Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)
CỦA VIỆT NAM”

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)
CỦA VIỆT NAM”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 6020114
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Hƣớng dẫn 1 : TS. Trần Mỹ Linh
Hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Tƣờng Vân

Hà Nội - 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với
các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chƣa
đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng
Tác giả

1

năm 2020


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS.
Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam (VAST), TS. Nguyễn Tƣờng Vân – Viện Công nghệ sinh học,
VAST và ThS. Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST đã tận tình
hƣớng dẫn, động viên tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn
Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số
QTBY01.05/18-19 do TS. Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm đã hỗ trợ trong q
trình thực hiện nghiên cứu.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Học viện Khoa
học và Cơng nghệ, VAST đã hết lịng truyền đạt kiến thức cho tôi xong suốt
hai năm học vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Phòng Nghiên cứu Tài
nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp
đỡ tơi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng

năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Huyền

2

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... 1
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. 2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 5
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................... 6
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... 7
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 8
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 10
1.1.

Giới thiệu chung về dừa cạn ........................................................................... 10

1.1.1.

Đặc điểm sinh học và phân bố ..................................................................... 10

1.1.2.

Giá trị y học ................................................................................................. 11

1.2.

Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro ............................................................ 12

1.2.1.

Các xu hƣớng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro ...................................... 13

1.2.2.

Các yếu tố chính ảnh hƣởng ni cấy mơ và tế bào cây thuốc in vitro....... 16

1.2.3.

Nuôi nhân chồi in vitro ................................................................................ 19

1.2.4.

Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù ......................................................... 20

1.3. Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cƣờng sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23
1.4. Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro ...................................... 26
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 27
2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 27
2.1.1. Các giống thực vật nghiên cứu ........................................................................ 27
2.1.2. Các môi trƣờng dùng cho nghiên cứu ............................................................. 27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 28
2.2.1. Khử trùng và nảy mầm hạt .............................................................................. 28
2.2.2. Tạo nguồn vật liệu bằng phƣơng pháp nhân nhanh chồi in vitro ................... 28
2.2.3. Thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo từ đoạn thân dừa cạn .................................. 28
2.2.3.1. Tối ƣu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng lên khả năng tạo mơ
sẹo.............................................................................................................................. 28
2.2.3.2. Đánh giá ảnh hƣởng của ví trí và kích thƣớc đoạn thân đến hình thành mơ
sẹo.............................................................................................................................. 29
3


2.2.3.3. Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân ................................................................. 29

2.2.3.4. So sánh khả năng tạo mô sẹo giữa các giống dừa cạn thu thập tại Việt Nam30
2.2.4. Tối ƣu hóa môi trƣờng nhân nhanh mô sẹo dừa cạn ....................................... 30
2.2.5. Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn .......................... 30
2.2.6. Đánh giá ảnh hƣởng của ánh sáng và nhiệt độ lên sự phát triển của tế bào
huyền phù dừa cạn..................................................................................................... 31

2.2.7. Tách chiết và định lƣợng alkaloid tổng số ........................................... 31
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 33
3.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ các vật
liệu ban đầu khác nhau của hai giống dừa cạn .......................................................... 33
3.1.1 Đánh giá khả năng nảy mầm hạt dừa cạn trong điều kiện in vitro .................. 33
3.1.2. Đánh giá khả năng nhân chồi in vitro của dừa cạn ......................................... 33
3.1.3. Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ các vật liệu nuôi cấy in vitro .................. 35
3.1.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của đoạn lóng thân đến khả năng hình thành mơ sẹo 39
3.1.5. Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân dùng trong thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo39
3.1.5. Đánh giá khả năng hình thành mơ sẹo ở hai giống dừa cạn QN02 và H01 từ
đoạn thân thứ 3, kích thƣớc 0,3cm ............................................................................ 41
3.2. Nghiên cứu phát triển tế bào huyền phù dừa cạn ............................................... 43
3.2.1. Phát triển mơi trƣờng nhân nhanh mơ sẹo, bảo tồn khả năng sinh tổng hợp
alkaloid ...................................................................................................................... 43
3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ tế bào ban đầu đến sự phát triển của tế bào dừa cạn
nuôi lỏng .................................................................................................................... 47
3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và ánh sáng lên tốc độ phát triển của tế bào ............ 49
3.2.4. So sánh khả năng nhân nhanh của tế bào huyền phù của hai giống dừa cạn
QN02 và H01 ............................................................................................................ 51
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 54
4.1. Kết luận .............................................................................................................. 54
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 55

4


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4,5-T

2,4,5-Trichlorophenoxyacetic axit

2,4-D

Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic

B5

Môi trƣờng nuôi cấy của Gamborg (1968)

BAP

6-benzyladenine

CT

Công thức

DDW

Nƣớc cất hai lần (double distilled water)

DW

Trọng lƣợng khô – dry weight

IAA

Indole Acetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

Kin

Kinetin

LS

Môi trƣờng nuôi cấy của Linsmaier và Skoog (1965)

MS

Môi trƣờng nuôi cấy của Murashige và Skoog (1962)

N6

Môi trƣờng nuôi cấy của Chu và cs (1975)

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

TDZ

Thidiazuron

5


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn ...................................................... 27
Bảng 2.2: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy mô ...................................... 27
Bảng 3.1. Tỷ lệ tạo mô sẹo của các đoạn lóng thân lên mơi trƣờng CT2 ...... 36
Bảng 3.2 A. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống QN02 thử nghiệm trên
các công thức của môi trƣờng nhân nhanh tế bào ........................................... 45
Bảng 3.2 B. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn giống H01 thử nghiệm trên các
công thức của môi trƣờng nhân nhanh tế bào ................................................. 45
Bảng 3.3. Sự tăng trƣởng của tế bào dừa cạn QN02 sau 27 ngày nuôi cấy ... 48
Bảng 3.4. Trọng lƣợng tƣơi tế bào dừa cạn thử nghiệm trong môi trƣờng lỏng
CT4 nhân nhanh tế bào huyền phù trong thí nghiệm cấy chuyển tế bào từ mơi
trƣờng đặc CT3 sang môi trƣờng lỏng CT4 .................................................... 51

