Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện mycoplasma pneumoniae gây viêm đường hô hấp cấp ở trẻ em dưới 15 tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
------o0o------

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA PNEUMONIAE
GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP
Ở TRẺ EM DƯỚI 15 TUỔI

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VŨ THÚY PHƯỢNG

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. PHAN LÊ THANH HƯƠNG

HÀ NỘI, 2007


i

LỜI CẢM ƠN
Hồn thành Luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới:
- Đảng uỷ, Ban giám hiệu và Phòng đào tạo sau đại học cùng tồn thể
các thầy cơ Khoa Cơng nghệ sinh học, Trường đại học Bách khoa Hà
Nội đã dành cho tơi mọi sự thuận lợi, giúp đỡ và khích lệ trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
- Đảng uỷ, Ban giám đốc, cán bộ, cơng nhân viên các khoa, phịng của

Viện Vệ sinh dịch tễ TW, đặc biệt Phòng Vi khuẩn hơ hấp đã nhiệt
tình giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu đề tài.
- PGS. TS. Phan Lê Thu Hương, Phó trưởng khoa Vi khuẩn - Viện Vệ
sinh dịch tễ TW đã tận tình hướng dẫn và góp những ý kiến q báu
cho tơi hồn thành bản Luận văn này.
- Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè thân hữu đã
luôn sát cánh cổ vũ và giúp đỡ có hiệu quả cho tơi hồn thành bản
Luận văn này.
- Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cha
mẹ, những người đã có cơng dưỡng dục, sinh thành; anh em ruột thịt
đã chia sẻ, giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho
tơi hồn thành bản Luận văn này!
Vũ Thúy Phượng


ii

LỜI CAM ĐOAN

Đây là cơng trình nghiên cứu do tơi tham gia thực hiện. Những kết quả
trong Luận văn này là trung thực và chưa có ai cơng bố trong bất kỳ một cơng
trình nghiên cứu nào khác.
Tơi xin đảm bảo tính khách quan và trung thực của các số liệu đã thu
thập và kết quả xử lý số liệu trong nghiên cứu này.

Vũ Thúy Phượng


iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ M. PNEUMONIAE
1.1.1. Định danh và phân loại
1.1.2. Đặc điểm sinh học
1.1.3. Sinh học tế bào
1.1.4. Vai trị gây bệnh
1.1.4.1. Biểu mơ của cơ quan hô hấp
1.1.4.2. Bệnh cảnh lâm sàng
1.1.5. Đặc điểm dịch tễ học
1.1.5.1. Tỷ lệ lưu hành và đặc điểm theo mùa của bệnh
1.1.5.2. Lứa tuổi
1.1.5.3. Giới tính
1.1.5.4. Chủng tộc
1.1.5.5. Nghề nghiệp
1.1.5.6. Trong những điều kiện đặc biệt
1.1.5.7. Sự phân bố theo địa lý
1.1.5.8. Sự phân bố theo thời gian
1.1.6. Chức năng, cấu trúc của protein P1
1.2. CHẨN ĐOÁN
1.2.1. Phương pháp nuôi cấy
1.2.2. Phương pháp phát hiện kháng nguyên
1.2.3. Phương pháp huyết thanh học

1.2.4. Phương pháp DNA dò
1.2.5. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

TRANG
i
ii
iii
v
vi
vii
1
3
3
3
4
7
11
11
14
16
16
19
22
23
23
23
27
27

29
31
33
35
35
37
38
45
45


iv

2.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Vật liệu
2.2.1.1. Mơi trường ni cấy phân lập
2.2.1.2. Thiết bị
2.2.1.3. Hóa chất
2.2.1.4. Mồi cho phản ứng PCR
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Nuôi cấy phân lập
2.2.2.2. Huyết thanh học
2.2.2.3. Tách chiết DNA
2.2.2.4. PCR
2.2.2.5. Điện di sản phẩm PCR
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ
3.1.1. Tỷ lệ bệnh nhân viêm đường hô hấp dưới cấp được
chẩn đoán bằng các phương pháp
3.1.2. Bệnh cảnh lâm sàng trên kết quả PCR và/hoặc nuôi

cấy dương tính
3.1.3. Phân bố theo tuổi và giới tính
3.1.4. Điều trị kháng sinh không đặc hiệu
3.1.5. Sự tương quan giữa kết quả PCR và/hoặc nuôi cấy
3.1.6. Sự tương quan giữa kết quả PCR dương tính và/hoặc
huyết thanh học dương tính (IgM)
3.1.7. Định loại phân tử dựa trên gen mã hóa protein P1
3.1.8. Tính đặc hiệu của kỹ thuật PCR tổ
3.2. BÀN LUẬN
3.2.1. Bệnh cảnh lâm sàng
3.2.2. Kháng sinh điều trị trước khi nhập viện
3.2.3. Phương pháp nuôi cấy
3.2.4. Phương pháp huyết thanh học
3.2.5. Phương pháp PCR
3.3. KẾT LUẬN
3.4. ĐỀ NGHỊ
3.5. HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
PHỤ LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO

45
45
45
46
47
47
48
48
48
50

51
52
54
54
54
55
56
57
58
60
62
63
65
66
67
68
69
72
76
77
77
78
82


v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP
bp

CAP
CF
C. pneumoniae
DNA
dNTP
EIA
G+C
HS
IFA
IgG
IgM
kDa
M. pneumoniae
PA
PCR
PPLO
rDNA
RFLP
rRNA
RT-PCR
TE
Tm
TRI

