Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh phục vụ công tác chuyển gen ở sắn Manihot esculenta Crantz Manihot esculenta Crantz

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

Tống Thị Hƣờng

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ TẠO MÔ SẸO PHƠI HĨA VÀ KHẢ NĂNG
TÁI SINH CÂY HỒN CHỈNH, PHỤC VỤ CÔNG TÁC
CHUYỂN GEN Ở SẮN (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------

Tống Thị Hƣờng

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ TẠO MÔ SẸO PHƠI HĨA VÀ KHẢ NĂNG
TÁI SINH CÂY HỒN CHỈNH, PHỤC VỤ CÔNG TÁC
CHUYỂN GEN Ở SẮN (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Nguyễn Văn Đồng
TS. Lê Hồng Điệp

Hà Nội – 2014


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tơi trong thời gian
học tập tại Trường.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng và TS. Lê
Hồng Điệp, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tơi trong suốt quá trình
học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên
làm việc tại Phịng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Cơng nghệ Tế bào thực vật, Viện
Di truyền Nông nghiệp đã hết lịng giúp đỡ tơi thực hiện thành cơng luận văn này.
Cuối cùng, tơi vơ cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp
đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua.
Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Cơng nghệ
thơng qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ
theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT. Tôi xin chân thành biết ơn sự hỗ trợ đó.

Hà Nội, tháng 6 năm 2014
Học viên

Tống Thị Hường

1

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................v
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................................vi
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn ...............................................................................3
1. 1. 1. Nguồn gốc và phân loại..............................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn ....................................................................5
1.1.3. Giá trị của cây sắn ........................................................................................7
1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng sắn trên thế giới và Việt Nam .......................8
1.2.1. Trên thế giới ..................................................................................................8
1.2.2.Ở Việt Nam.....................................................................................................9
1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................11
1.4. Nguyên lý và ứng dụng của phƣơng pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật .....14
1.4.1. Cơ sở lí thuyết .............................................................................................14
1.4.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro ...........................15
1.4.3. Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật .....................16
1.5. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào mơ thực vật ........................................................17
1.5.1. Các chất khống .........................................................................................17
1.5.2.Các vitamin ..................................................................................................18
1.5.3. Các chất điều hoà sinh trưởng ...................................................................19
1.6. Các phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật .......................................................21

i


1.6.1. Chuyển gen trƣc tiếp .................................................................................21
a. Chuyển gen bằng xung điện...........................................................................21

b. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) ....................................................22
c. Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube) ..................................22
d. Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics) 22
1.6.2. Chuyển gen gián tiếp ....................................................................................23
a. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus ......................................................................23
b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .....................23
1.7. Tình hình nghiên cứu ni cấy mơ sẹo phơi hóa tạo hệ thống tái sinh và
chuyển gen vào sắn ..................................................................................................24
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................27
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...........................................................................................27
2.1.1. Mẫu thực vật ...............................................................................................27
2.1.2. Vi khuẩn và các vector ...............................................................................27
2.1.3. Môi trường nuôi cấy ...................................................................................28
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................28
2.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch......................................................28
2.2.2. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm ............................................29
2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa...............................................29
2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa
...............................................................................................................................30
2.2.5. Phương pháp biến nạp ...............................................................................31
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................33
3.1. Nghiên cứu tạo mẫu sạch .................................................................................33
3.2. Nghiên cứu thí nghiệm tạo chồi, nhân cụm chồi và kéo dài chồi .................36

ii


3.3. Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa từ chồi nách cây sắn ..................................37
3.4. Kết quả tái sinh thành cây hồn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa của giống TMS
60444..........................................................................................................................47

3.5. Kết quả chuyển gen vào mơ sẹo phơi hóa của giống TMS 60444 .................49
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................60

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Diện tích trồng sắn tại Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66] ..........9
Bảng 2. Sản lượng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66] ..............10
Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol và rượu từ sắn của Việt Nam năm 2012 [67] .11
Bảng 4: Khái quát các bước tạo mơ sẹo phơi hóa ở sắn ................................................30
Bảng 5. Hệ số của các thí nghiệm tạo cụm chồi, thí nghiệm nhân cụm chồi và thí
nghiệm kéo dài chồi .......................................................................................................36
Bảng 6. Kết quả tạo mô sẹo từ chồi nách trên môi trường CIM ...................................38
Bảng 7.Đánh giá chất lượng mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường DKW......40
Bảng 8: Đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trường
DKW ..............................................................................................................................41
Bảng 9. Đánh giá khả năng tạo mơ sẹo phơi hóa ở mơi trường MMS ..........................43
Bảng 10. Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn nghiên cứu ..............................46
Bảng 11. Đánh giá khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mơ sẹo phơi hóa ..........48
Bảng 12. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh từ mơ sẹo
phơi hóa của TMS 60444 (theo dõi sau 8 tuần) .............................................................55
Bảng 13. Ảnh hưởng của nồng độ OD600 đến khả năng tiếp nhận gen của mơ sẹo phơi
hóa .................................................................................................................................51