6


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây dừa cạn .................................................................................... 10
Hình 2.1. Lựa chọn đoạn thân trong thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo ở dừa
cạn ................................................................................................................... 29
Hình 3.1. Hạt dừa cạn nảy mầm sau 1 tuần gieo hạt ...................................... 33
Hình 3.2. Hình ảnh thí nghiệm nhân chồi dừa cạn tạo ngun liệu cho TN tạo
mơ sẹo ............................................................................................................. 34

Hình 3.3. Mơ sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát triển trên
mơi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L IAA ......................... 35
Hình 3.4. Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát
triển trên mơi trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L NAA ........ 37
Hình 3.5. Mơ sẹo dừa cạn H01 sau 4 tuần phát triển trên mơi trƣờng CT2 có
các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau ...................................................... 38
Hình 3.6. Hình ảnh mơ sẹo dừa cạn QN02 sau 4 tuần phát triển trên mơi
trƣờng CT2 có các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau .............................. 38
Hình 3.7. Một số hình ảnh thí nghiệm tối ƣu vị trí đoạn lóng thân trong thí
nghiệm tạo mơ sẹo sau 4 tuần đặt trên môi trƣờng tạo mô sẹo. A: đoạn 1; B:
đoạn 2; C: đoạn 3 ............................................................................................ 39
Hình 3.8. Hình ảnh thí nghiệm tối ƣu kích thƣớc đoạn thân trong TN tạo mơ
sẹo.................................................................................................................... 40
Hình 3.9. Mơ sẹo dừa cạn trên mơi trƣờng CT2 chứa 1,5 mg/L 2,4-D ......... 41
Hình 3.10. Tốc độ nhân sinh khối của tế bào dừa cạn QN02 và H01 ........... 47
Hình 3.11. Hình ảnh tế bào dừa cạn QN02 phát triển trên mơi trƣờng CT3-547
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển của tế bào dừa cạn ..... 50
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của ánh sáng đến sự phát triển của tế bào huyền phù
dừa cạn. A. tế bào nuôi trong tối; B. tế bào ni ngồi ánh sáng ................... 50
Hình 3.14. Hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02 nuôi lỏng tại thời điểm
A: 1 ngày; B: 3 ngày; C: 5 ngày; D: 7 ngày; E: 10 ngày; F: 14 ngày ............. 52
7


MỞ ĐẦU
Từ lâu thực vật luôn là nguồn cung cấp một số lƣợng khổng lồ các hợp
chất hóa học có hoạt tính và đƣợc dùng làm thuốc. Các hợp chất hoạt tính
sinh học đƣợc chiết xuất từ thực vật có thể đƣợc sử dụng nhƣ thuốc điều trị
bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc
nhuộm, chất tạo hƣơng vị và mỹ phẩm. Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa

bệnh có nguồn gốc từ thực vật, hơn 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp hoặc
gián tiếp từ thực vật và có nhiều loại khơng có sản phẩm tổng hợp hoặc bán
tổng hợp thay thế. Vì thế nguồn sinh khối thực vật đang ngày một tăng cao và
những nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có
hoạt tính dƣợc học là đòi hỏi cấp bách..
Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật đã có
những bƣớc phát triển vƣợt bậc, là một phƣơng pháp thay thế thích hợp trong
việc tạo các nguồn sinh khối ở quy mơ khác nhau khơng phụ thuộc vào mùa
vụ. Ngồi ra, việc ni cấy mơ tế bào cịn có thể tiến hành ở bất cứ nơi nào
trong điều kiện vô trùng và không phải sử dụng các chất bảo vệ thực vật độc
hại. Một trong những tiến bộ đáng kể trong kỹ thuật ni cấy mơ thực vật
chính là tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào không bị biệt hóa) của thực vật để
nghiên cứu các hoạt tính sinh học và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá
trị. Ni cấy tế bào huyền phù cịn là một trong những giải pháp để cải thiện
khó khăn khi nồng độ các chất trao đổi thứ cấp trong cây thấp và đã đƣợc phát
triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ cây thanh hao hoa vàng, có
tác dụng chữa sốt rét) và chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ cây thơng đỏ,
có tác dụng chữa ung thƣ).
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) G. Don) là cây dƣợc liệu, chứa
nhiều chất thứ cấp khác nhau trong đó có nhóm chất terpenoid alkaloid có
nhân indole (TIA) nhƣ vinblastine và vincristine để điều trị một số bệnh ung
thƣ nguy hiểm nhƣ bệnh bạch cầu, ung thƣ hạch bạch huyết
8


(lymphosarcoma), ung thƣ biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần
kinh, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, bệnh Hodgkin, các khối u dạng Wilkin và ung
thƣ tế bào lƣới. Trên thực tế nhu cầu về các alkaloid ngày một tăng, nhƣng
quá trình sản xuất những hợp chất này vẫn gặp nhiều khó khăn do hai hợp
chất này chỉ có mặt trong cây dừa cạn với hàm lƣợng rất thấp, khoảng 0,00020,0005% tổng hàm lƣợng alkaloid trong cây và phụ thuộc vào giống và các

cơ quan khác nhau của cây. Vì thế, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro
để phát triển sinh khối và sau đó là điều khiển sinh tổng hợp các chất thứ cấp
có giá trị đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt ở cây dừa cạn, tuy nhiên kết
quả vẫn còn hạn chế và phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật
liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu sẽ tập
trung “ Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa
cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam” nhằm chọn tạo đƣợc các
dịng tế bào có khả năng phát triển sinh khối với tốc độ nhanh và giữ đƣơc
khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Kết quả của luận văn sẽ là cơ sở cho
những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện khả năng tổng hợp các chất thứ
cấp của tế bào dừa cạn ở điều kiện in vitro.
Để đạt đƣợc mục tiêu, các công việc cụ thể sẽ đƣợc tiến hành nhƣ sau:
1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của vật liệu, mơi trƣờng, chất kích thích sinh
trƣởng khác nhau đến khả năng hình thành mơ sẹo của 02 giống dừa
cạn của Việt Nam.
2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào từ mô
sẹo dừa cạn đã đƣợc chọn lọc.

