Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Chu Thanh Bình

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2012

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Chu Thanh Bình

NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN PHƢƠNG NHUỆ

Hà Nội – Năm 2012

2


Lời cảm ơn

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Lê Gia Hy, TS. Nguyễn
Phương Nhuệ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức,
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phí Quyết Tiến – trưởng phịng và các cán bộ
Phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt q trình nghiên cứu.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các thày cô giáo Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh
vật học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo
điều kiện cho tơi hồn thành khóa học này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt
đới Việt – Nga đã tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học và bản luận văn.
Tơi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy
trình sản xuất vancomyxin hydrochlorid cơng suất 1 kg/mẻ” mã số 032/2012/HĐĐTCNHD, thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc
gia phát triển cơng nghiệp Hóa dược đến năm 2020”.
Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người ln
bên tơi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu.

Chu Thanh Bình

3


MỤC LỤC
Lời cảm ơn …………………………………………………………...............
Mục lục ……………………………………………………………….……...
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt……………………………………....
Danh mục các bảng …………………………………………………………..
Danh mục các hình vẽ, đồ thị………………………………………………...
MỞ ĐẦU ……………………………………………………………...……..
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………...….....

1

1.1. Chất kháng sinh vancomyxin …………………………………………

1

1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin………………………….....

1

1.1.2. Đặc tính của vancomyxin.......................................................................

2

1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin…………………………………

4

1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin………………………..

7

1.2. Streptomyces orientalis và các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp
vancomyxin …........................................................................................

8

1.2.1. Streptomyces orientalis..........................................................................

8

1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn………………………………..

9

1.2.3. Nghiên cứu qui trình cơng nghệ sản xuất vancomyxin ……………….

11

1.3. Nghiên cứu duy trì và nâng cao hiệu suất chủng giống sản xuất
vancomyxin………………………......………………………………...

14

1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất vancomyxin……...……….............

18

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………..

21

2.1. Vật liệu .....………………... ……………………………………………

21

2.1.1. Chủng giống vi sinh vật ………………………………………….........

21

2.1.2. Hoá chất …………………………………………………………….....

21

2.1.3. Thiết bị ………………………………………………………………...

21

2.1.4. Môi trƣờng ……………………………………………………………

22

2.1.5. Các dung dịch đệm

24

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ……...……………………………………....

24

2.2.1. Bảo quản giống ………………………………………………………..

24

2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học …………………………………...............

25

4


2.2.3. Xác định sinh khối ………………………………………………….....

25

2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh………………………………………....

25

2.2.5. Phƣơng pháp lên men.............................................................................

26

2.2.6. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm

28

2.2.7. Thu nhận tế bào trần xạ khuẩn…………………………………………

28

2.2.8. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh bằng xử lý UV và Nmetyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)…………………………...

29

2.2.9. Xây dựng đƣờng cong sống sót………………………………………..

30

2.2.10. Xác định sự biến đổi hình thái khuẩn lạc và hoạt tính kháng sinh…. .

30

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………….....

32

3.1. Đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912.................

32

3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy……………………………………………………..

32

3.1.2. Đặc điểm hình thái…………………………………………………… .

33

3.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912..............

34

3.3. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912………...

36

3.3.1. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S.orientalis 4912………………

36

3.3.2. Nâng cao HTKS của chủng S. orientalis 4912 bằng phƣơng pháp gây đột
biến
dùng
tia
UV
và
N-metyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin
(MNNG)……………………………………………………………………

40

3.4. Một số đặc điểm sinh học của biến chủng Streptomyces orientalis 491281- 61……………………………………………….....................

46

3.5. Tối ƣu hóa quy trình lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61….

48

3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống……………………………………...

48

3.5.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men………………………………………....

48

3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến
chủng S. orientalis 4912-81-61……………………………………

48

3.5.4. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S.
orientalis 4912-81-61 trong thiết bị lên men Bioflo………….

57

KẾT LUẬN .....................................................................................................

58

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………..

59

5

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Phổ kháng khuẩn của vancomyxin

3.1

Đặc điểm ni cấy của chủng S. orientalis 4912

32

3.2

Hoạt tính kháng khuẩn của chủng S. orientalis 4912

35

3.3

Ảnh hƣởng của nồng độ lysozym tới khả năng tạo TBT của chủng S.
orientalis 4912

38

3.4

Ảnh hƣởng của nồng độ glyxin tới khả năng tạo TBT của chủng S.
orientalis 4912

39

3.5

Ảnh hƣởng của nồng độ MNNG tới khả năng sống sót của chủng S.
orientalis 4912

41

3.6

Ảnh hƣởng của pH khi xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của
chủng S. orientalis 4912

41

3.7

Ảnh hƣởng của thời gian xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của
chủng S. orientalis 4912

42

3.8

Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi xử
lý UV và MNNG

44

3.9

Kết quả lên men các biến chủng sau khi đột biến

45

3.10

Một số đặc điểm sinh học của biến chủng S. orientalis 4912-81-61

47

3.11

Khả năng sinh trƣởng của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 trên
một số môi trƣờng

48

3.12

Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin
của biến chủng S. orientalis 4912-81-61

49

3.13

Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin
của biến chủng S. orientalis 4912-81-61

