Tách dòng và biểu hiện gen chil 6 trong tế bào vi khuẩn e coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THY NGỌC

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN chIL-6
TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Hà Nội tháng 9/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN THY NGỌC

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN chIL-6
TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. PGS.TS Phạm Việt Cường
2. PGS.TS Khuất Hữu Thanh

Hà Nội 9/2011


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... 3
T
3

3T

LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... 4
T
3

3T

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ...................................... 5
T
3

T
3

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 6
T

3

3T

A - Lý do chọn đề tài........................................................................................... 7
T
3

3T

B - Mục tiêu nghiên cứu của luận văn: ................................................................. 8
T
3

T
3

C - Nội dung nghiên cứu của luận văn:................................................................. 8
T
3

T
3

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 9
T
3

T
3

1.1. Tổng quan về Interleukin-6: .......................................................................... 9
T
3

T
3

1.1.1. Nguồn gốc của IL-6: ............................................................................... 9
T
3

T
3

1.1.2. Lịch sử phát hiện IL-6: .......................................................................... 10
T
3

T
3

1.1.3. Hoạt tính sinh học của IL-6:.................................................................. 12
T
3

T
3

1.1.4. Vai trị của IL-6 trong đáp ứng miễn dịch: ............................................ 16

T
3

T
3

1.1.5. Cấu trúc của IL-6 .................................................................................. 18
T
3

3T

1.2. Tình hình nghiên cứu về gen chIL-6 ở Việt Nam và trên thế giới:................ 21
T
3

T
3

1.2.1. Tình hình nghiên cứu IL-6 trên thế giới ................................................. 21
T
3

T
3

1.2.2. Tình hình nghiên cứu IL-6 ở Việt Nam: ................................................. 22
T
3

T
3

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................... 23
T
3

T
3

2.1. Vật liệu........................................................................................................ 23
T
3

3T

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu : ......................................................................... 23
T
3

T
3

2.1.2. Hóa chất: .............................................................................................. 24
T
3

3T

2.1.3. Máy móc thiết bị: .................................................................................. 25

T
3

3T

2.2. Phương pháp nghiên cứu: ........................................................................... 26
T
3

T
3

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mô lá lách của gà ........................................ 26
T
3

T
3

2.2.2. Phương pháp xác định nồng độ bằng quang phổ kế ............................. 27
T
3

T
3

2.2.3.Phương pháp RT – PCR ......................................................................... 28
T
3

T
3

2.2.4 . Khuếch đại một đoạn gen bằng phản ứng PCR .................................... 29
T
3

T
3

2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid.................................................. 30
T
3

T
3

2.2.6. Phương pháp cắt, nối DNA bằng enzym giới hạn .................................. 30
T
3

T
3

1


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

2.2.7. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến.................................................. 31
T
3

T
3

2.2.8. Phương pháp biến nạp vào E. coli bằng sốc nhiệt ................................. 32
T
3

T
3

2.2.9. Phương pháp điện di trên gel agar 1% .................................................. 32
T
3

T
3

2.2.10. Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agar (thôi gel) .............................. 33
T
3

T
3

2.2.11. Phương pháp điện di protein SDS – PAGE.......................................... 34

T
3

T
3

2.2.12. Xác định Protein là nội bào hay ngoại bào.......................................... 36
T
3

T
3

2.2.13. Xác định trạng thái Protein (hịa tan hay khơng hịa tan) .................... 36
T
3

T
3

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 38
T
3

T
3

A- KẾT QUẢ TÁCH DÒNG chIL-6:................................................................. 38
T
3

T
3

3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số ............................................................... 38
T
3

T
3

3.2. Kết quả tạo cDNA của chIL-6 bằng phản ứng RT-PCR: ........................... 39
T
3

T
3

3.3. Phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector pCR®2.1 ............................. 40
T
3

P

P

T
3

3.4. Tách chiết plasmid tái tổ hợp..................................................................... 42

T
3

T
3

3.5. Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng cách cắt với enzym giới hạn EcoRI ......... 43
T
3

T
3

3.6. Kết quả xác định trình tự gen chIL-6 của gà ............................................. 45
T
3

T
3

3.7. So sánh trình tự gen và trình tự axit amin chIL-6 phân lập ở Việt Nam và
T
3

trình tự đã công bố .......................................................................................... 46
3T

B- BIỂU HIỆN GEN chIL-6 TRONG VI KHUẨN E.Coli ................................. 47
T
3

T
3

3.8. Kết quả đồng bộ hoá bộ mã của chIL-6 phù hợp E. coli............................ 47
T
3

T
3

3.9. Kết quả thiết kế mồi thích hợp để gắn gen chIL-6 vào vector biểu hiện: ... 50
T
3

T
3

3.10. Thiết kế vector biểu hiện pGS-21a-chIL-6. ............................................. 52
T
3

T
3

3.11.Biến nạp vào tế bào E.coli BL21 (DE3 star): ........................................... 54
T
3

T

3

3.12. Kết quả biểu hiện pGS-21a-chIL-6 : ....................................................... 55
T
3

T
3

3.13. Xác định trạng thái hòa tan của protein: ................................................. 56
T
3

T
3

3.14. Nghiên cứu khảo sát một số yếu tố điều kiện biểu hiện cảm ứng: ........... 58
T
3

T
3

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 61
T
3

T
3

4.1 Kết luận:....................................................................................................... 61
T
3

3T

4.2. Kiến nghị hướng phát triển đề tài: ............................................................... 61
T
3

T
3

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 62
T
3

3T

PHỤ LỤC ............................................................................................................. 65
T
3

3T

2


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn tốt nghiệp “Tách dòng và biểu hiện gen chIL-6
trong vi khuẩn E.coli” là kết quả nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự
hướng dẫn khoa học của PGS.TS Phạm Việt Cường (phòng Các chất chức năng
sinh học - Viện Công nghệ sinh học và PGS.TS Khuất Hữu Thanh (Trung tâm
nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội).
Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng
tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của
luận văn.