9


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Giới thiệu chung về dừa cạn

1.1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố
Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G. Don, tên
thƣờng gọi là dừa cạn hoặc bông dừa hay trƣờng xuân hoa là một loài thực vật
thân thảo thuộc chi Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae). Chi

Catharanthus gồm 8 lồi, trong đó 7 lồi có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar
(C. coriaceus, C. lanceus, C. longifolius, C. ovalis, C. roseus, C. scitulus, C.
trichophyllus) và 1 loài C. pusillus từ Ấn Độ. Loài Catharanthus roseus (L)
G. Don (dừa cạn) đƣợc du nhập vào Việt Nam, phân bố ở nhiều vùng, trải dài
từ Bắc vào Nam [1]. Loài cây này chủ yếu đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới, ở
những vùng lạnh cây đƣợc trồng vào mùa hè vì khơng chịu đƣợc lạnh.

Hình 1.1: Cây dừa cạn (Nguồn: />Dừa cạn là dạng cây thƣờng xanh hoặc cây thân thảo, cao tới 80 cm
đến 1 m và hoa nở liên tục quanh năm với hoa màu hồng, tím hoặc trắng [2].
Lá cây có hình từ bầu dục đến thuôn, dài từ 2,5- 9,0 cm và rộng từ 1- 3,5 cm,
khơng có lơng, màu xanh bóng với một gân ở giữa màu nhạt và cuống lá
ngắn khoảng 1-1,8 cm và đƣợc sắp xếp theo cặp đối diện. Hai giống C.
roseus phổ biến nhất đƣợc đặt tên dựa trên màu hoa, bao gồm một giống hoa
màu hồng Rosel và một giống hoa màu trắng Alba. Hoa có nhiều màu từ màu
trắng đến hồng đậm với hoa gồm 5 cánh mỏng, tiểu nhụy gắn với phần trên
10


của ống vành, tâm bì rời ở nỗn sào với năm cánh giống thùy hoa. Quả là
một cặp nang dài khoảng 2-4 cm và rộng 3 mm. Dừa cạn C. roseus là một
loài khác biệt với hầu hết các loài khác trong họ ở khả năng tự tƣơng thích.
Tuy nhiên, q trình tự thụ phấn trong hoa thƣờng khơng xảy ra ở cây dừa cạn
vì sự tách biệt vật lý giữa nhụy và bao phấn, một hiện tƣợng đƣợc gọi là
herkogamy ngƣợc, khi nhụy bị thấp xuống dƣới mức bao phấn [3].
Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng
đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập
trung ở các tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế,
Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú n. Ngồi ra dừa cạn cịn xuất
hiện ở các đảo nhƣ Cô Tô, Côn Đảo và Phú Quốc [1]. Ở những vùng phân bố
tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần nhƣ thuần loại trên các bãi cát dƣới

rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai
khơ cằn của vùng cát ven biển.
1.1.2. Giá trị y học
Catharanthus roseus đƣợc coi là một nhà máy sản xuất đến 130
terpenoid indole alkaloids (TIAs) khác nhau, trong đó có nhiều chất có hoạt
tính dƣợc học quan trọng đƣợc dùng trong điều trị ung thƣ, tiểu đƣờng, cao
huyết áp, dị ứng, táo bón và nhiều bệnh đƣờng ruột. Trong đó, vinblastine là
hợp chất đã đƣợc FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ phê duyệt
vào năm 1965 và trở thành một thành phần chính của phƣơng pháp hóa trị
liệu trong điều trị nhiều loại ung thƣ nhƣ bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, các
u bạch huyết, ung thƣ vú, ung thƣ phổi tế bào nhỏ…, đƣợc bán trên thị trƣờng
hơn 40 năm nay. Ngồi ra, vincristine và vinblastine cịn thể hiện hoạt tính
kháng khuẩn [4]. Một hợp chất khác của nhóm TIA là ajmalicin đƣợc sử dụng
làm chất chống cao huyết áp, hợp chất vindoline đƣợc nghiên cứu ứng dụng
trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [5]. Khi nghiên cứu để phát hiện các chất có
hoạt tính hạ đƣờng huyết từ cây dừa cạn của Việt Nam, Nguyen và cs [6] đã
11


phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 9 hợp chất có hoạt tính ức chế
enzyme glucosidase từ cây và rễ dừa cạn thu hái tại Hoài Nhơn, Bình Định,
trong đó có 2 chất lần đầu tiên đƣợc phân lập từ lồi này. Đánh giá hoạt tính
gây độc tế bào trên 9 dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời, gồm ung thƣ gan (HepG2), ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ phổi (LU-1), ung thƣ vú (MCF-7),
melanoma cancer ung thƣ sắc tố (SK-Mel2), ung thƣ bạch cầu cấp tính
(HL60), ung thƣ buồng trứng (SW626), ung thƣ tuyến tiền liệt (LNCaP) và
ung thƣ ruột kết (HT-29) đã có những kết quả nhất định. Mặc dù có vai trị
quan trong nhƣng cấu trúc phức tạp của vinblastine và vincristine làm cho
việc tổng hợp hóa học các chất này rất khó khăn.
Dừa cạn cũng đƣợc dùng phổ biến trong các bài thuốc Đông y để trị
cao huyết áp, trị bệnh tiểu đƣờng, tiêu hóa kém, lỵ thơng tiểu tiện, bệnh đi

tiểu đỏ và ít... Một số trƣờng hợp cịn dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi
[7]. Trƣớc đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào.
Trƣớc năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm.
Những năm gần đây, lƣợng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm)
thƣờng xuyên hơn, nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên.
1.2.

Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc bắt đầu từ đầu thế kỷ 20. Trong

những năm 1940 và 1960, những tiến bộ công nghệ đã dẫn đến sự phát triển
của kỹ thuật nuôi cấy mô tế thực vật nhằm nghiên cứu hoạt động của tế bào
(bao gồm tế bào học, dinh dƣỡng, chuyển hóa, q trình phát sinh hình thái,
hình thành phơi và bệnh học), tạo ra cây sạch bệnh và điều kiện lƣu trữ tế bào
và nhân giống vơ tính. Từ những năm 1960, q trình sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa thứ cấp đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi trong nhiều loại tế bào thực
vật và nhiều ứng dụng mới đã đƣợc phát triển, cải thiện đáng kể cho q
trình ni cấy mô và tế bào thực vật. Hiện nay, việc nuôi cấy tế bào thực vật
trở thành công cụ hiệu quả để sản xuất quy mô lớn các chất chuyển hóa thứ
12