50

7

6


3.14

Ảnh hƣởng của bột đậu tƣơng, glucoza và đƣờng saccaroza tới khả
năng sinh tổng hợp vancomyxxin của biến chủng S. orientalis 491281-61

51

3.15

Ảnh hƣởng của CaCl2 đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của
biến chủng S. orientalis 4912-81-61

52

3.16

Ảnh hƣởng của CuSO4 đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của
biến chủng S. orientalis 4912-81-61

52

3.17

Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp
vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61

54

3.18

Ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới sinh trƣởng và sinh tổng hợp
vancomyxin bởi biến chủng S.orientalis 4912-81-61

56

7


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Cấu trúc hóa học của vancomyxin

3

1.2

Các bƣớc tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin

6

1.3

Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn

10

3.1

Khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 trên MT 48

33

3.2

Hình dạng bào tử của chủng S. orientalis 4912

33

3.3

Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S. orientalis 4912

34

3.4

Hoạt tính kháng sinh kháng B. subtilis ATCC 6633 của chủng S.
orientalis 4912

35

3.5

Tế bào trần chủng S. orientalis trên kính hiển vi

36

3.6

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tạo thành TBT của
chủng S. orientalis 4912

37

3.7

Ảnh hƣởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng tạo thành TBT

của chủng S. orientalis 4912

37

3.8

Khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử của chủng 4912 sau khi
xử lý UV và MNNG

40

3.9

Hình dạng khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia
UV tế bào trần

43

3.10

HTKS của biến chủng nhận đƣợc sau khi gây đột biến tế bào trần

45

3.11

Khuẩn lạc của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 (A) và chủng S.
orientalis 4912 (B)

46

3.12

Ảnh hƣởng của độ thơng khí tới khả năng sinh tổng hợp vancomyxin
của biến chủng S. orientalis 4912-81-61

55

3.13

Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin bởi biến
chủng S. orientalis 4912-81-61 trên thiết bị Bioflo 110

57

8


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BT

Bào tử

CKS

Chất kháng sinh

CMC

Cacboxyl metyl xenluloza

ĐKVVK

Đƣờng kính vịng vơ khuẩn

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

KS

Kháng sinh

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

MNNG

N-metyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidin

MT

Mơi trƣờng

SK

Sinh khối

SKK

Sinh khối khơ

SS

Tế bào sống sót

TBT

Tế bào trần

VSV

Vi sinh vật

9


MỞ ĐẦU

Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nƣớc nhập khẩu thuốc nhiều nhất
thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, trong đó kháng sinh chiếm thị phần
tiêu thụ cao. Dự kiến đến năm 2020, cả nƣớc sẽ cần mỗi năm hơn 1,5 tỷ USD tiền
thuốc, trong đó kháng sinh chiếm 30%.
Theo Quyết định số 61/2007/QĐ- TTg ngày 07/5/2007 của Thủ tƣớng Chính

phủ phê duyệt “Chương trình Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia
phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020” thì mục tiêu của chƣơng trình là:
“Nghiên cứu tạo ra những cơng nghệ có chất lƣợng cao phù hợp với điều kiện sản
xuất ở trong nƣớc, làm chủ và ứng dụng công nghệ hiện đại của nƣớc ngoài, tiến tới
chủ động việc sản xuất thuốc chữa bệnh trong nƣớc”. Do vậy, việc nghiên cứu ứng
dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển
sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết.
Vancomyxin là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo ra các loại kháng sinh
bán tổng hợp với đặc tính chữa bệnh cao và chọn lọc. Chất kháng sinh này đƣợc
sản xuất nhờ xạ khuẩn Streptomyces orientalis. Việc nâng cao khả năng sinh kháng
sinh vancomyxin của chủng và hạ giá thành sản phẩm là rất cần thiết. Do vậy,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng
hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis” với các nội dung chính nhƣ
sau:
1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S. orientalis
2. Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S. orientalis.
3. Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng và điều kiện lên men chủng S. orientalis.

10


Đề tài được thực hiện tại Phịng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mục tiêu:
Nâng cao hoạt tính kháng sinh vancomyxin của xạ khuẩn S. orientalis 4912
hƣớng tới sản xuất kháng sinh này phù hợp với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và điều
kiện mơi trƣờng khí hậu của Việt Nam.

11

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN
1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin
Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, đƣợc Eli
Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S. orientalis phân
lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh ra [45]. Ban đầu CKS này đƣợc gọi là hợp
chất 05865, nhƣng sau đó đã đƣợc đặt tên là vancomyxin (do bắt nguồn từ
“Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”). Năm 1958, CKS này đƣợc đƣa vào điều trị
thử nghiệm trên ngƣời. Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đƣa vancomyxin vào sử
dụng rộng rãi trong các bệnh viện. Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin là
metixilin đƣợc đƣa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm
xuống trong một thời gian. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S.
auureus kháng metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh
glycopeptit đƣợc lựa chọn trong phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn
kháng nhiều loại KS thơng dụng gây ra. Lúc đó vancomyxin đƣợc ví nhƣ một loại
thần dƣợc hay phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm
trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin gây nên. Vancomyxin đã
mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng kháng penixilin của
các chủng Staphylococcus. Sau khi những nghi ngờ này đƣợc dẫn chứng bằng
những số liệu cụ thể thì liệu pháp này đƣợc điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22],
[28], [36], [56]. Vancomyxin đƣợc sử dụng trong vòng hơn 30 năm mà khơng có
những dẫn chứng đáng kể nào về sự kháng thuốc. Nhƣng sự lạm dụng trong việc
dùng vancomyxin đã làm con ngƣời phải đối mặt trƣớc một thực tế là sự xuất hiện
và gia tăng ngày càng nhiều của các chủng vi khuẩn kháng lại CKS từng đƣợc xem
nhƣ hy vọng cuối cùng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm hiểm nghèo. Chủng vi
sinh vật kháng vancomyxin đầu tiên đƣợc cơng bố vào cuối những năm 1980 và sau
đó số lƣợng này tăng lên không ngừng. Do sự xuất hiện của những chủng vi sinh

