞ ĐẦU
Đậu tương (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay còn gọi là cây đậu nành là cây
công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao. Đậu tương là
cây trồng lấy hạt, và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, chỉ đứng hàng
thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngơ. Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu
tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ - chiếm
tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á – 18,54% [85]. Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng
đậu tương đang được mở rộng, tính đến tháng 11/2013 diện tích gieo trồng đậu
tương khoảng 117,8 triệu ha, sản lượng đạt khoảng 168,3 nghìn tấn [8].
Tuy nhiên, hiện nay cả thế giới đang phải đối mặt với hiện tượng biến đổi
khí hậu, nền nhiệt hằng năm tăng cao dẫn đến tình trạng hạn hán. Mức độ hạn hán
thường khó dự đốn do phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tần suất và sự phân bố
lượng mưa, mức độ nước bay hơi, và khả năng giữ nước của đất [76, 29]. Theo
Boyer (1982) [13], hạn hán là yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn nhất đến năng
suất cây trồng trên toàn thế giới, đồng thời hạn hán có khả năng tác động lên nhiều
giai đoạn phát triển khác nhau của cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng
[29]. Bởi sự ấm lên của khí hậu tồn cầu, và nhu cầu thực phẩm tăng ngày càng cao

dưới áp lực của gia tăng dân số, tần suất và sự ảnh hưởng của hạn hán càng trở nên
rõ rệt [68, 63, 22]. Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển những giống cây
trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu tốt trong điều kiện hạn hán đang là một
trong những mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới cũng như các nhà
khoa học Việt Nam.
Các nghiên cứu trước đây về cơ chế phân tử chỉ ra rằng tính trạng chịu hạn ở
thực vật được kiểm soát bởi nhiều gen và được chia làm hai nhóm chính là nhóm
các gen điều hịa và nhóm các gen chức năng [38, 61, 11]. Trong nhóm gen chức
năng thì họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trị thiết yếu đối
với tiềm năng chịu hạn ở cây. Ở đậu tương, họ gen GmGLP được biết đến gồm 21
gen [45], GLPs được biết đến với khả năng SOD, POD là các hoạt tính enzyme
chống oxi hóa. Nhờ đó đóng vai trị quan trọng trong việc thể hiện khả năng chống

1


chịu của cây trồng với các điều kiện bất lợi. Ở đậu tương, gen mã hóa cho protein
này được đặt tên là Glycine max GmGLP1 – Soybean Oxalate oxidase.
Việc nghiên cứu và sử dụng hệ thống gen chống chịu với các điều kiện bất
lợi trong việc chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng kháng hạn đã và
đang là tâm điểm của hàng loạt các phịng thí nghiệm trên toàn thế giới.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên
cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (Glycine max) thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào 4 giống đậu tương Việt Nam: ĐT22,
ĐVN9, ĐT26 và DT84.
Yêu cầu của nghiên cứu
Biến nạp thành công gen GmGLP1 vào một trong bốn giống đậu tương
ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84.

Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0 và cây T1.

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương
1.1.1. Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương
Đậu tương hay cịn gọi là đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine
max(L.) Merr theo khóa phân loại của Hymowitz, và Newel (1981) [37].Căn cứ
vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, đậu tương
được xếp vào Bộ (Fabales), Họ (Fabaceae), Phân họ (Leguminosae), Chi (Glycine).
Đậu tương có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40.
Đặc điểm hình thái học của cây đậu tương Glycine max(L.) Merr
- Rễ đậu tương bao gồm: rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 3050cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ tập trung nhiều ở tầng
đất 7-8cm rộng 30-40cm2 [1] Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần.
- Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình trịn, trên thân có nhiều lơng
nhỏ, thân trung bình có 14-15 lóng. Tồn thân có 1 lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao
phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá.
- Lá cây đậu tương có 3 loại lá:
* Lá mầm (lá tử diệp): lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục,
khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh
* Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3
ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau.
* Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá chét mọc so
le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu.
- Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm,
mỗi chùm có từ 1-10 hoa và mỗi chùm thường có 3-5 hoa. Hoa đậu tương thuộc loại
hoa lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa, có 10
nhị và 1 nhụy, vì thế cây đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phẩn rất thấp chỉ

chiếm 0,5 – 1%.
- Số quả đậu tương biến động từ 2-20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới
400 quả trên một cây. Một quả chứa từ 1-5 hạt, nhưng hầu hết ở các giống đậu