Tác giả

Nguyễn Thy Ngọc

3


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS. TS
Phạm Việt Cường (phòng Các chất chức năng sinh học - Viện Công nghệ sinh học),
và PGS.TS Khuất Hữu Thanh (Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh
học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội) đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và dìu dắt
tơi trong q suốt q trình nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Cúc, Th.S Vũ Thị Thu

Huyền cùng các cán bộ Phòng Các chất chức năng sinh học - Viện Cơng nghệ sinh
học đã có những góp ý q báu cho tơi trong q trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và
động viên tôi trong suốt q trình nghiên cứu, đã giúp tơi hồn thành tốt khóa luận
này.
Do điều kiện, khả năng và thời gian thực hiện có giới hạn nên đề tài khơng
thể tránh khỏi những sai sót. Tơi rất mong nhận được sự đóng góp các thầy cơ và
các bạn để đề tài của tơi được hồn thiện hơn.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 9 năm 2011
Học viên thực hiện

NGUYỄN THY NGỌC

4


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Amp

Ampicillin

a.a

Axit amin

CLT

Lymphô bào T gây độc tế bào

DNA

Deoxyribonucleotid Acid

DEPC

Diethylpyrocarbonat

dNTP

Deoxyribonucleotid 5’-triphosphates

EtBr

Ethidium bromide

EDTA

Ethylen diamine tetraacetic acid

IFN

Interferon

IL

Interleukin

kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

mRNA

messenger RNA

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

Primer F

Mồi xuôi

Primer R

Mồi ngược

RE

Enzym cắt giới hạn

RNA

Ribonucleotid Acid

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Sol

Solution

TAE

Tris-Acetate-EDTA

5


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

DANH MỤC ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Trang
Hình 3.1: Kết quả tách chiết RNA tổng số từ máu gà

39

Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agar 1%

41

Hình 3.3: Các khuẩn lạc E.coli sau biến nạp trên mơi trường chọn lọc

42

Hình 3.4: Kết quả tách chiết Plasmid

44

Hình 3.5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt bằng EcoRI

45

Hình 3.6: Kết quả tinh sạch plasmid mang gen IL-6

46

Hình 3.7. Hệ số thích ứng codon CAI (Codon Adaptation Index) của gen
chIL-6 trước và sau tối ưu hố.

52

Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR

54

Hình 3.9: Ảnh điện di sản phẩm cắt của vector pGS-21a và sản phẩm
PCR sau khi cắt bằng 2 enzym giới hạn Nco I và Xho I

55

Hình 3.10: Ảnh điện di cắt kiểm tra plasmid pGS-21a-chIL-6

57

Hình 3.11: Điện di đồ SDS - PAGE của protein biểu hiện

58

Hình 3.12: Điện di đồ SDS-PAGE xác định trạng thái hịa tan của protein

59

Hình 3.13: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG lên kết
quả biểu hiện protein tái tổ hợp

61

Hình 3.14: Khảo sát ảnh hưởng của nhiêt độ lên kết quả biểu
hiện protein tái tổ hợp

62

6


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
A - Lý do chọn đề tài
Cùng với sự gia tăng nhu cầu tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm gia cầm an
tồn thì việc phát hiện và phòng trừ các bệnh dịch gia cầm đang là một thách thức
lớn đối với nền Công nghiệp sản xuất thực phẩm. Nhiều nhân tố gây bệnh ở gà đã
xâm nhập vào cơ thể vật chủ thông qua hệ thống đường ruột. Để giải quyết vấn đề
này cần có một giải pháp tổng thể mang tính chiến lược trong việc phòng trừ các
nhân tố gây bệnh ở gia cầm dựa trên việc nghiên cứu sự tác động qua lại giữa vật
chủ - tác nhân gây bệnh. Hiện nay, người ta đang nghiên cứu ứng dụng các phương
pháp sinh học phân tử, miễn dịch học trong việc phát hiện, điều trị và phòng chống
các bệnh ở gia cầm nói chung và ở gà nói riêng.
Trong hai thập kỉ gần đây, nhiều nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm tác dụng
kích ứng miễn dịch và liệu pháp điều trị của cytokin đã được chú trọng, ví dụ:
-

Ứng dụng sản phẩm nguyên thể protein cytokin.

-

Sản xuất vector tái tổ hợp để sản xuất chế phẩm rồi ứng dụng.

-

Nghiên cứu phát triển hệ thống vector tái tổ hợp phù hợp mang gen cytokin
(đơn hoặc đa gen) đưa trực tiếp vào cơ thể và sử dụng như là một chế phẩm hỗ
trợ miễn dịch.
Cytokin là những phân tử protein tín hiệu nhỏ trong tế bào, được tiết ra bởi

các tế bào thần kinh đệm của hệ thống thần kinh và hệ thống miễn dịch, đóng vai trị
quan trọng trong q trình thơng tin nội bào.
IL-6 là một cytokin đa chức năng, có vai trị quan trọng điều hồ miễn dịch
trong q trình nhiễm virut cấp. IL-6 nếu được sản xuất bằng con đường tái tổ hợp,
tinh sạch sản phẩm và đưa vào cơ thể để tăng cường miễn dịch, sẽ rất tốn kém và
đòi hỏi phương thức sử dụng bằng đường tiêm, rất phức tạp, đặc biệt cho đối tượng
là gia cầm. Do vậy hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào chọn lọc, phân lập gen
IL-6, rồi tái tổ hợp vào vector để đưa vector vào cơ thể gia cầm, đặc biệt khi sử
dụng loại vector cho uống / ăn / đường tiêu hóa / hơ hấp / niêm mạc thì lợi thế của
công nghệ nhân lên hàng chục lần, đặc biệt cho gia cầm nuôi mật độ đông.
7


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

Với mục tiêu thử nghiệm sản xuất và tinh sạch lượng lớn protein interleukin
6 của gà (chIL-6) tinh khiết, chúng tơi tiến hành q trình thu nhận gen interleukin
6 của gà (chIL-6) và tiến hành chuyển nạp vào vector biểu hiện và biểu hiện gen
trong hệ thống E.coli.
Để thực hiện được mục tiêu này, chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Tách dịng và biểu hiện gen chIL-6 trong tế bào vi khuẩn E.coli”. Đề tài này là
một nhánh nghiên cứu trong vấn đề nghiên cứu sử dụng cytokin chIL-6 ở gà như
một tăng cường chất miễn dịch cho gia cầm.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Các chất chức năng sinh học – Viện Công
nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
B - Mục tiêu nghiên cứu của luận văn:
Tiến hành tách dịng gen chIL-6 từ mẫu mơ lá lách của gà, gắn vào vector tách
dịng pCR2.1, giải trình tự gen chIL-6, đối chiếu với ngân hàng dữ liệu Genbank.
Từ gen chIL-6 đã được dịng hóa trong vector tách dòng pCR2.1, gắn vào
vector biểu hiện pGS-21a và biểu hiện trong tế bào E.coli chủng BL21 (DE3). Xác
định protein thu được ở trạng thái nội bào hay ngoại bào và trạng thái hòa tan.
C - Nội dung nghiên cứu của luận văn:
-

Tách mRNA tổng số từ mô lá lách gà.

-

Tạo cDNA bằng phản ứng RT-PCR, gắn vào vector tách dòng pCR2.1.