12


vật kháng vancomyxin, nhu cầu tìm kiếm các CKS thay thế với mục đích ngăn chặn
mối hiểm họa cho sức khỏe cộng đồng luôn luôn đƣợc thúc đẩy. Tuy nhiên, kể từ
khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomyxin đã ln lơi cuốn
sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác
nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học chủ yếu, từ đó biến đổi
bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế
với những đặc tính ƣu việt [37], [52], [58].
Dạng vancomyxin HCl đầu tiên đã đƣợc Eli Lilly đƣa ra thị trƣờng dƣới tên
thƣơng mại là Vancoxyn. Giấy chứng nhận quyền sử dụng sản phẩm này hết hạn
vào đầu những năm 1980. Ngày nay, các dạng thuốc mang đặc tính chung của
vancomyxin đƣợc đƣa ra dƣới nhiều tên thƣơng mại khác nhau. Năm 2004, Eli Lilly
đã đăng ký bản quyền cho Vancoxyn với ViroPharma tại Mỹ, Flynn Pharma tại Anh
và Aspen Pharmacare tại Úc [58]. Vancomyxin không những là một loại thuốc
kháng sinh sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng rất có hiệu quả, mà cịn là nguyên liệu
cơ bản để nghiên cứu tạo các loại kháng sinh bán tổng hợp đang rất đƣợc quan tâm.
Ngày nay, tầm quan trọng của vancomyxin vẫn đƣợc khẳng định, chúng đƣợc sử
dụng rộng rãi trong các bệnh viện khi kết hợp với các CKS nhóm - lactam [10],
[69]. Cho đến nay, trên thị trƣờng ít nhất đã có 10 biệt dƣợc chứa vancomyxin do
nhiều hãng thuốc nổi tiếng trên thế giới sản xuất nhƣ: Diatraxin (Dista, Tây Ban
Nha), Hanomyxin (Samjin, Hàn Quốc), Lyphoxyn (Fujisawa, Mỹ), Vancoxyn
(Lilly, Mỹ), Vancoxyna (Lilly, Mỹ), Vancoled (Lederle, Mỹ), Vancor (Andria, Mỹ),
Vancolin, Vancomyxin (Dakota Pharm, Pháp), Voncon (Lilly, Mỹ) [72].
1.1.2. Đặc tính của vancomyxin
Vancomyxin có cơng thức tổng quát C66H75Cl2N9O24. Trong phân tử có chứa
một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học đƣợc thể hiện ở hình 1.1 [9],
[16]. Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên
lõi glycol và các trung tâm cịn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58]. Cấu trúc

hóa học lập thể quyết định cơ chế hoạt động của vancomyxin. Vancomyxin có một
chuỗi hexapeptit đã glycozyl hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại nhƣ chloro-β-

13


hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin, N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành
bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của vancomyxin [58], [71]
Trọng lƣợng phân tử của vancomyxin là 1449,3 Da. Các phân tử
vancomyxin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomyxin là một chất vơ định
hình, khơng màu sắc và có tính chất lƣỡng tính [40]. Vancomyxin ở dạng clohydrat
hòa tan rất tốt trong nƣớc, hòa tan vừa phải trong methanol, hịa tan ít trong rƣợu
bậc cao, clorofoc, etylaxetat, butylaxetat, axeton và este. Giá trị pKa của
vancomyxin là 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7. Theo những phân tích cơ bản đã chỉ
ra rằng phân tử vancomyxin chứa khoảng 1,17% nitơ và 4,26% clo. Vancomyxin
bền trong nƣớc ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37oC trong 6 ngày, sau 6 ngày khả năng
ức chế vi khuẩn còn 10%. Ở nhiệt độ phòng (khoảng 22oC) độ bền sẽ bị giảm sau 26 ngày. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ nâng nhẹ (trên 22oC) thì sự
phân hủy có thể quan sát đƣợc [4], [40]. CKS này có thể hịa tan trong nƣớc tại pH
7 (khoảng 1 mg/ml) và hòa tan tốt hơn ở pH kiềm (khoảng pH 8,5 – 9,0).
Vancomyxin bền ở dạng rắn và trong dịch lỏng tại nhiệt độ lớn hơn 70oC
trong khoảng pH từ 2,5-9,0. Nhờ đặc điểm lƣỡng tính, vancomyxin phản ứng với
axit vô cơ nhƣ: HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác… [36], [40]. Vancomyxin có 3
hệ thống vịng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vịng thơm, 9 nhóm OH trong đó có 3 nhóm
phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7,2. Vancomyxin khác