Adenosin Triphosphat
Base pair
Community Acquired Pneumonia
Complement Fixation
Chlamydia. pneumoniae
Acid Deoxyribonucleic

Dideoxyribonucleozid Triphosphat
Enzyme Immuno Assay
Guanine + Cytosine
Horse Serum
Immuno Fluorescence Assay
Immunoglubulin G
Immunoglubulin M
Kilo Dalton
Mycoplasma pneumoniae
Partical Agglutination
Polymerase Chain Reaction
Pleuropneumonia like organisms
Ribosomal Acid Deoxyribonucleic
Restriction Fragment Length Polymorphism
Ribosomal Acid Ribonucleic
Revert Transcription - Polymerase Chain Reaction
Tris Etylen diamine tetra acetic acid
Melting Temperature
Tetrazolium Reduction Inhibition


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Số
1.1
1.2
1.3

Tên bảng

Mycoplasmas được phân lập từ người
Các thống kê về dịch tễ M. pneumoniae
Kỹ thuật khuếch đại axít nucleic dựa trên các đoạn gen đặc
hiệu của M. pneumoniae
2.1 Thành phần phản ứng PCR
2.2 Chương trình cho phản ứng PCR
3.1 Tỷ lệ bệnh nhân viêm phổi dựa trên kết quả dương tính
của PCR, ni cấy và xét nghiệm huyết thanh học
3.2 Bệnh cảnh lâm sàng viêm phổi nhiễm M. pneumoniae
3.3 Viêm phổi do M. pneumoniae (xác định bởi PCR và/hoặc
ni cấy) phân bố theo tuổi và giới tính
3.4 Tỷ lệ bệnh nhân được điều trị kháng sinh trước khi nhập
viện
3.5 Mối tương quan giữa kết quả PCR và/hoặc nuôi cấy
3.6 Mối tương quan giữa hiệu giá IgM và kết quả PCR
3.7 Định loại phân tử gen mã hóa protein P1 của M.
pneumoniae gây viêm phổi ở trẻ em
3.8 Các mồi đặc hiệu cho các loài Mycoplasma
3.9 Các mồi đặc hiệu cho M. pneumoniae (protein P1)
3.10 Các chủng thử nghiệm với mồi đặc hiệu cho
các loài Mycoplasma
3.11 Mối tương quan giữa hai cặp mồi đặc hiệu dùng để tiến
hành phản ứng PCR

Trang
5
28
41
51
52

54
55
56
57
59
61
62
64
64
64
65


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Số
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9

Tên hình
Sơ đồ phân loại M. pneumoniae dựa trên sự so sánh trình
tự 16 rRNA

Nhóm khuẩn lạc M. pneumoniae hình cầu sinh trưởng
trong mơi trường thạch SP4
Sơ đồ sự phân chia tế bào và nhân đôi cấu trúc đầu bám
dính của M. pneumoniae
Các mũi tên chỉ cấu trúc đầu bám dính của M. pneumoniae
dưới kinh hiển vi điện tử
Tỷ lệ viêm phổi do nhiễm M. pneumoniae theo độ tuổi và
các xét nghiệm khác nhau
Cấu trúc cơ quan bám dính của M. pneumoniae
Tổ chức cấu trúc của operon P1
Các giai đoạn của kỹ thuật PCR
Sơ đồ khuếch đại sản phẩm PCR

Trang
4
7
10
12
22
30
30
39
40


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) là một trong những nguyên

nhân gây viêm phổi khơng điển hình ở cộng đồng, bệnh lây lan qua khơng khí
hoặc trong các mơi trường giao tiếp gần gũi. Dịch bệnh bùng phát thường
xuất hiện một cách định kỳ, bệnh cảnh lâm sàng thay đổi từ không triệu
chứng sang viêm phổi [1].
Viêm phổi do M. pneumoniae thường gặp ở mọi lứa tuổi, khơng phân
biệt giới tính. Bệnh có thể gặp ở hầu hết các nơi trên thế giới, xảy ra quanh
năm, nhưng chủ yếu vào cuối mùa hè và chớm thu. Triệu chứng lâm sàng của
viêm phổi do M. pneumoniae thường là sốt trên 380C và ho khan. Tuy nhiên,
nếu chỉ căn cứ vào các triệu chứng lâm sàng thì chưa thể kết luận chính xác
ngun nhân gây viêm phổi là do vi khuẩn này.
M. pneumoniae gây viêm phổi bằng cách bám dính lên tế bào biểu mô cơ
quan hô hấp. Nếu không được phát hiện, chẩn đốn và điều trị kịp thời, bệnh
có thể tiến triển nặng hơn và biến chứng, thậm chí dẫn tới tử vong.
Trên thế giới, tỷ lệ mắc viêm phổi do M. pneumoniae chiếm khoảng từ
10 – 30% trong tổng số trẻ viêm đường hô hấp cấp. Ở Việt Nam, một trẻ dưới
5 tuổi thường trải qua 4 – 6 lần viêm đường hơ hấp cấp, trong đó 20 – 30%
dẫn đến viêm phổi. Tuy nhiên, hiện nay nước ta vẫn chưa có thống kê đầy đủ
về tỷ lệ mắc viêm phổi do M. pneumoniae ở trẻ em.
Trước đây, các phương pháp thường được sử dụng để phát hiện viêm
phổi do M. pneumoniae bao gồm nuôi cấy và huyết thanh học. Phương pháp
ni cấy phát hiện chính xác M. pneumoniae nhưng đòi hỏi thời gian dài (từ 2
– 3 tuần); phương pháp huyết thanh học đơn giản hơn phương pháp nuôi cấy

1


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

nhưng khơng có giá trị thực tiễn cho cơng tác điều trị mà chỉ có giá trị cho
cơng tác giám sát dịch tễ học.