cấp dùng trong chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời (ví dụ, thuốc chống ung
thƣ) [8].
Những ƣu điểm chính của hệ thống nuôi cấy mô tế bào so với trồng trọt
ngoài tự nhiên bao gồm: các hợp chất thực vật đƣợc lựa chọn có thể đƣợc tạo
liên tục khơng phụ thuộc các yếu tố bên ngoài nhƣ mùa vụ, điều kiện đất đai
và khí hậu; các tế bào ni cấy không bị đe dọa bởi sự tấn công của vi sinh
vật hoặc côn trùng; các tế bào của bất kỳ lồi thực vật nào thậm chí là những
lồi q hiếm hoặc có nguy cơ tuyệt chủng có thể dễ dàng duy trì để tạo ra

các chất chuyển hóa thứ cấp; và q trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có
thể điều khiển nhằm giảm chi phí và cải thiện năng suất.
1.2.1. Các xu hướng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro
Nuôi cấy in vitro liên quan đến việc sản xuất các tế bào, mô và cơ quan
mới đơn thuần từ phân bào, do đó tạo ra các tế bào, mơ và cơ quan, có cùng
gen di truyền của cây mẹ. Việc sử dụng các kỹ thuật in vitro để tạo ra các chất
thứ cấp, đặc biệt là các chất có hoạt tính dƣợc học có những ƣu điểm chính
nhƣ khơng bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện mơi trƣờng bên ngồi và các điều
kiện ni cấy đƣợc kiểm sốt trong phịng ni cấy; việc sinh tổng hợp chất
thứ cấp có khả năng cải thiện bằng cách tạo ra các quy trình đặc thù cho
từng bƣớc để tăng tốc tích lũy sinh khối tƣơi và tăng nồng độ chất trong các
mơ; có thể sản xuất quanh năm khơng phụ thuộc vào mùa vụ; các chất thứ cấp
đƣợc tạo ra trong điều kiện vơ trùng và có rất ít rủi ro bị nhiễm bởi các hợp
chất độc hại không mong muốn.
Các chất thứ cấp đƣợc sản xuất in vitro bắt đầu bằng việc đƣa các vật
liệu ban đầu từ các lồi cây thuốc mong muốn vào trong ni cấy. Vật liệu
ban đầu đƣợc khử trùng bề mặt và nuôi cấy trong điều kiện in vitro, sử dụng
môi trƣờng nuôi cấy đã đƣợc tối ƣu hóa trong các điều kiện vật lý đƣợc kiểm
sốt cho từng giai đoạn khác nhau. Mơi trƣờng nuôi cấy chứa các nguồn dinh
dƣỡng cần thiết cho việc phát triển của tế bào nhƣ đƣờng, vì thƣờng bị hạn
13


chế trong trong điều kiện thiếu ánh sáng và CO2 nồng độ thấp; các chất điều
hòa sinh trƣởng thực vật, đƣợc sử dụng để kiểm soát sự phát triển của mơ và
để kích thích sự gia tăng sinh khối thực vật và hàm lƣợng chất thứ cấp; các
chất bổ sung khác nhƣ axit amin, vitamin, than hoạt tính, chất chống oxy hóa
và các chất khác tùy thuộc vào lồi cụ thể.
Các vật liệu ban đầu cho việc nuôi cấy thƣờng là các chồi mang mô
phân sinh, các mảnh lá non và các mô phù hợp khác, đƣợc khử trùng bề mặt

(vô trùng) để loại bỏ vi sinh vật sử dụng cồn 70% hoặc natri hypochlorite.
Tiếp theo, các vật liệu ban đầu đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để
bắt đầu thiết lập hệ thống nuôi cấy in vitro. Khởi đầu của hệ thống có thể là
tạo mơ sẹo từ các các mơ phân sinh, tạo cây hồn chỉnh, tạo chồi hoặc chỉ là
tạo rễ in vitro. Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm một một số giai
đoạn đƣợc gọi là organogenesis để biến các dạng tế bào chuyên biệt thành các
tế bào có khả năng phân bào và phát triển mô sẹo (indirect organogenesis)
hoặc chồi và chồi trực tiếp từ mô ban đầu (direct organogenesis). Sau khi
thiết lập thành công giai đoạn khởi đầu nuôi cấy in vitro, không bị nhiễm với
vi khuẩn và nấm, các giai đoạn tiếp theo bao gồm quá trình nhân các tế bào,
mô, chồi và rễ. Các giai đoạn này rất quan trọng, có tính quyết định về hiệu
quả kinh tế của quá trình, chủ yếu là do càng nhiều tế bào và mô đƣợc sản
xuất, năng suất của các chất thứ cấp mục tiêu càng cao.
Việc nuôi cấy in vitro của các lồi cây thuốc có thể giúp sản xuất cây
dƣợc liệu theo nhiều phƣơng thức khác nhau nhƣ : i) vi nhân giống trên các
dịng vơ tính quy mô lớn với chất lƣợng di truyền ổn định và nồng độ chất
thứ cấp cao và nhân giống các lồi khó nhân giống bằng các phƣơng pháp
thơng thƣờng, chẳng hạn nhƣ cây có chu kỳ sinh trƣởng dài hoặc bị nhiễm
bệnh, ví dụ virus và vi khuẩn nếu nhân bằng phƣơng pháp vơ tính thơng
thƣờng; ii) sử dụng elicitor (sinh học hoặc phi sinh học áp dụng để kích thích
sản xuất các chất thứ cấp) để kích thích các mô trong điều kiện in vitro để sản
14


xuất chất thứ cấp mục tiêu; iii) biến đổi gen của cây thuốc để sản xuất chất
thứ cấp trong các mô cụ thể, nhằm cải thiện hiệu quả sản xuất sinh khối, tế
bào và do đó, chất thứ cấp từ các lồi hiếm hoặc khó phát triển trong tự nhiên,
hoặc các chất ở nồng độ thấp trong các loài ban đầu đƣợc cải thiện hiệu quả
hơn.
Quá trình vi nhân giống có thể góp phần vào việc sản xuất thuốc thảo