-

Giải trình tự gen chIL-6, so sánh với các trình tự đã cơng bố.

-

Tối ưu hóa bộ mã gen chIL-6 để biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E.coli.

-

Thiết kế mồi để gắn gen chIL-6 vào vector biểu hiện pGS-21a.

-

Biểu hiện vector pGS-21a-chIL-6 trong tế bào E.coli.

- Khảo sát một số điều kiện cảm ứng biểu hiện gen chIL-6 trên E.coli.

8


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Interleukin và Interleukin-6:
1.1.1. Nguồn gốc của IL-6:
Interleukin là một nhóm các cytokin (các phân tử tín hiệu) lần đầu tiên được
tìm thấy khi nó biểu hiện dưới dạng các tế bào bạch cầu. Thuật ngữ “interleukin”
xuất phát từ (Inter-) tức là "phân tử tín hiệu", và (-leukin) là các phân tử protein
được sinh ra bởi các tế bào bạch cầu và tác động lên hệ bạch cầu. Ngoài ra, họ phân
tử interleukin ( từ IL-1 đến IL-35) còn được sản xuất bởi rất nhiều tế bào khác trong
cơ thể như tế bào tủy xương, tế bào biểu mô, tế bào nội mô... Chức năng của hệ
thống miễn dịch phụ thuộc phần lớn vào interleukins.
IL-6 một cytokin đa chức năng, được sản xuất bởi các loại tế bào bạch cầu và
tế bào không phải bạch cầu như tế bào T, tế bào B, bạch cầu đơn nhân, tế bào sợi,
các tế bào màng trong, tế bào cuộn mao mạch và nhiều loại u bào khác. Cytokin là
các protein hay glycoprotein không phải kháng thể được sản xuất và phóng thích
bởi các tế bào bạch cầu viêm và một số tế bào khác không phải bạch cầu. Các

protein này hoạt động trong vai trò là các chất trung gian điều hòa giữa các tế bào
trong cơ thể. Cytokin khác với các hormon kinh điển vì chúng được sản xuất bởi
nhiều loại tổ chức khác nhau chứ không phải bởi các tuyến biệt hóa nào. Cytokin là
các protein có trọng lượng phân tử thấp, thường từ 8 đến 30 kDa, trung bình khoảng
25 kDa [14].
Trong cơ thể con người và động vật, IL-6 kích thích sự sinh trưởng của tế bào
T. IL-6 hoạt động cùng với IL-3 trong sự tạo máu. IL-6 cũng tạo nên sự khác biệt
giữa đại thực bào, tế bào nhân khổng lồ và tế bào tủy xương. Trong phản ứng cấp
tính, cytokin này kích thích tế bào gan sản xuất ra các protein cấp tính như CRP (Creactive protein), fibrinogen, α1-antitrypsin và amyloid A huyết thanh, và nó cũng
ngăn cản việc sản xuất albumin. Nó gây ra chứng tăng bạch cầu và sốt trong phản
ứng invivo và cũng hoạt động như một nhân tố sinh trưởng cho các tế bào mao
mạch thận, tế bào biểu bì keratinocyt và nhiều loại u bào khác như u tương bào, đa
u tủy và ung thư biểu mô. [2]
9


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

Hình 1.1: Nguồn gốc phát sinh và hoạt tính sinh học của IL-6
U

U

(nguồn: )
1.1.2. Lịch sử phát hiện IL-6:
IL-6 là loại cytokin duy nhất đã được con người tạo dịng một cách khơng có
chủ định từ trước khi phát hiện ra hoạt tính sinh học chính của nó. Trong khi cố
gắng tách dịng cDNA của inteferon β (IFN- β) tế bào sợi (fibroblast) trong cơ thể

người, Weissenbach và cs (1980) đã phân lập 2 dòng cDNA nhận được từ 1,3 kb
mRNA. Protein tương ứng 26 kDa được gọi là “IFN- β2”, vì tế bào nỗn của
Xenopus laevis được tiêm với mRNA tạo ra hoạt tính kháng virus và có thể bị ức
chế bởi kháng huyết thanh IFN- β. Cũng với phương pháp này, Content và cs
(1982) cũng tạo dòng 1,3 kb mRNA nhưng kết luận protein mà họ gọi là nhân tố
26kD khơng có hoạt tính kháng virus và khơng giống về typ huyết thanh với IFNβ. Những trình tự được cơng bố sau đó của hai nhóm nghiên cứu cho thấy khơng có
sự tương đồng về cấu trúc với IFN- β nhưng không giải quyết được sự tranh luận
quanh hoạt tính interferon. Con đường thứ hai, thông thường hơn, dẫn đến IL-6 bắt
đầu từ sự quan sát là tế bào B có khả năng cảm ứng tạo immunoglobulin (Ig) trong
tế bào B hoạt hoá hoặc trong tế bào B Epstein- Barr virus (EBV) bất tử. Phân tử này
10


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

gọi là nhân tố kích thích tế bào B2 (BSF2) được làm sạch đến độ đồng nhất và tạo
dòng bởi Hirano et al từ dòng tế bào T của người được biến nạp virus máu trắng
typ1 (Leukemia type1 virus-HTLV-1). Cả hoạt tính sinh học và nguồn gốc tế bào
của BSF2 khơng có mối quan hệ nào với IFN- β2/ 26K [7].
Hướng nghiên cứu thứ 3 xác định IL-6 bắt nguồn từ việc nghiên cứu các
nhân tố phát triển cho u tương bào, tế bào B lai. Sự tồn tại của những nhân tố này
được biết đến từ lâu nhưng các đặc điểm của chúng không được mơ tả, một phần vì
khơng có dịng tế bào bền vững phụ thuộc vào các nhân tố này. Sau khi những dịng
tế bào đạt u cầu đã có và những kỹ thuật tách chiết, tinh chế được cải tiến đã xuất
hiện rất nhiều báo cáo. Van Snick J.et al (1986) đã làm sạch nhân tố phát triển tế
bào lai từ dịch chiết của dòng tế bào hỗ trợ T ở chuột. Nhân tố này khơng có trình tự
tương đồng với những protein đã biết và tạm thời được đặt tên là IL-HP1. Một phân
tử tương tự gọi là nhân tố phát triển u tương bào (PCT-GF) được làm sạch từ dịch

chiết đại thực bào bởi Nordan R. et al (1987). Những phân tử tương tự ở người được
tách chiết và làm sạch rất nhanh khi người ta phát hiện rằng tế bào lai phụ thuộc
nhân tố của chuột có thể được sử dụng để xác định độ sạch của chúng. Phương pháp
này giúp Van Damme J. et al (1987) làm sạch nhân tố phát triển tế bào lai/ u tương
bào của người từ mơi trường ni cấy dịng tế bào ung thư xương (osteosareoma)
được xử lý bằng IL-1. Đáng ngạc nhiên là trình tự amino acid đầu NH 2 của nhân tố
R