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Hình thái cây sắn [47].........................................................................................3
Hình 2. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2012 [66] ..8
Hình 3. Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65] ................................9
Hình 4. Các hệ thống đang được sử dụng để thu cây sắn biến đổi gen [59] .................24
Hình 5: Tỷ lệ mẫu sống của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
.......................................................................................................................................33
Hình 6: Tỷ lệ mẫu sạch của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau
.......................................................................................................................................34
Hình 7. Kết quả thí nghiệm tạo cụm chồi của giống HL 2004-28 sau 28 ngày ni cấy
.......................................................................................................................................37
Hình 8. Các cụm mơ sẹo 2 tuần tuổi trong mơi trường CIM ........................................40
Hình 9. Khối mơ sẹo của các giống trong môi trường DKW sau 2 tuần ni cấy........42
Hình 10. Khối mơ sẹo HL 2004-28 (A); KM 140 (B); KM 419 (C) và TMS 60444 (D)
ở giai đoạn 8 tuần tuổi tại mơi trường MMS .................................................................45
Hình 11. Cụm mơ sẹo phơi hóa tái sinh ........................................................................48
Hình 12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thơng qua A. tumefaciens .....................50
Hình 13: Chồi tái sinh của cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 =
0,5 biểu hiện gen GFP. ..................................................................................................53
Hình 14: Chồi tái sinh của cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 =
0,7 biểu hiện gen GFP. ..................................................................................................53
Hình 15: Chồi tái sinh của cụm mơ sẹo phơi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 =
0,25 biểu hiện gen GFP. ................................................................................................ 54

v


DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu/viết tắt

Tên đầy đủ

AS

Acetosyringone

BAP

6-Benzyl amino purin

GFP

Green Flourescen Protein

EC

Embryogenic Callus

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

IAA

Acid-β-indolacetic

NAA

Napthanele acetic acid

2,4D

Axit 2,4 Diclorophenoxiaxetic

ADN

Acid deoxiribonucleic

Picloram

4-Amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxylic

Glufosinate

(RS)-2-Amino-4 (hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoic acid

MS

Murashige and Skoog

OD

Optical Density

w/v

Weight per volume

vi

MỞ ĐẦU
Biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trái đất tăng lên, dẫn đến các hiện tượng hạn hán,
lũ lụt xảy ra thường xuyên hơn, cùng với dịch bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự
sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất cây trồng. Điều này ảnh hưởng trực tiếp
đến đời sống của con người, đặc biệt là vấn đề an ninh lương thực, nhất là đối với con
người ở những khu vực thường xảy ra thiên tai hoặc có điều kiện tự nhiên khơng thuận
lợi. Trước tình hình đó, việc tạo ra các nguồn giống cây mới, nhất là cây lương thực có
năng suất cao, phẩm chất tốt, thích nghi rộng với các điều kiện mơi trường, càng trở
nên cấp thiết. Công nghệ chọn giống trước đây chủ yếu được tiến hành bằng phép lai
giữa các giống có các tính trạng khác nhau để thu được thế hệ con lai có tính trạng
mong muốn. Tuy nhiên phương pháp này có những hạn chế nhất định khiến tiềm năng
của nó bị giảm sút, chẳng hạn như thế hệ con lai bất thụ, hoặc chỉ giới hạn ở các cá thể
cùng loài. Chọn tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong
các phương pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo nói trên. Hơn
thế nữa, trong những năm gần đây, công nghệ sinh học thực vật đã đạt được một số
thành tựu khả quan, cho phép các nhà chọn giống tạo ra giống mới có nhiều phẩm chất
tốt từ những nguồn gốc khác nhau. Đặc biệt, công nghệ nuôi cấy mơ sẹo phơi hóa (ký
hiệu EC – embryogenic callus) khơng những có thể tạo ra những giống cây sạch bệnh,
mà cịn có thể nghiên cứu phát sinh hình thái phơi vơ tính, nhân sinh khối tế bào dịch
lỏng, ni cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể, tạo cây trồng chuyển
gen và bảo quản nguồn gen.
Trong lĩnh vực cây lương thực, bên cạnh lúa, ngơ và đậu tương, sắn là một lồi
đóng vai trị quan trọng góp phần ổn định nhu cầu lương thực của con người và giải
quyết vấn đề an ninh lương thực trên thế giới, sắn cũng là nguồn nguyên liệu quan
trọng cho các ngành công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học. Sắn được trồng
nhiều nơi trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Tuy nhiên, do kĩ thuật thâm canh khơng
đồng bộ dẫn đến tình trạng đất đai bị xói mịn, rửa trơi, kết hợp với các điều kiện môi
trường không thuận lợi, sâu bệnh ngày càng nhiều, nên sắn có sản lượng thấp và chất
lượng suy giảm. Vì vậy, để sản xuất cây sắn một cách bền vững thì cần phải tạo ra