Hiện nay, trên thế giới, kỹ thuật PCR đang được sử dụng một cách rộng
rãi. Phương pháp này cho phép phát hiện M. pneumoniae nhanh chóng
(1 ngày), có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, mang lại kết quả chẩn đốn chính
xác, khắc phục được nhược điểm của hai phương pháp trên.
Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào đầy đủ và có hệ
thống về vấn đề này, do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Áp dụng
kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện Mycoplasma pneumoniae gây viêm
đường hô hấp cấp ở trẻ em dưới 15 tuổi” với 3 mục tiêu:
1. Phát hiện nhanh và chính xác viêm phổi do M. pneumoniae;
2. Đánh giá vai trò gây bệnh của M. pneumoniae trong viêm đường
hô hấp cấp;
3. Phân loại protein bám dính P1 của M. pneumoniae dựa trên
phân tử.

2


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ M. PNEUMONIAE
1.1.1. Định danh và phân loại
Thuật ngữ “Mycoplasma” (theo tiếng Hy Lạp, “mykes” là “nấm”,
“plasma” là “dạng”) nổi lên từ những năm 1950 và được thay thế thuật ngữ cũ
– PPLO. Sự ám chỉ tới cách phát triển giống như nấm được đề cập trong tên
Mycoplasma liên quan đến sự phát triển của Mycoplasma mycoides, nhưng
sau đó thuật ngữ này khơng được chấp nhận. Vào những năm 1960,
Mycoplasma được xếp vào nhóm Mollicutes, từ này xuất phát từ tiếng Latin
(“molli” có nghĩa là “mềm” và “cutis” có nghĩa là “vỏ bọc”). Định danh hiện

nay trong lớp Mollicutes bao gồm 4 dưới lớp, 5 họ, 8 bộ và khoảng 200 loài
đã được biết đến và được phát hiện ở người, động vật có xương sống, động
vật chân khớp và thực vật. M. pneumoniae là một thành viên trong họ
Mycoplasmataceae và dưới lớp Mycoplasmatales.
Các thành viên lớp Mollicutes được đặc trưng bởi bộ gen nhỏ của chúng,
bao gồm một nhiễm sắc thể dạng vòng đơn chứa từ 0,58 – 2,2Mbp, hàm
lượng (G+C) thấp (23 – 40% mol) và khơng có thành tế bào. Định danh của
lớp này đã được mở rộng dựa trên các phân tích về 16 rRNA. Các nghiên cứu
về trình tự 16 rRNA cho thấy, Mycoplasmaong có quan hệ gần gũi nhất với
dưới nhóm vi khuẩn Gram dương bao gồm bacilli, streptococci, và
lactobacilli. Theo Maniloff, khoảng 605 triệu năm trước, lớp Mollicutes đã
được tách ra từ nhánh Streptococus của các vi khuẩn Gram dương. Các vi
khuẩn này có hàm lượng (G+C) thấp và bộ gen tương đối nhỏ, đó là kết quả
của sự thối hóa dần kích thước bộ gen từ tổ tiên chúng trong quá trình tiến

3


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

hóa suy biến. Cho đến nay, áp lực chọn lọc tự nhiên dẫn đến q trình tiến
hóa của Mollicutes vẫn chưa được biết chính xác [38].

Hình 1.1: Sơ đồ phân loại M. pneumoniae dựa trên
sự so sánh trình tự 16s rRNA [38]
1.1.2. Đặc điểm sinh học
Vi khuẩn Mycoplasma đầu tiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy
bệnh phẩm viêm phổi ở bò và được biết đến với cái tên Mycoplasma
mycoides, công bố bởi Nocad và Roux năm 1898 [48]. Hơn 50 năm sau, các
bằng chứng thu được liên quan đến tầm quan trọng của những vi khuẩn ký

sinh tại thời điểm đó là những vi sinh vật ưa gây viêm phổi màng phổi
(Pleuropneumonia like organisms – PPLOs) ở động vật và có khả năng gây
bệnh cho người. Vào những năm 1930, Klieneberger [39] đã đưa ra khái niệm
Mycoplasma là vi khuẩn dạng L, khơng có thành tế bào và sống cộng sinh với
các vi khuẩn có thành khác. Học thuyết này gây tranh cãi giữa những người

4


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

tin rằng Mycoplasma là loài duy nhất với những người cho rằng Mycoplasma
là biến thể thiếu thành tế bào của một lồi vi khuẩn đã biết và nó khơng đáng
được coi là một loài mới. Cho đến năm 1960, khi những thử nghiệm về hàm
lượng guanine cộng cytosine (G+C) và các thử nghiệm về lai DNA đã chứng
tỏ Mycoplasma là những dạng đặc biệt của sự sống, nó thiếu khả năng tạo
thành tế bào ở bất kỳ điều kiện nào. Các loài Mycoplasma và Ureaplasma đã
được biết đến gây bệnh cho người, trừ những chủng được phân lập không
thường xuyên hoặc những lồi Mycoplasma có nguồn gốc từ động vật nhưng
đơi khi gây bệnh cho người được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1.
Bảng 1.1: Mycoplasmas được phân lập từ người [38]
Sinh vật
Acholeplasma laidlawii

Nơi cư trú
Cơ quan
Cơ quan niệu
hô hấp
sinh dục
+

–

Mycoplasma buccale

+

Mycoplasma faucium

+

Mycoplasma fermentans
Mycoplasma hominis

+

Mycoplasma genitalium

–
–

Mycoplasma lipophilum

+

Mycoplasma orale
Mycoplasma pirum
Mycoplasma penetrans
Mycoplasma primatum
Mycoplasma salivarium

+
?