3


tương thường thấy chỉ có từ 2-3 hạt. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều
dài từ 2-7cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến động từ vàng đến trắng tới vàng sẫm
hoặc đen.
- Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: hình trịn, hình bầu dục, trịn dẹt,... Rốn
hạt có màu sắc khác nhau và đặc trưng cho mỗi giống.
Đặc điểm quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương
Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương được chia làm hai giai
đoạn chính là (i): giai đoạn phát triển sinh dưỡng và (ii): giai đoạn sinh sản. Trong
từng giai đoạn trải qua các bước khác nhau.
(i). Giai đoạn phát triển sinh dưỡng: chia ra làm 6 giai đoạn nhỏ.
- Giai đoạn nảy mầm: hạt đậu tương bắt đầu nảy mầm khi hấp thụ đủ lượng
nước bằng hoặc tương đương 50% khối lượng hạt. Rễ chính xuất hiện đầu tiên rồi
đến thân mầm sau đó lá mầm xuất hiện. Sự nảy mầm hạt diễn ra trong vòng từ 5 –
10 ngày. Hạt nảy mầm phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trường, độ ẩm và độ
sâu của hạt trong đất… Trong 5 ngày tính từ ngày gieo hạt, lơng rễ xuất hiện và có
chức năng hấp thu chất dinh dưỡng và nước cho cây. Rễ thứ sinh bắt đầu phát triển
từ rễ chính. Thân mầm tiếp xúc với ánh sáng, kéo lá mầm lên khỏi mặt đất, trụ lá
mầm bắt đầu sinh trưởng, lá đơn xuất hiện.
- Giai đoạn lá mầm: giai đoạn lá mầm bắt đầu khi những lá đơn xuất hiện.
Trong giai đoạn này, lá mầm duy trì nguồn dinh dưỡng cần thiết cho cây non.
Khoảng 70% khối lượng khô của lá mầm dần bị mất đi bởi quá trình chuyển dinh
dưỡng từ lá mầm tới các phần còn lại của cây.
- Giai đoạn xuất hiện lá kép đầu tiên: giai đoạn này được đánh dấu bằng sự

xuất hiện của chiếc lá kép đầu tiên.
- Giai đoạn lá kép thứ 2: cây cao khoảng 15,24 – 20,32 cm, xuất hiện 3 đốt
trên thân và có thêm chiếc lá kép thứ 2. Ở giai đoạn này, quá trình cố định nito từ vi
khuẩn bắt đầu diễn ra. Các nốt sần của rễ xuất hiện trong phạm vi 25,4 cm từ mặt
đất xuống rễ. Những nốt sần có màu sắc khác nhau, nốt sần có mầu hồng hay đỏ

4


diễn ra sự cố định nitơ tích cực; trong khi đó những khối u màu trắng, nâu hay xanh
lá cây không diễn ra sự cố định nitơ.
- Giai đoạn lá kép thứ 3 tới giai đoạn sinh trưởngthứ 5: cây cao khoảng 17,78
– 22,86 cm, có 4 đốt và 3 lá kép. Đến giai đoạn 5, cây cao từ 25,4 – 30,48 cm, lá
kép tiếp tục xuất hiện. Ở giai đoạn 5 này, xuất hiện các chồi phụ ở đỉnh – các chồi
này sau này sẽ phát triển thành chùm hoa.
- Giai đoạn xuất hiện hoa sớm: cây cao từ 30,48 – 35,56 cm. Lá mầm và lá
đơn trong giai đoạn này có thể bị già hóa.
(ii): Giai đoạn sinh sản: chia ra làm 7 giai đoạn nhỏ:
- Bắt đầu nở hoa: ít nhất 1 hoa nở ra từ một trong các đốt phát triển từ thân
chính của cây.
- Nở hoa hoàn toàn: xuất hiện một hoa đã nở từ 1 trong 2 đốt ở phần ngọn
cây. Một trong hai đốt này có 1 lá đã phát triển hồn tồn. Chiều cao cây đạt 50%
chiều cao của cây trưởng thành, và đạt 50% tổng số đốt ở cây trưởng thành. Rễ phụ
hướng sâu vào lòng đất, sự cố định nitơ tăng lên nhanh chóng.
- Hình thành quả đậu:một quả phát triển từ 4 đốt trên cùng dài khoảng 0,15
cm. Nhiệt độ, độ ẩm ảnh hưởng lên tổng số quả được hình thành, số lượng hạt được
tạo thành trên mỗi quả và kích thước của hạt.
- Hình thành quả: giai đoạn diễn ra sự phát triển nhanh của quả, sự phát triển
của hạt bắt đầu diễn ra. Khối lượng khô của quả tăng nhanh từ giai đoạn hình thành
quả tới giai đoạn hình thành hạt. Có một quả đậu dài 1,9 cm phát triển từ 4 đốt trên

cùng. Quá trình hình thành hoa diễn ra ở đỉnh thân chính. Đây là giai đoạn quan
trọng đối với năng suất tạo hạt. Bất kỳ điều kiện bất lợi nào cũng làm giảm năng
suất cây.
- Hình thành hạt:hạt có kích thước 0,31 cm trong quả phát triển từ 4 đốt trên
cùng của thân chính. Vào giữa giai đoạn này, cây đạt được chiều cao tối đa, số
lượng đốt tối đa và diện tích bề mặt lá tối đa. Sự cố định nitơ đạt đỉnh và bắt đầu
giảm. Hạt vẫn tiếp tục tích lũy hàm lượng khơ. Cuối giai đoạn này, sự tích lũy dinh