1


được giống sắn sạch bệnh, năng suất cao và phải mang các đặc điểm thích hợp với
điều kiện mơi trường hiện tại.
Nhu cầu về sản lượng sắn ngày càng tăng cao trong khi diện tích trồng sắn ngày
càng giới hạn, khiến cho việc tạo giống tăng năng suất, sản lượng và chất lượng sắn củ
càng trở nên cấp thiết. Việc sản xuất sắn bằng các giải pháp công nghệ sinh học chính
là một trong các phương pháp hiệu quả nhất để giải quyết vấn đề này. Chính vì thế,
chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phơi hóa và khả năng
tái sinh cây hồn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (Manihot esculenta
Crantz)” với mục đích nghiên cứu như sau:
MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
- Tạo được lượng lớn nguồn nguyên liệu sắn vô trùng, phục vụ cho việc tạo mơ
sẹo phơi hóa.
- Xác định được mức độ tạo mơ sẹo phơi hóa và khả năng tái sinh từ mơ sẹo
phơi hóa.
- Thăm dị khả năng chuyển gen vào mơ sẹo phơi hóa thơng qua Agrobacterium
tumefaciens.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về
mức độ tạo mơ sẹo phơi hóa, khả năng tái sinh, khả năng tiếp nhận gen từ
Agrobacterium tumefaciens vào mơ sẹo phơi hóa của sắn (Manihot esculenta Crantz).
Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào cây sắn (M.
esculenta Crantz) nhằm tạo ra giống sắn mới có tính trạng mong muốn.

Đề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào thực
vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Cơng nghệ
thơng qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ

theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT.

2


CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây sắn
1. 1. 1. Nguồn gốc và phân loại
Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) là cây đóng vai trị quan trọng trong kinh tế
nơng nghiệp của nước ta. Nó khơng chỉ đóng vai trị cung cấp nguồn thực phẩm cho con
người, nguồn thức ăn cho chăn ni mà cịn là mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ chốt,
thu về nguồn ngoại tệ đáng kể cho đất nước [31].

Hình 1. Hình thái cây sắn [47]

Tất cả 98 loài thuộc chi Manihot đều sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh
đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới. Nguồn gốc thực sự của cây sắn vẫn chưa rõ
ràng [14]. Sắn thuộc họ Euphorbiaceae bao gồm 7200 loài, được đặc trưng bởi các hệ
thống tuyến mủ do các tế bào tiết mủ tạo thành. Hình thái của họ này rất đa dạng, từ
nhóm thân cao như cao su đến nhóm thân bụi, cũng như các nhóm thực vật có giá trị
kinh tế cao, như thầu dầu [19].

3


Sắn sống tự nhiên ở vùng nhiệt đới, phân bố phổ biến từ 33° vĩ bắc đến 33° vĩ
nam. Trong số 98 lồi đã được mơ tả, chỉ có sắn được trồng trên diện rộng vì giá trị
kinh tế của chúng. Sắn được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa
lý nơi chúng được trồng. Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yuca (theo tiếng Tây Ban
Nha) hoặc mandioca (tiếng Bồ Đào Nha), trong khi tại Brazin, chúng được chia thành

2 loại, sắn ngọt (sweet cassava) hay sắn đắng (bitter cassava) theo người trồng [19].
Về nguồn gốc của sắn vẫn chưa khẳng định được chính xác, tuy nhiên, với
những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định rằng sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới
của châu Mỹ La-Tinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây
5000 năm. Trung tâm phát sinh sắn ở Đông Bắc Brazin và một trung tâm khác ở Trung
Mỹ và Mexico. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ sắn đã được tìm
thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước cơng ngun ở Venezuela, và khoảng 2000
năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong khi đó, những lị nướng bánh sắn
phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước cơng ngun đã được tìm thấy ở phía Bắc
Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900-200 trước cơng nguyên trong
những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học
khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất
lâu đời [52], [53].
Sắn được người Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi lần đầu tiên vào giữa thế kỷ 16.
Trải qua thế kỷ 17 phát triển chậm chạp, sắn được du nhập vào đảo Bourbon và Ilede
(Pháp) vào các năm 1738-1739, và đưa sang Madagasca vào năm 1875, Xri lanca
(1786), Calcutta (1794) và một số nước phía đơng châu Phi như Zambiar (1799),
Uganda (1878). Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17, Việt Nam
và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ 18 [2].Tuy nhiên, mãi đến
thế kỷ 19, nghề trồng sắn và tiêu thụ mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật
chế biến ở Brazin bởi các nô lệ được phóng thích. Từ đó đến nay, diện tích, năng suất
và sản lượng sắn ngày một tăng [8].