R

này tương đồng (homology) rất ít với nhân tố phát triển tế bào lai của chuột, nhưng
lại rất giống (match) với IFN- β2/ 26K/BSF2. Sự giống nhau hoàn toàn giữa những
phân tử này được khẳng định bằng sự tạo dòng độc lập của nhân tố phát triển tế bào
lai của người và bằng sự chứng minh là 26 K tái tổ hợp có hoạt tính HPGF.
Việc xác định IFN- β2 , 26K, BSF2 và nhân tố tế bào lai/ u tương bào là cùng
một phân tử dẫn đến việc các nhân tố được đặt lại là IL-6. Một bước ngoặt lớn khác
là sau đó đã phát hiện ra rằng kháng thể kháng IL-6 ức chế hoạt tính của protein
nhận được từ bạch cầu đơn nhân gọi là nhân tố kích thích tế bào máu. Phát hiện này
ám chỉ vai trò của IL-6 trong việc điều chỉnh đáp ứng pha cấp tính. Cuối cùng kỹ
thuật biểu hiện dịng cho thấy IL- 6 hoạt động trong việc tạo máu và như một nhân
tố độc cho việc phân hoá tế bào T (CDF).
11


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

1.1.3. Hoạt tính sinh học của IL-6:
a - Sự phát triển tế bào lai B và u tương bào

Tế bào lai B và u tương bào phát triển tốt hơn khi có IL-6, điều này có ý nghĩa
thực tế rất lớn trong việc sản xuất kháng thể đơn dòng. Dòng tế bào lai B như B9
và 7TD1 rất mẫn cảm với IL-6, chỉ cần 1pg/ml IL-6 đã tăng gấp đơi sự phát triển
của các dịng tế bào này. Trong khi đó u tương bào có một lượng thụ thể tương tự
với cùng ái lực, cần lượng IL-6 cao hơn gấp 100 lần để cảm ứng sự phát triển tương
tự. Hiện cịn rất ít các cơng trình nghiên cứu về cơ chế hoạt động của IL-6 lên các tế
bào này. Trong u tương bào phụ thuộc IL-6, việc loại IL-6 ức chế pha G1 đi đôi với
việc mất sự biểu hiện transferin thụ thể nhanh và đặc hiệu. Thời gian cần cho ức
chế tối đa G1 trong các dòng tế bào u tương bào khác nhau tương ứng với mức độ
biểu hiện đầu tiên của thụ thể transferin và tốc độ suy sụp của tế bào sau khi loại
IL-6.
Do u tương bào cần IL-6 để phát triển nên người ta gợi ý có thể IL-6 hoạt
động như nhân tố phát triển khối u in vivo. Kết quả một số thí nghiệm cho thấy các
dịng tế bào khối u cần IL-6 và vi môi trường để phát triển in vitro và như vậy có
thể sự tạo IL-6 tại chỗ cũng quan trọng cho sự phát triển khối u in vivo [2].
Những kết quả nhận được với u tương bào chuột được mở rộng đến u tuỷ ở
người. Một số u tuỷ ở người phát triển in vivo mạnh hơn khi có IL-6. Hoạt tính
nhân tố phát triển của IL-6 cho tế bào khối u B có lẽ khơng chỉ giới hạn với tế bào u
tuỷ mà cịn cả với dòng tế bào B biến nạp EBV và các tế bào B u tân sinh khác
nhau.
b - Sự biệt hoá tế bào B
Ở người, IL-6 cảm ứng tạo immunoglobulin (Ig) trong tế bào bị kích thích
bởi Staphyloccus aureus CowanI hoặc trong tế bào EBV bất tử mà không kích thích
sự biệt hố tế bào B. Kết quả nhận từ một số nghiên cứu củng cố kết quả cho rằng
vai trị chính của IL-6 là cảm ứng sự biệt hoá cuối cùng của tế bào B thành tế bào
huyết tương [16].

12

Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

Những nghiên cứu về tế bào B của chuột đã gợi ra một khía cạnh quan trọng
khác về sinh lý IL-6, được gọi là sự cộng hưởng (synergy) với IL-1. Người ta thấy
rằng IL-1 và IL-6 tự bản thân chúng có hiệu quả rất ít đến tế bào B lách nhưng khi
kết hợp 2 IL này lại, chúng cảm ứng tiết IgM gấp 50 lần [16]. Đồng thời đã xác định
được sự kích thích biệt hoá tế bào B. Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng IL-6
đóng góp vào đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu kháng nguyên mặc dù không
chứng minh hiệu quả trực tiếp của IL-6 lên tế bào B invivo [18].
c - Hoạt hoá tế bào T
Các kết quả nghiên cứu thống nhất IL-6 là một nhân tố có hiệu quả quan
trọng cộng hưởng với IL-1 kiểm soát các bước hoạt hoá đầu tiên của tế bào T. Một
phần của sự cộng hưởng là IL-6 chủ yếu tăng phản ứng của IL-2 trong khi IL-1 tăng
sự tạo IL-2.
Những nghiên cứu đầu tiên liên quan đến IL-6 điều khiển sự phát triển của tế
bào T cảm ứng bởi lectin cho thấy IL-6 có thể thay thế tế bào bổ trợ (accesory).
Nhưng những nghiên cứu sau đó chỉ ra rằng IL-6 khơng phải lúc nào cũng có hiệu
quả trong phục hồi sự phát triển tế bào T. Tác động cộng hưởng của IL-6 và IL-1 đã
được nghiên cứu với đáp ứng CTL.
Trong môi trường nuôi cấy đã làm giảm một phần tế bào bổ trợ, cả IL-1 và
IL-6 đều tăng đáp ứng CTL. Ngồi hoạt tính của IL-6 lên tế bào T ngoại vi, IL-6
cịn kích thích sự phát triển của tế bào tuyến ức CD4+ CD8- và CD4- CD8+ thuần
P