–

Mycoplasma pneumoniae

+

Mycoplasma spermatophilum

–
–
–

Ureaplasma urealyticum
Ureaplasma parvum

+
+

5

–
–

Vai trị gây
bệnh
Khơng
Khơng

Khơng

+
+

Có?
Có

+

Có

–
–

Khơng

?
+
+

–
–

Khơng
Khơng
?
Khơng
Khơng
Có

+

Khơng

+

Có

+

Có


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

Dienes và Edsall lần đầu tiên đã phân lập được Mycoplasma từ một ổ áp
xe hạch ở người vào năm 1937 [26]. Đây có thể là loại vi khuẩn mà bây giờ
được biết đến với cái tên Mycoplasma hominis. Các Mycoplasma khác từ
người bao gồm Mycoplasma fermentans, Mycoplasma salivarium và các
chủng T, sau đó là Ureaplasma được cơng bố vào những năm 1950. Loại vi
khuẩn được biết đến cuối cùng là M. pneumoniae, phân lập lần đầu tiên trong
môi trường nuôi cấy mô tách từ nước bọt của bệnh nhân viêm phổi tiên phát
khơng điển hình do Eaton và cộng sự thực hiện năm 1944, được đặt tên là tác
nhân Eaton [28]. Các thử nghiệm trên người tình nguyện và các nghiên cứu
trong những năm 1950 đã khẳng định: tác nhân Eaton là nguyên nhân gây
nhiễm trùng đường hô hấp dưới, nhưng nó vẫn được coi là một vi rút cho đến
khi người ta phát hiện các kháng sinh có thể tác động lên nó [16, 19, 44].
Năm 1961, Marmion và Goodburn cơng nhận tác nhân Eaton là PPLO và nó
khơng phải là vi rút [47]. Đến năm 1963, Chanock và cộng sự đã thành công

trong việc nuôi cấy tác nhân Eaton trong mơi trường khơng có tế bào và đề
xuất định danh cho nó là M. pneumoniae [17, 18].
Một số loài Mycoplasma hội sinh thường ký sinh tại họng người, phổ
biến nhất là Mycoplasma orale, Mycoplasma salivarium, chúng có thể gây
nhầm lẫn với M. pneumoniae trong chẩn đoán nếu chúng tìm cách xâm nhập
xuống bộ máy hơ hấp dưới.
Trong các loài Mycoplasma gây bệnh ở người, M. pneumoniae được biết
đến nhiều nhất và được nghiên cứu cẩn thận nhất. Có rất nhiều nghiên cứu
trong những năm gần đây về sinh học tế bào, đáp ứng miễn dịch trên vật chủ
mà M. pneumoniae gây ra, các kỹ thuật phát hiện M. pneumoniae trong phịng
thí nghiệm, dịch tễ bệnh học và vai trị gây bệnh của nó cho bộ máy hơ hấp.

6


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

1.1.3. Sinh học tế bào
Mycoplasma là loài sinh vật tự tái bản nhỏ nhất cả về kích thước tế bào
lẫn bộ gen, chúng tồn tại ở dạng tế bào tự do.
Các tế bào có dạng hình mũ của M. pneumoniae có kích thước dài từ 1 –
2µm và rộng từ 0,1 – 0,2µm (so với các trực khuẩn điển hình dài từ 1 – 4µm,
rộng từ 0,5 – 1µm thì thể tích tế bào của M. pneumoniae nhỏ hơn 5%). Kích
thước và thể tích nhỏ của tế bào Mycoplasma cho phép chúng dễ dàng đi qua
màng lọc vi khuẩn có kích thước 0,45µm (là loại màng lọc thường được sử
dụng để lọc vơ trùng). Vì khối lượng tế bào nhỏ nên M. pneumoniae khơng
thể phát hiện được bằng kính hiển vi quang học và chúng cũng không tạo ra
độ đục trong mơi trường ni cấy lỏng. Khuẩn lạc điển hình của M.
pneumoniae khi nuôi cấy trong môi trường được làm giàu như thạch SP4
hiếm khi vượt quá 100µm và phải sử dụng kính hiển vi đa lập thể để quan sát

đặc điểm hình thái của chúng.

Hình 1.2: Nhóm khuẩn lạc M. pneumoniae hình cầu
sinh trưởng trong mơi trường thạch SP4 [38]

7


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

Bộ gen của M. pneumoniae đã được giải trình tự vào năm 1996, bao gồm
816.394bp với 687 gen [31], bằng 1/5 bộ gen của Escherichia coli
(4.600.000bp và 4.300 gen) [52]. Bộ gen nhỏ của M. pneumoniae và khả năng
sinh tổng hợp hạn chế của nó là nguyên nhân của nhiều đặc tính sinh học và
những u cầu phức tạp về mơi trường ni cấy trong phịng thí nghiệm.
Mollicutes khơng có khả năng tổng hợp thành tế bào peptidoglycan do trong
bộ gen khơng có gen chịu trách nhiệm cho q trình này. Vì thiếu thành tế
bào chắc chắn nên tế bào này có tính đa hình thái, khơng thể phân loại như
cầu khuẩn hay trực khuẩn theo các quy ước phân loại vi khuẩn thông thường.
Trong tự nhiên, Mollicutes chưa bao giờ được tìm thấy như một sinh vật sống
tự do vì nó phải dựa vào tế bào vật chủ để cộng sinh. Một đặc tính khác của
hầu hết Mollicutes và các thành viên của bộ Mycoplasma là chúng cần sterol
– thành phần cần thiết cho màng tế bào 3 lớp, thứ tạo nên cấu trúc hỗ trợ cho
tính thấm của nó – được cung cấp bằng cách bổ sung huyết thanh trong mơi
trường ni nhân tạo.
Duy trì tính thấm ổn định đặc biệt quan trọng đối với nhóm Mollicutes vì
chúng thiếu lớp thành tế bào vững chắc. Những sinh vật này có thể phát triển
trong mơi trường ổn định về tính thấm là mơi trường bên trong vật chủ (có
nhân), chúng đặc biệt nhạy cảm với điều kiện khô. Điều này có ý nghĩa lớn
đến yêu cầu phải có cách xử lý phù hợp các mẫu bệnh phẩm lâm sàng để có