5


dưỡng trong các lá cây đạt đỉnh và bắt đầu quá trình dịch chuyển sinh dưỡng đến
hạt. Khả năng phục hồi của cây với điều kiện bất lợi là rất thấp.
- Hình thành hạt hồn tồn: khối lượng hạt trong giai đoạn này đạt đỉnh. Tốc
độ sinh trưởng diễn ra nhanh nhưng bị chậm lại ở giữa giai đoạn này, và đạt đỉnh ở
giai đoạn bắt đầu trưởng thành. Trong giai đoạn này, hạt phát triển chiếm hết không
gian trong khoang hạt. Sự hóa vàng của lá bắt đầu diễn ra. Sự sinh trưởng của rễ
diễn ra hoàn toàn vào khoảng giữa giai đoạn này.
- Bắt đầu trưởng thành: giai đoạn này được đánh dấu bằng việc một quả trên
thân chính có màu nâu, màu xanh của vỏ quả chuyển sang màu vàng. Chất khô
trong mỗi hạt bắt đầu đạt đỉnh. Ở bước trưởng thành về mặt sinh lý, các hạt đạt
khoảng 60% độ ẩm. Điều kiện bất lợi ở giai đoạn này hay sau đó hầu như khơng
gây ra ảnh hưởng lên năng suất của cây trồng.
- Hoàn toàn trưởng thành: 95% số quả trên cây chuyển sang màu nâu.
1.1.2. Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người
Cây đậu tương đóng vai trị quan trọng trong đời sống con người bởi nó là
nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu các chất
khoáng và các vitamin. Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,5 – 40% trong khi
đó, hàm lượng protein trong gạo chỉ từ 6,2 – 12%, ngô từ 9,8 – 13,2%, thịt bò 21%,
thịt gà 20%, cá từ 17 – 20% và trứng từ 13 – 14%. Hàm lượng lipit trung bình từ 15

– 20% và với thành phần chủ yếu là các axit béo không no khoảng 60 – 70% có hệ
số đồng hóa cao và mùi vị thơm như axit linoleic khoảng 52 – 65%, oleic khoảng 25
– 36%, linolenolic khoảng 2 – 3% [1].
Vai trị của cây đậu tương với ngành cơng nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau: chế biến
cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi
trơn trong ngành hàng không. Tuy nhiên, đậu tương chủ yếu được dùng làm nguyên
liệu để ép dầu:hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên
liệu cho ép dầu, chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật.

6


Vai trị của cây đậu tương với ngành nơng nghiệp
Trước tiên, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, với tỉ lệ 1kg hạt đậu
tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Các bộ phận thân, lá, rễ, quả, hạt
của cây đậu tương đều có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như
thân, lá tươi và nghiền khô đều là thức ăn tổng hợp cho gia súc. Sản phẩm phụ công
nghiệp như khơ dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao (N: 6,2% ; P2O5: 0,7% ;
K2O: 2,4%) và cũng được dùng sản xuất thức ăn cho gia súc [1].
Tiếp đến, cây đậu tương đóng vai trị trong việc cải tạo đất. Đậu tương là cây
luân canh cải tạo đất tốt. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ
cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng
suất cả hệ thống cây trồng đồng thời giảm chi phí cho việc bón nitơ. Thân, lá đậu
tương có thể dùng để bón ruộng thay phân hữu cơ bởi hàm lượng nitơ trong thân
chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [1].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương, nên cây đậu tương
được xem là một trong những loại cây trồng chiến lược trên toàn thế giới, đứng ở

vị trí thứ 4 chỉ sau cây lúa, cây ngơ và cây lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng
với các điều kiện môi trường khác nhau nên cây đậu tương được trồng rộng rãi trên
toàn thế giới, nhưng điều kiện khí hậu khác nhau ở các châu lục do đó, cây đậu
tương được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ chiếm tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á
chiếm tỷ lệ 18,54%[85]. Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nơng nghiệp
Liên hiệp Quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng 11,6 triệu
ha trong vịng 4 năm trở lại đây (diện tích gieo trồng năm 2009 là 99,34 triệu ha đến
năm 2013 diện tích gieo trồng tăng lên 111,27 triệu ha) (bảng 1) [27].
Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới trong những năm gần đây
Năm
2009
2010