dƣợc và các sản phẩm thông thƣờng sử dụng hợp chất thứ cấp đƣợc chiết xuất
từ cây thuốc. Các kỹ thuật vi nhân giống in vitro đẩy nhanh quá trình sản xuất
cây vơ tính từ giống có khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp tốt hơn và có
thể phát triển tốt hơn trong điều kiện tự nhiên. Mặc dù hai phƣơng thức cịn
lại cũng có thể dẫn đến việc sản xuất các loại thuốc thảo dƣợc, nhƣng đƣợc
ứng dụng chủ yếu để sản xuất các chất thứ cấp có giá trị cao vì chi phí của
các kỹ thuật liên quan tƣơng đối đắt đỏ [9]. Dùng các chất elicitor là một
phƣơng tiện có thể thúc đẩy những khó khăn khác nhau liên quan đến việc
sản xuất quy mô lớn của hầu hết các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh
học quan trọng từ thực vật, ni cấy mơ biệt hóa và khơng biệt hóa bằng cách
áp dụng nồng độ thấp của các yếu tố sinh học và phi sinh học đã đƣợc tiến
hành rộng rãi. Một vài hợp chất hóa học thƣờng đƣợc sử dụng là salicylic
axit, metyl salicylat, axit bezoic, chitosan, v.v. có ảnh hƣởng đến sản xuất các
hợp chất phenolic và kích hoạt các enzym liên quan đến chống chịu trong
thực vật [10]. Đối với tạo cây thuốc biến đổi gen, hiện đang có nhiều yêu cầu
về an toàn sinh học liên quan đến việc trồng cây dƣợc liệu chuyển gen ngoài
tự nhiên và nhận thức của ngƣời tiêu dùng [9]. Do vậy, các mô chuyển gen in
vitro sẽ chỉ có nghĩa là để tạo ra sinh khối cho việc chiết xuất các hợp chất
hóa học tinh khiết (nhƣ ở cây khơng chuyển gen).
Các dịng thuốc lá chuyển gen có khả năng sinh tổng hợp các chất thứ
cấp hiếm, nhƣ vincristine và vinblastine đã đƣợc tạo ra. Các tế bào mô sẹo
của cây thuốc lá chuyển gen sẽ đóng vai trị là nơi để sản xuất các chất mong
15


muốn. Các tế bào phát triển rất nhanh này sẽ cho phép tăng khả năng sinh
tổng hợp chất thứ cấp theo cấp số nhân. Tế bào cây thuốc lá đƣợc lựa chọn vì
đây là các tế bào dễ dàng tiến hành biến đổi gen và cho phép điều khiển quá
trình phát triển sinh khối. Ngoài ra, cây thuốc lá biến đổi gen đã đƣợc dùng để
sản xuất các loại chất có hoạt tính khác nhau nhƣ vắc-xin, hormone và kháng

thể [11].
1.2.2. Các yếu tố chính ảnh hưởng ni cấy mơ và tế bào cây thuốc in vitro
Kiểu gen là yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp đối với việc sản xuất sinh
khối thực vật và chất thứ cấp. Các giống có hàm lƣợng chất thứ cấp cao là lựa
chọn đầu tiên cho việc sử dụng ni cấy mơ. Ví dụ nhƣ cây gai Ấn độ
(Pilocarpus microphyllus) có hàm lƣợng pilocarpin, một alkaloid có vai trị
tăng cƣờng hoạt động của hệ thần kinh giao cảm, nằm trong khoảng từ 16,3
đến 235,9 µg/g lá khơ tùy thuộc vào giống [12], có sự chênh lệch đến 14,5
lần về hàm lƣợng pilocarpin. Tuy nhiên, các kiểu gen quý của cây dƣợc liệu
có hàm lƣợng chất có hoạt tính cao cịn hạn chế và cần phải có những nghiên
cứu chi tiết đối với các giống ở từng vùng địa lý khác nhau.
Việc sử dụng các kiểu gen có hàm lƣợng chất thứ cấp tự nhiên cao là
điều kiện cần thiết để đảm bảo hiệu quả trong ni cấy in vitro cây thuốc do
chi phí của hệ thống nuôi cấy thƣờng cao hơn so với các kỹ thuật thơng
thƣờng khác. Bên cạnh đó, vì ni cấy in vitro dựa trên nguyên phân, các
kiểu gen sinh tổng hợp các chất có hoạt tính cao sẽ dẫn đến hàm lƣợng chất
mong muốn cao hơn đáng kể trong cây hoặc các mô đƣợc nuôi cấy. Tuy
nhiên, ngay cùng với một kiểu gen thì trong điều kiện phát triển ngồi tự
nhiên quần thể cây thƣờng có nhiều biến động về di truyền, dẫn đến biến
động về sinh khối và hàm lƣợng chất trao đổi thứ cấp [13]. Do đó, điều cần
thiết là phải nghiên cứu tƣơng tác giữa kiểu gen và môi trƣờng, để tạo ra điều
kiện nuôi trồng tốt nhất, kể cả với hệ thống nuôi cấy in vitro. Trong điều kiện
ni trồng ngồi tự nhiên, yếu tố nội sinh nhƣ kiểu gen, loại cơ quan và tuổi
16


mô, đồng hồ sinh học; và các yếu tố ngoại sinh, chẳng hạn nhƣ chu kỳ quang,
cƣờng độ chiếu sáng và bƣớc sóng, nhiệt độ, nguồn nƣớc, loại đất và thành
phần khơng khí, có thể riêng rẽ hoặc phối hợp ảnh hƣởng đến cả thành phần
và nồng độ của một chất thứ cấp đơn lẻ hoặc nhiều chất khác nhau [14,15].