4


1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn
Rễ sắn
Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại
làm giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ cọc mọc thẳng cắm xuống

đất sau đó các rễ phụ mọc ra. Cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ.
Rễ mọc ra từ hom thì đầu tiên mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất.
Rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hóa và dự trữ. Rễ đồng hóa thường cắm
sâu trong lịng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây
vững chắc. Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây
mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ một số rễ con được tập trung dinh
dưỡng phát triển thành củ. Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể
có hoặc khơng có cuống củ [19].
Thân cây
Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1-3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào
giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Thân sắn có
khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây.
Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân
phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân
sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của
vỏ và ngồi cùng là lớp biểu bìrất mỏng. Khi nhân vơ tính sắn người ta sử dụng các
đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngồi việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh
phải giữ cho lớp biểu bì khơng bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom
không bị mất nước [19], [62].
Lá sắn
Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá.
Cuống lá dài từ 3-30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tùy theo giống (màu vàng, xanh
vàng, hồng, đỏ tươi...). Phiến lá thường chia 5-7 thùy nhưng cũng có khi khơng chia

5


thùy. Lá của những cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chia thùy
không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thùy của phiến lá thường giảm.
Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mơ dậu, tầng

mơ hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm và có
khoảng 700 lỗ/mm2 [8], [62].
Hoa sắn
Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ phân
cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do khơng có sự phân hóa hoa hoặc do
mầm hoa rụng đi. Những cụm sinh ra từ những cành thấp thường rụng sớm. Cụm hoa
gồm một trục dài 2-10 cm và các trục bên hợp lại thành chùy [8], [19].
Hoa cái có năm lá đài và có màu sặc sỡ, ngồi rìa có lơng. Giữa hoa cái có một
bầu hoa có 6 cánh, chứa 3 lá nỗn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vịi nhụy ngắn với đầu
nhụy uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn ở bên
trong và có lơng ở phía ngồi. Có khoảng 8-10 nhị đực xếp thành hai vòng và mọc lên
từ các thùy của một đĩa phía dưới. Bao phấn mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày dính, màng
ngồi hạt phấn có gai nhỏ.
Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều
hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ
phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa đực
thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào nửa cuối buổi chiều.
Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở được khoảng 2 giờ và mở hoàn tồn
trước khi hoa nở 1 giờ; sau đó phát tán nhờ gió hoặc cơn trùng với phạm vi thụ phấn là
trong khoảng 30 cm. Tuổi thọ của hạt phấn là một tuần còn thời gian tiếp nhận hạt
phấn của đầu nhụy trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang
màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất là sau 1 ngày. Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ
tinh kéo dài từ 8-19 giờ [8], [19].

6


Quả và hạt
Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1-1,5 cm. Quả có 3 ngăn,
được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa một hạt. Màu sắc quả thường

biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng đến lục hay đỏ tía khá đậm. Cuống quả phình lên ở chỗ
tiếp xúc với quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ cịn lại trục giữa của quả.Hạt sắn hình
trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu nâu đỏ trên
nền màu kem hoặc xám nhạt [8], [19].
1.1.3. Giá trị của cây sắn
Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới bên cạnh gạo và ngô
[26]. Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84-87% trọng lượng khô, là nguồn
cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới
cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới.Trong củ sắn cũng có một số loại axit amin chứa
lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein, chất béo, một số chất
khoáng (P, K, Mg,...) và vitamin (B1, B2,...) [22], [25], [30]. Tại Châu Á, Châu Phi và
Mỹ Latinh, có khoảng 600 triệu người có cuộc sống phụ thuộc vào cây sắn. Ở những
khu vực này, cây sắn được coi là cây lương thực xóa đói giảm nghèo quan trọng do là
cây trồng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng và có khả năng chịu hạn cao [8]. Ở
Đông Nam Á, sắn là một nguồn năng lượng chính cho người dân như tại Campuchia,
Lào và Myanmar [12].Củ sắn cũng là nguồn thức ăn quan trọng để sản xuất thức ăn
chăn nuôi [8].
Lá sắn chứa nhiều chất dinh dưỡng với hàm lượng protein cao hơn trong củ từ 67% trọng lượng tươi và 21-25% trọng lượng khô. Hàm lượng lipit ở lá gấp 6 lần ở củ.
Ngoài ra, lá sắn chứa nhiều canxi, carotene, vitamin B1, vitamin C, nhiều axit amin
không thay thế đặc biệt lizin và triptophan nhưng thiếu methionin. Lá sắn được ủ chua
làm thức ăn cho trâu, bò,… hoặc thức ăn tươi cho cá, tằm,… [35].
Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn cịn
góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp công
nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc gia có khả
năng phát triển ngành cơng nghiệp từ sắn [8], [12]. Tinh bột sắn được dùng để sản xuất
các loại bánh, kẹo, bột ngọt, mì ăn liền, làm phụ gia dược phẩm và đặc biệt, sắn được
7