thể phân lập được các chủng vi sinh vật này bằng phương pháp ni cấy, hơn
nữa, chỉ có sự tiếp xúc gần mới tạo điều kiện dễ dàng cho việc truyền bệnh từ
người sang người qua khơng khí. Một thành phần cấu trúc khác của tế bào M.
pneumoniae là lưới protein, đóng vai trị quan trọng trong sự sống sót ngoại
bào, tạo dựng nên bộ khung để hỗ trợ cho màng tế bào.
Một khía cạnh khác về sinh học tế bào của M. pneumoniae vẫn chưa
được hiểu rộng rãi là trên thực tế, những sinh vật này cùng với một số loài

8


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

khác của Mollicutes có khả năng phát sinh ra các vật liệu vỏ bên ngồi màng
tế bào. Sự có mặt của vật liệu vỏ M. pneumoniae được công bố năm 1976
trong một báo cáo về cấu trúc cực lớn của M. pneumoniae khi cấu trúc này
được xác định bằng kính hiển vi điện tử [59]. Điều này cho thấy, các vật liệu
vỏ có thể đóng vai trị trong sự bám dính nhưng chưa được kết luận rõ ràng.
So với các vi khuẩn thông thường, hoạt động sinh tổng hợp và trao đổi
chất của M. pneumoniae rất hạn chế đối với các protein, cacbon hydrat và
chất béo. Giống như các loài Mollicutes khác, nhu cầu của nó là các tiền acid
nucleid, hình như không phải để tổng hợp các purin, pyrimidine. M.
pneumoniae có khả năng lên men glucose thành axit lactic bằng cách phốt
pho hóa cơ chất dưới tác dụng của enzym phân hủy acid phosphoglyceric, sử
dụng enzym kinase và pyruvate kinase để tạo ra ATP. Ngồi ra, đã có những
nghiên cứu đáng kể về hệ enzym của M. pneumoniae. Phần lớn những điều
được biết đến hiện nay về đặc tính trao đổi chất của M. pneumoniae đều thông
qua bộ gen của nó và việc xác định trực tiếp các gen mã hóa hệ thống enzym
chịu trách nhiệm trong các hướng trao đổi chất khác nhau [23, 31]. Tuy nhiên,
một số phát hiện không mong đợi đã xảy ra từ khi các đoạn trình tự trong bộ

gen được giải mã và những giải thích về bộ gen được cơng bố, ví dụ như các
bằng chứng về bộ gen cho các enzym như arginine deiminase, thậm chí bằng
chứng về hoạt tính sinh hóa của việc sản xuất amon chưa được tìm thấy trực
tiếp trong M. pneumoniae. Pollack và cộng sự gần đây đã báo cáo về con
đường tổng hợp cacbon hydrat chính của Mollicutes và chỉ ra rằng M.
pneumoniae có tất cả 10 phản ứng phân giải glucoza, nhưng chu trình axit 3
cacbon và chuỗi vận chuyển electron hoàn chỉnh thiếu các sắc tố tế bào [49].
Do đó axit lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men bị giảm tương
đối với các electron mà năng lượng có thể bị giữ lại nếu tiền pyruvate có thể
sẽ làm chuyển hướng quá trình lên men đến chu trình axit 3 cacbon.

9


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

M. pneumoniae làm giảm tetrazolium bằng cách hoặc hiếu khí, hoặc kỵ
khí, đây là một trong những đặc tính đã từng được sử dụng để xác định các
loài và phân biệt chúng từ các Mycoplasma hội sinh trong họng. Ứng dụng
của kỹ thuật khuếch đại axid nucleic PCR đã tỏ ra ưu việt hơn hẳn các
phương pháp định danh trước đó như phương pháp làm giảm tetazolium và
phương pháp hấp phụ trên bề mặt hồng cầu chuột lang trước đó. Danh sách
liệt kê tất cả các enzym tham gia vào các chu trình trao đổi chất được mã hóa
trong bộ gen của M. pneumoniae đã được công bố tại địa chỉ www.bork.emblheidelberg.de/Annot/MP/. Một đặc trưng khác của Mycoplasma ssp. là sử
dụng bộ 3 mã hóa dừng UGA để tổng hợp tryptophan.
Giống như các loài Mollicutes khác, M. pneumoniae đã phát triển những
chu trình tái sản xuất chun hóa như kết quả của sự thích nghi để tồn tại với
một bộ gen hạn chế và cách sống ký sinh cần thiết phải gắn liền với tế bào
chủ. Nó sinh sản bằng phương pháp nhân đơi: đầu tiên nó nhân đơi cơ quan
bám dính, sau đó phân tách cơ quan này ra hai cực đối diện trước khi thực

hiện quá trình phân chia tế bào chất (hình 1.3).