14

với các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit khác bởi cấu trúc phức tạp. Sự khác biệt
này thể hiện trong cấu trúc của vancomyxin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ
4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai (nhƣ đƣờng glucoza …) để tạo nên các
vancomyxin bán tổng hợp có hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng.
Đây là hƣớng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ KS mới có
hoạt tính cao và chọn lọc [34], [58].
Theo “Sổ tay Kháng sinh” của Navashin, S.M. & Fomina, I.P., 1974, 1 mg
vancomyxin dạng sunphat chuẩn cần đạt 1007 đơn vị hay một đơn vị vancomyxin
dạng sunphat tƣơng đƣơng 0,993 mcg. Khi tiêm tĩnh mạch chuột nhắt trắng theo
chuẩn dƣợc, độ nhạy độc của vancomyxin HCl biểu hiện ở LD50 (liều gây chết
50% động vật thí nghiệm) đƣợc tìm thấy trong khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg.
Ngƣời ta thƣờng sử dụng vancomyxin khi biết hoặc nghi ngờ về khả năng
nhiễm trùng máu, hoặc sử dụng cho các bệnh nhân bị viêm xƣơng, viêm khớp,
nhiễm trùng da và mô mềm [4], [10], [56]. Tác dụng của vancomyxin cao hơn khi
kết hợp với các CKS khác (ví dụ KS nhóm β-lactam) trong điều trị một số loại vi
sinh vật có thể thay đổi cấu trúc thành tế bào để kháng lại vancomyxin [28], [58].
1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin
Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh
vật thơng qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào. Vị trí mà các tác nhân tấn cơng
vào thành tế bào là lớp peptidoglycan. Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các
điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Nếu khơng có lớp này hoặc vì một lý do nào đó
mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh
động, kết qủa tế bào bị chết [33]. Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của quá trình
sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]:
- Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các
bƣớc sinh tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế
bào chất. Sự ức chế các chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang
C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy tiền chất của tế bào chất. Đây là một cơ chế không

15

thƣờng xuyên xảy ra đối với một tác nhân kháng vi sinh vật bao gồm việc sử dụng
cơ chất thay vì điều khiển hoạt tính của enzyme sinh tổng hợp.
- Giai đoạn 2: Nhờ cấu tạo hình xoắn của phân tử mà gần đây ngƣời ta đã
phát hiện ra khả năng kháng vi sinh vật của vancomyxin tác động ngƣợc lại với sự
mẫn cảm penixilin. Ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, enzyme transglycosylaza bổ
sung các mảnh disacaryl pentapeptit để hình thành lớp peptidoglycan của tế bào.
Sau đó, enzyme transpeptidaza nối các peptit ở bên trong với các sợi của lớp
peptidoglycan ở bên ngoài bề mặt của màng tế bào. Đích tác dụng của vancomyxin
là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt động của
enzyme. Khi đó, phân tử vancomyxin có dạng hình chiếc cốc liên kết với ái lực cao
nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-DAlanin của cầu liên kết chéo peptit chƣa nối với pentapeptit.
- Giai đoạn 3: Liên kết của vancomyxin với chuỗi lipit-PP-Glc NACpentapeptit là liên kết vật lý tƣơng đối bền vững đã ngăn cản tác động tiếp theo của
transglycosylaza/transpeptidaza. Vancomyxin không tấn công đƣợc disacaryl
pentapeptit mà làm giảm các liên kết đồng hóa trị, giảm tính bền cơ học của lớp
peptidoglycan và làm cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải nhờ những thay đổi
xảy ra do áp suất thẩm thấu.
Vancomyxin có hoạt tính mạnh với các cầu khuẩn và vi khuẩn Gram (+)
nhƣ: Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus và xoắn
khuẩn (Bảng 1.2) [58], [62]. CKS này có khả năng tiêu diệt tốt vi khuẩn đang ở
trong giai đoạn sinh sản, pH tối ƣu là 8,0 và hoạt tính giảm mạnh khi pH dƣới 6,0.
Điều này đƣợc giải thích bởi hai nguyên nhân: một là do sự khác biệt của cấu trúc
thành tế bào giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Cấu trúc thành tế bào vi
khuẩn Gram (+) gồm có lớp peptidoglycan dầy, axit teichoic và axit teichoronic, có
thể có hoặc khơng có màng protein hoặc polysaccarit bao quanh. Trong khi đó
thành tế bào vi khuẩn Gram (-) gồm có lớp peptidoglycan mỏng, lipopolysacarit,
lipoprotein, photpholipit và protein. Trong các tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp
peptidoglycan và lớp màng bên trong đƣợc bao bọc bởi một lớp màng ngoài ngăn

16


chặn sự khuếch tán vancomyxin đến lớp peptidoglycan. Ngƣợc lại, lớp
peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+) đƣợc xác định trên bề mặt ngồi của thành tế
bào và do đó nó mẫn cảm với kháng sinh vancomyxin. Hai là có thể do phân tử
glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể hòa tan lớp lipit của màng tế bào
vi khuẩn Gram (-), do đó khó có thể xâm nhập đƣợc vào lớp bên trong của thành tế
bào [40], [58], [71]

Hình 1.2. Các bƣớc tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin [71]