sử dụng làm nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất cồn sinh học đem lại hiệu suất

và hiệu quả kinh tế cao.Thân sắn dùng để sản xuất nấm, nguyên liệu cho công nghiệp
xenlulozơ và nguyên liệu để sản xuất một số sản phẩm khác như màng phủ sinh học,
chất giữ ẩm, bao bì và phụ gia dược phẩm [8].
Tại Việt Nam, cây sắn đang được trồng rất rộng rãi và là cây lương thực được
xếp vào hàng thứ ba sau lúa và ngô. Cây sắn tạo ra lượng tinh bột cao nhất trong các
cây lương thực, chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, và làm hàng xuất khẩu
có giá trị kinh tế cao.
1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng sắn trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Sắn được trồng trên 100 nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp châu
Á, châu Phi và Mỹ Latin. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều
hướng gia tăng từ năm 1995 đến 2011 (Hình 2).
Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

20

300

250

200

10

150

Sản lượng

Diện tích, năng suất

15

100
5
50

0

0
1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

Hình 2. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2011 [66]

Năm 2011, sản lượng sắn thế giới đạt 252,2triệu tấn củ tươi so với 231,76triệu
tấn năm 2010 và năm 1995 là 161,79 triệu tấn. Nước sản xuất sắn nhiều nhất là
Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu

8


tấn). Nước có năng suất sắn cao nhất là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan
(21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,87 tấn/ha. Việt Nam
đứng thứ mười về sản lượng sắn trên thế giới (9,38 triệu tấn) (hình 3) [65].

Hình 3. Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65]

1.2.2.Ở Việt Nam
Việt Nam đứng thứ mười về sản lượng sắn trên thế giới (9,38 triệu tấn). Quy
mô trồng sắn ở Việt Nam khá nhỏ, chủ yếu ở vùng núi và trung du, với diện tích trung
bình khoảng 0.27 ha/ thửa, trong đó, quy mơ tại khu vực Đơng Nam Bộ lớn nhất (0,85
ha) trong khi tại khu vực miền núi phía Bắc chỉ khoảng 0,2 ha. Ở miền Bắc, sắn được
trồng chủ yếu ở các khu vực có địa hình đồi núi và khoảng 68 % diện tích trồng sắn
trên đất đá và tương ứng khoảng 12% trên đất cát [2]. Ở Nam Việt Nam sắn được
trồng chủ yếu trên đất cát xám, có địa hình tương đối bằng phẳng và nghèo chất dinh
dưỡng. Vùng duyên hải miền Trung và Đơng nam bộ chiếm hơn 60% diện tích trồng
sắn của tồn bộ khu vực phía nam, trong đó, hơn 30% sắn được trồng ở Tây Nguyên
và các tỉnh Đồng Nai, Bình Phước thuộc khu vực Đơng Nam Bộ (Bảng 1).
Bảng 1. Diện tích trồng sắn tại Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66]

9


Sản lượng sắn ở Việt Nam bị suy giảm trong suốt những năm 1980-1990,
nhưng trồng sắn đã tăng mạnh trong những năm gần đây (2000-2012). Sản lượng sắn
năm 2000 chỉ đạt 1,99 triệu tấn đã tăng gấp 5 lần, đạt 9,74 triệu tấn vào năm 2012
(Bảng 2). Sự nhảy vọt này là do có sự tăng mạnh cả diện tích trồng (từ 237600 ha năm
2000 lên 550600 ha năm 2012) và năng suất (từ 8,66 tấn/ha năm 2000 lên 17,7 tấn/ha
năm 2012). Sản lượng sắn ở các vùng miền Trung và khu vực Đông Nam Bộ chiếm
đến 78% tổng sản lượng cả nước, đặc biệt là các tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắk
Nông,Đắk Lắk ở Tây Nguyên; Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận ở khu
vực Đơng Nam Bộ; và các tỉnh Phú Yên,Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định ở khu
vực duyên hải miền trung (Bảng 2).
Bảng 2. Sản lƣợng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66]