Diện tích gieo trồng
(triệu ha)
99,34
102,8

Năng suất
(Tạ/ha)
22,49
25,78

7

Sản lượng
(triệu tấn)
223,41
265,04

103,8
2011
104,92
2012
111,27
2013
(Nguồn: FAOSTAT, 2014)

25,23
22,98
24,84

261,94
241,14
276,4

Trong đó, 4 quốc gia sản xuất nhiều đậu tương nhất là Mỹ, Brazil, Argentina
và Ấn Độ (Bảng 2). Mỹ là nước có diện tích gieo trồng và sản lượng đậu tương lớn
nhất trên thế giới vào khoảng 30,7 triệu ha năm 2013.
Tuy diện tích gieo trồng đậu tương tăng đều qua các năm (bảng 1), nhưng
sản lượng đậu tương trên thế giới lại biến động không đồng đều qua các năm. Năm
2009 sản lượng đậu tương trên toàn thế giới đạt 223,41 triệu tấn, năm 2010 sản
lượng tăng lên 265,04 triệu tấn nhưng tới năm 2011 sản lượng giảm xuống 261,94
triệu tấn, năm 2012 sản lượng đậu tương tiếp tục giảm xuống còn 241,14 triệu tấn,
tới năm 2013 sản lượng tăng trở lại 276,4 triệu tấn cao nhất trong 4 năm trở về
trước.
Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới
trong những năm gần đây
Diện tích gieo

trồng (triệu ha)
Mỹ
29,86
Brazil
23,97
2011
Argentina
18,75
Ấn Độ
10,18
Mỹ
30,8
Brazil
24,98
2012
Argentina
17,58
Ấn Độ
10,84
Mỹ
30,7
Brazil
27,86
2013
Argentina
19,42
Ấn Độ
12,2
(Nguồn: FAOSTAT, 2014)

Năm

Quốc gia

Năng suất
(tạ/ha)
28,2
31,21
26,07
12,0
26,64
26,36
22,81
13,53
29,15
29,32
25,4
9,8

Sản lượng
(triệu ha)
84,19
74,82
48,88
12,21
82,05
65,85
40,1
14,66
89,48

81,7
49,3
11,95

Trong năm năm trở lại đây, năng suất đậu tương trên thế giới cũng biến động
không ngừng (bảng 1), năm 2010 năng suất đậu tương đạt 25,78 tạ/ha cao nhất
trong năm năm qua. Bốn quốc gia có diện tích gieo trồng và sản lượng đậu tương
lớn nhất trên thế giới, cũng có những biến động về sản lượng đậu qua các năm. Tuy

8


Mỹ là quốc gia có diện tích gieo trồng và tổng sản lượng đậu tương cao nhất trên
thế giới nhưng Mỹ khơng phải là quốc gia có sản lượng đậu tương lớn nhất trên thế
giới (sản lượng đậu tương của Mỹ năm 2013 là 29,15 tạ/ha thấp hơn so với Brazil
sản lượng đậu tương đạt 29,32 tạ/ha)
Có nhiều nguyên nhân gây ra sự không ổn định về năng suất và sản lượng
đậu tương mặc dù diện tích đất canh tác đậu tương qua các năm tăng đồng đều,
chẳng hạn như là do dịch bệnh, yếu tố kỹ thuật. Nhưng đáng chú ý nhất là do tình
hình biến đổi khí hậu và hạn hán là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất đậu
tương trên toàn thế giới. Theo thống kê của cơ quan nông nghiệp Hoa Kỳ, sản
lượng đậu tương của Argentina đạt hơn 49 triệu tấn năm 2009, năng suất khoảng
hơn 25 tạ/ha. Nguyên nhân gây ra tình trạng này là do tình trạng hạn hán của một số
nước Châu Mỹ Latinh trong đó có Argentina. Sự tụt giảm nắng suất của Ấn Độ và
Argentina gây ra sự suy giảm sản lượng đậu tương trên thế giới.
Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Cây đậu tương đã được gieo trồng từ lâu đời ở Việt Nam. Tuy nhiên, Việt
Nam là một quốc gia có nền nơng nghiệp truyền thống lâu đời, ngành nông nghiệp
hoạt động chủ yếu dựa trên phương pháp canh tác truyền thống, nên năng suất cây
trồng thấp và sản xuất còn nhỏ lẻ. Nhưng do những giá trị về mặt dinh dưỡng cũng

như giá trị về mặt công nghiệp của cây đậu tương là rất lớn nên hằng năm Việt Nam
nhập khẩu một lượng lớn đậu tương từ các quốc gia khác trên thế giới (năm 2013,
Việt Nam nhập khẩu khoảng 556 nghìn tấn đậu tương từ Hoa Kỳ).
Bảng 3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây
Năm