Hình 1.3: Sơ đồ sự phân chia tế bào và nhân đơi cấu trúc
đầu bám dính của M. pneumoniae [38]

10


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

M. pneumoniae bám và di chuyển trên bề mặt kính hoặc trên các bề mặt
rắn khác bằng cơ quan bám dính ở đuôi. Cả phương pháp quan sát bằng hiển
vi điện tử lẫn phân tích bộ gen của M. pneumoniae đều không chứng minh
được sự tồn tại của cấu trúc như lông mao, điều này cho thấy, sự di chuyển
xảy ra theo một cơ chế nào đó liên quan đến cơ quan bám dính.
1.1.4. Vai trị gây bệnh
Mycoplasma là tác nhân gây bệnh đầu tiên cho tổ chức niêm mạc,
thường gặp ở đường hơ hấp và niệu – sinh dục, nó ký sinh và tồn tại trong
mối liên kết chặt chẽ với tế bào biểu mô của vật chủ. M. pneumoniae ký sinh
tuyệt đối ở người, trong khi một số Mycoplasma khác đã được tìm thấy ở cả
những động vật linh trưởng. Năm 1998, Razin và cộng sự đã công bố một báo
cáo tổng hợp về sinh học phân tử và khả năng gây bệnh của Mycoplasma,
trong đó bao gồm các thông tin đáng kể về M. pneumoniae.
1.1.4.1. Biểu mô của cơ quan hơ hấp
Các bằng chứng tích lũy từ thập niên 60 qua các mẫu động vật cũng như
tế bào in vitro và hệ thống nuôi cấy cơ quan cho thấy, việc bám dính của M.
pneumoniae lên biểu mơ cơ quan hô hấp tạo điều kiện gây bệnh về sau [55].
Sự tương tác gần gũi giữa M. pneumoniae và tế bào vật chủ như vậy bảo vệ
nó khơng bị loại bỏ bởi cơ chế làm sạch của hệ lông mao ở niêm mạc vật chủ,
cho phép chúng tạo ra sự đa dạng về tác động gây độc tế bào tại chỗ.

Vì M. pneumoniae là tác nhân gây bệnh ngoại bào tiên phát, sự tồn tại
của nó phụ thuộc vào mối liên kết chặt chẽ với tế bào vật chủ nên trong q
trình tiến hóa, một cơ quan bám dính chun biệt hoàn hảo đã được phát triển
để tạo điều kiện dễ dàng cho việc ký sinh (hình 1.4). Cơ quan này có cấu trúc

11


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

với một đầu chuyên biệt cùng với một lõi trung tâm, bao xung quanh là một
khoảng trống được tạo ra bởi sự mở rộng của lớp màng tế bào.

Hình 1.4: Các mũi tên chỉ cấu trúc đầu bám dính của M. pneumoniae
dưới kinh hiển vi điện tử [38]
Thực tế, cấu trúc đầu (tip) là một mạng lưới bao gồm các protein bám
dính, các protein tương tác và các protein cần thiết khác, chúng cùng nhau
hợp tác về cấu trúc và chức năng để di chuyển và tập trung các protein bám
dính tại đầu của M. pneumoniae. Sự kết hợp giữa tế bào chủ và các protein
bám dính của Mycoplasma vẫn chưa được xác định đặc tính một cách chắc
chắn. Các dữ liệu gần đây cho thấy, có hai protein biểu hiện trên bề mặt tế
bào của M. pneumoniae, sự kéo dài nhân tố TU và enzym pyruvate
dehydrogenase E1 β cũng liên quan đến việc gắn kết M. pneumoniae tới các
fibronectin – một thành phần rất phổ biến ở các bề mặt tế bào nhân thật, màng
đáy tế bào và chất đệm ngoại bào.

12


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

Protein bám dính P1 có trọng lượng phân tử 170kDa, tập trung ở đầu
bám dính, là cấu trúc chủ yếu chịu trách nhiệm cho sự tương tác giữa M.
pneumoniae với tế bào vật chủ. P1 không chỉ tập trung ở cơ quan bám dính
mà cịn trải rộng với mật độ thấp ở bề mặt tế bào. Hoạt tính của P1 chỉ bị mất
do đột biến hay do tác động của trypsin dẫn đến việc giảm độc lực do sự bám
dính của Mycoplasma vào tế bào vật chủ (có nhân) bị giảm [9, 11, 12, 21, 22,
34, 40, 41]. Nếu P1 không hoạt động, cơ quan bám dính sẽ tự biến đổi và bổ
sung các protein cần thiết để khôi phục nguyên vẹn cấu trúc và chức năng ban
đầu, từ đó khơi phục đầy đủ khả năng gây nhiễm trùng. Các bằng chứng
thuyết phục hơn về vai trị, chức năng bám dính của P1 là các kháng thể đơn
dịng kháng lại nó đã cản trở q trình bám dính của Mycoplasma lên tế bào
vật chủ (mơ hình gây bệnh viêm đường hơ hấp do Mycoplasma trên chuột đất
vàng), trong khi các kháng thể khác được tạo ra để chống lại một số protein
khác của M. pneumoniae thì khơng ảnh hưởng đến khả năng bám dính.
Jacobs đặt giả thuyết các quyết định kháng nguyên nổi trội về miễn dịch
của chất kết dính M. pneumoniae khác với các vùng (domains) trung gian
bám dính bảo tồn cao. Điều này cho thấy, lý do của việc thiếu hụt tính miễn
dịch bảo vệ chống lại q trình tái nhiễm thậm chí có phản ứng huyết thanh
học là do trên thực tế, các kháng thể trực tiếp chống lại các vùng khác nhau
này chưa chắc đã là các kháng thể ngăn cản hiệu quả sự bám dính. Nghiên
cứu của Baseman và cộng sự đã gợi ý rằng, protein P1 đơn độc khơng đủ gây
nên sự bám dính của M. pneumoniae lên tế bào vật chủ mà cần phải có sự
phối hợp của một số protein khác nữa [10, 42, 43]. Một trong những protein
đó là protein 30 (P30) – chức năng của nó đã được chứng minh qua việc sử
dụng các kháng thể kháng P30 để làm mất khả năng hấp phụ lên hồng cầu của
M. pneumoniae. Gần đây, Balish và Krause cho rằng protein P30 có thể tham