17


Bảng 1.1. Phổ kháng khuẩn của vancomyxin [58], [62]
Vi sinh vật
Staphylococcus
aureus
Streptococcus
pyogenes
Streptococcus
viridians
Streptococcus
faecalis
Corynebacterium
diphtheria
Actinomyces
israeli
Bacillus

anthracis

Nồng độ ức chế
Vi sinh vật
tối thiểu (mcg/ml)
0,2 – 6,2
Haemophilus
influenza
0,2 – 0,3
Clostridium sp

Nồng độ ức chế tối
thiểu (mcg/ml)
100 và hơn 100

0,3 – 20

100 và hơn 100

0,3 – 30

Escherrichia
coli
Klebssiellae

0,3 – 1,0

Pasteurllae

100 và hơn 100

1,5 – 4,0

Shigellae

100 và hơn 100

2,5

Salmonella

100 và hơn 100

0,3 - 0,5

100 và hơn 100

Ngồi ra, vancomyxin cịn có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp ARN.
Mặt khác, cũng nhƣ penixilin, nó có thể tác dụng thẳng lên màng tế bào chất theo
cơ chế tác dụng giống nhƣ ristomyxin và baxitraxin. Có thể do cơ chế tác động kép
này mà sự kháng vancomyxin ít xảy ra. Những vi sinh vật nhạy cảm với
vancomyxin thƣờng bị tiêu diệt ở nồng độ từ 1-5 mcg/ml, kể cả những chủng kháng
metixilin [53]
1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin
Vancomyxin từng đƣợc xem nhƣ phƣơng thuốc cuối cùng, chỉ sử dụng sau
khi việc điều trị bệnh bằng các kháng sinh khác khơng có hiệu quả. Khơng lâu sau
khi đƣợc phát hiện, vancomyxin đƣợc xếp vào danh mục những loại dƣợc phẩm
hàng đầu và đƣợc đƣa vào dùng rộng rãi trong bệnh viện để điều trị các bệnh nhiễm
trùng nguy hiểm do các vi sinh vật kháng KS nhóm β-lactam gây nên [15], [58]
Vancomyxin đặc biệt có hiệu quả cao khi dùng trong điều trị các bệnh do

MRSA gây nên, vi khuẩn này là mối nguy hiểm với bệnh nhân cao tuổi, bệnh nhân
sau phẫu thuật và những ngƣời có hệ miễn dịch suy giảm [30]. Vancomyxin còn
đƣợc chỉ định để điều trị cho các bệnh nhân dị ứng với penixilin, các bệnh nhân

18


không thể sử dụng các loại thuốc nhƣ penixilin hoặc cephalosporin và sử dụng khi
những chủng vi sinh vật mẫn cảm với vancomyxin. Dƣới tác dụng của vancomyxin
tính bền vững vốn có của các cầu khuẩn Gram (+) đối với penixilin khơng phát hiện
thấy [58]. Mặc dù có nhiều CKS chữa trị các bệnh do vi khuẩn Gram (+) gây ra đã
đƣợc công bố trong những năm gần đây, nhƣng vancomyxin vẫn là kháng sinh
không thể thay thế trong việc chữa trị những bệnh do Staphyloccus, Enterococcus
và các chủng vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng gây nên [5], [30].
Vancomyxin có tác dụng cao khi dùng phối hợp hoặc thay thế kháng sinh
nhóm β-lactam để chữa các bệnh nhiễm trùng do các loại vi khuẩn đã nhờn với
kháng sinh thông dụng gây nên nhƣ: bệnh nhiễm trùng máu, viêm xƣơng, viêm
đƣờng hơ hấp … [17], [34]. Ngồi ra, CKS này cịn có tác dụng điều trị bệnh do vi
khuẩn bạch hầu gây nên [41], [45]. Các chủng Staphylococcus có khả năng đề
kháng với penixilin G, streptomyxin, tetraxyclin, macrolit và các loại khác, nhƣng
mẫn cảm với vancomyxin [36], [44].
1.2. Streptomyces orientalis VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI SINH
TỔNG HỢP VANCOMYXIN
1.2.1. Streptomyces orientalis
Streptomyces orientalis có khả năng sinh CKS vancomyxin. Lúc đầu, khi
mới phát hiện, xạ khuẩn này có tên là Amycolatopsis orientalis, đƣợc xếp vào chi
Nocardia, sau đó lồi này đƣợc phân loại lại và xếp vào chi Streptomyces, đặt tên là
S. orientalis, tuy nhiên, nhiều tài liệu vẫn gọi tên truyền thống là Amycolatopsis
orientalis. Cho đến nay, vẫn chỉ phát hiện thấy kháng sinh vancomyxin từ loài xạ
khuẩn này [23], [26], [31], [35], [51]. S. orientalis đƣợc phân biệt với các loài khác

thuộc chi Streptomyces bởi các đặc điểm ni cấy, hình thái, sinh lý, sinh hóa…
[23].
Hình thái hiển vi: Khi ni trên mơi trƣờng thạch tổng hợp, quan sát thấy
khuẩn ty khí sinh dạng thẳng hoặc tạo thành các chuỗi nhánh không đồng đều. Bào
tử của chủng có dạng từ hình trụ đến hình trứng, có kích thƣớc 0,7-1,0 x 1,4-1,8
µm, có chuỗi bào tử hình xoắn rõ ràng.