Những yếu tố tƣơng tự cũng có thể ảnh hƣởng đến hình thành các chất
thứ cấp có hoạt tính trong ni cấy in vitro. Ví dụ, Kapoor và cs [16] cho biết
chỉ cần một thay đổi một yếu tố là chất lƣợng ánh sáng đã có ảnh hƣởng đến
tích lũy sinh khối, tốc độ sinh trƣởng và nồng độ của hợp chất phenolic
Salidroside trong cây rễ vàng Rhodiola imbricata. Dƣới tác động của ánh sáng
đỏ, mơ sẹo có chỉ số tăng trƣởng cao nhất (2,97) và nồng độ phenolic tổng số
và Salidroside lại cao nhất dƣới ánh sáng xanh sau 21 ngày nuôi cấy. Trong
trƣờng hợp này, nuôi cấy mô sẹo để phát triển sinh khối cần ánh sáng trắng và
sau đó để tăng cƣờng sinh tổng hợp chất mong muốn sẽ chuyển đổi sang ánh
sáng xanh. Các yếu tố khác có thể đƣợc vì thế cũng cần đƣợc tối ƣu hóa để cải
thiện q trình ni cấy, chẳng hạn nhƣ kết hợp ánh sáng xanh /trắng với tỷ lệ
thích hợp có thể cải thiện đồng thời việc tăng sinh khối và sinh tổng hợp chất
thứ cấp.
Điều khiển các yếu tố môi trƣờng trong nuôi cấy mô tế bào in vitro để
tăng cƣờng sinh khối và theo sinh tổng hợp chất thứ cấp là một ƣu việt của hệ
thống này vì khơng phụ thuộc vào mùa vụ trong năm và trong điều kiện vơ
trùng. Tuy nhiên, nhƣợc điểm chính nằm ở chi phí sản xuất cao, vì thế cần
phải đƣợc bù đắp bằng hệ thống nuôi cấy đƣợc thiết kế phù hợp. Các yếu tố
chính đƣợc sử dụng để tính năng suất thu nhận các chất thứ cấp trong điều
kiện in vitro chính là khối lƣợng sinh khối tƣơi hoặc khơ và nồng độ chất kèm
theo, diện tích dùng cho ni cấy (bình ni hoặc bioreactor) và thời gian cần
thiết để có hồn thành 1 chu kỳ sản xuất. Các yếu tố khác, nhƣ thể tích mơi
trƣờng ni cấy, cũng có thể đƣợc sử dụng trong cơng thức này. Tuy nhiên,
môi trƣờng nuôi cấy thƣờng chiếm chƣa đến 5% tổng chi phí.
17


Diện tích cần dùng cho ni cấy in vitro thay đổi tùy theo loại và kích
cỡ bình, hiệu quả tạo sinh khối và hệ thống sử dụng. Các hệ thống thông
thƣờng bao gồm môi trƣờng bán rắn, chứa agar hoặc mơi trƣờng lỏng, có

khuấy trộn khơng liên tục hoặc trong hệ thống bioreactor ngập tạm thời (TIB).
Việc sử dụng TIB đƣợc cho gia tăng tích lũy sinh khối tốt hơn so với nuôi cấy
trên môi trƣờng bán rắn [17, 18].
Các yếu tố phi sinh học, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ, ánh sáng cƣờng độ,
thời gian chiếu sáng và bƣớc sóng, độ ẩm tƣơng đối và thành phần khơng khí
quyển trong bình ni cũng ảnh hƣởng mạnh đến sự tích lũy sinh khối tƣơi và
khô, nồng độ chất trong sinh khối và thời gian nuôi. Những đặc điểm trên
cũng phụ thuộc vào từng lồi cây thuốc cần ni cấy. Mơi trƣờng nuôi cấy và
các thành phần dinh dƣỡng, chẳng hạn nhƣ lƣợng nƣớc và áp suất của môi
trƣờng nuôi cấy, dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, carbohydrate, vitamin và axit
amin, và các chất kích thích sinh trƣởng thuộc các nhóm khác nhau nhƣ
auxin, cytokinin [19], gibberellin, jasmonate và salicylate [20] cũng ảnh
hƣởng sâu sắc đến các đặc điểm này.
Các yếu tố ảnh hƣởng khác là loại, cƣờng độ và thời gian tƣơng tác với
các elicitor, đƣợc sử dụng để kích thích sinh tổng hợp và tăng nồng độ PDMC
vào cuối chu kỳ tăng trƣởng hoặc tích lũy sinh khối thực vật [21]. Elicitor là
các chất hóa học đƣợc đƣa vào mơi trƣờng ni cấy, là bức xạ ion hóa hoặc
các yếu tố vật lý khác áp dụng cho các tế bào và mơ, hoặc thậm chí đồng ni
cấy mơ thực vật với các vi sinh vật nào đó [22] hoặc áp dụng các điều kiện
môi trƣờng bất lợi, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ cao hoặc thấp trong một thời gian
nhất định. Trong số các chất elicitor hóa học đƣợc áp dụng cho mơi trƣờng
ni cấy, có cả các chất điều hịa sinh trƣởng nhƣ axit salicylic và jasmonic
[23], chitosan [24], chiết xuất từ vi sinh vật [25] và các dạng phân tử thế hệ
mới khác [26]. Trong số các yếu tố vật lý, bức xạ cực tím đã đƣợc sử dụng

18


thƣờng xun và có tác dụng kích hoạt các q trình khác nhau trong ni cấy
in vitro [27].

Việc đồng ni cấy tế bào thực vật với vi sinh vật đã đƣợc sử dụng để
kích hoạt sinh tổng hợp một số chất thứ cấp có giá trị. Nấm Aspergillus flavus
đồng ni cấy với mô dừa cạn đã dẫn đến tăng 7,88 và 15,5% nồng độ
vinblastine và vincristine, so với các mô đối chứng [22]. Nhiều khả năng việc
kích hoạt tổng hợp một số chất chuyển hóa thứ cấp là do đáp ứng của cây sản
xuất chất có hoat tính sinh học chống lại vi sinh vật gây bệnh. Ludwig-Müller
[28] cho rằng cảm ứng chuyển hóa thứ cấp ở thực vật cũng đƣợc sinh ra bởi
các vi sinh vật nội sinh (endophyte). Tuy nhiên, việc đồng nuôi cấy mô thực
vật với vi sinh vật cũng có thể dẫn đến tăng chi phí sản xuất vì việc liên quan
đến ni cấy hai loại sinh vật riêng rẽ và sau đó là giai đoạn đồng ni cấy.
Ngồi ra, vi sinh vật đƣợc sử dụng cho đồng ni cấy có thể tạo ra các thành
phần độc hại và làm tăng nguy cơ tế bào thực vật bị nhiễm khuẩn.
Do đó, việc xây dựng một quy trình ni cấy tế bào in vitro các tế bào,
mơ của cây thuốc để tạo ra chất thứ cấp đòi hỏi phải nghiên cứu nhiều yếu tố
đặc thù cho từng lồi và loại chất cần sản xuất in vitro.
1.2.3. Ni nhân chồi in vitro
Nuôi nhân chồi tƣơng tự nhƣ vi nhân giống thông thƣờng, bao gồm
nuôi cấy các vật liệu ban đầu đã đƣợc khử trùng bề mặt trong môi trƣờng tái
sinh chồi, sau đó là nhân nhanh chồi bằng cách bổ sung chất kích thích sinh
trƣởng thuộc nhóm cytokinin vào môi trƣờng nuôi cấy. Sau một số chu kỳ
nhân chồi và tích lũy sinh khối, elicitor có thể đƣợc bổ sung để kích hoạt việc
tăng cƣờng sinh tổng hợp chất thứ cấp trong các mô của chồi. Tiếp theo, các
chất thứ cấp có hoạt tính sẽ đƣợc tách chiết từ chồi, thay vì từ trồng cây con
hồn chỉnh nhƣ là vi nhân giống.
Để xác định và định lƣợng các chất chuyển hóa thứ cấp chính đƣợc tạo
trong chồi cây hoàng cầm râu (Scutellaria alpine), Gzegorczyk-Karolak và cs
19