Việt Nam đạt được tiến bộ nhanh trong việc áp dụng công nghệ mới trong chọn
tạo và nhân giống cây trồng mới ở châu Á. Tiến bộ nàylà kết quả của nhiều yếu tố,

trong đó sự thành công trong lai tạo giống và ứng dụng công nghệ mới là những yếu tố
góp phần chính. Sự kết hợp giữa sản xuất trên diện rộng và phát triển các ngành công
nghiệp chế biến tinh bột và ethanol đã tạo ra nhiều công ăn việc làm, tăng xuất khẩu,
thu hút đầu tư nước ngồi và góp phần cơng nghiệp hóa và hiện đại hóa một số khu
vực nơng thơn. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN & PTNT) đã có kế
hoạch duy trì diện tích sắn khoảng 450000 ha 2011-2015, và những nỗ lực đang được
thực hiện để tăng năng suất củ tươi 16,9-20 tấn/ha vào năm 2011 và 23-24 tấn/ha vào
năm 2015 bằng cách sử dụng công nghệ mới, đặc biệt là trong lai tạo (Bộ NN & PTNT
7256/TB-BNN-VP 25/12/2009) [26].
Việt Nam gần đây đã phát triển một chính sách E10 mà sẽ yêu cầu sản xuất từ
100 đến 150 triệu lít mỗi năm. Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt "Đề án phát triển
nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025", nhằm mục đích để sản
10


xuất nhiên liệu sinh học và một phần thay thế nhiên liệu truyền thống. Điều này sẽ
đóng góp vào an ninh năng lượng và bảo vệ mơi trường. Dầu khí Việt Nam có kế
hoạch xây dựng ba nhà máy sắn dựa trên ethanol ở miền Bắc (Phú Thọ), miền Trung
(Quảng Ngãi) và miền Nam Việt Nam (Bình Phước) với tổng cơng suất hàng năm dự
kiến khoảng 300 triệu lít mỗi năm (Bảng 3). Sự kết hợp rộng rãi giữa sản xuất sắn
tươi, chế biến sắn tinh bột và sản xuất ethanol đã tạo ra nhiều công ăn việc làm, tăng
xuất khẩu, thu hút đầu tư nước ngồi, góp phần cơng nghiệp hóa và hiện đại hóa một
số khu vực nơng thôn [68].
Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol và rƣợu từ sắn của Việt Nam năm 2012 [67]

Tên nhà máy

Công suất
(triệu lít/ năm)

Tên nhà máy

Cơng suất
(triệu lít/ năm)

Ethanol Đại Tân
Ethanol Dung Quất
Ethanol Bình Phước
Ethanol Tam Nơng

125
100
100
100

Ethanol Tùng Lâm
Alcohol Lam Sơn
Alcohol Bình Tây
Đồng Xanh

70
25
60
70

Tổng cộng

650 triệu lít/ năm

1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được khởi nguồn từ học thuyết tế bào,
được nêu bởi Schleiden và Schwan vào năm 1983. Đến năm 1902, Haberlandt đã đưa
học thuyết trên vào thực nghiệm với nỗ lực tạo các phôi nhân từ các tế bào soma từ lá
một số cây một lá mầm, tuy nhiên, những thí nghiệm của ông đã thất bại bởi các cây
một lá mầm rất khó ni cấy và các tế bào này đã mất khả năng tái sinh. Sau đó, Kotte
và Robins (năm 1922)đã lặp lại thí nghiệm này với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một
cây hịa thảo. Trong mơi trường lỏng gồm có muối khống và glucose, đầu rễ sinh
trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Thành cơng bước đầu của thí
nghiệm này đã mở ra giai đoạn phát triển mạnh mẽ của công nghệ nuôi cấy mô tế bào
với thành công của White(1934) khi nuôi cấy thành công rễ cây cà chua
(Lycopersicum esculentum) trong mơi trường lỏng chứa muối khống, glucose và nước
chiết nấm men. Sau đó, White đã thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại

11


vitamin nhóm B: thiamine (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid nên việc nuôi cấy
đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau.Sau khi Went
và Thimann phát hiện chất điều hòa sinh trưởng (hormone) đầu tiên làacid-βindolacetic (IAA) và kết tinh được chất này, Gautheret cùng với Nobercourt (năm
1939) đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian vơ hạn của mô
sẹo cà rốt (Daucuscarota) trên một môi trường rắn bằng thạch, bằng cách cấy chuyền 6
tuần một lần [16].
Giai đoạn 1941-1957 là thời kì phát triển mạnh của các chất điều hòa sinh
trưởng, khởi đầu là phát hiện tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong ni
cấy phôi họ cà và cà rốt [11]. Nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin được
nghiên cứu và tổng hợp thành công như α-napthil acetic acid (NAA) và 2,4-dichloro
phenoxy acetic (2,4-D), giúp cho việc tạo mô sẹovà phân chia tế bào thành công ở
nhiều đối tượng thực vật trước đây rất khó ni cấy, tạo ra những bước tiến rất quan
trọng cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy mô, tế bào. Năm 1955, kinetin đầu
tiên là 6-furfurylaminopurine được phân lập, gộp với các chất có hoạt tính tương tự

được phát hiện sau này thành nhóm cytokinin với chất đầu tiên được tách từ thực vật
bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô [15], [40], [58].Năm 1962, Skoog và Murashige công
bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi
cấy đối với việc hình thành các cơ quan của mơ sẹo thuốc lá và được xác nhận trên
nhiều cây khác nhau [43]. Thành công của Skoog và Murashige dẫn đến nhiều phát
hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật [16].
Trong thời gian từ 1954 đến 1959, kĩ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, được
phát triển bởi Muir, Hildebrandt và Riker; Nickell (1956); Melches và Beckman
(1959). Năm 1960, Bergman đã thu được một huyền phù khơng có tế bào dính cụm mà
gồm hầu hết là tế bào đơn có khả năng sống, phân chia và tái tạo mô sẹo. Cùng với
Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo dựng được một cây hoàn chỉnh từ
một tế bào, chứng minh tính tồn năng của tế bào thực vật. Khả năng ni cấy tế bào
thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây
hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo dòng tế bào đột
biến, các dòng tế bào siêu sản xuất (over-production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và
khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao [32].
12


Năm 1960, Cooking đã dùng cellulase để phân hủy vỏ cellulose của vỏ tế bào
thực vật, thu protoplast, mở đầu cho các kĩ thuật lai và dung hợp tế bào vào những
năm 1970 [20]. Bên cạnh đó, khả năng biến nạp của tế bào thực vật được đề xuất vào
năm 1965 cho dù chúng gây ra nhiều tranh cãi về khả năng xâm nhập và biểu hiện
cũng như tồn tại lâu dài của ADN ngoại lai. Nhờ các plasmid, hàng loạt gene ngoại lai
được chuyển vào nhiều họ thực vật. Các phương pháp để đưa gene ngoại lai vào tế bào
thực vật cũng trở nên đa dạng với những kĩ thuật hiện đại như sử dụng điện
(electroporation), kĩ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene
transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang được các phịng thí nghiệm trên thế
giới ứng dụng và phát triển bên cạnh kĩ thuật chuyển gen truyền thốngbằng vi khuẩn
Agrobacterium [16].

Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân
giống cây trồng và phục tráng cây trồng với thí nghiệm của Morel (1960) trên các lồi
địa lan (Cymbidium). Với phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục
tráng, tạo các dịng vơ tính không bị nhiễm bệnh virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị
với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao như
chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đóng góp to
lớn cho nông nghiệp thế giới.
Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực
tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học
và vào nghiên cứu lí luận di truyền thực vật bậc cao. Các hiểu biết cơ bản về đời sống
của mô và tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin,
chất sinh trưởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều
khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề được
chuẩn bị trong giai đoạn trước.
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương
trình chọn giống, nhân giống hiện đại. Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên
cứu để giải quyết trong những năm tới, ni cấy mơ thực vật ở Việt Nam đã thốt khỏi
giai đoạn phơi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lí luận sinh
học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp.

13


1.4. Nguyên lý và ứng dụng của phƣơng pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật
1.4.1. Cơ sở lí thuyết
Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô-tế bào là học thuyết về tính tồn năng
(totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt (1902), tất cả các tế bào của cây đều mang
toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào
đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh
được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng

trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống
vô cùng lớn [42].
Quá trình phát sinh hình thái trong ni cấy in vitro thực chất là kết quả của các
q trình biệt hóa và phản biệt hóa. Tất cả tế bào trong cơ thể thực vật đều bắt nguồn
từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm
nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Ngược lại với q
trình biệt hóa, phản biệt hóa là q trình tế bào đã phân hóa chuyển ngược về dạng
phơi sinh và tái phân chia.Bản chất của quá trình này là một q trình hoạt hóa, ức chế
các gen. Trong q trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số
gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt
động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử
ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật ln
được hài hịa. Mặt khác, khi nằm trong khối mơ bình thường, tế bào luôn bị chi phối
bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế
bào xung quanh khơng cịn nữa thì các gen được hoạt hóa và q trình phân hóa sẽ xảy
ra theo một q trình định sẵn [9].
Trong mơi trường ni cấy phù hợp, có bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, tế
bào soma được kích thích giải biệt hóa thành tế bào toàn năng và phân chia tế bào tạo
thành cụm mơ sẹo. Sự hình thành mơ sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân
chia tế bào và biệt hóa. Sự phát sinh mơ sẹo phụ thuộc chủ yếu vào tình trạng sinh lí
của mơ được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sau khi tế bào phân chia và tăng
sinh khối, quá trình biệt hóa bắt đầu và có sự xuất hiện các con đường trao đổi chất
14


dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [17]. Sự biệt hóa tế bào hình
thành chất liệu tạo nhu mơ các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mơ phân
sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ [29].
Khả năng hình thành chồi phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và hàm lượng các

chất điều hịa sinh trưởng, trong đó, tỷ lệ cytokinin/auxin từ 10–100 đóng vai trị quyết
định. GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi,
tuy nhiên sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên mơi trường khơng có chất kích
thích sinh trưởng hoặc có cytokinin và khơng có auxin . Ngược lại, q trình tạo rễ cần
auxin, khống, nhiệt độ, ánh sáng. Để tạo ra rễ thường dùng phlorolgucinol + IBA có
hiệu quả hơn chỉ dùng auxin [6].
1.4.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp ni cấy mơ – tế bào có những ưu điểm đáng lưu ý như (1) Cây
con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng
suất cao; (2) tạo được cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng
đã chọn lọc; (3) Tạo được dịng thuần của các cây tạp giao; (4) Tạo được cây có
genotip mới (đa bội, đơn bội); (5) Bảo quản và lưu giữ tập đồn gen; (6) Có khả năng
sản xuất quanh năm; (7) Có thể nhân nhanh nhiều cây khơng kết hạt trong những điều
kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém và (8) Hệ số nhân giống cực kì cao
(thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36-1012/năm), rút ngắn
thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà.Trong công tác giống cây trồng, vấn
đề chất lượng và số lượng giống được quan tâm hàng đầu. Bằng phương pháp nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn tồn sạch virus bởi (1)
Đỉnh sinh trưởng khơng có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng
thâm nhập; (2) Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin
khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus và (3) Q trình phân chia của tế
bào phơi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus[16], [17].
Tuy nhiên, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mơ – tế bào cũng có những
nhược điểm nhất định, trong đó yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao, nên
thường chỉ được áp dụng đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng
phương pháp khác. Hơn nữa, cây con có kích thước nhỏ, địi hỏi phải có chế độ chăm

15

sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm cũng là một trở ngại lớn. Bên cạnh đó, khả
năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền mơ sẹo hay huyền phù tế bào nhiều lần và
cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt trong q trình chuyển cây ra thực địa.
Phương pháp nuôi cấy mô-tế bàođang được sử dụng để phục vụ cho những mục đích
nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dịng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng
khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc
nhóm cây thân thảo, các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép
trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh và nhiều giống cây kinh tế khác.
1.4.3. Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng
có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng
hình thành điểm sinh trưởng phụ. Qua đó, cũng có hai phương pháp tương ứng để tái
sinh cây con, bao gồm tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng và tái sinh gián tiếp thơng
qua giai đoạn hình thành mô sẹo. Trong tái sinh trực tiếp, cây con được tạo thành bởi
quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân
chia và tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh
chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài. Cây con tạo ra theo con đường này hoàn
toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ. Ngược
lại, tái sinh gián tiếp không tạo thành cây ngay mà thơng qua q trình phát triển thành
khối mơ sẹo. Hệ số nhân của hướng này vô cùng lớn bởi từ một khối mơ sẹo có thể tạo
ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kĩ thuật tạo phôi soma
hoặc chế ra hạt giống nhân tạo. Tuy nhiên, nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác
với cây mẹ về mặt di truyền do q trình phát sinh và phát triển của mơ sẹo thường
xuất hiện đột biến gen, gây ra bởi hiện tượng nội nguyên phân, là hiện tượng nhân đôi
nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào. Đột biến tuy khơng có lợi cho việc duy trì
ngun trạng những đặc tính di truyền trong q trình tạo giống nhưng lại chính là đối
tượng tìm kiếm trong q trình cải tạo giống. Ngồi việc cung cấp những đột biến tự
nhiên, mơ sẹo cịn là đối tượng lí tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác
nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen.

16