13

Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

gia vào tính di chuyển bằng cách lướt cũng như sắp xếp quá trình phân chia tế
bào liên quan đến điểm bắt đầu sinh học của cơ quan bám dính [47].
Các cấu trúc khác được tạo ra bởi M. pneumoniae như các nhân tố trung
gian cho q trình bám dính bao gồm các protein: HMW1, HMW2, HMW3,
HMW4, HMW5, P90, và P65. Thêm vào đó, P30 cũng được cho là có tham
gia vào quá trình tạo lập nên cấu trúc cực (polar). Khi cấu trúc cực này được
thiết lập, phức hệ lắp ráp độc lập các protein B, C và P1 được đưa tới cấu trúc
này để hoàn chỉnh đầu chức năng của cơ quan bám dính. Những thảo luận sâu
hơn về sự tương tác của Mycoplasma với tế bào chủ và q trình bám dính ở
mức độ dưới tế bào đã được công bố gần đây bởi Rottem [51].
1.1.4.2. Bệnh cảnh lâm sàng
Việc chứng minh viêm phổi do M. pneumoniae đã được công nhận từ
nhiều năm trước khi nhận dạng bản chất của tác nhân gây bệnh. Sự thất bại
trong việc sử dụng sulfonamides hoặc penicillin để điều trị viêm phổi đã phân
biệt và chứng minh được tác nhân gây viêm phổi do M. pneumoniae hay viêm
phổi kinh điển do phế cầu (pneumococci). Việc không đáp ứng với trị liệu
kháng khuẩn đã được nghĩ là “khơng điển hình” (atypical) và điều kiện để
khơng đáp ứng đó được cho là do thể loại bệnh phổi tiên phát khơng rõ
ngun nhân; tính từ lúc này, thuật ngữ “viêm phổi khơng điển hình tiên
phát” đã được tạo ra. Thuật ngữ này cùng với “viêm phổi dạo quanh” được sử
dụng rộng rãi bởi các nhà nội khoa và để nói tới bệnh viêm đường hơ hấp do
Mycoplasma đối với con người.
Nhiễm trùng M. pneumoniae có thể biểu hiện ở đường hô hấp trên,
đường hô hấp dưới hoặc cả hai. Tần suất của những biểu hiện nhiễm trùng
đường hô hấp trên thay đổi ở nhiều nghiên cứu khoảng giữa thập niên 1960.
Trong một số báo cáo, khoảng 50% số trường hợp nhiễm trùng M.

14


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

pneumoniae có biểu hiện nhiễm trùng đường hơ hấp trên. Điển hình, bệnh
phát triển từ từ trong vài ngày, thường dai dẳng hàng tuần đến hàng tháng.
Biểu hiện phổ biến nhất là đau họng, khàn tiếng, sốt và ho, lúc đầu ho khan,
sau có đờm (khơng nhiều) nhưng khơng có máu; đau đầu, ớn lạnh, đau lưng,
đau tai và mệt mỏi nói chung. Khó thở có thể xảy ra ở những trường hợp nặng
hơn; ho có thể có đặc điểm giống ho gà làm bệnh nhân có cảm giác đau ngực
do ho kéo dài [20]. Có thể có viêm họng kèm hay không kèm viêm hạch cổ;
đặc biệt ở trẻ em, viêm kết mạc và viêm màng nhĩ thỉnh thoảng xảy ra [6].
Với trẻ dưới 5 tuổi, biểu hiện hay gặp nhất là sổ mũi và thở rít nhưng sự tiến
triển tới viêm phổi thường không phổ biến; trong khi ở trẻ lớn hơn (từ 5 – 15
tuổi), nhiễm trùng dễ phát triển thành viêm phế quản phổi ở một hay nhiều
thuỳ phổi; đôi khi bệnh nhân phải điều trị tại bệnh viện [29]. Một số nghiên
cứu từ những năm 1960 đến 1970 đã chỉ ra M. pneumoniae có thể là nguyên
nhân của 5% số trẻ bị viêm tiểu phế quản [25]. Ở người trưởng thành, nhiễm
trùng nhẹ, trạng thái không triệu chứng đặc biệt phổ biến. Viêm phế quản
phổi ở một hay nhiều thuỳ tiến triển ở 3 – 10% những người bị nhiễm. Như
đã đề cập ở trên, M. pneumoniae là một nguyên nhân quan trọng của viêm
phổi nặng đến mức phải được điều trị tại bệnh viện, nhất là đối với người lớn
tuổi [47].
Nghe phổi có thể thấy tiếng rít rải rác hoặc khu trú vì phế nang thường
không bị viêm, ran và độ đục không phổ biến lắm nếu như sự xẹp phổi không
lan rộng. Trong những trường hợp khơng biến chứng, giai đoạn sốt cấp tính
kéo dài khoảng 1 tuần, ho và mệt mỏi có thể tồn tại 2 tuần hoặc dài hơn. Thời
gian có các triệu chứng hay dấu hiệu lâm sàng thường rút ngắn nếu việc điều
trị kháng khuẩn được thực hiện sớm.