19


Hình dáng khuẩn lạc lồi cao hoặc hơi lồi, khơ, xù xì, tạo rãnh, có vùng khuẩn
ty màu trắng nhạt rất mỏng bao quanh, mặt dƣới không màu.
Đặc điểm nuôi cấy riêng: khi nuôi trên môi trƣờng thạch tổng hợp, khuẩn ty
cơ chất có màu vàng kem sau 7 ngày và chuyển sang màu vàng sẫm sau 14 ngày,
khuẩn ty khí sinh có màu trắng sau 7 ngày và có màu xám sau 14 ngày ni do có
sự hình thành bào tử, khơng có sắc tố tan trên mơi trƣờng nuôi cấy.
Trong tự nhiên, sự phát triển của vi sinh vật, trong đó có xạ khuẩn, liên quan
mật thiết đến nguồn thức ăn và mối liên hệ của chúng với nhau. Mối quan hệ đối
kháng giữa các vi sinh vật đã đƣợc Pasteur (1887) khẳng định là hiện tƣợng phổ
biến. Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt. Kháng sinh là
trƣờng hợp riêng của tính đối kháng, hiện tƣợng một vi sinh vật với sản phẩm trao
đổi chất của mình tạo điều kiện khơng thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật
khác [8], [20], [23]. Cơ chế hình thành CKS:
- Đối với các CKS tƣơng tự với các chất trao đổi sơ cấp (axit amin, nucleotit,
coenzyme) thì sự sinh tổng hợp giống nhƣ sự sinh tổng hợp của các chất trao đổi sơ
cấp.
- Đối với kháng sinh đƣợc tạo ra bằng con đƣờng polymer hóa bao gồm: các
chất là dẫn xuất polypeptit đƣợc tạo thành bằng cách ngƣng tụ axit amin, mạch
polypeptit đƣợc tạo thành có thể bị cải biến trong các phản ứng tiếp theo (sự ngƣng
tụ axit amin không theo cơ chế cổ điển sinh tổng hợp protein); các chất đƣợc tạo

thành từ các đơn vị axetat và propionate thì theo con đƣờng tổng hợp axit béo; các
chất tecpen đƣợc tạo thành từ các đơn vị izopren (chỉ do khuẩn ty sinh ra); đối với
các chất aminoglucozit thì tạo thành bằng con đƣờng ngƣng tụ các phân tử đƣờng,
axit amin thông thƣờng và các rƣợu amin mạch vòng [14], [27], [46].
1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn
Cũng giống nhƣ con đƣờng sinh tổng hợp KS nhóm glycopeptit, vancomyxin
đƣợc tổng hợp bằng cách ngƣng tụ các đơn vị nhỏ mà mỗi đơn vị này lại đƣợc tạo
thành từ các con đƣờng sinh tổng hợp riêng (Hình 1.3).

20


Hình 1.3. Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn [71]
Quá trình tổng hợp chịu sự chi phối của các gen nằm trên cluster trong bộ
gen. Các gen này quyết định sự tổng hợp vancomyxin theo con đƣờng riêng, khác
con đƣờng tổng hợp axit amin để hình thành nên protein [58]. Ngƣời ta có thể biết
đƣợc điều này khi tiến hành phân tích một cách chi tiết thành phần các axitamin của
vancomyxin. Trong khoảng 20 axit amin cơ bản đƣợc tạo thành trong tổng hợp
protein thì có p-hydroxyphenylglyxin, hydroxyltyrozin và 3,5 di-hydroxylphenylglyxin α và β là các thành phần chính của kháng sinh (Hình 1.3). Q trình tổng hợp
glycopeptit có những yêu cầu giống nhƣ tổng hợp protein nhƣng sự tham gia axit
amin theo con đƣờng khác [40], [57], [58]. Q trình hình thành vịng heptapeptit
khơng phải ở trên riboxom. Để thay thế riboxom, các mạch peptit đƣợc tổng hợp
nhờ enzyme NRPSs (nonribosomal protein synthase). NRPSs là một enzyme có
khối lƣợng phân tử lớn, cấu tạo chia làm 4 phần, bao gồm vùng A (adenyl hóa),
vùng ngƣng tụ hoặc kéo dài (C), vùng E (epime hóa) và T (thioesterase). Tại các
vùng tổng hợp, NRPSs chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các axit amin có những