P

P

P

P

P

P

P

thục và sự biệt hoá của tiền tế bào T cytolytic [21].
Người ta nhận thấy rằng IL-6 kích thích sự phát triển của tế bào tuyến giáp
và IL-1 cảm ứng IL-6 trong môi trường nuôi cấy tế bào tuyến giáp. Điều này dẫn
đến khả năng là phép thử truyền thống sự đồng kích thích tế bào tuyến giáp của IL1 biểu hiện sự cảm ứng của IL-6 hơn là hiệu quả trực tiếp của IL-1 lên tế bào tuyến
giáp. Ý kiến này sau đó đã được chứng minh qua thực nghiệm [21]. Ngoài việc cảm
ứng tạo IL-6, IL-1 cũng tăng độ mẫn cảm của tế bào tuyến giáp ngoại lai.
Sự phát triển của tế bào T ngoại vi bị kích thích bởi lectin ở chuột sau khi
thêm IL-6 và IL-1 bị ức chế mạnh bởi kháng thể ngăn cản hoạt động của IL-2 và sự
ức chế tương tự cũng nhận thấy trong đáp ứng dị sinh ( allogenic) CTL đã cho thấy
13


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

rằng, 2 cytokin này có lẽ điều khiển tăng cường sự tạo hoặc đáp ứng đến IL-2. Cùng
với việc tăng phản ứng của IL-2, IL-6 cảm ứng sự tăng đáng kể kích thước tế bào và
tổng hợp protein. Khi khơng có các nhân tố khác, sự hoạt hố này khơng dẫn tế bào
chuyển vào pha S, khẳng định vai trò quan trọng của IL-6 trong hoạt hoá tế bào T là

chuyển tế bào từ pha Go vào pha G1 sớm, nơi chúng phản ứng đến IL-2. Sự tiến
triển trong chu trình tế bào sau đó được kiểm soát bởi IL-1 cần cho cảm ứng IL-2.
Vai trò nổi bật của IL-6 trong cảm ứng đáp ứng IL-2 chủ yếu cần trong các
giai đoạn đầu hoạt hoá tế bào T. Kết luận này dựa trên các kết quả sau: (i) kháng thể
kháng IL-6 chỉ ngăn cản sự phát triển tế bào T cảm ứng bằng IL-6 khi thêm vào giai
đoạn đầu của cảm ứng. (ii) Sự cảm ứng đáp ứng tế bào T cytolytic trong dịch nuôi
cấy hỗn hợp tế bào lympho đã loại tế bào bổ trợ đòi hỏi IL-6 thêm vào trong 48 giờ
đầu của 7 ngày ni cấy, trong khi IL-1 có thể được thêm vào muộn hơn, ở ngày
thứ 5 mà hoạt tính bị mất rất ít. (iii) Phần lớn dịng tế bào T nuôi thời gian dài
không đáp ứng lại IL-6. (iv) sự biểu hiện thụ thể IL-6 bị điều khiển giảm theo sự
hoạt hoá tế bào T.
d - Đáp ứng pha cấp tính
Nhiễm khuẩn, bị thương, u ác và một loạt những rối loạn miễn dịch kích
thích phản ứng hỗn hợp của cơ thể được biết như đáp ứng cấp. Đặc điểm của nó là
sốt, tăng bạch cầu, cân bằng nitơ âm, tăng thẩm thấu thành mạch, thay đổi nồng độ
steroid và kim loại của huyết tương và tăng tổng hợp protein gan cấp. Ở người,
protein phản ứng C và amyloid A huyết thanh tăng 10- 100 lần, trong khi một số
loại khác tăng 2- 10 lần. Một vài protein như albumin và transferin giảm ở trong
huyết tương vì vậy gọi là protein cấp âm.
Tầm quan trọng của IL-6 như chất cảm ứng của đáp ứng cấp được khẳng
định bởi người ta nhận thấy IL-6 cảm ứng protein cấp invivo và nó kích thích phổ
đầy đủ của protein cấp trong tế bào gan người lớn[26]. Ngồi ra, IL-6 cịn góp phần
bảo vệ cơ thể bằng cách cảm ứng sốt và kích thích tiết hormone
adrenocorticotropic. Trong lĩnh vực này điều quan tâm là: (i) hiệu quả của IL-6 lên
tế bào gan tốt nhất khi có glucocorticoids và (ii) glucocorticoids tăng sự biểu hiện
thụ thể IL-6.
14


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

e - Tạo máu (hematopoiesis)
Người ta tin rằng trạng thái bền vững của tế bào gốc máu (hematopoiesis
sterm cells) là ở trạng thái nghỉ (dormant) và dừng lại ở pha Go của chu trình tế bào.
IL-3 cần thiết cho sự phát triển của những tế bào này nhưng khơng kích ứng chúng
ra khỏi pha Go. Nhiều bằng chứng củng cố quan điểm, có thể IL-6 là một trong
những nhân tố có khả năng cảm ứng tế bào gốc nguyên thuỷ (primitive) đi vào chu
trình tế bào.
IL-6 cũng cộng hưởng với GM-CSF và M-CSF. Thú vị là sự cộng hưởng với
M-CSF chỉ có thể nhận thấy với các tiền tế bào cực sạch. Nếu đưa IL-6 vào muộn,
sự cộng hưởng không xảy ra. Như vậy, IL-6 hoạt động như một nhân tố cần cho các
nhân tố phát triển tế bào máu truyền thống [14].
Cách thức hoạt động của IL-6 có sự giống nhau rõ ràng với IL-1, IL-1 tự nó
cũng khơng có khả năng kích thích tạo tế bào máu nhưng tăng hiệu quả của các
nhân tố tạo máu khác. Cũng chưa rõ liệu 2 cytokins hoạt động độc lập hay cái này
cảm ứng cái kia. Ngồi những hiệu quả đã nêu trên, IL-6 cịn hỗ trợ cho sự phát
triển của tiền đại thực bào/ bạch cầu hạt ở chuột. Hoạt tính này yếu hơn nhiều so với
GM-CSF và khơng có hiệu quả ở người.
IL-6 biểu hiện hiệu quả ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư
bạch cầu dạng tuỷ ở chuột và người. Sự ức chế quá trình phát triển xảy ra song song
với sự thay đổi hình thái tế bào, đặc trưng cho giai đoạn biệt hố muộn hơn. Ví dụ:
tế bào M1 ủ với IL-6 có hình dạng giống đại thực bào và hoạt tính thực bào tăng
cùng với sự biểu hiện thụ thể Fcó và C3. IL-6 cũng thể hiện hoạt tính ức chế sự
phát triển của các dịng tế bào ung thư và u lympho.
Có hai sự trùng hợp thú vị được ghi lại bởi nhóm nghiên cứu của các nhà
khoa học Hirano và Kyshimoto đó là khi thừa, IL6 có thể cảm ứng sự biệt hố tế
bào B đa dòng sinh ra sản phẩm hypergammaglobulinemia và tự kháng thể. Một là
u niêm tim và loại kia là bệnh castle- man’s, một trạng thái có đặc điểm là tăng sản