Diện tích gieo trồng
Năng suất (Tấn/ha)
Sản lượng
(nghìn ha)
(Nghìn tấn)
181,1
1,47
266,9
2011
119,6
1,45
173,5
2012
117,8
1,43
168,3
2013
120
1,47
176,4
2014*
130
1,48
192,4

2015*
(Nguồn:Tổng cục thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn, *: Số liệu dự báo của USDA [86])
Ở nước ta, cây đậu tương đang được trồng tại 25 tỉnh thành trong cả nước,
với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam, khu

9


vực trồng đậu tương chính tập trung ở vùng Đồng bằng sơng Hồng. Diện tích canh
tác đậu tương ngày càng bị thu hẹp, bên cạnh đó sản lượng đậu tương qua các năm
tương đối đồng đều nhưng tổng sản lượng chung qua các năm biến động và theo
chiều hưởng giảm (bảng 3) [8]. Mặc dù chưa có thống kê cụ thể nguyên nhân của
việc diện tích đất gieo trồng đậu tương ngày càng bị thu hẹp, tuy nhiên, kết hợp với
tình hình đánh giá sản lượng đậu tương của các Quốc gia trên thế giới có thể ban
đầu kết luận rằng hạn hán cũng đang góp phần ảnh hưởng tới năng suất và diện tích
gieo trồng đậu tương.
Trước những thực trạng ở cả Việt Nam và trên thế giới, việc nghiên cứu tìm
ra gen có khả năng kháng hạn và chuyển vào cây trồng nói chung và cây đậu tương
đang là vấn đề cấp bách nhất. Thêm vào đó, ngày 16 tháng 5 năm 2013, Bộ Tài
Nguyên và Môi trường đã ban hành Thơng tư số 08/2013/TT-BTNMT quy đinh
trình tự, thủ tục cấp và thu hồi Giấy chứng nhận an tồn sinh học với cây trồng biến
đổi gen, từ đó cho phép người nông dân được canh tác các loại cây trồng biến đổi
gen, cũng như mở ra triển vọng cho các nhà khoa học Việt Nam nghiên cứu tạo ra
những loại cây trồng có khả năng kháng hạn nói chung và cây đậu tương có khả
năng kháng hạn nói riêng.
1.2. Cơ chế chống chịu các yếu tố phi sinh học của thực vật
Trước những diễn biến của khí hậu theo hướng bất lợi như nền nhiệt độ cao
dẫn tới hạn hán, nước biển xâm lấn đất liền dẫn đến đất nhiễm mặn … Thực vật là
đối tượng chịu ảnh hưởng nhiều nhất bởi các yếu tố phi sinh học bởi thực vật khơng

có khả năng di chuyển như các lồi động vật. Do đó, để sống sót và tiếp tục duy trì
nịi giống thực vật có những cơ chế chống chịu khác nhau với các yếu tố phi sinh
học.
Các nhân tố phi sinh học (abiotic stress) như hạn hán, mặn và lạnh là những
điều kiện môi trường bất lợi ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và năng suất
cây trồng trên toàn thế giới [42]. Thực vật thường là đối tượng chịu sự tác động
trước hết của các điều kiện môi trường bất thuận như các yếu tố phi sinh học nguyên nhân gây ra các tác nhân phi sinh học ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

10


[13] cũng như gây ra sự phân bố của các lồi thực vật trên các loại mơi trường khác
nhau [14]. Thực vật thường phải đối mặt với các điều kiện bất lợi phi sinh học như
sự thiếu hụt về nước, sự khắc nghiệt về nhiệt độ (nóng hoặc lạnh), nguồn dinh
dưỡng trong đất bị suy giảm hoặc do sự dư thừa của các ion độc hại, thừa ánh sáng
và sự khơ cằn của đất làm cản trở q trình sinh trưởng của rễ [75]. Thực vật có khả
năng đáp ứng hoặc thích nghi với mơi trường khác nhau một cách trực tiếp hoặc
gián tiếp liên quan đến tính bền vững và khả năng phục hồi của quá trình quang
hợp, đồng thời kết hợp với các quá trình khác để sinh trưởng và phát triển đặc biệt
là sinh sản [14]. Một điểm nổi bật của khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi phi
sinh học là sự kích hoạt các đáp ứng phức tạp bao gồm tương tác gen và xen kẽ
(crsoss-talk) với nhiều con đường phân tử khác nhau.
Các điều kiện bất lợi hạn, lạnh và mặn đều là những điều kiện bất lợi mang
tính thẩm thấu. Đầu tiên chúng gây ra hiện tượng mất nước ở tế bào và dẫn tới làm
giảm khả năng thẩm thấu của tế bào. Tuy nhiên, mức độ mất nước của tế bào gây ra
bởi các điều kiện bất lợi khác nhau là khác nhau: i) điều kiện bất lợi do muối làm
giảm hàm lượng nước trong tế bào do giảm thế năng nước bên ngoài, làm nồng độ
ion tăng (chủ yếu là Na+ và Cl-) dẫn đến khó hấp thu nước qua rễ và vận chuyển
nước đến các tế bào thực hiện hoạt động trao đổi chất; ii) điều kiện bất lợi do lạnh
gây ra làm giảm hàm lượng nước tế bào có thể gọi là hạn sinh lý, tức là khơng có