21

sai khác, chỉ sử dụng các axit amin có hoạt tính, adenozin tri photphat (ATP) đƣợc
dùng làm năng lƣợng cho hoạt động của enzyme. Đầu tiên các axit amin đƣợc biến
đổi. L-tyrozin đƣợc biến đổi thành β-hydroxyclorotyrozin (β-hTyr) và 4hydroxyphenylglyxin (HPG). Mặt khác, axetat đƣợc chuyển hóa từ vịng 3,5dihydroxyphenylglyxin. Tại vùng A, axit amin đặc hiệu đƣợc hoạt hóa bằng cách
biến đổi thành phức hệ enzyme aminoaxyl adenyl hóa và gắn với 4 photphopantethein ở vùng T bởi thioesteraza, có sự giải phóng adenozin mono photphat
(AMP). Vùng A có trách nhiệm cung cấp liên tục axit amin cho quá trình liên kết.
Phức hệ này sau đó chuyển qua vùng E thực hiện phản ứng epime hóa các axit
amin. Kết thúc ở vùng C, các liên kết peptit đƣợc hình thành giữa các axit amin hoạt
tính. Sự tổng hợp này mới hình thành nên các mạch heptapeptit thẳng. Việc tạo nên
các dạng mạch khác sẽ đƣợc thực hiện ở các vị trí khác, tùy thuộc theo từng chủng
xạ khuẩn. Sau khi mạch heptapeptit thẳng đƣợc tổng hợp, vancomyxin phải trải qua
một loạt các biến đổi tiếp theo nhờ hoạt động của 8 enzym nhƣ oxy hóa liên kết
chéo, q trình glycozyl hóa… để trở thành phân tử có hoạt tính học. Sự tƣơng tác
giữa các cầu nối đƣợc thực hiện bởi P450, đây là một enzyme tƣơng tự NRPSs, có
vai trò gắn thêm phân tử đƣờng vào lõi heptapeptit để hình thành glycopeptit theo
con đƣờng glycozyl hóa. Ngồi ra cịn có sự tham gia của nhóm sulphat vào phần
cuối N. Việc gắn nguyên tử Clo và vòng 2 và 6 nhờ enzyme haloperoxydaza thơng
qua q trình oxy hóa. Qúa trình hình thành glycopeptit chịu sự chi phối của rất
nhiều gen, mỗi gen hoạt động lại chịu sự chi phối của rất nhiều yếu tố, do vậy
không thể tách các gen đơn chiếc để tạo ra đƣợc vancomyxin.
1.2.3. Nghiên cứu quy trình cơng nghệ sản xuất vancomyxin
1.2.3.1. Điều kiện ni cấy
Theo các tài liệu đã công bố [30], [33], [41], [42], [44], [59], xạ khuẩn S.
orientalis sử dụng trong sản xuất vancomyxin thƣờng phát triển tốt ở nhiệt độ 2035oC, nhiệt độ tối ƣu cho quá trình sinh vancomyxin là 28oC, ở nhiệt độ 20oC và
35oC chủng này sinh trƣởng yếu, sinh khối tích lũy và lƣợng kháng sinh tạo ra thấp.

22


Độ pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn thƣờng là trung tính.
Tuy nhiên dải pH cho phép chủng sinh trƣởng thƣờng lớn hơn so với pH tối ƣu cho

hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh. Đối với xạ khuẩn S. orientalis thì pH thích hợp
cho sinh trƣởng là 6-8, cịn pH thích hợp cho sinh vancomyxin chỉ từ 6,5-7,5. Môi
trƣờng kiềm hay axit đều ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình sinh kháng sinh [25].
Xạ khuẩn có nhu cầu thơng khí cao hơn so với vi sinh vật khác, nhất là trong
giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ 12 của quá trình ni). Theo
nhiều nghiên cứu, nếu ni trong bình tam giác, trên máy lắc, thì thể tích mơi
trƣờng chỉ nên bằng 10-15% so với thể tích bình lên men là thích hợp cho việc tạo
kháng sinh, khi độ thơng khí cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hƣởng đến quá trình
này. Lên men khối lƣợng lớn hơn phải thƣờng xuyên cấp khí vơ trùng và khuấy trộn
cho phân tử oxy hịa tan đều trong môi trƣờng lên men, đảm bảo lƣợng ôxy hòa tan,
nhƣng cũng làm tăng lƣợng sinh khối, rút ngắn thời gian pha tích tụ, có thể tạo thêm
nhiều sản phẩm không mong muốn. Trong thực tế, để đảm bảo lƣợng ơ xy hịa tan,
ngƣời ta thƣờng phối hợp điều chỉnh cả hai thơng số cƣờng độ sục khí và khuấy
trộn theo hƣớng đủ tạo ra các hạt nhỏ và mịn trong điều kiện khuấy trộn hơi dƣ so
với nhu cầu. Sục khí cịn có tác dụng đuổi khí CO2 có trong dịch lên men, vì CO2
làm cản trở q trình hấp thụ và chuyển hóa cơ chất của chủng, nghĩa là cản trở sinh
tổng hợp KS [21], [49], [50].
Vancomyxin đƣợc tạo thành chủ yếu trong pha thứ hai (pha tổng hợp) của
qúa trình lên men. Vì vậy, cần xác định đƣợc đúng thời điểm kết thúc lên men trƣớc
khi xạ khuẩn bị phân hủy làm giảm lƣợng KS tạo thành. Thời gian kết thúc lên men
đƣợc xác định bằng cách nghiên cứu động thái, thƣờng kéo dài 120 giờ.
Theo nhiều tài liệu công bố, sinh tổng hợp CKS khơng chỉ phụ thuộc vào
điều kiện lên men mà cịn phụ thuộc vào chất lƣợng của bào tử và giống sinh
dƣỡng. Môi trƣờng nhân giống giàu chất dinh dƣỡng hơn môi trƣờng lên men sẽ
cho hiệu suất sinh tổng hợp CKS cao hơn. Lƣợng giống và tuổi giống đƣợc bổ sung
vào mơi trƣờng lên men cũng có ảnh hƣởng khơng nhỏ đến khả năng tổng hợp KS.
Thông thƣờng lƣợng giống bổ sung vào môi trƣờng lên men là 2 – 10% [38], [47