(hyperplastic) lymphadenopathy lành tính kết hợp sốt và tăng độ chuẩn Ig [21].
Trong cả hai trường hợp mô tăng sinh sản sinh ra IL-6 và việc loại bỏ khối u lượng

15


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

Ig sẽ trở lại bình thường. IL-6 được sinh ra quá nhiều cũng liên quan đến bệnh phát
triển cục bộ (localized proliferative disease).
1.1.4. Vai trò của IL-6 trong đáp ứng miễn dịch:
IL-6 giữ vai trò quan trọng trong miễn dịch một số bệnh nhiễm virus.
Beatrice D. Strestik et al. đã tìm thấy đáp ứng kháng thể thứ cấp (secondary
antibody response) kháng Friend retrovirus (FV) bị hỏng trong chuột khuyết IL-6,
tương tự như những báo cáo của một số tác giả trước kia chỉ ra rằng đáp ứng miễn
dịch dịch thể giảm ở chuột khuyết IL-6 đối với virus gây viêm miệng phồng rộp
(vesicular stomatitis), virut đậu mùa(vaccinia virus) và virus cúm. Miễn dịch tế bào
của chuột khuyết IL-6 giảm sau khi bị nhiễm virus đậu mùa nhưng không phải sau
khi bị nhiễm virus gây viêm màng não bạch huyết (lymphocytic choriomeningtis
virus) [14]. Những đáp ứng miễn dịch chống virut suy giảm dẫn đến tổn thương
nghiêm trọng khả năng chuột khuyết IL-6 làm sạch virus đậu mùa, ectromelia virus
hoặc cytomegalovirus ở chuột bị nhiễm cấp tính.
IL-6 có chức năng quan trọng điều hồ miễn dịch trong q trình nhiễm
virut cấp nhưng khơng giữ vai trị lớn trong khống chế miễn dịch sự tồn tại dai dẳng
của virut [18]. Tất cả những nghiên cứu với chuột khuyết IL-6 cần phải tính đến
việc khơng có IL-6 sẽ ảnh hưởng đến sự sinh sản của mô lympho (lymphoid) invivo
dẫn đến lượng tế bào T giảm 20 - 40 % so với chuột dạng dại. Vì vậy, một vài hư
hỏng trong cơ chế bảo vệ cơ thể không bị nhiễm virut của chuột khuyết IL-6 một

phần do lượng tế bào T thấp. IL-6 là cytokin đa chức năng giữ vai trò quan trọng
trong đáp ứng viêm và sự thuần thục của lympho B thành tương bào (plasma) sinh
kháng thể. Theo Strestidce và cs, IL-6 có chức năng quan trọng trong việc hạn chế
sớm sự sao chép FV.
Đáp ứng miễn dịch trên bề mặt màng nhầy đặc trưng bởi sự tạo và tiết kháng
thể IgA isotype, đại diện cho phương thức bảo vệ đầu tiên chống lại sự xâm chiếm
của rất nhiều nguồn bệnh. IL-6, một cytokin đa chức năng có khả năng cảm ứng sự
phân hoá cuối cùng của tế bào B, làm tăng đáng kể và có chọn lọc sự tạo IgA
invitro bởi tế bào B. Độ tin cậy của những kết quả invivo này chưa được xác định,
16


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

nhưng sự có mặt của tế bào T, đại thực bào và các tế bào khác có khả năng sản xuất
IL-6 in vitro trong mơ nhầy và sự phân bố rộng rãi của tế bào sản xuất IL-6, mRNA
thông tin trong màng nhầy ruột phù hợp với sự xác nhận là nhân tố này quan trọng
trong việc điều chỉnh giai đoạn tác động của đáp ứng IgA .
Để chứng minh giả thuyết này, các tác giả đã nghiên cứu đáp ứng kháng thể
IgA ở chuột khơng có khả năng sinh IL-6. Kết quả nhận được cho thấy tầm quan
trọng của IL-6 trong việc phát triển đáp ứng kháng thể màng nhầy (mucosal) invivo.
Điều này có lẽ vì những hoạt động cục bộ của IL-6 trong việc thúc đẩy sự biệt hoá
hoặc sự phát triển của tiền tương bào đi đến các điểm nhầy. Mặt khác, khi sử dụng
các virut đậu mùa tái tổ hợp (rVV), sự mã hoá IL-6 đã được phục hồi [2] . Khả năng
làm tăng đáp ứng kháng thể màng nhầy của chuột khuyết IL-6 đến kháng thể của
vaccine chứng minh hiệu quả của việc trị liệu gen bằng cytokin vector điều khiển
tạm thời (transient, vector- directed cytokin gen). Việc biểu hiện cytokins và các
phân tử điều chỉnh khác bằng rVV và các vector khác bắt chước trạng thái sinh lý

gần thực tế hơn so với việc đưa những nhân tố này vào, sẽ cho phép điều khiển vi
môi trường, tạo điều kiện thuận lợi cho các quá trình phát triển đáp ứng miễn dịch
tương ứng trong các cá thể bình thường và khiếm khuyết di truyền.
Theo Manfred Kopf và cs (1994), chuột khuyết gen IL-6 được lai giống sinh
một lượng con bình thường vì vậy điều này đã loại hiệu quả quyết định của IL-6
trong q trình phát triển phơi. IL-6 là chất trung gian quan trọng của đáp ứng cấp
sau khi mô bị chấn thương hoặc bị nhiễm bởi vi khuẩn Gram (+), nhưng không phải
với vi khuẩn Gram (-). Các đáp ứng tối ưu đến chấn thương và nhiễm khuẩn chỉ có
thể được trung gian khi có IL-6, mặc dù rất nhiều nhân tố khác có hoạt tính tương tự
IL-6.
Sự có mặt của IL-6 trong mơi trường ni cấy ban đầu hỗ trợ cho việc cảm
ứng tế bào sản xuất IL-4 trong hệ thống nuôi cấy in vitro ở chuột. Quan trọng là,
khả năng IL-6 tăng sự biệt hoá của tế bào sản xuất IL-4 bị ức chế nếu kháng thể
trung hồ kháng IL-4 được đưa vào mơi trường nuôi cấy ban đầu. Những kết quả
này cho thấy IL-6 có thể cảm ứng nhanh IL-6 nội sinh đủ để dẫn đến sự biệt hoá tế
bào hỗ trợ T (Th2). Cuối cùng vì IL-6 được sản xuất từ các APCs khác nhau, nó
17