[19] đã bắt đầu bằng cấy đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 0,5 cm của cây trong

mơi trƣờng có bổ sung các loại cytokinin ở các nồng độ khác nhau. Đỉnh sinh
trƣởng đƣợc tách ra từ hạt đã đƣợc khử trùng và nảy mầm trên môi trƣờng
MS. Kết quả cho thấy, BAP (2-4 µM) có khả năng kích thích việc nhân chồi
và tạo sinh khối cao nhất. Liên quan đến việc sử dụng elicitor, Sharma và vs
[23] phát hiện hàm lƣợng bacoside cao nhất (8,73 mg/g sinh khối khô) thu
đƣợc ở chồi cây đắng biển Bacopa monnieri là từ các chồi đƣợc kích thích
với 45 mg/L CuSO4 trong mơi trƣờng nuôi cấy từ 6 đến 9 ngày. Đồng thời,
1,0 mg/l axit jasmonic và 50 µM axit salicylic trong thời gian 6 đến 9 ngày
cũng làm tăng tăng nồng độ bacoside là 8,46 và 8,14 mg/g so với đối chứng
khơng có elicitor (6,41 mg/g sinh khối khô).
1.2.4. Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù
Tạo mô sẹo và nhân mô sẹo đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất
sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học. Đây là hệ thống đƣợc cho là hiệu
quả nhất để sản xuất chất có hoạt tính trong thực vật ở quy mô lớn bởi chất
đƣợc tạo ra trực tiếp trong mô và các mô đƣợc nhân nhanh in vitro [16]. Các
yếu tố ảnh hƣởng đến việc nhân nhanh mô sẹo đã đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng
và nhiều quy trình nhân ni mô sẹo ổn định ở nhiều loại cây khác nhau đã
đƣợc sử dụng thƣơng mại [29].
Việc nuôi cấy mô sẹo cũng liên quan đến khả năng đáp ứng phản phân
hóa của nhiều dạng tế bào và mô từ các cơ quan khác nhau để tạo ra mô sẹo
trên môi trƣờng có các chất điều hịa sinh trƣởng thuộc nhóm auxin nhƣ
2,4D và/hoặc cùng với cytokinin [29]. Ƣu điểm của mô sẹo là hầu hết các tế
bào trong khối mô đều có khả năng tăng trƣởng liên tục trong mơi trƣờng
ni cấy thích hợp. Do đó, các tế bào duy trì các chu kỳ phân chia liên tục
trong giai đoạn đƣợc gọi là giai đoạn tăng trƣởng lũy thừa, sau đó là giai đoạn
dừng tăng trƣởng rồi giảm tăng trƣởng. Khả năng duy trì các tế bào này trong
điều kiện khơng biệt hóa giúp có thể dễ dàng tính đƣợc lƣợng sinh khối tạo ra
20

trên một đơn vị thời gian và diện tích. Quá trình này hiệu quả, đơn giản và rẻ
tiền hơn các q trình tạo cây, cơ quan.
Mơ sẹo thƣờng khơng thể hình thành trên mơi trƣờng khơng có chất
kích thích sinh trƣởng. Vật liệu nuôi cấy đối chứng sẽ bị chết và không quan
sát đƣợc sự xuất hiện của mô sẹo. Gao và Bjork (2000) [30] cho biết mô sẹo
đƣợc tạo ra từ đỉnh chồi của cây nữ lang Valeriana officinalis trong mơi
trƣờng có bổ sung các tổ hợp auxin (IAA, IBA và NAA) và cytokinin (BA và
kin), trong khi đấy Chang và Chang (1998) [31] thơng báo mơ sẹo hình thành
từ cây lan kiếm Cymibidium ensifolium trên môi trƣờng MS có chứa 2,4-D và
TDZ. Kumar và Bhavanandan [32] tạo mơ sẹo thành công cho cây bạch hoa
xà Plumbago rosea sử dụng tổ hợp chất kích thích phù hợp. Mơ sẹo cũng
đƣợc tạo ra từ chồi nách của cây sâm đất Boerhavia repens trên môi trƣờng
MS bổ sung với 0,5-1,5mg/L NAA và 0,25-1,0 mg/L BAP. Có tới 100% mẫu
tạo ra mơ sẹo tơi xốp và có màu xanh sáng trong tổ hợp 1,0 mg/l NAA+1,0
mg/L BAP. Khi thử nghiệm khả năng tạo mô sẹo của các mảnh lá cây xạ
hƣơng Falcaria vulgaris trên môi trƣờng MS bổ sung với các nồng độ NAA,
2,4-D, TDZ khác nhau, riêng rẽ hoặc kết hợp với BAP, Chalageri và Babu
[33] nhận thấy rằng tỷ lệ tạo mơ sẹo cao nhất là trên mơi trƣờng có 0,5 mg/L
2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L BA. Ở cây cỏ ngọt Stevia rebaudiana, các mảnh
lá đƣơc khử trùng và ni cấy trên mơi trƣờng MS có chứa 2,0 mg/L BAP và
2,0 mg/L 2,4-D đã tạo ra các mô sẹo chất lƣợng [29].
Các loài thuộc chi diệp hạ châu Phyllanthus có chứa nhiều chất trao đổi
thứ cấp quan trọng, đặc biệt là các phyllantine và hypophyllanthin thuộc
nhóm alkaloid [34]. Hạt của lồi P. amarus có hàm lƣợng các alkaloid cao
đƣợc nảy mầm trên mội trƣờng 1/2MS. Cây mầm cao khoảng 1 cm đƣợc
chuyển sang mơi trƣờng tạo mơ sẹo có chứa 0,5 mg/L 2,4-D [13]. Mô sẹo
đƣợc nhân trên cùng môi trƣờng trong tối và cấy chuyển sau 20-30 ngày.
Nhiều loại elicitor đã đƣợc sử dụng để thử nghiệm khả năng sản xuất
21

phyllantine và hypophyllanthin của các tế bào mô sẹo. Các mô sẹo thu cũng
đƣợc sử dụng tiếp để thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù và trở
thành một giai đoạn mới của nuôi cấy mô sẹo.