khả năng vận chuyển nước có sẵn trong đất đến các tế bào sống, chủ yếu diễn ra ở
phần thịt lá; iii) sự giảm hàm lượng nước trong tế bào gây ra bởi điều kiện bất lợi
hạn là do tình trạng thiếu nước trong đất hoặc trong khí quyển. Để thích nghi với
các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, thực vật phản ứng lại các điều kiện bất lợi
thông qua hai con đường chính là con đường phụ thuộc acid absisic (ABA) và con
đường khơng phụ thuộc ABA (hình 1).

11


Hình 1. Cơ chế chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi
Thực vật có khả năng chống lại tất cả các yếu tố phi sinh học ảnh hưởng tới
sự sinh trưởng và phát triển của cây. Trong tất cả các yếu tố phi sinh học, yếu tố nào
cũng đang là bài toán đối với các nhà khoa học và các nhà chọn giống trên toàn thế
giới. Tuy nhiên, trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chỉ quan tâm và đưa
ra giải pháp cho vấn đề chịu hạn ở thực vật mà đối tượng chính ở đây là cây đậu
tương.
1.3. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây
đậu tương
1.3.1. Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương
Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có ba cơ chế chính để có thể
thích ứng sinh trưởng và phát triển: (i): cơ chế trốn thoát điều kiện hạn, (ii): cơ chế
tránh hạn; (iii): cơ chế chống chịu hạn. Ở đậu tương, cơ chế trốn thoát điều kiện hạn
hán cho phép cây hoàn thành chu kỳ sống của mình sớm và thường các giống đậu
tương có cơ chế trốn thoát điều kiện hạn hán là những giống đậu tương ngắn ngày
và chín rất sớm (xem mục 1.1.1). Đối với giống đậu tương có cơ chế tránh hạn sẽ có

12

các cơ chế để duy trì lượng nước trong cây trong suốt giai đoạn hạn thông qua việc
tăng khả năng hấp thụ nước từ rễ và giảm sự thoát hơi nước ở những bộ phận khác
của cây. Các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, cây sẽ có khả năng duy
trì sức căng của các mơ và tế bào, do đó các q trình trao đổi chất có thể diễn ra
bình thường trong điều kiện lượng nước bên ngồi mơi trường xuống rất thấp [49].
1.3.2. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tìm ra những gen có khả năng
kháng hạn ở thực vật đang được hết sức quan tâm. Bởi khơng phải bất kỳ lồi thực
vật nào cũng có khả năng tự mình chống chịu lại với điều kiện hạn hán. Do đó việc
tìm ra những gen có khả năng kháng hạn, phân lập và chuyển vào cây trồng quan
tâm đang được tiến hành ở hầu hết các phịng thí nghiệm về thực vật. Cho tới nay,
có rất nhiều cơng bố liên quan tới việc phân lập tách chiết cũng như chuyển thành
công đoạn gen kháng hạn vào cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng.
Gen GmDREB2 và gen P5CR là hai trong số các gen có chức năng chịu hạn
đã từng được nghiên cứu và biến đổi ở cây đậu tương[23, 16]. Cả hai gen
GmDREB2 và P5CR, mã hóa lần lượt cho Dehydration Responsive Element
Binding protein và L-∆1-Pyrroline-5-Carboxylate Reductase, đều có mặt tự nhiên
trong hệ gen của đậu tương [24]. Trong điều kiện hạn hán, gen GmDREB2 được
kích hoạt biểu hiện và mã hóa cho một yếu tố phiên mã có khả năng liên kết với yếu
tố di truyền DRE của nhiều gen tham gia vào phản ứng chịu hạn, góp phần kích
hoạt phản ứng thích ứng với mơi trường thiếu nước. Chính từ đặc điểm này, các nhà
nghiên cứu đi đến hướng tăng cường sự biểu hiện của gen GmDREB2 nhằm nâng
cao tính chống chịu trong điều kiện mơi trường thiếu nước ở thực vật, mà
Arabodopsis chính là một ví dụ liên quan. Trong khi đó, theo Ronde và các cs
(2004)[23], với việc chuyển thêm bản copy của gen P5CR vào trong cây, đậu tương
được xác định có khả năng chống chịu với hạn hán tốt hơn. Theo nghiên cứu này
chỉ ra rằng số lượng gen P5CR có mối liên hệ đến hàm lượng nước trong tế vào,
cũng như hàm lượng proline tự do. Lý do cây chịu hạn tốt hơn là vì proline tự do sẽ
liên kết và làm ổn định màng tế bào.