Một điều quan trọng mà các nhà lâm sàng cần phải hiểu là những biểu
hiện lâm sàng của nhiễm trùng đường hô hấp do M. pneumoniae cũng giống

15


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

như những tác nhân gây bệnh đường hô hấp khác gây nên như Chlamydia.
pneumoniae, các vi rút đường hô hấp và các vi khuẩn như phế cầu khuẩn. M.
pneumoniae có thể có mặt ở đường hơ hấp đồng thời với với những tác nhân
gây bệnh khác [15]. Một số bằng chứng ở người và mơ hình gây nhiễm trùng
ở động vật đã cho thấy, nhiễm trùng M. pneumoniae có thể tiến tới hay tăng
cường khả năng bị mắc các bệnh nhiễm trùng tiếp theo bởi các loại vi rút
đường hô hấp khác hoặc bởi các loại vi khuẩn, kể cả Streptococcus pyogenes
(liên cầu gây thấp tim) và Neisseria menigitidis (não mô cầu). Điều này có thể
do sự ức chế miễn dịch hay do sự thay đổi hệ vi khuẩn chí ở đường hơ hấp do
sự có mặt của M. pneumoniae.
Những trẻ em bị dị tật khơng có lách, suy giảm hệ thống miễn dịch vì
bệnh tế bào hình liềm hay trong điều kiện bị hội chứng Down và nhiều trạng
thái ức chế miễn dịch khác đều có nguy cao bị viêm phổi nặng khi nhiễm
trùng M. pneumoniae [14]. Chứng giảm gammaglobulin máu cũng là nguy cơ
cao mắc bệnh nhiễm trùng đường hô hấp và khớp do M. pneumoniae. Nhiễm
trùng nặng, đa phủ tạng dẫn đến tử vong do M. pneumoniae cũng đã có báo
cáo nhưng ít gặp.
1.1.5. Đặc điểm dịch tễ học
1.1.5.1. Tỷ lệ lưu hành và đặc điểm theo mùa của bệnh
Ngay sau khi xác định M. pneumoniae là tác nhân gây viêm phổi khơng
điển hình tiên phát ở đầu những năm 1960, những nghiên cứu về tỷ lệ mắc, tỷ
lệ lưu hành, phương thức lây truyền và phạm vi của bệnh đã được nhiều nơi

quan tâm [38].
Trên thế giới, nhiễm trùng M. pneumoniae có thể xuất hiện ở cả đường
hô hấp trên và đường hô hấp dưới, xảy ra ở cả người lớn và trẻ em với mức

16


Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học

độ bệnh địa phương (endemic) hoặc bệnh dịch (epidemic). Khí hậu và địa lý
không phải là những yếu tố cơ bản cho dịch bệnh lây lan [38]. Sự phát triển
thành bệnh dịch có chu kỳ từ 4 – 7 năm. Sự lan truyền của bệnh chậm bởi khả
năng lây lan bị giới hạn và khoảng thời gian lây lan giữa các trường hợp kéo
dài (xấp xỉ 3 tuần). Dịch bệnh có thể kéo dài 1 – 2 năm trong các cộng đồng
lớn hơn. Tỷ lệ mắc cao được thấy ở lứa tuổi học sinh, chúng lây bệnh cho
nhau, nhưng bản thân lớp học không phải là tâm điểm truyền bệnh. Sự lan
truyền bệnh giữa những người hàng xóm cũng từng được phát hiện và các ổ
dịch nhỏ, thường xuất hiện trong phạm vi môi trường sống tập thể. Trong tân
binh, tỷ lệ mắc bệnh thay đổi giữa các đơn vị trung đội; ở mơi trường cơng sở,
sự lan truyền có thể xảy ra giữa các tòa nhà [32].
Hầu hết các vụ dịch xuất hiện là do lan truyền từ người này sang người
khác. Trong một bữa tiệc, gần một nửa số trẻ em đã bị lây bệnh; 7 trong số 23
người phải nhập viện do viêm phổi. Sự bùng phát đã từng xảy ra trong phịng
thí nghiệm nha khoa: việc khoan lỗ mài đá chế tạo răng giả làm cho bệnh lan
truyền qua khơng khí. Dịch bùng phát ngay cả trong trung tâm hạt nhân dưới
đáy biển. Sự tái tuần hoàn của khơng khí cũng có thể là phương tiện lan
truyền [38].
Tỷ lệ nhiễm trong các doanh trại tân binh có thể rất cao: năm 1955, ở
Parris Island viêm phổi do M. pneumoniae đạt 1,5%, viêm phổi khơng kể đến
chẩn đốn cao hơn 30 lần. Sự bùng phát trong quân đội có thể do phơi nhiễm

cao và các hoạt động tập thể tạo điều kiện dễ dàng cho sự lây lan [32].
Viêm phổi do M. pneumoniae được theo dõi trong 150.000 thành viên
của một trung tâm chăm sóc sức khỏe ở Seattle vào năm 1963 – 1975, 10%
trong số họ được chọn sống ở đô thị và vùng lân cận. Chẩn đoán bệnh bằng
phương pháp phân lập và tăng hiệu giá kháng thể CF antilipid. Tỷ lệ viêm

17