Nuôi cấy tế bào cây

Hypericum perforatum, có nguồn gốc châu Âu, đƣợc tiến hành trên môi
trƣờng MS lỏng chứa 1,0 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L BA từ các mô sẹo tơi xốp
đƣợc tạo thành trên mơi trƣờng đặc có cùng thành phần. Thông thƣờng các
đoạn thân tạo ra các dạng mô sẹo này, trong khi mô lá và hoa lại tạo ra dạng
mơ sẹo cứng, có màu xanh. Sau khi chuyển mơ sẹo tơi xốp sang mơi trƣờng
lỏng, các bình ni đƣợc đặt trên máy lắc quay và cấy chuyển sang chu kỳ
sinh trƣởng mới sau 20 ngày. Trọng lƣợng tƣơi (≈200 g/L) và khô (≈7-8 g/L)
tối đa thu đƣợc sau 20-25 ngày, kèm theo hàm lƣợng flavonoid tích lũy cũng
đạt cao nhất (≈15-16 mg/g DW). Wang và cs [35] cho thấy việc sử dụng
methyl jasmonate và axit salicylic cũng dẫn đến hàm lƣợng flavonoid trong tế
bào nuôi cấy huyền phù tăng gấp 2,1 và 1,5 lần so với đối chứng.
Nuôi cấy rễ tơ đƣợc tạo ra bởi lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes với các vật liệu ban đầu khác nhau in vitro là nguồn mô quan trọng
để sản xuất các chất thứ cấp với hàm lƣợng thƣờng cao hơn so với ni cấy tế
bào huyền phù ở một số lồi [36]. Sujatha và cs [37] đã sử dụng 4 chủng
Agrobacterium rhizogenes chuyển vào chồi, lá và đoạn thân của cây ngải cứu
Artemisia vulgaris và quan sát thấy rằng chủng A4GUS có hiệu suất vào các
mảnh lá là cao nhất đạt 92,6%. Từ tất cả các dòng rễ tơ chuyển gen thu đƣợc
từ lá , họ đã chọn đƣợc 2 dòng AV1 và AV2 phát triển tốt nhất, với độ tăng
sinh, phân nhánh và tích lũy sinh khối rễ tơ cao hơn các dịng khác. Việc ni
cấy các dịng rễ tơ biến đổi gen này đã tăng tốc độ phát triển của rễ lên gấp 9
lần và có nồng độ tinh dầu cao hơn so với các rễ không chuyển gen. Cảm ứng
tạo rễ tơ kết hợp với hệ thống bioreactor ni chìm cũng có thể cải thiện năng

suất các chất thứ cấp. Khi nghiên cứu sản xuất ajmalicine từ rễ tơ cây dừa cạn
C. roseus, Thakore và cộng sự [18] đã cho thấy thời gtian nuôi cấy, nồng độ
22


sucrose trong môi trƣờng nuôi cấy, lƣơng rễ tơ ban đầu, thời gian chiếu sáng,
loại bioreactor và thể tích khí có ảnh hƣởng đáng kể đến sự phát triển của rễ
tơ và nồng độ của ajmalicine, và kết luận rằng bioreactor tạo bong bóng kết
hợp với polyurethane đã cải thiện đáng kể sinh khối rễ tơ khô (15,4 lần trong
30 ngày nuôi cấy) và nồng độ ajmalicine tăng 3,4 lần so với hệ thống nuôi cấy
sử dụng que trống quay thông thƣờng. Hầu hết các nghiên cứu so sánh nuôi
cấy rễ tơ với nuôi cấy tế bào, mô sẹo và chồi trong việc sản xuất các chất thứ
cấp đã cho thấy ni cấy rễ tơ có nhiều lợi thế nhƣng quan trọng nhất là sự ổn
định di truyền và khả năng sản xuất các chất thứ cấp ở nồng độ cao [18, 37,
38].
1.3. Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cƣờng sản xuất các hợp chất terpene
indole alkaloid (TIA)

Việc sản xuất các hợp chất TIA sử dụng nuôi cấy mô cây dừa cạn là
một công nghệ đƣợc các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm. Một trong những
vấn đề có tính quyết định trƣớc khi tiến hành ni cấy mơ với mục đích sản
xuất chất thứ cấp là lựa chọn giống dừa cạn thích hợp, có khả năng sinh tổng
hợp TIA cao. Mặc dù có nhiều nghiên cứu dựa trên phân tích phổ HPLC cho
thấy các giống khác nhau có hàm lƣợng hợp chất TIA là nhƣ nhau, nhƣng một
vài dịng tế bào dừa cạn có khả năng sản xuất TIA cao hơn. Trên thực tế, việc
chọn lọc các giai đoạn phát triển của một dòng tế bào tổng hợp và tích lũy
đƣợc TIA phụ thuộc vào việc chọn lọc các vật liệu ban đầu cho ni cấy
(loại, kích thƣớc, tuổi) và điều kiện nuôi cấy (dinh dƣỡng, chất kích thích sinh
trƣởng, pH, nhiệt độ, ánh sáng…). Thêm vào đó, việc sàng lọc các tế bào
trong q trình cấy chuyển cũng giúp chọn ra đƣợc các dòng tế bào có năng

suất cao, mặc dù các dịng này thƣờng khơng ổn định và có xu hƣớng giảm
khả năng sinh tổng hợp

sau nhiều chu trình cấy chuyển [39, 40, 41].

Mannonen và cs [42] đã sử dụng các phƣơng pháp giữ lạnh, các chất bảo vệ
và quá trình làm lạnh và giải lạnh khác nhau. Dầu khoáng đã đƣợc dùng để
23