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

cung cấp một cơ chế tiềm năng cho APCs kiểm soát sự biệt hoá của tế bào Th2.
Những nghiên cứu tiếp theo kiểm tra vai trò của IL-6 trong việc trung gian đáp ứng
invivo Th2 sẽ cung cấp sự hiểu biết sâu sắc về vấn đề liệu phân tử này có vai trị
trong cảm ứng IL-4 hay không?
IL-6 là một cytokin quan trọng chủ yếu trung gian cho miễn dịch dịch thể.
Một số nghiên cứu cho thấy chIL-6 tái tổ hợp biểu hiện trong hệ eukaryote có thể
tăng hiệu quả miễn dịch của vaccine LaSota chống lại bệnh Newcastle của gà

[20,21]. Có một số nghiên cứu về IL-6 của gà như sản xuất kháng thể đơn dịng
kháng IL-6 của gà, Hoạt tính sinh học của ChIL-6 tái tổ hợp. Mặc dù đặc tính tăng
cường miễn dịch của cytokin nói chung và IL-6 nói riêng đã được biết, nhưng hiện
chưa có nghiên cứu nào sử dụng gen IL-6 của gà để làm nguồn nguyên liệu cho việc
sản xuất chất kích ứng miễn dịch cho gia cầm, nhằm tăng sức đề kháng cho gà cũng
như tăng hiệu quả bảo hộ miễn dịch của các loại vaccine hiện đang được sử dụng.
Vì vậy nghiên cứu này là tiền đề để tạo vector tái tổ hợp mang gen chIL-6 có tác
dụng như chất kích ứng miễn dịch cho gia cầm nói chung và gà nói riêng.
1.1.5. Cấu trúc của IL-6
IL-6 thuộc họ có các đặc tính cấu trúc rất giống với cytokin và thụ thể mà
chúng gắn vào. Những thành viên gần nhất của họ bao gồm nhân tố ức chế ung thư
(LIF), nhân tố dinh dưỡng thần kinh (ciliary neurotrophic - CNTF), oncostatin M và
IL-11. Thụ thể IL-6 gồm 2 polypeptides: chuỗi α (IL-6R) là một glycoprotein màng
80kDa có ái lực với IL-6 thấp và chuỗi β (gp 130) là một glycoprotein màng 130
kDa gắn với IL-6 - IL-6R heterodimer tạo hỗn hợp truyền tín hiệu ái lực cao[16].
Cấu trúc tinh thể của IL-6 là 4 bó xoắn với hình học khơng gian tương tự
nhiều cytokin trong cùng họ. Bốn sợi xoắn được sắp xếp theo kiểu xoắn A và B
cùng một hướng và xoắn C và D có hướng ngược lại. Các sợi xoắn được nối với
nhau bởi các quai, giữa A và B, C và D là các quai dài, B và C được nối với nhau
bằng một quai ngắn.[29]

18


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

Hình 1.2: Cấu trúc tinh thể của IL-6.
U

U

( nguồn: />Sự dẫn truyền tín hiệu trung gian IL-6 xảy ra khi IL-6 nhóm 2 thụ thể gp130
lại với nhau hoặc một kháng thể đơn dòng kháng agonistic gp130. IL-6 gắn vào
phân tử IL-6R đơn và tạo heterodimer. Vì tín hiệu được thực hiện qua việc gộp các
phân tử gp130, cần có một bước gắn nữa. Thực vậy, các thí nghiệm li tâm siêu tốc
với IL-6, IL-6R và gp130 tan cho một hexamer gồm 2 phân tử của mỗi thành phần
(Ward et al, 1994), hỗ trợ cho trường hợp gộp tiếp theo. Mơ hình chi tiết của hỗn
hợp truyền tín hiệu dựa trên cấu trúc rõ ràng của IL-6 đã được đưa ra. Sự kiện thứ
nhất trong dẫn truyền tín hiệu là IL-6 tan gắn vào IL-6R tại điểm 1 tạo thành
heterodimer. Sự kiện thứ 2 là heterodimer này gắn với gp130 trên bề mặt tế bào. Sự
gắn này xảy ra ở điểm 2, IL-6 kết hợp với gp130 cũng như sự tiếp xúc giữa vùng
đầu C của IL-6R và gp130. Sự kiện thứ 3 xảy ra trong truyền tin IL-6 (IL-6
19


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

signaling) là sự gắn 2 hỗn hợp hetero- trimers tại điểm 3 (IL-6 trimer1 – gp130
trimer2) và 4 (IL-6 trimer1 – IL-6 trimer2). Mơ hình này cũng dự đoán trước khả
năng kết hợp giữa trimers khác nhau qua nửa đầu C của các vùng gắn cytokin của
IL-6R và gp130.

Hình 1.3: Phức hợp thụ thể IL-6R dẫn truyền tín hiệu qua gp130
U

U

(nguồn: />Gần đây đã xác định đựơc rằng cytokins, đặc biệt là IL-1 và IL-6 trung gian
cho tác động qua lại giữa hệ thống miễn dịch và tuyến nội tiết thần kinh. Những
cytokins này có thể chịu trách nhiệm cho đáp ứng glycocorticoid đối với viêm và
nhiễm, triệu chứng thiểu năng tuyến giáp, chậm phát triển, chán ăn, loạn kinh và sốt
nhẹ trong quá trình bệnh mãn hoặc cấp tính. Những cytokin IL-1α, IL-1β, IL-2, IL6 và interferon đều có thể ảnh hưởng đến sự tiết hormone của tuyến yên [18].
Những cytokin này được sản xuất một cách có hệ thống (tồn bộ cơ thể), nhưng
hiện nay có bằng chứng là IL-1β và IL-6 được sản xuất và tiết ra bởi vùng dưới đồi
và tuyến yên trước (anterior pituitary gland). Không rõ liệu cytokin là những phân
tử tương đối lớn đi qua rào chắn máu-não để thể hiện hiệu ứng của chúng như thế
nào. Có 3 giả thuyết được đưa ra: (1) chúng đi qua rào chắn máu-não trong phần
trước vùng dưới đồi nơi tính toàn vẹn của rào chắn là yếu nhất. (2) cytokins kích
thích tạo cơ chất trung gian truyền tín hiệu đến vùng dưới đồi. (3) bằng cách nào đó
chúng kích thích sự tiết cytokin cục bộ trong vùng dưới đồi và tuyến yên.
20