23

1.2.3.2. Thành phần mơi trƣờng
Q trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào
thành phần môi trƣờng lên men. Mỗi chủng xạ khuẩn cần một nguồn cơ chất khác
nhau. Để xạ khuẩn phát triển tốt mơi trƣờng phải có đầy đủ nguồn cacbon, nitơ và
các nguyên tố vi lƣợng. Nguồn cacbon có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình sinh
trƣởng cũng nhƣ sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn S. orientalis, do nguồn cacbon
không những tham gia vào cấu tạo tế bào mà còn tham gia quá trình hình thành nên
cấu trúc của sản phẩm [59]. Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn
nguồn cacbon thích hợp gồm các loại đƣờng đơn nhƣ glucoza, fructoza … hay các
loại đƣờng kép nhƣ sacaroza, maltoza, lactoza… cũng có thể là các loại tinh bột
hoặc rỉ đƣờng hoặc đại mạch… Glucoza là nguồn đƣờng dễ sử dụng nhất, tuy nhiên
nếu hàm lƣợng glucoza trong môi trƣờng quá cao hiệu suất lên men sẽ giảm đi [60].
Nguyên nhân là glucoza làm tăng lƣợng axit hữu cơ trong môi trƣờng đồng thời làm
tăng các chất hữu cơ và axit nucleic trong khuẩn ty, dẫn tới thay đổi hoạt tính các
enzyme phân giải glucoza. Có thể khắc phục hiện tƣợng này bằng cách bổ sung
định kỳ một lƣợng nhỏ glucoza để khơng xảy ra sự tích lũy các chất trao đổi ức chế
[54], [59].
Quá trình sinh tổng hợp CKS từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn
nitơ vơ cơ và nitơ hữu cơ. Trong đó nguồn ni tơ vơ cơ cho khả năng sinh CKS
khơng cao, cịn nguồn ni tơ hữu cơ có ảnh hƣởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp
CKS do nó cung cấp các nguồn axit amin quan trọng dễ dàng đi vào chu trình tổng
hợp để hình thành nên mạch heptapeptit, là bộ khung của vancomyxin. Nguồn nitơ
thích hợp thƣờng đƣợc sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tƣơng…
nguồn nitơ vô cơ thƣờng sử dụng là các muối amon, muối nitrat…[65].
Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất khống trong q
trình trao đổi chất của chúng. Một lƣợng nhỏ các nguyên tố vi lƣợng cũng có ảnh
hƣởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn. Sự có mặt của một số muối
khống nhƣ Na, Fe, Al, Bo, K, Cr, Cu, Mn, Zn… [29] trong môi trƣờng lên men sẽ
tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của VSV. Có thể sự có mặt của

24


nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của
nguyên tố kia. Một số muối khoáng nhƣ Ca2+, Cu2+… đƣợc cho là có ảnh hƣởng tới
khả năng sinh ra một vài loại kháng sinh trong đó có vancomyxin. Các khống chất
này có tác động lên hoạt động của các enzyme trong sinh tổng hợp kháng sinh [29].
1.3. NGHIÊN CỨU DUY TRÌ VÀ NÂNG CAO HIỆU SUẤT CHỦNG GIỐNG
SẢN XUẤT VANCOMYXIN
Một yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp
hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật. Do các chủng VSV dễ bị biến dị và
hoạt tính bị thối hóa trong q trình ni cấy nhiều lần bởi tác động của môi
trƣờng sống của chúng, nên phải tiến hành chọn lọc thƣờng xuyên chủng giống cho
lên men. Phần lớn các chủng sản sinh KS phân lập từ tự nhiên thƣờng có hiệu suất
thấp vì thế không thể dùng ngay cho sản xuất [6], [7], [12], [26]. Để thu đƣợc các
chủng có khả năng siêu tổng hợp KS, có giá trị trong cơng nghiệp cần phải áp dụng
các phƣơng pháp đột biến nhân tạo (đột biến cảm ứng). Các phƣơng pháp hiện đại
về sinh tổng hợp, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, siêu tổng hợp, điều khiển
hoạt động của gen, gây đột biến định hƣớng, tạo và dung hợp tế bào trần
(protoplas)… không những nâng cao hiệu suất chủng giống trong thời gian ngắn mà
còn mở ra phƣơng hƣớng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS [58].
*Chọn lọc tự nhiên
Bào tử hoặc tế bào sinh dƣỡng của chủng sinh kháng sinh đƣợc pha lỗng
trong nƣớc muối sinh lý, sau đó cấy lên mơi trƣờng dinh dƣỡng trong hộp petri sao
cho chỉ hình thành 40-50 khuẩn lạc trong mỗi hộp. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ
thích hợp 4-5 ngày cho khuẩn lạc phát triển tốt và xác định hoạt tính kháng sinh
bằng phƣơng pháp cục thạch. Khi tuyển chọn chủng sinh kháng sinh cao theo
phƣơng pháp này, cần phải kiểm tra lại bằng lên men để xác định hiệu suất sinh
kháng sinh so với chủng ban đầu. Phƣơng pháp chọn chủng có hoạt tính cao theo

cách này chỉ là những đột biến tự nhiên, khơng có ý nghĩa tạo chủng có năng suất
cao, đáp ứng đƣợc nhu cầu của sản xuất [15], [69].

25