13


1.4. Gen GmGLP1
Germin-like proteins (GLPs) là những proteins có trình tự tương đồng với
những protein germin được tìm thấy ở cây lúa mỳ và lúa mạch – do vậy GLPs cũng
có các motif germin [45] – và được tìm thấy ở rêu, cây một lá mầm và cây hai lá
mầm [62]. Các phân tích hệ gen ở nhiều lồi thực vật cho thấy GLPs được mã hóa
bởi các họ gen gồm nhiều gen thành viên. Trong đó, riêng ở đậu tương đã xác định
có một họ gen GmGLP có 21 gen [45]. Khác với những germin – được biểu hiện ở
hạt đang nảy mầm – các gen GLPs được biểu hiện ở nhiều bộ phận khác nhau của
cây, như ở lá mầm, rễ, lá, hoa, và hạt [45, 62]. Sự biểu hiện này phản ánh vai trò đa
dạng của GLPs trong quá trình phát triển của cây: thực tế, GLPs tồn tại ở dạng
glycoprotein thường kết chuỗi lại trong ma trận ngoại bào nhờ các liên kết ion, và
có các chức năng isomerase, cyclase, dioxygenase. Ngoài ra, một số gen GLPs có
biểu hiện tăng cường trong điều kiện khơ hạn [40]. Hai trong số những chức năng
nổi bật đã biết của họ gen GLPs là: mã hóa cho proteins đóng vai trị thụ thể của
auxin—phân tử tín hiệu thực vật tham gia vào rất nhiều quá trình sinh trưởng và
phát triển ở thực vật; mã hóa cho proteins mang hoạt tính enzyme superoxide
dismutase (SOD) giúp chống oxy hóa và giúp cây chống chịu với nấm gây bệnh
như Rhizoctonia solaani và Verticillium longisporum [41, 62]. Năm 2010, Joydeep
Banerjee và cs [10] sử dụng chủng vi khuẩn A.tumefacien LBA4404 mang đoạn gen
OsGLP1 chuyển nạp gen vào cây thuốc lá bằng phương pháp lây nhiễm qua lá để
xác định ảnh hưởng của gen OsGLP1 tới chiều cao cây và khả năng kháng sâu
bệnh. Cũng năm 2010, Katrin Knecht và cs [41] sử dụng vi khuẩn A.tumefacien
chủng GV3101 mang gen BvGLP1 chuyển nạp vào Arabidopsis thaliana thông qua
phương pháp tổn thương lá, kết quả thu được cho thấy biểu hiện của gen BvGLP1
trong cây Arabidopsiskháng được hai loại nấm gây bệnh là Verticillium
longisporum và Rhizoctonia solaani. Năm 2009, Yuqin Ke và cs [40], nghiên cứu
sự biểu hiện khác nhau của các loại protein và photphoprotein trong điều kiện hạn

hán ở cây lúa, nghiên cứu chỉ ra rằng trong điều kiện khô hạn, protein GLP1 bị
giảm mức độ photphoryl hóa mạnh.

14


Ở đậu tương gen mã hóa cho protein này được đặt tên là Glycine max
GmGLP1- Soybean Oxalate oxidase ( Gen ID: |EU916269.1|).
1.5. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được nghiên
cứu và ứng dụng vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: chuyển gen thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen, chuyển gen qua ống
phấn, chuyển gen bằng vi tiêm … Nhưng hai phương pháp chuyển gen thành công
nhất và được ứng dụng nhiều nhất là phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen.
1.5.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Phương pháp này sử dụng vi khuẩn A. tumefaciensnhư một vector sinh học
để chuyển một đoạn ADN của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả tạo được cây biến
đổi gen [34], [80]. Vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thơng qua vị
trí bị tổn thương của cây. Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra một số hợp chất
phenol, hợp chất này đóng vai trị dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciensbiểu hiện vùng
gen Vir nằm trên Ti – plasmid [35]. Kết quả biểu hiện cácgen Vir, sợi đơn T-ADN
sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật. Vấn đề chính của phương pháp
chuyển gen này là làm thế nào để có thể kết hợp giữa tế bào chủ với vector tương
ứng.
Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để lây
nhiễm với vi khuẩn [21] cho tới khi Pederson và cs (1983) [59] đã chứng minh đậu
tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen
vẫn bị kiểm soát bởi yếu tố giống [25, 54]. Mặt khác, khả năng thu được các chồi
chuyển gen từ những khối mơ có khả năng tái sinh như phơi vơ tính và nốt lá mầm

ban đầu rất thấp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều nghiên cứu
nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trị xúc tác như acetosyringone
để kích thích sự biểu hiện của các gen Vir, L-cystein [53], thiol [52] hoặc sử dụng
các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [32], xác định các yếu tố ảnh
hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm [48, 55], cải tiến nốt lá mầm