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

1.2. Tình hình nghiên cứu về gen chIL-6 ở Việt Nam và trên thế giới:
1.2.1. Tình hình nghiên cứu IL-6 trên thế giới
Bên cạnh những nghiên cứu về IL-6 trong y học, các nghiên cứu về sinh học
phân tử IL-6 đã và đang được chú ý. Đã có nhiều nghiên cứu về tách dịng và xác
định trình tự gen IL-6 ở người, động vật và gia cầm.
Xác định trình tự cDNA mã hóa IL-6 được tiến hành chủ yếu ở người và một
số loài động vật (như lợn, chó, bị, mèo, chuột...)]. Grenett và cs (1990) đã tách
dịng và xác định trình tự cDNA mã hóa IL-6 dài 633bp mã hóa 211 amino acid
(AA), có mức độ tương đồng so với trình tự cDNA mã hóa IL-6 của người là 65%

trình tự nucleotid và 41% so với amino acid [19]. Sau đó, vào năm 1993 người ta đã
xác định được trình tự cDNA của cừu là 561bp mã hóa 187 AA có mức độ tương
đồng so với người, bò, chuột là 74%, 95% và 61% [20].
Gen IL-6 của gà đã được tách dòng, xác định trình tự, kết quả phân tích trình
tự cho thấy: Vùng mã hóa gen gồm 4 exon: exon đầu tiên gồm 5’-UTR và mã hóa
91 AA đầu tiên của protein, bao gồm cả trình tự protein tín hiệu và 44 AA đầu tiên
của protein trưởng thành [40]. Báo cáo gần đây nhất đã công bố gen IL-6 của gà
cũng được tách dòng từ đại thực bào - dòng tế bào HD11 và đã sản xuất thành công
protein chIL-6 tái tổ hợp (recombinant chicken interleukin-6) [29].
Nghiên cứu về tách dòng phân tử và xác định trình tự gen IL-6 của gấu trúc
và một số động vật khác (chuột, bò, cừu ...) đã được mô tả. Ở gấu trúc: các nhà khoa
học Trung Quốc đã xác đinh được trình tự cDNA của IL-6 là một khung đọc mở
gồm 636 bp mã hóa 211 aa [22]. Khi so sánh mức độ tương đồng về trình tự gen IL6 giữa gấu trúc và một vài loài khác (hải cẩu, rái cá biển, chồn, cáo đỏ, chó và mèo)
tương ứng khoảng 90,5% ; 86,2% ; 87,6% ; 86,4% ; 86,2% ; 85,6% [20].
Một vài nhóm nghiên cứu đã công bố kết quả sản xuất IL-6 của người
(hIL-6) trong E.coli, và hệ thống biểu hiện này có thể tạo ra một lượng lớn protein
tái tổ hợp ở thể vùi không tan. Nhưng protein tái tổ hợp biểu hiện ở thể vùi khơng
tan cần qua một q trình xử lý để phục hồi hoạt tính sinh học của chúng. Vì vậy,
vấn đề liên quan đến sản lượng thấp trong quá trình gấp lại protein do bản chất tự
21


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

hợp nhất của hIL-6 cần phải giải quyết. Tính chất này cũng gây khó khăn trong việc
thiết kế quy trình làm sạch protein biểu hiện vừa đảm bảo sản lượng cao, áp dụng
được cho việc sản xuất hIL-6 ở quy mơ lớn, mà cịn có thể loại bỏ một cách hiệu
quả những protein từ tế bào chủ và sự phân hủy hoặc sự thay đổi của hIL-6 từ sản

phẩm được làm sạch [16].
Ở cừu, khuếch đại gen bằng PCR phiên mã ngược sử dụng mồi dị ngun để
thu được cDNA mã hóa trình tự cấu trúc IL-6 từ hốc đại thực bào. cDNA này mã
hóa một protein M(r)= 23,429, có 53% trình tự AA tương đồng với IL-6 của người.
Gen cấu trúc IL-6 của cừu đã được tách dòng và gắn vào vector biểu hiện trong nấm
men pOGS40, để sản xuất protein tái tổ hợp [13].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu IL-6 ở Việt Nam:
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về cytokin, đã có: khảo sát interleukin-6,
interleukin-8 và TNF-α trong tiên đoán sớm độ nặng viêm tụy cấp [2]. Vai trò IL-6
trong tiên lượng rối loạn chức năng đa cơ quan ở trẻ mắc hội chứng nhiễm khuẩn toàn
thân ... Các nghiên cứu sinh học phân tử hiện tập trung vào phân lập và biểu hiện gen
cytokin (IL-2) ở người dùng trong điều trị bệnh ung thư [2], nghiên cứu biểu hiện gen
interleukin (IL-6) của người trong tế bào E.coli [7] và một số nghiên cứu thử nghiệm
kiểm tra hoạt tính, hầu hết thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học với các loại
interleukin quan trọng.
Cho đến nay tại Việt Nam chưa có bất kỳ cơng trình nào nghiên cứu về tách dịng
và xác định trình tự gen IL-6 của gia cầm nói chung và của gà nói riêng.

22


Nguyễn Thy Ngọc

Luận văn tốt nghiệp

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu là mẫu mô lá lách lấy từ gà khỏe mạnh hơn 4 tháng tuổi
đã tiêm vacxin nhằm tăng cường miễn dịch cho cơ thể.

Gà giống Ai Cập, được mua từ Viện Chăn nuôi Quốc Gia, gà đã được tiêm các
loại vacxin sau:
Ngày tuổi
1

Vacxin
Marek

1-4
3-5

Codivac D
Cầu trùng
Lasota hoặc LD-IB Newcastle và phế
quản truyền nhiễm
Gumbogo
Gumbogo
Đậu gà
Đậu gà
H5N1
Cúm gia cầm
Lasota hoặc LD-IB Newcastle và phế
quản truyền nhiễm
Hệ I hoặc
Newcastle
ND_Emultion
ILT
Viêm thanh khí
quản truyền nhiễm
ILT

Viêm thanh khí
H5N1
quản truyền nhiễm,
cúm gia cầm
ND_Emultion
Newcastle

7
14
16 - 19
42 - 45
60
120 - 125

130

Phòng bệnh
Marek

Cách sử dụng
Tiêm dưới da cổ
hoặc da đùi
Cho uống
Nhỏ mắt, mũi
Nhỏ mắt, mũi
Tiêm dưới da cổ
Nhỏ mắt, mũi
Tiêm dưới da cánh,
da cổ

Nhỏ mắt, mũi
Tiêm dưới da cổ
Tiêm dưới da cổ,
da cánh

Sinh phẩm:
- Bộ sinh phẩm TA cloning Kit (Invitrogen) dùng cho mục đích tạo dịng gen.
Trong bộ kit gồm các thành phần vectơ pCR®2.1 (đã mở vịng có đầu dính là
P

P

Timin), enzym T4 ligaza, đệm ligaza 10X, tế bào E. coli chủng InVαF’.
P

P

- Bộ sinh phẩm Kit Pure Link TM (Fermentas)dùng để tinh sạch plasmid.
P

P

23