15


làm vật liệu biến nạp [58], kết hợp lây nhiễm với tái sinh [15]. Vấn đề khác khi sử
dụng vi khuẩn A. tumefaciens còn phụ thuộc vào chủng khuẩn [47], số lượng bản
sao ADN được tổng hợp trong hệ gen thực vật [60, 71], pH môi trường [65], mức
độ gây tổn thương của cây [65, 70]. Trái ngược với phương pháp chuyển ADN trực
tiếp, chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có thể cho kết quả với số bản
copy nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khn
mẫu khơng được kiểm sốt.
Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tao ra bằng phương pháp nốt
lá mầm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens làm trung gian được báo cáo vào năm
1988 [20]. Nốt lá mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng vi khuẩn A.
tumefaciens mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate. Mẫu được
nuôi cấy trong môi trường có chứa BAP để cảm ứng tạo chồi , kanamycin cùng với
các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lượng vi khuẩn cịn lại sau khi đồng ni
cấy. Sau một vài tháng, cây con được tái sinh và được kiểm tra thông qua sự biểu
hiện của gen gus hoặc khả năng kháng glyphosate. Chỉ 6% tổng số chồi lựa chọn
được chuyển gen. Tám cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có
một sợi ADN được chèn vào. Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả khơng cao nhưng
báo cáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương
khi được lây nhiễm với chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp.
Gần đây vi khuẩn A. tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng nốt lá
mầm cũng được sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pob

Mottle (một loại virus gây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tương [26]. Tuy
nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm
khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu. Phân tích Southern blot cho thấy sự
tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây T1. Khoảng 30% cây
T2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu được xét nghiệm ELISA (Enzymlinked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng kháng hoàn tồn với virus này.
Tình trạng hình thái khơng bị biến đổi so với thế hện T1.

16


Parrott và cs (1989) [54] đã đưa ra phương pháp chuyển gen khác đó là sử
dụng vi khuẩn A. tumefaciens lây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo phơi vơ
tính sau đó tái sinh thành cây hồn chỉnh. Ba cây chuyển gen có chứa gen zein kích
thước 15kD được hình thành. Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và
khi phân tích các cây ở thế hệ sau khơng thấy có một cây nào có chứa gen mã hóa
zein 15kD.
Gần đây, một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được
phát triển để biến nạp vi khuẩn A. tumefaciens mang gen vào thẳng tế bào mơ đích.
Kỹ thuật mới này gọi là SAAT (Sonication Assisted Agrobacterium – media
transformation) [74]. Sử dụng SAAT với nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi vô tính
đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và khơng có hiện tượng thể khảm. Phương
pháp này có ưu điểm là thời gian nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với
Agrobacterium được rút ngắn. Với kỹ thuật quét điện tử hiển vi, nhóm tác giả khám
phá ra SAAT, tạo ra những rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép A.
tumefaciens dễ dàng đi vào mơ đích mong muốn không giống như phương pháp
chuyển nạp gen khác. Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng
đã làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan như: lá, nốt
lá mầm, phôi hữu tính, phơi vơ tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện GUS tăng
gấp 100-400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây vân sam trắng
(white spuruce), lúa mì, ngơ và đậu tương, đồng thời gen chuyển nạp tương đối ổn

định qua các thế hệ. Cũng với phương pháp trên Meurer và các cs (1998) [48] áp
dụng trên 28 giống đậu tương. Nhóm tác giả cho rằng, để thực hiện thành cơng
phương pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế
bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mô mong muốn. Với phương pháp SAAT ,
chọn những cụm phơi có 10 – 20 phơi (đường kính 2 – 4mm) được lây nhiễm với
1ml dịch khuẩn A. tumefaciens có nồng độ OD600 = 0,1 – 0,5 trong thời gian 0-300
giây. Sau 2 ngày trên mơi trường lây nhiễm có 0,1mM Acetosyringone mẫu được
chuyển lên môi trường chứa 400 mg/l timetin. Hai tuần sau khi SAAT, chuyển mô

17